IT201800010393A1 - Integratore alimentare atto a ridurre il rilascio di agenti infiammatori e relativo uso - Google Patents

Integratore alimentare atto a ridurre il rilascio di agenti infiammatori e relativo uso Download PDF

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Description

Descrizione dell’Invenzione Industriale avente per titolo:
“Integratore alimentare atto a ridurre il rilascio di agenti infiammatori e relativo uso”
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un integratore alimentare idoneo a ridurre drasticamente gli effetti infiammatori in persone affette da leucemia in presenza di infezioni da batteri Gram-negativi.
È noto che i monociti e i macrofagi sintetizzano e rilasciano nel loro ambiente una varietà di citochine e altre proteine che svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di infiammazione acuta e cronica.
THP-1 è una linea cellulare leucemica monocitica umana; è noto dalla letteratura scientifica che queste cellule sono in grado di produrre citochine pro-infiammatorie (IL-1, IL-6 e TNF) e chemochine (IL-8 e MCP-1) in risposta a stimolazione da parte di Lipopolisaccaridi (LPS). LPS è un polisaccaride considerato il principale componente della membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Recenti studi hanno chiarito come LPS sia riconosciuto da monociti e macrofagi del sistema immunitario innato; in particolare i monociti umani sono estremamente sensibili a LPS e la loro risposta si traduce con l’espressione e il rilascio di molte citochine infiammatorie.
Da quanto sopra discende che in una persona affetta da leucemia, nel cui organismo sono presenti cellule THP-1, nel caso di infezione da parte di batteri Gram-negativi, vengono rilasciate molte citochine infiammatorie.
Lo scopo fondamentale della presente invenzione è quello di ridurre, fin quasi ad annullare, il rilascio di citochine infiammatorie, in pazienti nel cui organismo siano presenti cellule leucemiche del tipo TPH-1, detto rilascio essendo conseguenza della risposta di dette cellule TPH-1 ad una stimolazione con Lipopolisaccaridi (LPS).
Il suddetto scopo e i vantaggi dell’invenzione, quali risulteranno dal seguito della descrizione, vengono raggiunti con un integratore alimentare come quello descritto nella rivendicazione 1, cioè caratterizzato dal fatto di comprendere uno o più fra i seguenti ingredienti attivi:
- Olio di semi di Buglossoides arvensis (L.) I.M. Johnst titolato in acidi grassi essenziali, preferibilmente Omega 3 e Omega 6;
- Ananas (Ananas comosus (L. MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina;
- Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA);
- Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni.
Secondo una forma preferita di attuazione dell’invenzione, detto integratore alimentare comprende tutti i quattro ingredienti attivi suddetti, con le seguenti concentrazioni relative: - Olio di semi di Buglossoides arvensis (L.) I.M. Johnst titolato in acidi grassi essenziali, preferibilmente Omega 3 e Omega 6: 14%;
- Ananas (Ananas comosus (L.) MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina: 16%;
- Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA): 30%;
- Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni: 40%.
Forme di realizzazione preferite e varianti non banali della presente invenzione formano l’oggetto delle rivendicazioni dipendenti.
Resta inteso che tutte le rivendicazioni allegate formano parte integrante della presente descrizione.
Risulterà immediatamente ovvio che si potranno apportare a quanto descritto innumerevoli varianti e modifiche (per esempio sostituzioni di uno o più ingredienti attivi e/o eccipienti con altri di riconosciuta equivalenza) senza discostarsi dal campo di protezione dell'invenzione come appare dalle rivendicazioni allegate.
La presente invenzione verrà meglio descritta da una forma preferita di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento alle figure allegate, in cui:
- la Fig. 1 mostra il rilascio di citochine infiammatorie TNF-α, dovuto alla stimolazione con LPS, di cellule THP-1 tal quali e pretrattate con un formulato secondo l’invenzione;
- la Fig. 2 mostra una Tabella con un formulato secondo l’invenzione sottoposto a sperimentazione; - la Fig. 3 mostra una Tabella con i risultati della sperimentazione effettuata sul formulato di Fig. 2.
L’integratore secondo l’invenzione (nel seguito formulato) è stato sottoposto a sperimentazione per verificarne l’efficacia nell’inibire il rilascio di citochine infiammatorie, simulando in vitro l’effetto della membrana cellulare di batteri Gram-negativi su cellule THP-1.
