IT201900013992A1

IT201900013992A1 - Metodo per stimolare l’espressione genica in cellule endometriali

Info

Publication number: IT201900013992A1
Application number: IT102019000013992A
Authority: IT
Inventors: Gianantonio Pozzato; Alessandro Pozzato
Original assignee: Telea Electronic Eng Srl
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2021-02-05
Also published as: US20210047631A1

Description

METODO PER STIMOLARE L’ESPRESSIONE GENICA IN CELLULE ENDOMETRIALI.

DESCRIZIONE

L’invenzione concerne un metodo per stimolare l’espressione genica in cellule endometriali, in particolare un metodo per stimolare l’espressione genica in tali cellule di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV.

L’invenzione riguarda inoltre un procedimento per aumentare le probabilità di concepimento di un soggetto sano.

E’ noto che al fine di ottenere un impianto embrionale è necessario che differenti molecole cooperino e interagiscano tra loro per assicurare l’attecchimento dell’ovulo fecondato e la progressione dell’embrione durante le prime fasi di una gravidanza.

In particolare, XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV sono dei geni che svolgono un ruolo importante nel processo di attecchimento e progressione dell’embrione, essi infatti codificano per delle classi di proteine implicate nello sviluppo e nella regolazione dei suddetti processi nelle cellule embrionali.

Più nello specifico, i geni Homebox 10 (HOXA10) e Homebox 11 (HOXA11) codificano per fattori di trascrizione del DNA che regolano l'espressione genica, la morfogenesi e la differenziazione dell'embrione, la cui sottoespressione è nota per conferire infertilità in modelli murini.

Il gene LIF codifica invece per uno tra i più importanti mediatori dell’ormone estrogeno, il leukaemia inhibitory factor, essenziale per la recettività uterina e l’impianto. Tale mediatore infatti si associa al suo recettore LIFR nell’epitelio ghiandolare uterino dell’endometrio ed attiva i pathway molecolari JAK/STAT3, MAPK/ERG e fosfatidilinositolo-3 fosfato chinasi PI3K che regolano la risposta biologica di diverse fasi del ciclo cellulare.

Ulteriormente, anche le glicoproteine transmembrana note come integrine svolgono un ruolo importante nelle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice in numerosi processi fisiologici.

Diversi studi hanno mostrato che anche le glicoproteine transmembrana note come integrine svolgono un ruolo importante nelle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice in numerosi processi fisiologici.

In particolare, le integrine β3 e α5, codificate rispettivamente dai geni ITGB3 e ITGAV, sono risultate coinvolte nello sviluppo embrionale perché fungono da recettori per l’osteopontina, una glicoproteina acida la cui espressione sia nell’endometrio che nei trofoblasti è correlata ai livelli dell’ormone progesterone. Alcuni studi hanno evidenziato tra l’altro come bassi livelli di tali integrine, siano riscontrabili in soggetti donna sani che tuttavia erano inspiegabilmente infertili.

Nonostante esistano diversi approcci sperimentali e medici per la stimolazione dei processi di attecchimento embrionale, esiste ancora il bisogno di sviluppare nuovi metodi per la stimolazione dello sviluppo embrionale, in particolare per la stimolazione dello sviluppo embrionale nei soggetti sani, cioè privi di patologie al sistema riproduttivo, che sono tuttavia infertili secondo la definizione dell’American Fertility Society che indica che “è infertile una coppia che entro un anno di rapporti sessuali completi, regolari e non protetti non sia stata in grado di ottenere una gravidanza”.

Normalmente, le coppie definite infertili secondo la definizione citata, sono sottoposte ad analisi della funzionalità riproduttiva secondo guidelines mediche standard che comprendono analisi del liquido seminale, valutazione dell’ovulazione e della riserva ovarica, isterosalpingografia e laparoscopia per l’identificazione di eventuali anormalità. Quando i suddetti test non rilevano alcun tipo di anomalia o patologia, l’infertilità viene definita come inspiegabile o idiopatica. Il soggetto infatti è da considerarsi come un soggetto sano perché privo di patologie tali da renderlo infertile ma, tuttavia, è comunque infertile.

Ad oggi, in tali soggetti sani infertili i procedimenti utilizzati per aumentare le probabilità di concepimento concernono per lo più i cosiddetti metodi di procreazione medicalmente assistita PMA.

Un noto metodo di PMA è l’inseminazione artificiale con la quale il liquido seminale del donatore viene introdotto dal medico specialista all’interno della vagina, della cervice o dell’utero della ricevente.

Un’ulteriore tipologia di metodo PMA è la cosiddetta fecondazione in vitro in cui gli ovuli della donna vengono raccolti e fecondati con liquido seminale maschile all’esterno del corpo e, una volta fecondato l’ovocita, se si sviluppa un embrione, questo viene trasferito nell’utero.

Ancora, i metodi PMA comprendono l’iniezione intra-citoplasmatica in vitro di spermatozoi, una procedura in cui un singolo spermatozoo viene iniettato direttamente all’interno del citoplasma dell’ovocita ed una volta fecondato l’ovocita, l’embrione che si sviluppa viene trasferito nell’utero.

