IT201800007589A1 - Modelli in vitro per elettroporazione - Google Patents
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Classifications
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Landscapes
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
“MODELLI IN VITRO PER L’ELETTROPO RAZIONE”
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda il campo della coltura cellulare tridimensionale e le matrici adatte alla coltura cellulare.
La presente invenzione riguarda matrici solide reticolate, i procedimenti per la loro preparazione e il loro impiego nelle colture cellulare.
STATO DELL’ARTE
L’elettrochemoterapia (ECT) è una procedura relativamente recente che combina la somministrazione di farmaci antitumorali chemioterapici meno costosi e ben-tollerati con brevi impulsi elettrici applicati localmente che generano un campo elettrico. Tale campo elettrico è in grado di permeabilizzare la membrana cellulare al fine di aumentare l’entrata nella cellula del farmaco. Questa terapia è correntemente in uso nella pratica clinica per il trattamento di differenti tipi di tumori della pelle, come le recidive sulla parete toracica del cancro al seno. Inoltre, recentemente sono stati fatti sforzi per trattare altri tipi di tumori come i sarcomi e i tumori del pancreas. Per esempio, esperienze cliniche in corso riguardanti il cancro al seno metastatico sono incoraggianti, con tassi di risposta locale completi che variano da un 50% al 90% sulle metastasi della pelle. Nonostante i risultati degli studi clinici preliminari relativi ai trattamenti ETC abbiano mostrato un’alta attività antitumorale, questa procedura ha delle limitazioni tra le quali la necessità di trattamenti multipli per raggiungere il controllo del tumore con il conseguente incremento degli effetti collaterali {dolore locale e tossicità per la pelle).
I test dell’ETC in vitro rimangono largamente dipendenti da convenzionali colture cellulari bidimensionali o da cellule sospese in soluzione salina. Ciononostante, questi sistemi mostrano una capacità limitata di mimare l’architettura tridimensionale dei tessuti oltre all’eterogenicità dei tessuti tumorali. Infatti, la diversità del tessuto tumorale è ben documentata in letteratura. Nel caso dei sarcomi dei tessuti molli la diversità istologica comprende fino a 50 sottotipi. Questi tessuti mostrano differenze nello stroma (mixoide, fibroso o necrotico) ma anche nei tipi di cellule (per esempio presenza o meno di componenti grasse). Tale eterogenicità dei tessuti influenza le caratteristiche elettriche dell’area trattata. Uno studio preliminare, condotto dagli autori tramite modelli numerici e simulazioni, ha dimostrato che l’eterogenicità del tessuto influenza l'intensità del campo elettrico locale. Gli esperimenti per studiare l’efficacia dei farmaci chemioterapici in condizioni di ETC sono generalmente effettuati su cellule coltivate in monostrato o in sospensioni (per ETC) oppure in modelli animali, anche se attualmente l’efficacia dei farmaci chemioterapici viene studiata in modelli 3D. Il genotipo disregolato della cellula cancerosa è la fase iniziale della trasformazione maligna, ma è divenuto chiaro che tutto il fenotipo del tumore è dettato dal microambiente tridimensionale del tumore. Ciononostante, lo studio della biologia del cancro e la valutazione dei farmaci nei tumori utilizzando cellule in sospensione o in colture 2D non include l’effetto della matrice extracellulare (ECM) nè i tipi di cellule che circondano il tumore in vivo.
Per superare i vincoli derivanti da colture 2D o cellule in sospensione, i modelli 3D in vitro (es. colture di sferoidi o idrogel) sono stati ampiamente studiati e sembrano imitare meglio gli effetti profondi che l'ambiente 3D in vivo ha sul fenotipo del tumore umano rispetto a quanto osservato in colture 2D monostrato. Ad esempio, negli ultimi anni alcune colture 3D come gli sferoidi (colture cellulari 3D con diametri di poche centinaia di μm , tipicamente 350-550 μm) sembravano essere più utili per simulare la condizione di ipossia nei tumori rispetto alle colture 2D. Inoltre, forniscono una migliore rappresentazione del vero ambiente tumorale poiché includono almeno l'ECM prodotta dalle cellule. Inoltre, i dosaggi citotossici di farmaci nel modello 2D generalmente sovrastimano l'efficacia del farmaco, mentre i test in modelli 3D migliorano i risultati dei test e la sensibilità ai farmaci. Altri possibili modelli 3D sono gli idrogeli in cui le cellule possono essere incorporate e coltivate: in questo caso la matrice non è strutturata.
Recentemente, sono stati pubblicati diversi studi in vitro su ECT riguardanti sferoidi e idrogeli. Gli sferoidi sono stati usati per valutare l'effetto del trattamento ECT su tumori e su cellule sane, ma non tutte le linee cellulari sono in grado di generare sferoidi. D'altro canto, le cellule incorporate negli idrogeli sperimentano un ambiente di coltura 3D, mimetico di quello in vivo, anche se solo alcuni tipi di idrogeli possono effettivamente imitare le interazioni cellula-matrice e cellulacellula.
Alcune delle matrici attualmente utilizzate nella coltura cellulare 3D contengono fibre di collagene poiché proprio il collagene è stato identificato come uno dei componenti della matrice extracellulare in alcuni tipi di tessuto (Arena CB et al. Biophysical J, 103, 2033-2042 (2012)). Al contrario, nell'approccio proposto nessuna componente di collagene è stata aggiunta alla matrice.
C'è una grande necessità di identificare un modello che permetta di studiare l'efficacia dei farmaci chemioterapici in condizioni ECT che imiti l'ambiente in vivo dei tumori dello stroma mixoide e che non richieda l'uso di modelli animali. È pertanto oggetto della presente invenzione lo sviluppo di una matrice per colture cellulari 3D che imiti l'ambiente in vivo dei tumori dello stroma mixoide e che consenta la progettazione sperimentale del trattamento elettrochemioterapico.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda una matrice macroscopica 3D come matrice per coltura cellulare in grado di imitare l'ambiente in vivo dei tumori caratterizzati da stroma mixoide. Lo stroma mixoide consiste di abbondanti sostanze di base con grandi quantità di glicosaminoglicani (acido ialuronico) e proteoglicani, povera di fibre di collagene e priva di elastina. Nella matrice 3D proposta è possibile stabilire sia le interazioni cellula-cellula che cellula-ECM tridimensionali.