L’invenzione riguarda quindi un integratore alimentare, atto a ridurre il rilascio di citochine infiammatorie in pazienti nel cui organismo siano presenti cellule leucemiche del tipo TPH-1, tale rilascio essendo conseguenza della risposta di dette cellule TPH-1 ad una stimolazione con Lipopolisaccaridi (LPS); l’integratore alimentare dell’invenzione comprende uno o più fra i seguenti ingredienti attivi:
- Olio di semi di Buglossoides arvensis (L.) I.M. Johnst titolato in acidi grassi essenziali, preferibilmente Omega 3 e Omega 6;
- Ananas (Ananas comosus (L.) MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina;
- Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA);
- Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni.
Secondo la forma di realizzazione preferita, per ottenere l’effetto migliore, l’integratore alimentare dell’invenzione comprende tutti i quattro ingredienti attivi suddetti, con le seguenti concentrazioni relative:
- Olio di semi di Buglossoides arvensis (L.) I.M. Johnst titolato in acidi grassi essenziali, preferibilmente Omega 3 e Omega 6: 14%;
- Ananas (Ananas comosus (L.) MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina: 16%;
- Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA); 30%;
- Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni: La formulazione sopra indicata può essere integrata con l’aggiunta di:
- biossido di silicio;
- idrossi-propil-metilcellulosa;
- DL-α Tocoferolo;
- etilcellulosa;
- olio Extravergine di oliva (Olea europaea L., fructus);
- glicerolo;
- alginato di sodio;
- trigliceridi a media catena;
- complessi rameici delle clorofilline;
- biossido di titanio;
- acido oleico;
- acido stearico.
In particolare, l’integratore sopra descritto può essere confezionato in capsule ed avere la seguente composizione complessiva:
- Olio di semi di Buglossoides arvensis (L.) I.M. Johnst titolato in acidi grassi essenziali, preferibilmente Omega 3 e Omega 6: 9,764%;
- Ananas (Ananas comosus (L.) MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina: 11,159%;
- Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA): 20,923%;
- Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni: 28,456%.
- idrossi-propil-metilcellulosa: 12,554%
- biossido di silicio: 0,139%;
- DL-α Tocoferolo: 1,395%;
- etilcellulosa: 2,664%;
- olio Extravergine di oliva: 6,138%;
- glicerolo: 0,753%;
- alginato di sodio: 0,621%;
- trigliceridi a media catena: 0,711%;
- complessi rameici delle clorofilline: 0,446%; - biossido di titanio: 0,349%;
- acido oleico: 0,307%;
- acido stearico: 0,006%.
L’integratore alimentare sopra descritto viene quindi utilizzato come agente anti-infiammatorio.
Come tale, esso viene somministrato in un dosaggio da 500 mg a 2000 mg.
La composizione del formulato sottoposto a sperimentazione è riportata anche nella Tabella in Fig. 2.
Le cellule THP-1 sono state mantenute in terreno RPMI-1640 privo di endotossine e contenente: 5,5 mmol/l di glucosio, 50 µmol/l mercaptoetanolo, 10% di siero fetale bovino, 2 mmol/l glutammina, 1 mmol/l di sodio piruvato, 10 mmol/l HEPES.
La sperimentazione in vitro è stata condotta stimolando dette cellule TPH-1 con LPS, in quanto componente principale della membrana esterna dei batteri Gram-negativi. In questo modo si può valutare la quantità di citochine infiammatorie rilasciate e, quindi, ripetere l’esperimento aggiungendo il formulato e valutando le differenze nel rilascio di dette citochine infiammatorie.
La stimolazione in vitro, è stata eseguita mediante aggiunta di LPS [100 µg/l] per 4 ore a cellule THP-1 seminate in 12-well plate (~1×10<6 >cellule/ml) e incubate a 37°C e 5% CO2 cresciute in fiasche da 75-mm<2 >in terreno RPMI-1640 arricchito di siero fetale bovino e portate al 70% di confluenza.
Il Tumor Necrosis Factor (TNF-α) è una citochina infiammatoria ed è un polipeptide di 17 kDa prodotto principalmente da monociti e macrofagi attivati. Questo polipeptide media alcune risposte immuni ed infiammatorie, incluse l’attivazione e la differenziazione di monociti e macrofagi, l’espressione di MHC di classe I e II e l’espressione di molecole di adesione sulle cellule endoteliali.
La sperimentazione condotta prevedeva di dosare il TNF-α rilasciato a seguito della stimolazione delle cellule THP-1 con LPS. La determinazione della concentrazione di TNF-α nel terreno di coltura è stata effettuata mediante un saggio ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) (Cayman Chemical, Michigan 48108 USA), basato su una tecnica a sandwich doppio-anticorpo.
Gli effetti anti-infiammatori del trattamento con il formulato sono stati valutati utilizzando cellule THP-1 (1×10<6 >cellule/ml) stimolate con LPS [100 µg/l] per 4 ore; successivamente, la concentrazione di TNF-α eventualmente presente nel terreno di coltura cellulare è stata rilevata e quantificata.