Un altro ancora metodo di PMA noto consiste nell’induzione dell’ovulazione, cioè nell’eseguire una stimolazione farmacologica dell’ovulazione in caso di mancata (anovulazione) o ridotta (oligovulazione) produzione di ovociti.

E’ evidente che i citati metodi PMA consistono in trattamenti di tipo invasivo a livello fisico, soprattutto per la donna che, oltre a dover ricevere eventuali impianti degli embrioni fecondati, viene solitamente sottoposta anche a protocolli di stimolazione ormonale prima della raccolta degli ovuli.

Non meno importante, tali metodi PMA, richiedendo l’intervento di personale altamente qualificato, strutture mediche specializzate e/o farmaci, sono particolarmente costosi.

Non ultimo, nonostante uno stile di vita corretto ed un quadro clinico sano, privo di patologie conclamate, molte coppie di soggetti sani che si sottopongono ai metodi citati non riescono comunque a concepire un figlio biologico.

La resa infatti, in termini di bambini nati per ciclo di procreazione medicalmente assistita, è limitata a circa il 30% delle coppie.

Viene rimarcata perciò la necessità di sviluppare degli approcci alternativi per aumentare le probabilità di concepimento nelle coppie sane infertili.

Descrizione dell’invenzione

Lo scopo della presente invenzione è realizzare un metodo per stimolare il processo di attecchimento dell’ovulo fecondato e progressione dell’embrione nelle cellule endometriali che superi le limitazioni dei metodi noti.

In particolare, scopo dell’invenzione è che tale metodo sia realizzabile con cellule endometriali in vitro ed in vivo.

Inoltre, è uno scopo della presente invenzione, che tale metodo non sia di tipo invasivo.

Particolarmente, è scopo dell’invenzione realizzare un metodo che aumenti le probabilità di concepimento nei soggetti femminili sani infertili.

Un altro scopo che si propone il metodo dell’invenzione è quello di realizzare un metodo che sia di facile utilizzo e che non abbia alcun effetto collaterale ed indesiderato sull’organismo al quale si applica tale trattamento.

Non ultimo scopo è che tale metodo sia realizzato mediante un dispositivo che sia poco costoso ed efficace.

Gli scopi suddetti vengono raggiunti da un metodo in vitro per stimolare l’espressione genica di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV in cellule endometriali, come definito nella rivendicazione principale.

In particolare, il metodo dell’invenzione prevede di applicare a cellule endometriali in vitro, per un tempo predefinito, onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale con frequenza fondamentale superiore a 2 MHz, preferibilmente di circa 4 MHz.

Secondo il metodo dell’invenzione, la forma d’onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche, preferibilmente armoniche almeno del secondo del terzo ordine.

Secondo il metodo dell’invenzione inoltre, il tempo predefinito è compreso tra 10 e 60 minuti e l’applicazione è ripetuta n volte al giorno per m giorni, in cui n ed m sono ciascuno un numero intero, preferibilmente compreso tra 1 e 10.

Secondo una particolare forma esecutiva del metodo dell’invenzione, le cellule endometriali sono cellule appartenenti ad endometrio di mammifero, preferibilmente cellule appartenenti a materiale bioptico di endometrio di origine umana.

Vantaggiosamente, il metodo dell’invenzione permette di stimolare l’espressione genica di tutti i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV.

Fa parte della presente invenzione anche un procedimento per aumentare le probabilità di concepimento di un soggetto sano infertile mediante stimolazione dell’espressione genica di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV nelle cellule endometriali in vivo, che comprende le seguenti fasi:

- collegare un dispositivo elettronico atto a generare onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale con frequenza fondamentale superiore a 2 MHz, preferibilmente di circa 4 MHz, ad uno o più elettrodi;

- applicare almeno uno di tali elettrodi in corrispondenza o in vicinanza dell’endometrio del suddetto soggetto sano;

- attivare il dispositivo elettronico in modo da trasferire le onde di corrente a tale elettrodo e mantenere attivato il dispositivo per un tempo predeterminato, preferibilmente compreso tra 10 e 60 minuti; - disattivare il dispositivo elettronico e allontanare l’elettrodo dal soggetto.

L’applicazione di tale almeno un elettrodo e la sua attivazione è inoltre preferibilmente ripetuta n volte al giorno per m giorni, in cui n è un numero intero, preferibilmente compreso tra 1 e 5, ed m è numero intero, preferibilmente m è superiore a 2, più preferibilmente m è superiore 4, ancor più preferibilmente m è compreso tra 6 e 16.

Il termine “soggetto” utilizzato nella presente descrizione include tutti i mammiferi di sesso femminile, umani e non umani.

Nella presente invenzione, il soggetto preferito è un umano.

Inoltre, con il termine “sano” si intende un soggetto che non presenta patologie di tipo noto tali da renderlo clinicamente infertile.

Ulteriormente, il termine “infertile” fa riferimento alla definizione dell’American Fertility Society che indica che è infertile un soggetto di una coppia che entro un anno di rapporti sessuali completi, regolari e non protetti non sia stata in grado di ottenere una gravidanza.