La presente invenzione riguarda quindi una matrice solida reticolata comprendente almeno un peptide auto-assemblante (SAP), coniugato ad un peptide adesivo, e acido ialuronico, in cui la matrice è ottenibile mediante reticolazione con un agente reticolante scelto dal gruppo costituito di 1 -etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC), disuccinimidil suberato (DSS), solfosuccinimidil-4- (N-malimidometil) cicloesano-1 -carbossilato (Sulfo SMCC), glutaraldeide (GTA), diidazide adipica (ADH), Butanediol-diglicidil etere (BDDE), Divinil solfone (DVS) e Octenil succinic anidride (OSA).
Un ulteriore aspetto della presente invenzione è il procedimento per la preparazione di una matrice reticolata, comprendente le seguenti fasi:
a. preparare una soluzione di un peptide auto-assemblante ionicocomplementare (SAP) coniugato covalentemente con un peptide adesivo (coniugato di peptide auto-assemblante);
b. aggiungere acido ialuronico alla soluzione ottenuta nella fase a. per ottenere una seconda soluzione;
c. congelamento e liofilizzazione della seconda soluzione della faseb. per ottenere una matrice solida;
d. aggiungere un agente di reticolazione alla seconda matrice della fase c. per ottenere una matrice reticolata.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione è una matrice reticolata solida ottenibile mediante il procedimento comprendente le fasi di:
a. preparare una soluzione di coniugato di peptide auto-assemblante;
b. aggiungere acido ialuronico alla soluzione ottenuta nella fase a. per ottenere una seconda soluzione;
c. congelamento e liofilizzazione della seconda soluzione della fase b. per ottenere una matrice solida;
d. aggiungere un agente di reticolazione alla seconda matrice della fase c. per ottenere una matrice solida reticolata.
Un ancora ulteriore aspetto dell'invenzione riguarda l'uso della matrice solida reticolata secondo la presente invenzione, per le colture cellulari.
In un ancora ulteriore aspetto, l'invenzione riguarda l'uso della matrice solida reticolata, secondo la presente invenzione, per coltura cellulare 3D per elettroporazione.
Come sarà ulteriormente riportato nella descrizione dettagliata dell'invenzione, la matrice solida reticolata della presente invenzione ha il vantaggio di imitare l'ambiente in vivo dei tumori dello stroma mixoide che consentirà la progettazione sperimentale del trattamento con elettrochemioterapia e permetterà di determinare le condizioni appropriate per lo studio dell'efficacia dei farmaci chemioterapici nell'elettrochemioterapia.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata riportata di seguito, dagli esempi forniti a titolo illustrativo e non limitativo, e dalle Figure 1-9 allegate, in cui:
Figura 1. (a) elettrodo con dimensioni e (b) set-up di prova per elettroporazione.
Figura 2. Immagini SEM della matrice mixoide liofilizzata prima della reidratazione e semina cellulare. Riquadro (b) zoom della struttura del riquadro (a). Riquadro (c): analisi della dimensione dei pori nell'intervallo di (c) micrometri (media di 100 pori) e (d) nanometri (media di 350 pori). Riquadro (e): istogramma della sezione trasversale di elementi allungati, come descritto nell'Esempio 1.
Figura 3. L'attività metabolica delle cellule è stata valutata mediante MTT test in cellule MCF7 coltivate su matrici per 2 ore, 24 ore o 7 giorni, (a) conteggio delle cellule dopo 2 ore, 24 ore e 7 giorni dalla semina cellulare. * p <0,05 vs cellule seminate su pozzetto di plastica a 2 h; ° p <0.05 vs cellule seminate in matrice mixoide a 2 h. (b) rapporto della vitalità delle cellule espresso in valori percentuali rispetto alle cellule seminate su superficie di plastica (( n. di cellule su matrice mixoide) / (n. di cellule su pozzetti di plastica) x 100), come discusso nell'Esempio 2.
Figura 4. Densità cellulare a 24 ore, a 3 giorni e a 7 giorni dalla semina delle cellule sulla matrice mixoide. Valori medi con p-value = 0.0497 come descritto nell'Esempio 3.
Figura 5. Campioni istologici trattati con ematossilina ed eosina come descritto nell'Esempio 4. (a) matrice senza cellule trattata con medium per 7 giorni (ingrandimento 20x), (b) campione analizzato 24 ore dopo la semina cellulare.
Sono visibili piccoli componenti fibrosi (piccole strutture rosa scuro). Riquadro (c) mostra l’istologia di un campione analizzato 7 giorni dopo la semina cellulare. La componente fibrosa è più diffusa. Essa è evidenziata da una grande struttura più scura. Le cellule sono indicate da frecce e uno zoom è riportato nei piccoli riquadri laterali.
Figura 6. Immagini confocali di un campione analizzato (a) a 24 ore, (b) a 3 giorni e (c) a 7 giorni dopo la semina cellulare come descritto nell'Esempio 4. Campo chiaro sovrapposto all'immagine di fluorescenza verde (CFSE): la messa a fuoco sulla matrice evidenziata dal colorante CFSE. Per ciascuno step della fase è stata scelta un'immagine esplicativa tra le immagini acquisite dai 4 campioni per punto temporale. Obiettivo, 10x.
Figura 7. (a) immagine di microscopia a contrasto di fase in coltura cellulare 2D con concentrazione di cellule seminate: (a) 2 · 10<4 >cellule / cm<2>), (b) 10 · 10<4 >cellule / cm<2 >e (c) 25 · 10<4 >cellule / cm<2>.
Figura 8. Immagine in fluorescenza ottenuta da microscopia confocale (colorante CFSE) per cellule MCF 7 su matrice mixoide 3D utilizzando mezzo di cultura DMEM: (a) 24 ore, (b) 3 giorni e (c) 7 giorni dopo la semina cellulare. Per ciascun punto temporale, è stata scelta un'immagine esplicativa tra quelle acquisite dai 4 campioni per punto temporale. Obiettivo, 10x.