La sperimentazione è stata condotta in tre fasi:
1 - pretrattamento delle cellule TPH-1 con il formulato;
2 - stimolazione con LPS delle cellule pretrattate con il formulato;
3 - analisi qualitativa e quantitativa dei risultati sperimentali.
Fase 1 - le cellule THP-1 (1×10<6 >cellule/ml) sono state pretrattate per 1 ora con due differenti concentrazioni di formulato:
a - [0,2 mg/ml];
b - [67 mg/ml].
La scelta della concentrazione [0,2 mg/ml] è stata determinata dal fatto che la posologia giornaliera è di 2 capsule/die per un adulto; ogni capsula contiene 500 mg di ingredienti attivi: quindi 1 g/die, che in vivo si distribuisce in circa 5 l di sangue. In vitro ciò corrisponde a [0,2 mg/ml] di formulato.
La scelta della concentrazione [67 mg/ml] è stata determinata sia dal rispetto delle precise condizioni sperimentali del modello in vitro (1×10<6 >monociti/ml terreno di coltura LPS 100 μg/l), sia dalla considerazione che in vivo, in condizioni normali, ci sono circa 10<6 >monociti per litro di sangue; quindi 0,2 g/l di formulato potenzialmente hanno effetto su 10<6 >monociti.
Fase 2 - Le cellule TPH-1 pretrattate sono state stimolate con LPS [100 µg/l] per 4 ore. Il terreno di coltura con le cellule è stato recuperato alla fine del tempo sperimentale e le cellule sono state lisate utilizzando un sonicatore. Il surnatante così ottenuto è stato poi utilizzato per le successive analisi qualitative e quantitative.
Fase 3 - Il surnatante è stato usato per quantificare il TNF-α tramite ELISA test (Tumor Necrosis Factor-α human EIA Kit, Cayman Chemical, Michigan 48108 USA). I risultati per il rilascio della citochina sono riportati per ml di surnatante.
Tutti gli esperimenti sono stati svolti in triplicato. Il test “t” di Student per dati non appaiati è stato applicato per il confronto tra le medie accettando significatività del 5%.
Risultati della sperimentazione
In Fig. 1 sono riportati i risultati della stimolazione delle cellule THP-1 con LPS, tal quali e pretrattate con il formulato.
Il livello massimo di stimolazione delle cellule THP-1 si è ottenuto trattando le stesse con LPS [100 μg/l] dopo una incubazione di 4 ore.
Nelle colonne (A) e (D) sono indicati i rilasci di citochine dalle cellule TPH-1 non stimolate con LPS (CTR-), mentre nelle colonne (B) e (E) sono indicati i rilasci di citochine da parte di due campioni di cellule stimolate con LPS, cioè il dosaggio di TNF-α rilevato su un primo e su un secondo campione di cellule TPH-1, rispettivamente.
Si può notare come la concentrazione di TNF-α rilasciato dalle cellule non stimolate (CTR-) differisca significativamente dalla concentrazione di TNF-α rilasciato dalle cellule stimolate con LPS.
Le colonne indicate con (C) ed (F) riportano il TNF-α rilasciato dopo stimolazione con LPS delle cellule THP-1 pretrattate con il formulato alle concentrazione di [0,2 mg/ml] e [67 mg/ml] rispettivamente.
Come si vede dalla Fig. 1 e dalla Tabella in Fig. 3, il formulato alla concentrazione di [0,2 mg/ml] ha inibito il rilascio di TNF-α del 6,82%, mentre alla concentrazione di [67 mg/ml] ha inibito il rilascio di TNF-α del 99,85%.
I risultati sono riportati nella Tabella in Fig. 3 come media ± Deviazione Standard (DS) da esperimenti svolti in triplicato.
Nella stessa tabella:
- Δ è la variazione percentuale calcolata tra il campione di cellule TPH-1 stimolato con LPS e pretrattato con il formulato vs il campione di cellule TPH-1 solamente stimolato con LPS;
- p è il p value, secondo la statistica di Student, calcolato tra campione stimolato con LPS e trattato con il formulato in relazione al campione stimolato con LPS;
- CTR è il controllo di sole cellule TPH-1 non trattate con LPS.
Il modello in vitro che è stato applicato ha permesso di testare due differenti concentrazioni [0,2 mg/ml] e [67 mg/ml] del formulato secondo l’invenzione.