Nel procedimento per aumentare le probabilità di concepimento di un soggetto sano infertile dell’invenzione, l’onda di corrente elettrica presenta forma d’onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del metodo dell’invenzione risulteranno evidenti ad un esperto del ramo dalla descrizione seguente di una forma esecutiva preferita dell’invenzione che viene data a titolo indicativo, ma non limitativo.

Breve descrizione delle figure

- la figura 1 riporta l’aumento percentuale dell’enzima lattico deidrogenasi (LDH) nel medium di colture di cellule Ishikawa trattate con il metodo dell’invenzione rispetto alle cellule controllo (CTRL) ad un valore di potenza impostato da display di 4, 8 e 16, in acuto e dopo 24 ore dalla stimolazione (media ± deviazione standard; ** = p <0,01);

- le figure 2a, 2b, 2c, 2d e 2e mostrano i valori di espressione genica rispettivamente dei geni HOXA10, XOXA11, ITGAV, ITGB3 e LIF in cellule Ishikawa trattate ad un valore di potenza impostato da display di 4, 8 e 16 con il metodo dell’invenzione rispetto alle cellule controllo (CTRL) non trattate (media ± deviazione standard; ** = p <0,01; ***= p <0,001);

- la figura 3 riporta l’aumento percentuale dell’enzima lattico deidrogenasi (LDH) nel medium di colture di cellule Ishikawa trattate con il metodo dell’invenzione ad un valore di potenza impostato da display di 2, 4 e 8 per tre giorni consecutivi rispetto alle cellule controllo (CTRL), dopo 24 ore dalla stimolazione (media ± deviazione standard);

- le figure 4a, 4b, 4c, 4d e 4e mostrano i valori di espressione genica rispettivamente dei geni HOXA10, XOXA11, ITGAV, ITGB3 e LIF in cellule Ishikawa dopo uno, due o tre giorni di applicazione di onde di corrente secondo il metodo dell’invenzione ad un valore di potenza impostato da display di 0 (cellule controllo CTRL) 2, 4 e 8(media ± deviazione standard; * = p <0,05; ** = p <0,01; ***= p <0,001);

- le figure 5a, 5b, 5c, 5d e 5e mostrano i valori di espressione genica rispettivamente dei geni HOXA10, XOXA11, ITGAV, ITGB3 e LIF in campioni di biopsie endometriali trattati con il metodo dell’invenzione ad un valore di potenza impostato da display di 4 per tre giorni consecutivi, rispetto ai campioni controllo (CTRL) non trattati (media ± deviazione standard; * = p <0,05; ** = p <0,01; ***= p <0,001).

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Come indicato precedentemente, la presente invenzione concerne un metodo per stimolare l’espressione genica di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV in cellule endometriali in vitro.

Con il termine cellule endometriali si intendono cellule derivanti da tessuto endometriale di mammifero.

In particolare, tali cellule comprendono cellule da linea di adenocarcinoma endometriale umano, meglio note commercialmente come cellule Ishikawa, e cellule endometriali di mammifero presenti in materiale bioptico.

Le cellule Ishikawa sono ben note nell’arte e reperibili commercialmente in diverse banche cellulari quali ATCC e ECACC, pertanto non verranno ulteriormente discusse in quanto ben conosciute da un esperto del ramo.

Le cellule endometriali di mammifero da tessuto bioptico della presente invenzione sono ottenibili sia da biopsie di endometrio da animali da laboratorio, quali in particolari topi, ratti, conigli e primati, sia da campioni bioptici di endometrio umano, come mostrato negli esempi successivi.

In particolare, nell’esempio 2, le cellule endometriali di derivazione bioptica trattate con il metodo dell’invenzione sono state ottenute da sei campioni di materiale bioptico endometriale umano ottenuto da sei soggetti donna sottoposti a biopsia durante un periodico controllo endoscopico per pregresso mioma, endometriosi o menometrorragia, dietro sottoscrizione del consenso informato.

Ritornando al metodo in vitro dell’invenzione, esso prevede di applicare onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale con frequenza fondamentale superiore a 2 MHz alle cellule endometriali per un tempo predefinito.

Particolarmente vantaggioso è risultato l’utilizzo di una frequenza fondamentale di circa 4 MHz.

Vantaggiosamente, come sarà meglio visibile dagli esempi seguenti, l’applicazione di tali onde di corrente consente di ottenere un aumento dell’espressione genica di tutti i suddetti geni che, come evidenziato precedentemente, sono coinvolti nei processi di attecchimento embrionale durante le prime fasi di una gravidanza, favorendo così una cooperazione tra i vari pathways proteici implicati nello sviluppo embrionale nelle prime settimane di una gravidanza. Inoltre, vantaggiosamente, la stimolazione genica mediante il metodo dell’invenzione non è associata ad una degradazione cellulare derivante dall’aumento di temperatura del medium, come si può vedere dai risultati dell’analisi sulla presenza dell’enzima lattico deidrogenasi.

L’enzima lattico deidrogenasi infatti è un enzima che viene rilasciato dalla cellula nell’ambiente extra cellulare in conseguenza ad un danno acuto alla cellula e la sua quantificazione nel medium è indice di danno cellulare.

Secondo il metodo dell’invenzione, la forma d’onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche, preferibilmente per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.