Figura 9. Immagini confocali di un campione analizzato a (a) 24 h, (b) 3 giorni e (c) 7 giorni dopo la semina cellulare. Il colore rosso (PI) mostra le cellule elettroporate, il colore verde (CFSE) mostra tutte le cellule. Per ogni punto temporale è stata scelta un'immagine esplicativa tra quelle acquisite dai 4 campioni per punto temporale. Obiettivo, 10x.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda quindi una matrice solida reticolata comprendente almeno un peptide auto-assemblante ionico- complementare (SAP) coniugato covalentemente con un peptide adesivo e acido ialuronico, in cui la matrice è ottenibile mediante reticolazione con un agente reticolante scelto dal gruppo costituito da 1 -Etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC), Disuccinimidil suberate (DSS), Sulfosuccinimidil-4- (N-malimidometil) cicloesano-1 -carbossilato (Sulfo SMCC), Glutaraldeide (GTA), Adipico diidrazide (ADH), Butandiolo-diglicidil etere (BDDE), Divinil solfone (DVS) e Octenil succinic anidride (OSA).
Nella presente invenzione, il termine "peptide auto-assemblante ionicocomplementare (SAP) coniugato covalentemente con un peptide adesivo" indica un SAP, come ad esempio il SAP di SEQ ID NO: 3 che dettagliatamente è un frammento di Laminina (SEQ ID NO: 2) condensato al C-terminale del SAP di SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1 è un SAP preferito.
La matrice solida reticolata o matrice macroscopica 3D per coltura cellulare mixoide della presente invenzione imita l'ambiente in vivo dei tumori dello stroma mixoide. Lo stroma mixoide consiste di abbondanti sostanze di base con grandi quantità di glicosaminoglicani (acido ialuronico) e proteoglicani, basso contenuto di fibre di collagene e assenza di elastina.
Le cellule tumorali, seminate sulla matrice solida 3D reticolata che simula lo stroma mixoide, possono vantaggiosamente stabilire sia interazioni tridimensionali cellula-cellula che cellula-ECM.
La matrice solida reticolata secondo la presente invenzione, in cui:
- detto coniugato peptidico auto-assemblante è in una quantità nell'intervallo da 0,1% a 1% in peso rispetto al peso della soluzione; e
- detto acido ialuronico è in una quantità neH'intervallo dallo 0,5% al 5% in peso rispetto al peso della soluzione.
In un aspetto preferito le quantità di coniugato di SAP e di acido ialuronico (HA) sono rispettivamente 0,12% e 3%.
In un altro aspetto, nella matrice solida reticolata secondo la presente invenzione detto coniugato SAP può essere ottenuto utilizzando differenti sequenze SAP aventi lo stesso schema amminoacidico di SEQ ID NO: 1 e aventi lunghezza da 8 a 24, preferibilmente 16 amminoacidi e una sequenza adesiva come quella di SEQ ID NO: 2 avente una lunghezza da 3 a 50, preferibilmente 5 amminoacidi di lunghezza.
In un aspetto ancora preferito, nella matrice solida reticolata secondo la presente invenzione, detto almeno un coniugato dove il SAP ha la sequenza di H-Abu-Glu-Abu-Glu-Abu-Lys-Abu-Lys-Abu- Glu-Abu-Glu-Abu-Lys-Abu-Lys-OH (SEQ ID NO: 1) e la sequenza di adesione (H-lle-Lys-Val-Ala-Val-OH, SEQ ID NO: 2) è derivata da laminina. Il frammento di Laminina è condensato al C-terminale del cSAP che provuce la SEQ ID NO: 3. Il coniugato è ammideterminale.
Per gli scopi della presente divulgazione, ciascun SAP possiede la corrispondente SEQ ID NO.1 come segue:
SEQ ID NO: 1 : corrisponde alla sequenza aminoacidica di un coniugato in cui il SAP ha la seguente sequenza
H-Abu-Glu-Abu-Glu-Abu-Lys-Abu-Lys-Abu-Glu-Abu-Glu-Abu-Lys-Abu-Lys-OH SEQ ID NO: 2 corrisponde alla sequenza amminoacidica di una sequenza di adesione derivata dalla laminina
H-lle-Lys-Val-Ala-Val-OH,
SEQ ID NO: 3. corrisponde alla sequenza amminoacidica del frammento di Laminina condensata al C-terminale della sequenza che produce il SAP, il coniugato è ammide-terminale. Questo coniugato SAP è noto come EAbuK-IKVAV.
H-Abu-Glu-Glu-Abu-Abu-Lys-Abu-Lys-Abu-Glu-Glu-Abu-Abu-Lys-Abu-Lys-lle-Lys- Val- Ala- Val-N H2
Un ulteriore aspetto della presente invenzione è un procedimento per la preparazione di una matrice solida reticolata, comprendente le fasi di:
a. preparare una soluzione di coniugato peptide SAP-adesivo;
b. aggiungere acido ialuronico alla soluzione ottenuta nella fase a. per ottenere una seconda soluzione;
c. liofilizzare la seconda soluzione della fase b. per ottenere una matrice solida; d. aggiungere un agente di reticolazione alla seconda matrice della fase c. per ottenere una matrice solida reticolata.
In un ancora ulteriore aspetto preferito, nel procedimento secondo la presente invenzione si ha una opzionale fase di liofilizzazione e. in cui la matrice solida reticolata della fase d. è liofilizzata a -20°C, mentre la liofilizzazione della fase c. è in azoto liquido.
In un aspetto preferito, nel procedimento secondo la presente invenzione detta soluzione di un coniugato tra un peptide auto-assemblante (SAP) e una sequenza adesiva della fase a. si ottiene sciogliendo uno o più peptidi autoassemblanti in un solvente in una quantità dallo 0,1% all'1% peso/peso rispetto al peso della soluzione,
in cui detto solvente è preferibilmente acqua.
In un ulteriore aspetto preferito, nel procedimento secondo la presente invenzione detto almeno un peptide coniugato SAP-adesivo della fase a. sono uguali e hanno la sequenza di SEQ ID NO: 1 condensata a SEQ ID NO: 2. In un aspetto preferito, nel procedimento secondo la presente invenzione detto acido ialuronico della fase b. è in una quantità dallo 0,5% al 5% (peso / peso) rispetto alla soluzione.