Entrambe le concentrazioni sono state scelte tenendo in considerazione: 1) la posologia giornaliera; 2) il volume totale di sangue che è presente in un individuo adulto; 3) il numero di cellule (monociti) presenti sia in vivo in 1l di sangue sia in vitro nel modello sperimentale seguito.
La concentrazione più bassa [0,2 mg/ml] ha ridotto la concentrazione di TNF-α misurata del 6,82% e la concentrazione maggiore [67 mg/ml] ha causato una riduzione significativa di TNF-α (p=3,4*10<-10>) (Δ = 99,85%).
In accordo con il test e le condizioni sperimentali usate, si conclude che il formulato secondo l’invenzione, la cui composizione è riportata nella Tabella in Fig. 2, è in grado di inibire il rilascio di TNF-α, noto mediatore di diverse risposte immuni e infiammatorie, suggerendo una attività anti-infiammatoria del campione testato.
Nella Tabella in Fig. 2 è riportata una composizione comprendente i già citati quattro ingredienti attivi, più vari ingredienti aventi altre funzioni.
Altri test effettuati su composizioni analoghe a quella riportata nella Tabella in Fig. 2, e comprendenti uno o più degli ingredienti attivi suddetti, hanno mostrato una validità nell’inibire il rilascio di TNF-α, sia pure con minore efficacia di quella mostrata dalla composizione riportata nella Tabella in Fig. 2.
Il formulato secondo l’invenzione può essere convenientemente confezionato in capsule, per una pratica assunzione da parte del paziente.
Si è descritta una forma preferita di attuazione dell’invenzione, ma naturalmente essa è suscettibile di ulteriori modifiche e varianti nell’ambito della medesima idea inventiva. In particolare, agli esperti nel ramo risulteranno immediatamente evidenti numerose varianti e modifiche, funzionalmente equivalenti alle precedenti, che ricadono nel campo di protezione dell'invenzione come evidenziato nelle rivendicazioni allegate.

Claims (6)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Integratore alimentare, atto a ridurre il rilascio di citochine infiammatorie in pazienti nel cui organismo siano presenti cellule leucemiche del tipo TPH-1, detto rilascio essendo conseguenza della risposta di dette cellule TPH-1 ad una stimolazione con Lipopolisaccaridi (LPS), caratterizzato dal fatto di comprendere i seguenti ingredienti attivi: - Olio di semi di Buglossoides arvensis (L., I.M. Johnst) titolato in acidi grassi essenziali; - Ananas (Ananas comosus, L. MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina; - Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA); - Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni.
  2. 2. Integratore alimentare secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere i quattro ingredienti attivi suddetti, con le seguenti concentrazioni relative: - Olio di semi di Buglossoides arvensis (L., I.M. Johnst) titolato in acidi grassi essenziali: 14%; - Ananas (Ananas comosus, L. MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina: 16%; - Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA): 30%; - Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni: 40%.
  3. 3. Integratore alimentare secondo la rivendicazione 2, con l’aggiunta di: - biossido di silicio; - idrossi-propil-metilcellulosa; - DL-α Tocoferolo; - etilcellulosa; - olio Extravergine di oliva; - glicerolo; - alginato di sodio; - trigliceridi a media catena; - complessi rameici delle clorofilline; - biossido di titanio; - acido oleico; - acido stearico.
  4. 4. Integratore alimentare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di essere confezionato in capsule e di avere la seguente composizione complessiva: - Olio di semi di Buglossoides arvensis (L., I.M. Johnst) titolato in acidi grassi essenziali: 9,764%; - Ananas (Ananas comosus, L. MERR, stipites) estratto secco titolato in bromelina: 11,159%; - Boswellia (Boswellia sacra Flueck. (syn. Boswellia carteri Birdw.), resina gummi) estratto fluido titolato 4% in acido acetil-11– cheto-betaboswellico (AKBA): 20,923%; - Mirra (Commiphora myrra, Engl., oleumgummiresina) estratto fluido titolato 4% in furanodieni: 28,456%; - idrossi-propil-metilcellulosa: 12,554%; - biossido di silicio: 0,139%; - DL-α Tocoferolo: 1,395%; - etilcellulosa: 2,664%; - olio extravergine di oliva: 6,138%; - glicerolo: 0,753%; - alginato di sodio: 0,621%; - trigliceridi a media catena: 0,711%; - complessi rameici delle clorofilline: 0,446%; - biossido di titanio: 0,349%; - acido oleico: 0,307%; - acido stearico:0,006 %.
  5. 5. Uso dell’integratore alimentare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti come agente anti-infiammatorio.
  6. 6. Uso secondo la rivendicazione 5, in cui detto integratore alimentare è somministrato in un dosaggio da 500 mg a 2000 mg.
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