La combinazione di tali frequenze e delle armoniche consente vantaggiosamente che l’energia trasmessa alle cellule sia convertita quasi esclusivamente in energia potenziale e non in energia cinetica, evitando lo sviluppo di alte temperature.

Ulteriormente, si viene a generare un campo elettrico indotto sulla membrana cellulare con conseguente alterazione nel potenziale transmembrana che comporta l’attivazione o l’inattivazione di canali ionici di membrana e la modulazione dell’attività dei domini proteici fosforilati con attività di sensore di tensione.

I migliori risultati in termine di stimolazione dell’espressione genica si ottengono quando il tempo predefinito è compreso tra 10 e 60 minuti, preferibilmente circa 20-30 minuti, e l’applicazione di tali onde di corrente elettrica è ripetuta n volte al giorno per m giorni, in cui n ed m sono ciascuno un numero intero, preferibilmente un numero intero compreso tra 1 e 10.

In particolare, dagli esempi sotto riportati, è risultato particolarmente vantaggioso applicare le onde di corrente 1 volta al giorno per tre giorni consecutivi.

Non si esclude tuttavia, che secondo varianti realizzative del metodo dell’invenzione, tale tempo predefinito e/o tale numero di applicazioni presentino un valore differente da quanto indicato poc’anzi.

Più specificatamente, il metodo dell’invenzione prevede di applicare alle cellule endometriali in vitro uno o più elettrodi collegati ad un dispositivo elettronico configurato per generare le suddette onde di corrente elettrica.

Tale dispositivo elettronico comprende preferibilmente un circuito raddrizzatore alimentato dalla tensione di rete che fornisce tensione continua, preferibilmente stabilizzata, ad un circuito di radiofrequenza, ed un circuito di radiofrequenza comprendente almeno un interruttore elettronico alimentato dalla tensione e pilotato da un circuito di pilotaggio.

Più nel dettaglio, il circuito di radiofrequenza presenta in uscita un’onda di corrente avente frequenza fondamentale corrispondente a circa 4 MHz e forma sinusoidale distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.

Tale onda di corrente inoltre circola in un circuito risonante a banda larga sulla frequenza dell’onda fondamentale della forma sinusoidale distorta.

Particolarmente preferito è l’utilizzo del dispositivo elettronico descritto nel documento US8457751.

Vantaggiosamente, i risultati ottenuti dal metodo in vitro dell’invenzione sono ottenibili anche in vivo sugli animali, in particolare su mammiferi.

Particolarmente preferito è l’applicazione di tale metodo a soggetti umani sani infertili secondo la definizione fornita precedentemente. Fa dunque parte della presente invenzione anche un procedimento per aumentare le probabilità di concepimento di un soggetto sano infertile mediante stimolazione dell’espressione genica di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV nelle cellule endometriali, comprendente le seguenti fasi:

- collegare un dispositivo elettronico atto a generare onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale con frequenza fondamentale superiore a 2 MHz, ad uno o più elettrodi;

- applicare almeno uno di tali elettrodi in corrispondenza o in vicinanza dell’endometrio del soggetto sano infertile;

- attivare il dispositivo elettronico in modo da trasferire le onde di corrente a tale elettrodo e mantenere attivato il dispositivo per un tempo predeterminato;

- disattivare il dispositivo elettronico e allontanare l’elettrodo dal suddetto soggetto.

Il dispositivo elettronico che realizza il procedimento sopra nominato è lo stesso dispositivo elettronico utilizzato nel metodo in vitro della presente invenzione, che in più comprende essenzialmente uno o più elettrodi presentanti una forma tale da poter essere applicati in corrispondenza o in vicinanza dell’endometrio del soggetto.

Preferibilmente tali elettrodi possono presentare forma di manipolo oppure forma essenzialmente laminare ed essere applicabili per adesione alla pelle del soggetto o, ancora, tali elettrodi possono presentare forma di sonda per l’applicazione vaginale.

Quando gli elettrodi utilizzati nel procedimento dell’invenzione hanno forma laminare, essi sono essenzialmente flessibili in modo da seguire senza difficoltà la forma della superficie della pelle e, inoltre, sono preferibilmente dotati anche di una sostanza adesiva che facilita il mantenimento del contatto sulla pelle durante l’applicazione della forma d’onda generata dal dispositivo elettronico.

Anche nel procedimento per aumentare le probabilità di concepimento della presente invenzione, l’onda applicata agli elettrodi è un’onda sinusoidale che ha come frequenza fondamentale una frequenza superiore a 2 MHz, preferibilmente di circa 4 MHz, in modo da ottenere i vantaggi sopra citati.

In più, la forma d’onda sinusoidale applicata agli elettrodi è distorta per la presenza di armoniche, preferibilmente di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.

L’effetto dell’applicazione di tali forme d’onda in corrispondenza o in vicinanza della zona ove è localizzato l’endometrio del soggetto è quello di agire sulle cellule endometriali, in modo tale da stimolare l’espressione genica di tutti i geni citati, coinvolti nel processo di attecchimento e progressione dell’embrione nelle prime fasi di una gravidanza, aumentando le probabilità di concepimento.