In un ancora ulteriore aspetto preferito, nel procedimento secondo la presente invenzione detto agente reticolante della fase d. è in una quantità da 10 mM a 1 M, preferibilmente da 15 mM a 0,58 M.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione è una matrice solida reticolata ottenibile mediante il procedimento comprendente le fasi di:
a. preparare una soluzione di almeno due coniugati peptidici auto-assemblanti; b. aggiungere acido ialuronico alla soluzione ottenuta nella fasea. per ottenere una seconda soluzione;
c. liofilizzare la seconda soluzione della fase b. per ottenere una matrice solida; d. aggiungere un agente di reticolazione alla seconda matrice della fase c. per ottenere una matrice solida reticolata; e la fase opzionale e. della liofilizzazione della matrice solida reticolata della fase d.
In un ancora ulteriore aspetto preferito, nel procedimento secondo la presente invenzione detta liofilizzazione opzionale della fase e., in cui la matrice solida reticolata della fase d, è liofilizzata a -20 ° C, mentre il congelamento della fase c. è in azoto liquido.
Le condizioni preferite per la liofilizzazione della matrice dopo reticolazione è a -20 °C.
In un ulteriore aspetto, l'invenzione riguarda l'uso della matrice solida reticolata secondo la presente invenzione, per coltura cellulare.
Le cellule MCF7 (linea cellulare di adenocarcinoma mammario umano) sono state seminate sulla matrice solida reticolata dell'invenzione in terreno di coltura completo. Le colture cellulari sono state incubate a 37 ° C per 24 ore, 3 giorni o 7 giorni. Alcuni campioni sono stati utilizzati per valutare la vitalità cellulare utilizzando il test 3- (4,5-dimetil-tiazolil-2) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) e altri per test di elettroporazione e analisi istologica. L'elettroporazione è stata verificata mediante l'assorbimento cellulare del colorante fluorescente ioduro di propidio.
La matrice di stroma mixoide proposto dall'invenzione mostra proliferazione cellulare e un incremento delle strutture dense aH’aumentare del tempo di coltura cellulare. Entrambe le immagini confocali e le immagini istologiche mostrano la presenza di strutture dense.
Il modello di coltura 3D proposto è promettente come ambiente favorevole per la proliferazione cellulare poiché incrementa vantaggiosamente l'adesione delle cellule compresa la generazione della propria matrice.
In un ulteriore aspetto, l'invenzione riguarda l'uso della matrice solida reticolata secondo la presente invenzione, per coltura cellulare 3D per elettroporazione. L'elettroporazione delle cellule, al fine di determinare le condizioni appropriate per lo studio dell'efficacia dei farmaci chemioterapici nell'elettrochemioterapia, viene solitamente studiata usando sospensioni cellulari o colture monostrato. Le matrici 3D per colture cellulari sono state progettate di recente per riprodurre in vitro l'ambiente complesso e multifattoriale sperimentato in vivo dalle cellule. Infatti, è noto che le colture cellulari 2D non sono in grado di simulare le interazioni complesse tra le cellule e la loro matrice extracellulare (ECM).
Recentemente, alcuni esempi di modelli 3D, come gli sferoidi, sono stati studiati anche nel campo dell'elettroporazione. Gli sferoidi sono stati proposti in studi ECT per imitare le condizioni tumorali in vivo : sono modelli 3D facili da maneggiare ma la loro sensibilità agli impulsi di campo elettrico dipende dal loro diametro e, cosa più interessante, nonostante siano rilevanti per le giunzioni intercellulari, non lo sono tanto per le interazioni cellula-ECM. La matrice solida reticolata ha il vantaggio di imitare l'ambiente in vivo dei tumori dello stroma mixoide e pertanto è usato vantaggiosamente per l'elettroporazione cellulare. La matrice solida reticolata della presente invenzione ha permesso la crescita cellulare in un intetvallo di tempo di 7 giorni. Le cellule hanno proliferato e alcune strutture sono comparse nella matrice solo in presenza di cellule. La matrice solida reticolata risulta gradita da parte delle cellule. Inoltre, l'elettroporazione delle cellule è avvenuta con successo.
Diverse forme di realizzazione e aspetti della presente invenzione, come delineato in precedenza e come rivendicato nella sezione delle rivendicazioni sottostante, trovano supporto sperimentale nei seguenti esempi.
ESEMPI
Si fa ora riferimento ai seguenti esempi, che insieme alle descrizioni precedenti illustrano alcune forme di realizzazione dell'invenzione.
Esempio1 .
Progettazione e caratterizzazione della matrice.
Poiché, nei tumori dei tessuti molli, lo stroma mixoide è paragonabile al tessuto connettivo mucoso / mixoide, con abbondante sostanza di base e poche fibre di collagene, il nostro modello considera la composizione naturale dello stroma mixoide. Infatti, abbiamo progettato una matrice mimetica dello stroma mixoide come materiale amorfo prevalentemente costituito dall'acido ialuronico. La presenza di una esigua componente proteica (collagene) è rappresentata nella nostra matrice da peptidi auto-assemblanti coniugati con una sequenza adesiva. Questo tipo di peptidi è in grado di formare idrogeli attraverso l'autoassemblaggio e di solito vengono utilizzati nell'ingegneria dei tessuti come matrice.
In generale, i modelli di matrici extracellulari sono stati ottenuti utilizzando diversi tipi di biomolecole. La matrice mixoide sintetizzata è una variante del tessuto connettivo linfatico presente nell'embrione e nel giovane adulto, ed è costituita da abbondante sostanza amorfa con grandi quantità di proteoglicani, povera di fibre di collagene e senza fibre elastiche. La sostanza fondamentale o amorfa ha le proprietà di una soluzione colloidale altamente viscosa o di un gel fluido e ha la capacità di legare quantità variabili di acqua. La sostanza amorfa è formata da proteoglicani e in una concentrazione inferiore da glicoproteine (per esempio laminina e fibronectina). Inoltre, sono presenti elevate quantità di acqua, sali inorganici, enzimi, ormoni, vitamine e quantità variabili di tropocollagene non aggregato nelle fibre.