Da esperimenti effettuati si è osservato un aumento della probabilità di ottenere un concepimento in un soggetto sano infertile, quando l’applicazione delle suddette onde di corrente agli elettrodi e quindi al soggetto avviene secondo un tempo predeterminato compreso tra 10 e 60 minuti ed in cui tale applicazione è ripetuta n volte al giorno per m giorni, in cui n è un numero intero, preferibilmente compreso tra 1 e 5, ed m è numero intero, preferibilmente superiore a 2, più preferibilmente superiore a 4, ancor più preferibilmente compreso tra 6 e 16.

Non si esclude tuttavia, che secondo varianti realizzative del procedimento dell’invenzione, tale tempo predeterminato e/o il numero di applicazioni presentino valori differenti da quanto indicato. Si specifica che il termine “soggetto” include tutti i mammiferi, umani e non umani, tuttavia, il soggetto preferito è l’umano.

Vantaggiosamente, è stato riscontrato che l’applicazione del metodo dell’invenzione per 20 minuti, 1 volta al giorno per 2-3 giorni a settimana per 4-5 settimane consecutive a sette donne di età compresa tra 25 e 43 anni che da oltre un anno non riuscivano a concepire un figlio nonostante rapporti completi, regolari e non protetti, dietro sottoscrizione di consenso informato, entro l’anno successivo all’ultima applicazione del procedimento dell’invenzione hanno concepito un figlio naturalmente, cioè senza essere sottoposte a trattamenti PMA.

Altri aspetti e vantaggi della presente invenzione appariranno alla lettura degli esempi che seguono, che devono essere considerati come illustrativi e non limitativi.

Esempi

Esempio 1. Colture cellulari Ishikawa

1.1 Crescita cellulare

Le cellule di linea cellulare Ishikawa (gentile dono del prof. M. Maggiolini del Dipartimento di Farmacia e Scienze della Salute e della Nutrizione, Università della Calabria) sono state coltivate in Minimal Essential Medium (MEM) addizionato di 5% siero fetale bovino (FBS), 1% penicillina/streptomicina, 1% soluzione di amfotericina B, 1% amminoacidi non essenziali (NEAA) e 2mM L-Glutammina. Le cellule sono state coltivate in piastra Petri di 6 cm e mantenute in incubatore sterile a 37°C e 5% CO2.

1.2 Trattamento singolo con onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale

Le piastre Petri contenenti le colture endometriali di Ishikawa mantenute in medium secondo quanto riportato nell’esempio 1.1, sono state collegate a due elettrodi in acciaio inossidabile sterilizzati a caldo che sono stati poi connessi ad un dispositivo elettronico configurato per generare le onde di corrente elettrica del metodo dell’invenzione. Il dispositivo elettronico utilizzato è stato il dispositivo Rexon-age2 della ditta Telea Electronic Engineering, che genera un’onda di corrente a frequenza compresa tra 1-64 MHz e nel quale vengono impostati come parametri operativi da display i valori desiderati di potenza e il tempo di applicazione.

Si evidenzia che il valore di potenza impostato da display potrebbe non coincidere con il reale valore di potenza applicato alle cellule perché esso dipende da vari parametri esterni, come ad esempio l’impedenza del medium.

Il cambiamento di temperatura durante l’applicazione delle onde di corrente è stato monitorato mediante termografia a raggi infrarossi (Handy Thermo TVS- 200 Nippon Avionics Co., Ltd) e analizzata usando PE Professional (Nippon Avionics Co., Ltd.).

Le cellule di Ishikawa sono state stimolate mediante applicazione di onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche e con frequenza fondamentale di 4 MHz e valore impostato di potenza da 0 (cellule controllo) a 16 per un tempo predefinito di 20 minuti a temperatura ambiente e in condizioni di sterilità.

Immediatamente dopo la stimolazione, il medium è stato prelevato, centrifugato e stoccato a -80°C per la valutazione del rilascio acuto di LDH.

Nuovo medium è stato quindi aggiunto alle piastre Petri e le cellule sono state mantenute a 37°C in 5% CO 2 per altre 24 ore.

Dopo 24 h, il medium è stato quindi prelevato, centrifugato e stoccato a -80°C per la quantificazione del rilascio ritardato di LDH.

Le cellule inoltre sono state raccolte per l’analisi dell’espressione genica.

1.3 Analisi della lisi cellulare da trattamento singolo

La lisi cellulare è stata valutata mediante quantificazione dell’enzima Lattico Deidrogenasi (LDH) con LDH Cytotoxicity Assay (Pierce-Life Technologies), in accordo con il protocollo fornito dalla ditta produttrice, nel medium raccolto in acuto e dopo 24 h dalla stimolazione con le onde di corrente secondo quanto riportato nell’esempio 1.2.

Operativamente, il medium delle colture cellulari è stato trasferito in tubi Falcon da 15 ml (Becton Dickinson) che sono stati centrifugati per 10 minuti a 2500 rpm. 2 ml di medium sono stati quindi immagazzinati a -80°C fino al loro utilizzo.

Per l’analisi di LDH, 50 µl di reagente è stato addizionato a 50 µl del medium da analizzare ed incubato a temperatura ambiente per 60 minuti. La reazione è stata poi fermata mediante aggiunta di acido acetico ed è stata misurata la densità ottica a 490 nm.

Ogni analisi è stata eseguita in triplicato.

I risultati ottenuti sono mostrati in figura 1 ove è mostrato che la quantità maggiore di LDH è presente nel medium raccolto in acuto, cioè immediatamente dopo la stimolazione con il dispositivo elettronico, ad un valore impostato di potenza di 4, 8 e 16, rispetto alle cellule controllo che non sono state trattate. L’incremento tuttavia, anche se statisticamente significativo, è stato modesto e non correlato al valore di potenza impostato.

Vantaggiosamente, i livelli di LDH nel medium cellulare raccolto dopo 24 h dalla stimolazione non ha mostrato variazioni rispetto al medium delle cellule controllo, indicando che l’effetto della stimolazione cellulare non provoca degradazione cellulare.

1.4 Analisi dell’espressione genica da trattamento singolo

Le cellule Ishikawa trattate secondo quanto riportato nell’esempio 1.2, sono state raccolte per l’analisi dell’espressione genica.

L’RNA totale è stato estratto dal pellet delle cellule mediante RNeasy® Mini kit (QIAGEN) in accordo con le istruzioni fornite dalla ditta produttrice.

L’RNA è stato successivamente quantificato mediante spettrofotometro UV-VIS NanoDrop (Thermo Fisher scientific).

Il c-DNA corrispondente è stato ottenuto dall’RNA totale mediante utilizzo di SuperScript III Reverse Transcriptase. Sono stati utilizzati primer di oligo-desossiribonucleotidi con sequenze di basi casuali (esamer random) come descritto dal produttore. Il cDNA è stato quindi amplificato mediante PCR Real-Time StepOnePlus™ (Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific).

La reazione di PCR è stata eseguita in MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate, con volume del pozzetto di 0,1 mL (Applied biosystem, Thermo Fisher). Il volume totale di reazione era di 10 µL contenenti: 2 µL di cDNA (corrispondenti a 20 ng), 5 µL di 2X Power SYBR Green PCR Master mix, 1 µL di forward primer e 1 µL di reverse primer. I primer sono stati disegnati mediante Primer3 software per amplificare i seguenti geni: HOXA10, HOXA11, LIF, ITGAV, ITGB3 e GAPDH (il gene GAPDH è stato usato come gene di riferimento).

Le sequenze delle coppie di primer, sia “in avanti” (forward primer) che “contrari” (reverse primer) sono elencati nella lista qui sotto:

SEQ. ID. NO.1:

GAPDH forward primer 5' TCGACAGTCAGCCGCATCTT 3'

SEQ. ID. NO.2:

GAPDH reverse primer 5' AGGCGCCCAATACGACCAAA 3'

SEQ. ID. NO.3:

HOXA10 forward primer 5' GGTTTGTTCTGACTTTTTGTTTCT 3' SEQ. ID. NO.4:

HOXA10 reverse primer 5' TGACACTTAGGACAATATCTATCTCTA 3' SEQ. ID. NO.5:

HOXA11 forward primer 5' AGTTCTTTCTTCAGCGTCTACATT 3' SEQ. ID. NO.6:

HOXA11 reverse primer 5' TTTTTCCTTCATTCTCCTGTTCTG 3' SEQ. ID. NO.7:

LIF forward primer 5' GGAGGTCACTTGGCATTCAG 3'

SEQ. ID. NO.8:

LIF reverse primer 5' GGAAGAGAACGAAGAACCTACC 3'

SEQ. ID. NO.9:

ITGB3 forward primer 5' ACCATCTCTTTACCTCCTAATTCC 3' SEQ. ID. NO.10:

ITGB3 reverse primer 5' CTGGCTCTACAATAGCACTCTC 3' SEQ. ID. NO.11:

ITGAV forward primer 5' AAACAGAATTTGTAAGTTGGCAGAT 3' SEQ. ID. NO.12:

ITGAV reverse primer 5' GGTGACATTGAGATGGGTAGTG 3'

Il protocollo di amplificazione comprendeva una fase di denaturazione iniziale a 95°C per 10 minuti e 40 cicli di amplificazio ne ciascuno consistente in 15 secondi a 95°C, 30 secondi a 60°C e 30 secondi a 72°C.

La quantificazione dell’espressione genica è stata determinata usando il comparative CT method (2 -ΔΔCT) che valuta la differenza di espressione relativa di un gene target in un campione rispetto all’espressione dello stesso gene target in un campione di riferimento. Ogni reazione è stata eseguita in triplicato.

I prodotti di qRealTime-PCR sono stati controllati mediante SYBR® Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Thermo Fisher scientific), in E-Gel® gel di agarosio (pre-cast gel di agarosio 2%).

I risultati ottenuti sono mostrati nelle figure 2a-2e.

Tutti i geni analizzati hanno mostrato un incremento significativo della loro espressione genica rispetto alle cellule controllo (p<0,01).

Tali dati mostrano come l’applicazione di onde di corrente elettrica secondo l’invenzione a cellule endometriali stimoli l’espressione genica di tutti i geni analizzati implicati nei processi di attecchimento embrionale.

1.5 Trattamento multiplo con onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale

Le piastre Petri contenenti le colture endometriali di Ishikawa mantenute in medium secondo quanto riportato nell’esempio 1.1, sono state stimolate mediante una singola applicazione di onde di corrente elettrica che è stata ripetuta per tre giorni consecutivi.