Nel nostro modello, per simulare correttamente la matrice mixoide, sono state ottenute spugne di acido ialuronico contenenti piccole percentuali di peptidi auto-assemblanti ionico-complementari (SAPs) funzionalizzati con sequenze adesive della laminina. I peptidi ionico-complementari auto-aggreganti sono una classe molto promettente di composti che possono formare spontaneamente idrogeli in un approccio bottom-up. Questi idrogeli, estremamente ricchi di acqua, sono matrici molto promettenti per l'adesione e la crescita delle cellule. Inoltre, i peptidi ionico-complementari possono essere funzionalizzati selettivamente con sequenze proteiche adesive o fattori di crescita per imitare la componente proteica delle matrici.
La Figura 1 mostra la morfologia della matrice mixoide al microscopio (SEM) prima che venga seminata e coltivata con cellule. In entrambe le immagini, riportate in Figura 2, la matrice era asciutta e non bagnata dal terreno di coltura cellulare. In particolare, gli elementi allungati nell'idrogel hanno forma e orientamento irregolari; i pori non sono di dimensioni uniformi per tutto il campione. Il riquadro (a) di Figura 2 mostra la struttura spugnosa della matrice. Questa struttura mostra pori nell'intetvallo di μm, micropori, (Figura 2 (a) magnitudo 1000x) e alcune sotto-aree in cui i pori sono nell'intetvallo di nm (nanopori) come l'area evidenziata dal quadrato a.1 . Il riquadro (b) della Figura 1 presenta uno zoom dell'area dei nanopori (Figura 2 (b) magnitudo 5000x). I riquadri (c) e (d) sono gli istogrammi dei diametri ottenuti analizzando 100 campioni dei micropori (media 5,3 ± 2,7 μm e mediana 4,7 μm) e 250 campioni dei nanopori (media 373 ± 161 nm e mediana 360 nm).
La media della sezione trasversale misurata degli elementi allungati (110 campioni) come quelli della Figura 2 (a) è 4 pm con un intervallo da 1 ,5 pm a 10 pm e l'istogramma corrispondente è mostrato nella Figura 2 (e).
Esempio2.
Attività metabolica delle cellule.
In un primo esperimento, la tossicità cellulare dello stroma mixoide proposto è stata analizzata determinando l'attività metabolica cellulare. Le analisi MTT sono state eseguite in cellule coltivate per 2 ore, 24 ore e 7 giorni; le cellule sono state quantificate mediante una curva standard dove le cellule sono state seminatein quantità nota. La densità ottica ottenuta in ciascun saggio MTT è stata quindi tracciata sulla curva standard e il numero di cellule è stato ottenuto mediante l'equazione di regressione.
Come riportato nella Figura 3 (a), il numero di cellule a 24 ore è duplicato rispetto a 2 ore; il numero di cellule a 7 giorni è duplicato rispetto a quello ottenuto a 24 ore il che esclude qualsiasi effetto tossico della matrice di stroma mixoide. La Figura 3 (b) mostra la percentuale di cellule calcolata come (numero di cellule sulla matricemixoide) / (numero di cellule sul pozzetto di plastica) x 100 per ciascun punto temporale.
Esempio3.
Crescita cellulare
La crescita cellulare è apprezzabile osservando le immagini confocali acquisite dopo 24 ore, 3 giorni e 7 giorni dalla procedura di semina su matrice mixoide. Il numero di repliche di ciascun esperimento è 4. Il numero di cellule cresce con l'aumentare del tempo di coltura come riportato in Figura 4. La Figura 4 mostra la densità di cellule stimata in base al conteggio effettuato su tre immagini. I dati riportati sono la media valutata su tre quadrati disegnati in ciascuna immagine (come nel paragrafo 2.4.4), ripetuti per le tre matrici.Il valore p ottenuto tramite ANOVA-analisi univoca è p = 0,0497, vale a dire che la differenza tra il numero di cellule che aumenta il tempo di coltura risulta significativo. Questo suggerisce che le cellule proliferano e popolano il supporto dove sono state seminate. Inoltre, le cellule si sono infiltrate nella struttura spugnosa come è evidenziato dalloz-stack acquisite dal microscopio confocale (dati non mostrati).
Esempio 4.
Analisi istopatologica
L'analisi istologica eseguita dopo 24 ore e 7 giorni dalla semina delle cellule ha mostrato una modifica della morfologia della matrice come ad esempio si è osservato nel campione dopo 7 giorni. La Figura 5 (a) mostra la matrice tenuta in terreno di cultura per 7 giorni senza cellule. Nella Figura 5 (b) è riporata l'immagine di un campione dopo 24 ore dalla semina delle cellule e nella Figura 5 (c) un campione osservato 7 giorni dopo la semina delle cellule. Nella Figura 5 (c) è predominante una componente fibrotica che è scarsamente evidente nel campione osservato dopo 24 ore dalla semina delle cellule. Nella Figura 5 (a) non esiste alcuna struttura come quella nella Figura 5 (b) e (c). La figura 6 (a) - (c) riporta le immagini acquisite al microscopio confocale dopo 24h, 3 giorni e 7 giorni dalla semina delle cellule focalizzandosi sulla struttura della matrice. L'immagine in fluorescenza verde, che mostra le cellule, è sovrapposta all'immagine in campo chiaro che mostra la matrice in cui le cellule vengono seminate. In questo caso il verde è il colorante CFSE che evidenzia le cellule. Le immagini riportate mostrano una crescita di materiale nella matrice all'aumentare del tempo di coltura. Infatti, l'immagine acquisita 24 ore dopo la semina delle cellule mostra una struttura quasi trasparente (Figura 6 (a)); nelle immagini acquisite dopo 3 giorni (Figura 6 (b)) e 7 giorni Figura 6 (c) dalla semina delle cellule, la luce laser evidenzia che è più difficile illuminare la struttura del campione che appare più spessa. Questo fatto è stato trovato per tutti i campioni analizzati (4 campioni per ciascuna delle tre prove di esame). Da queste può essere evidenziato che 7 giorni dopo la semina delle cellule appare una matrice più complessa.