Le cellule sono state inizialmente seminate ad una densità minore rispetto alla densità di semina delle cellule trattate con trattamento singolo, come riportato nell’esempio 1.2, in modo da evitare un’eccessiva proliferazione delle cellule a causa delle prolungate condizioni di coltura.

Ogni giorno, le piastre Petri contenenti le colture endometriali di Ishikawa sono state collegate a due elettrodi in acciaio inossidabile sterilizzati a caldo che sono stati poi connessi ad un dispositivo elettronico configurato per generare le onde di corrente elettrica del metodo dell’invenzione (Rexon-age2, Telea Electronic Engineering) e sono state stimolate mediante applicazione di onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche e con frequenza fondamentale di 4 MHz ed un valore impostato di potenza da 0 (cellule controllo) a 8 per un tempo predefinito di 20 minuti a temperatura ambiente e in condizioni di sterilità.

Al termine di ogni applicazione, le cellule sono state mantenute a 37°C in 5% CO 2 per ulteriori 24 ore.

Dopo 24 ore, il medium cellulare è stato raccolto, centrifugato e stoccato a -80°C per valutare il rilascio di LDH. Anche le cellule sono state raccolte per eseguire l’analisi dell’espressione genica.

1.6 Analisi della lisi cellulare da trattamento multiplo

La lisi cellulare delle cellule trattate secondo l’esempio 1.5 è stata valutata mediante quantificazione dell’enzima Lattico Deidrogenasi (LDH) con LDH Cytotoxicity Assay (Pierce-Life Technologies) secondo quanto riportato nell’esempio 1.3.

I risultati ottenuti sono mostrati in figura 3.

Al fine di escludere l'effetto dovuto alle condizioni di coltura prolungate, i livelli di LDH sono stati normalizzati giorno per giorno su ciascun campione di controllo.

Non è stato riscontrato nessun aumento significativo nei livelli di lisi cellulare per effetto del trattamento dell’invenzione.

1.7 Analisi dell’espressione genica da trattamento multiplo

Le cellule Ishikawa trattate secondo quanto riportato nell’esempio 1.5, sono state raccolte per l’analisi dell’espressione genica.

L’analisi dell’espressione genica è stata eseguita secondo il protocollo riportato nell’esempio 1.4.

I risultati ottenuti sono mostrati nelle figure da 4a a 4e.

Dopo 2 giorni di stimolazione tutti i geni analizzati mostrano un incremento significativo dell’espressione genica ad un valore impostato di potenza corrispondente a 4 e 8. In particolare, i geni ITGB3 e LIF mostrano un incremento significativo anche ad un valore impostato di potenza di 2. Un trend generale di aumento dell’espressione genica è visibile anche dopo 3 giorni di trattamento. I risultati mostrano che applicazioni giornaliere ripetute di onde di corrente elettrica secondo il metodo dell’invenzione stimolano l’espressione genica dei geni delle cellule endometriali coinvolti nei processi di attecchimento embrionale.

Inoltre, la stimolazione genica non è associata a effetti sulla vitalità cellulare, come si può notare dai risultati dell’analisi di lisi cellulare. 1.8 Analisi statistica

L’analisi statistica dei dati è stata realizzata con programma SPSS 21.0 per Windows (SPSS). E’ stato adottato il test t di Student a due code per il confronto tra due gruppi, prima della valutazione della distribuzione normale.

Per il confronto multiplo è stata utilizzata l’analisi della varianza (ANOVA) con correzione Bonferroni-Holmes.

Esempio 2. Tessuto bioptico da endometrio umano

2.1 Raccolta tessuto bioptico e condizioni di coltura

Circa 10-20 mg di materiale bioptico di endometrio è stato prelevato da sei pazienti di sesso femminile (età media 41,8±4,7 anni) afferenti al Dipartimento di Salute della Donna e del Bambino - Clinica Ginecologica e Ostetrica dell’Università di Padova, dietro sottoscrizione del consenso informato.

I campioni sono stati raccolti durante un periodico controllo endoscopico per pregresso mioma, endometriosi o menometrorragia. I campioni sono stati esaminati visivamente e la parte di tessuto normale è stata separata dalla parte patologica e mantenuta a freddo in tampone fosfato salino (PBS) sterile e rapidamente trasferita in laboratorio.

Prima del trattamento con il metodo dell’invenzione, i campioni sono stati suddivisi in pezzi di dimensioni minori mediante un bisturi sterile e disposti in piastre Petri da 6 cm contenenti medium MEM addizionato di 5% FBS, 1% penicillina/streptomicina, 1% soluzione di amfotericina B, 1% amminoacidi non essenziali e 2 mM di LGlutammina.

2.2 Trattamento multiplo con onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale

I campioni di biopsia endometriale secondo l’esempio 2.1 sono stati stimolati per tre giorni consecutivi mediante applicazione di onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale.

Ogni giorno di stimolazione, ciascuna piastra Petri contenente i campioni di biopsia endometriale è stata collegata a due elettrodi in acciaio inossidabile connessi al dispositivo elettronico usato negli esempi precedenti configurato per generare le onde di corrente elettrica del metodo dell’invenzione (Telea Electronic Engineering). Una volta collegata, a ciascuna piastra contenente i campioni sono state applicate onde di corrente aventi una forma d’onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche e una frequenza fondamentale di 4 MHz. Sul display del dispositivo è stato inoltre impostato il valore di potenza desiderata di 4 per un tempo predefinito di 20 minuti a temperatura ambiente e in condizioni di sterilità.

I campioni di biopsia utilizzati come controllo non sono stati sottoposti a stimolazione mediante onde di corrente.

Dopo il terzo giorno di stimolazione, i campioni sono stati mantenuti a 37°C in 5% CO 2 per altre 24 ore per essere poi raccolti per l’analisi dell’espressione genica.

2.3 Analisi dell’espressione genica da trattamento multiplo

I campioni di biopsia endometriale trattati secondo quanto riportato nell’esempio 2.2, sono stati raccolti per l’analisi dell’espressione genica.

I risultati ottenuti sono mostrati nelle figure da 5a a 5e.

Ad eccezione del gene ITGB3, dopo il primo giorno di stimolazione tutti i geni monitorati hanno mostrato una riduzione della loro espressione. Tale riduzione è ascrivibile al trasferimento del tessuto dal suo ambiente naturale alla crescita in piastra, infatti già dal secondo giorno di stimolazione i geni HOXA10, HOXA11, ITGAV e ITGB3 hanno mostrato un incremento significativo della loro espressione rispetto all’espressione dello stesso gene al giorno 1. Tali risultati mostrano inequivocabilmente come la stimolazione con onde di corrente elettrica di tessuto endometriale stimoli l’espressione genica di geni implicati nei processi di attecchimento embrionale e quindi implicati nello sviluppo di una gravidanza.

In base a quanto detto quindi il metodo per stimolare l’espressione genica di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV in cellule endometriali dell’invenzione raggiunge tutti gli scopi prefissati.

In particolare, è raggiunto lo scopo di realizzare un metodo per stimolare il processo di attecchimento e progressione dell’embrione nelle cellule endometriali che supera le limitazioni dei metodi noti. Inoltre, il metodo dell’invenzione è realizzabile sia con cellule endometriali in vitro che con cellule endometriali in vivo.

Ulteriormente, il metodo dell’invenzione non è di tipo invasivo.

Ancora, il metodo dell’invenzione aumenta le probabilità di concepimento nei soggetti femminili sani infertili.

In aggiunta, il metodo dell’invenzione è facilmente applicabile e non presenta effetti collaterali indesiderati sull’organismo al quale si applica tale trattamento.

Non ultimo, è raggiunto lo scopo che il metodo dell’invenzione è realizzato mediante un dispositivo poco costoso ed efficace.

Claims

RIVENDICAZIONI 1) Un metodo in vitro per stimolare l’espressione genica di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV in cellule endometriali, detto metodo prevedendo di applicare a dette cellule endometriali per un tempo predefinito onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale con frequenza fondamentale superiore a 2 MHz, preferibilmente di circa 4 MHz.
2) Metodo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta forma d’onda sinusoidale è distorta per la presenza di armoniche.
3) Metodo secondo la rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che detta forma d’onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
4) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto tempo predefinito è compreso tra 10 e 60 minuti e detta applicazione è ripetuta n volte al giorno per m giorni, in cui n ed m sono ciascuno un numero intero, preferibilmente un numero intero compreso tra 1 e 10.
5) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette cellule endometriali sono cellule di endometrio di mammifero.
6) Metodo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che dette cellule endometriali sono cellule di materiale bioptico di endometrio di origine umana.
7) Metodo per stimolare l’espressione genica dei geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV in cellule endometriali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
8) Un procedimento per aumentare le probabilità di concepimento di un soggetto sano infertile mediante stimolazione dell’espressione genica di almeno uno tra i geni XOXA10, LIF, ITGB3, XOXA11 e ITGAV nelle cellule endometriali, comprendente le seguenti fasi: - collegare un dispositivo elettronico atto a generare onde di corrente elettrica aventi una forma d’onda sinusoidale con frequenza fondamentale superiore a 2 MHz, preferibilmente di circa 4 MHz, ad uno o più elettrodi; - applicare almeno uno di detti elettrodi in corrispondenza o in vicinanza dell’endometrio di detto soggetto; - attivare detto dispositivo elettronico in modo da trasferire dette onde di corrente a detto almeno un elettrodo e mantenere attivato detto dispositivo per un tempo predeterminato; - disattivare detto dispositivo elettronico e allontanare detto almeno un elettrodo da detto soggetto.
9) Procedimento secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta onda sinusoidale è un’onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche, preferibilmente per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
10) Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 o 9, caratterizzato dal fatto che detto tempo predeterminato è compreso tra 10 e 60 minuti e detta applicazione è ripetuta n volte al giorno per m giorni, in cui n è un numero intero preferibilmente compreso tra 1 e 5, ed m è un numero intero, preferibilmente superiore a 2, più preferibilmente superiore a 4.
11) Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 10, caratterizzato dal fatto che detto soggetto sano infertile è un umano.