Considerando l'evoluzione temporale dell’inspessimento del materiale, gli autori ipotizzano che questo nuovo materiale sia stato deposto dalle cellule come è stato evidenziato in letteratura per culture 3D. Considerando il materiale osservato nella coltura e trattato con colorazione ematossilina ed eosina (H & E), sembra che esso sia colorato di un intenso colore rosa. Queste strutture potrebbero essere fatte di collagene o altri componenti solidi che sono colorati dall’eosina. Poiché alla matrice sintetizzata, non è stato aggiunto collagene e neppure altri componenti di base, il collagene o le altre strutture solide che appaiono progressivamente sono probabilmente deposte dalle cellule. In letteratura, è stato evidenziato che questo tipo di cellule può generare strutture collageniche, fibronectina o fibre di actina.
Esempio 5.
Morfologia delle cellule
La morfologia delle cellule osservate nella matrice 3D presentata è molto diversa rispetto alla morfologia delle stesse cellule coltivate in monostrato. Ad esempio, la Figura 6 riporta la cella in coltura cellulare 2D a diverse concentrazioni di semina ((a) 2- 10<4 >cellule/cm<2>, (b) 10- 10<4 >cellule/cm<2 >e (c) 25-10<4 >cellule/cm<2>), mentre la Figura 7 mostra le cellule in cultura 3D. In particolare, la forma delle cellule è diversa. Nella coltura 2D, le cellule sono appiattite e hanno una forma non ben rotonda, ma allungata principalmente quando la densità delle cellule è bassa (ad esempio, Figura 6). In particolare, nella Figura 7 le cellule mostrano una forma allungata con una dimensione maggiore rispetto all'altra e mostrano alcuni dendriti che si allungano dalla membrana cellulare. Questa modalità di crescita influenza il comportamento della cellula, ad esempio in termini di espressione genica. In particolare, nella cultura 2D essi mancano nell' espressione del gene a causa dell’ organizzazione specifica del tessuto. Considerando la Figura 8, in cui sono mostrate le cellule dello stroma mixoide 3D, sembra che la forma della cellula sia più regolare rispetto alla coltura 2D ed è più vicina alla forma rotonda. Quindi sembra che lo stroma 3D consenta alla cellula di mantenere una forma più regolare e simile a quella rotondeggiante così come risulta nel tessuto reale.
Esempio 6.
Esperimenti di elettroporazione
La Figura 9 riporta le immagini acquisite al microscopio confocale delle cellule coltivate in una matrice mixoide ed elettroporate. Le cellule sono state colorate con CFSE e Propidio Ioduro (PI). Queste immagini sono state prese dopo l'applicazione degli impulsi elettrici. Esse corrispondono all'elettroporazione di campioni di età 24 ore, 3 giorni e 7 giorni, rispettivamente. Le cellule elettroporate appaiono rosse poiché il colorante PI si è intercalato al DNA del nucleo.
Dalle immagini dei controlli, cioè senza l'applicazione degli impulsi di elettroporazione, ma in cui sono stati aggiunti i coloranti, CFSE e PI, sembra che la colorazione PI, se visibile, non sia intensa come quella osservata per le cellule elettroporate. Nei campioni di controllo, il verde del CFSE è prevalente. Infatti, confrontando i campioni elettroporati e non elettroporati in questi ultimi il rapporto tra le cellule verdi e quelle rosse è maggiore rispetto ai casi elettroporati (Figura 9).
Materiali e metodi
Preparazione della matrice
Materiali per la preparazione della matrice
L'acido ialuronico (MW = 100-1250 kDa) è stato acquistato presso Contipro Biotech s.r.o (Dolni Dobrouc, Rep.Ceca). L’ 1 -etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) e trietossisilano (TES) di Sigma Aldrich (Steinheim, Germania) e l'etanolo presso VWR Chemicals Prolab (Fontenay-sous-Bois, Francia). Il supporto solido, la resina Rink Amide MBHA e gli amminoacidi protetti con Fmoc sono stati acquistati da Novabiochem (Merck KGaA, Darmstadt, Germania). I reagenti di coupling 2- (1 H-Benzotriazolo-1-il) -1 , 1,3,3tetrametil uranio esafluorofosfato (HBTU) e 1 -idrossibenzotriazolo (HOBt) di Advanced Biotech (Seveso, MI, Italia). N, N-diisopropiletilammina (DIEA) e piperidina sono state acquisite da Biosolve (Leenderweg, Valkenswaard, Paesi Bassi). I solventi come N, N-dimetilformammide (DMF), l’acido trifluoroacetico (TFA), il N-metil-2-pirrolidone (NMP) e il diclorometano (DCM) sono stati acquisiti da Biosolve (Leenderweg, Valkenswaard, Paesi Bassi). I solventi per HPLC come l’acetonitrile e il TFA sono stati acquisiti da Sigma-Aldrich.
Sintesi di un SAP funzionalizzato con sequenza di adesione della laminina Il peptide è stato sintetizzato dalla chimica Fmoc standard utilizzando resina Rink Amide MBHA (0,7 mmol/g, scala 0,125 mmoli) e un sintetizzatore peptidico completamente automatizzato (Syro I, Multisynthec, Witten, Germania). Il caricamento dei primi tre aminoacidi è stato effettuato con un doppio accoppiamento, i seguenti due accoppiamenti sono stati singoli e tutti i rimanenti doppi. Dopo la deprotezione Fmoc, la resina è stata lavata con DCM ed essiccata per 1 ora sotto vuoto. Il peptide è stato sbloccato dal supporto solido con contemporanea deprotezione delle catene laterali utilizzando la seguente miscela: 0,125 mi di H2O MilliQ, 0,125 mi di TES e 4,750 mi di TFA (90 minuti sotto agitazione magnetica). Dopo lo sblocco, la resina è stata filtrata, la miscela di reazione è stata concentrata e il peptide grezzo è stato precipitato con etere etilico freddo. Il cromatogramma del peptide, purificato mediante HPLC semipreparativo, è stato effettuato nelle seguenti condizioni: colonna, Symmetry Shield C8 (5 μm, 100 À, 4.6 x 250 mm, Waters); volume di iniezione, 200 ml di soluzione peptidica 1 mg / mi; flusso, 1 ml / min; eluente A, TFA 0,05% in acqua; eluente B, TFA 0,05% in CH3CN; gradiente, da 10% B a 40% B in 30 minuti, rilevamento a 214 nm. Il tempo di ritenzione è risultato pari a 17,4 min.
Il SAP denominato EAbuK-IKVAV ha la seguente sequenza:
H-Abu-Glu-Abu-Glu-Abu-Lys-Abu-Lys-Abu-Glu-Abu-Glu-Abu-Lys-Abu-Lys-lle-Lys- Val- Ala- Val-N H2 (SEQ ID NO: 3).
Preparazione della matrice mimetica dello stroma mixoide
Il SAP (4,2 mg) è stato sciolto in 3,5 mL di acqua MilliQ sotto agitazione. L'acido ialuronico (108 mg) è stato aggiunto lentamente alla soluzione. La soluzione densa è stata suddivisa in 5 pozzetti di una chamber slide di silicone, congelata in azoto liquido e liofilizzata. Le matrici (dimensione: 8 x 10 x 5 mm) sono stati reticolate per reazione con 50 mM EDC in etanolo al 95% per 24 ore. Sono stati lavate in un bagno a ultrasuoni due volte con etanolo per 30 minuti e due volte con acqua MilliQ per 30 minuti. Infine, le matrici sono state congelate a -20 ° C e liofilizzati.
Coltura cellulare
Le MCF7 (linea cellulare cancerosa epiteliale derivata da adenocarcinoma mammario umano) sono state acquistate presso ATCC (LGC Standards, Milano, ATCC® HTB-22 ™) e coltivate in terreno DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) a cui è stato aggiunto un 10% v / v di siero fetale bovino, un 1 % di antibiotico, un 0,01 mg / mi di insulina ricombinante umana (tutti forniti da
Cultura cellulare 3D
Per il test MTT, le cellule MCF7 (3x10<5 >/ cm<2 >in 200 μL DMEM) sono state coltivate a 37 <0 >C per 2 o 24 ore in piastre a 96 pozzetti ad estremamente bassa adesione (Corning® Costar®; Sigma). Alle cellule sono stati poi aggiunti 5 mg / mL di 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazodio bromuro (MTT, Sigma) in DMEM e incubate a 37 <0 >C per ulteriori 4 ore. Le reazioni sono state interrotte aggiungendo il 10% di SDS in HCl 0,01 N e sono state analizzate 16 ore dopo misurando la densità ottica a 550 nm utilizzando un lettore di piastre
. Il rapporto di sopravvivenza cellulare è stato espresso in percentuale rispetto alle cellule seminate supporti in plastica e determinato mediante repliche di 3 matrici per ciasuno dei 3 esperimenti indipendenti.
Per esperimenti di elettroporazione, le cellule sono state staccate con 0,25% p / v di tripsina / 0,53 mM soluzione di EDTA (Gibco), centrifugate (1600 rpm, 6 min) e risospese (10<7 >/ ml) in PBS preriscaldata contenente 0,1% v / v BSA e 25 mM di esteri di succinimidil diacetato di carbossifluoresceina (CFSE; CellTrace ™ CFSE Kit di proliferazione cellulare sonda molecolare, . Dopo l'incubazione (37° C, 10 min al buio), la colorazione è stata interrotta aggiungendo 5 volumi di terreno di coltura freddo. Le cellule sono state quindi lavate, contate usando Trypan blue (Sigma), seminate (3x10<5 >/ cm<2 >in 200 pL DMEM) e coltivate a 37° C su una matrice messa in piastre ad estremamente bassa adesione per 2 ore, 3 giorni o 7 giorni prima dell'elettroporazione.
Cultura cellulare 2D
Le cellule utilizzate nelle colture cellulari 2D per i test di elettroporazione sono le stesse utilizzate nelle culture 3D. Esse sono state seminate in piastre di Petri con terreno di coltura DMEM addizionato con siero bovino fetale 10% v / v, e antibiotici standard 24 ore prima dell'ossetvazione. Le piastre di Petri sono state incubate a 37° C e al 5% di CO2. In questo esperimento, le cellule sono state coltivate a partire da tre diverse concentrazioni cellulari: 2 · 10<4 >cellule / cm<2>, 10 · 10<4 >cellule/cm<2 >e 25 · 10<4 >cellule / cm<2>.
Elettroporazione
L'elettroporazione delle cellule è stata eseguita utilizzando il generatore di impulsi elettrici EPS-02 (prodotto . Gli impulsi elettrici sono stati applicati utilizzando un elettrodo a due piastre in acciaio inossidabile con un lato di 10 mm e uno spazio tra le piastre di 7,5 mm (lunghezza della piastra 30 mm). L'elettrodo è in Figura 1 (a), dove sono evidenziate le dimensioni principali. Il pannello (b) della Figura 1 mostra il set up di prova che si adatta esattamente alla dimensione dell'elettrodo e in cui la freccia mostra l'aspetto della matrice con le cellule dopo 7 giorni, come mostrato in Figura 1.
Ogni campione è stato trattato mediante 8 impulsi elettrici rettangolari a 5 kHz con un'ampiezza di 680 V (durata dell'impulso 100 ps, periodo 200 ps, 905 V / cm) come procedure standard per ECT con elettrodi impiantati.
Il voltaggio da applicare è stato determinato in esperimenti preliminari al fine di non elettroporare in modo irreversibile le cellule (dati non mostrati).
Elettroporazione della coltura cellulare 3D
Gli esperimenti di elettroporazione sono stati condotti su cellule MCF7 caricate con CFSE coltivate su matrice per 24 ore, 3 giorni o 7 giorni e infine è stata aggiunta una soluzione PI (60 μΜ) . Come controllo, alle cellule caricate con CFSE coltivate su matrici per 24 ore, 3 giorni o 7 giorni è stata aggiunta la soluzione di PI, ma non sono state sottoposte all'elettroporazione.
Inoltre, per valutare la morfologia cellulare, le cellule caricate con CFSE coltivate su matrici per 24 ore, 3 giorni o 7 giorni sono state poste in agarosio standard 2% p/v (Agarosio Tipo l-A; Sigma) disciolto in acqua bollente. L’agarosio è stato lasciato a solidificare a temperatura ambiente e preparato per l’analisi con miroscopio confocale. Infine, le matrici incubate in DMEM per 24 ore, 3 giorni e 7 giorni ma popolate con MCF7 sono state trattate similmente per gli studi morfologici.
Il protocollo di elettroporazione prevede i seguenti passaggi:
(i) Semina dei campioni 24 ore, 3 giorni o 7 giorni prima dell'applicazione di impulsi di elettroporazione;
(ii) prelievo di un campione di matrice con cellule messe in coltura 24 ore, 3 giorni o 7 giorni prima dell'elettroporazione;
(iii) rimozione di parte del terreno di coltura (1⁄2 del volume di terreno di coltura nei pozzetti della coltura);
(iv) Spostamento della coltura cellulare in una chamber slide con pozzetti rettangolari (dimensione 11 x 8 mm, profondità 11 ,3 mm);
(v) Aggiunta del tampone di elettroporazione contenente lo Ioduro di Propidio (PI) (10 mM K2HPO4 / KH2PO4, 1 mM MgCl2 e saccarosio 250 mM pH 7.4 contenente 60 μΜ di colorante fluorescente PI propidio ioduro (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)). Il PI non è in grado di permeare la membrana della cellula viva, quindi è generalmente escluso dalle cellule vitali;
(vi) Posizionamento degli elettrodi nel tampone di elettroporazione (toccando il fondo del vetrino della chamber slide);
(vii) Applicazione di 8 impulsi elettrici;
(viii) Attesa di 2 minuti;
(ix) Rimozione di parte del tampone di elettroporazione;
(x) Spostamento della coltura cellulare in una piastra di coltura (24 pozzetti) ;
(xi) Aggiunta di nuovo mezzo di coltura, DMEM, nei pozzetti contenenti la coltura cellulare.
(xii) Osservazione del campione al microscopio confocale (set-up a fluorescenza) 1 ora dopo l'applicazione degli impulsi di tensione. I campioni di controllo sono stati trattati con entrambi i coloranti, CFSE e PI, come descritto nel protocollo, ma non sono stati applicati gli impulsi elettrici. Gli esperimenti sono stati ripetuti più volte. In particolare, sono stati analizzati due campioni a 24 ore, quattro matrici a 3 giorni e quattro matrici a 7 giorni. Elettroporazione di colture cellulari 2D
In questo esperimento sono state utilizzate le celle MCF7 caricate con CFSE. Prima di applicare gli impulsi elettrici, il mezzo di cultura è stato completamente rimosso dalle piastre di Petri. Il mezzo è stato sostituito dal tampone di elettroporazione (10 mM K2HPO4 / KH2PO4, 1 mM MgCl2 e 250 mM saccarosio pH 7,4) contenente 30 μΜ di colorante fluorescente, propidio ioduro (PI)
. Il protocollo degli impulsi elettrici per l'elettroporazione delle cellule coltivate in piastre di Petri è lo stesso utilizzato per la coltura 3D [54], Dopo l'elettroporazione delle cellule coltivate in monostrato è stato rimosso il tampone di elettroporazione e è stato aggiunto nuovo mezzo di cultura DMEM.
Valutazione dei risultati
I campioni di matrice sono stati analizzati mediante microscopia SEM, mentre le colture cellulari 3D sono state analizzate mediante test MTT, microscopio confocale e analisi istopatologica.
Microscopia elettronica a scansione
Le matrici liofilizzate sono stati ricoperte con oro mediante sputtering (EMITECHK950x Turbo Evaporator, EBSciences, EastGranby, CT) e osservate al Scanning Electron Microscopy, SEM (Cambridge Stereoscan 440 SEM, Cambridge, UK). Le immagini sono state acquisite con ingrandimenti 1000x e 5000x.
Microscopio confocale a fluorescenza
Le colture cellulari trattate mediante impulsi elettrici di elettroporazione sono state osservate al microscopio confocale a fluorescenza (Leica SP5, obiettivo 10.0x0.30 SECCO) osservando l'emissione dello ioduro di propidio (emissione rossa intorno a 612 nm, osservata tra 590 nm - 684 nm) e del CFSE (emissione verde circa 517 nm, osservati nell'intervallo 498 nm - 561 nm) fissando la lunghezza d'onda eccitante a 488 nm (laser AOTF al 32%). Le immagini sono state elaborate utilizzando il software LAS AF Lite. La profondità di osservazione era compresa tra 50 e 200 μm a seconda del campione. Sono state acquisite anche le immagini in campo chiaro. Le immagini a fluorescenza sono state sovrapposte alle immagini di campo chiaro.
Analisi istopatologica
Le matrici con le cellule sono state trattate includendole in gel di agar al 2% (Meat Liver Agar, Fluka) alla fine dell'esperimento poco prima del trattamento con formalina per ottenere un blocco macroscopico adatto per il procedimento di taglio. Dopo l'inclusione in agar i campioni sono stati fissati in formalina tamponata al 10%, incorporati in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina (H & E). Il blocco del campione è stato tagliato a fette (spessore: 3-4 pm) e posizionato su vetrini per microscopia. Le immagini istologiche sono state acquisite utilizzando Aperio ScanScope di tipo CS
. Nell'analisi istologica sono state analizzate almeno 3 matrici per i diversi intervalli di tempo di cultura (24 ore e 7 giorni).
Test MTT
L'attività metabolica delle cellule è stata valutata utilizzando l'ΜΤΤ test (3- (4,5-dimetil-tiazolo-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio bromuro). Le cellule sono state risciacquate due volte con PBS per rimuovere le cellule non aderenti e quindi incubate con 200 pi di soluzione MTT (5 mg / mi in PBS) a 37° C per 4 ore. La reazione è stata interrotta aggiungendo HCl 0,01 N in SDS 10% p / v. Poiché il test MTT valuta l'attività cellulare metabolica, per dedurre il numero di cellule è stata ottenuta una curva standard per ciascun esperimento seminando un numero noto di cellule MCF7 in piastre per coltura. Le cellule lisate sono state trasferite in piastre da 96 pozzetti per determinare l'assorbanza a 620 nm utilizzando un lettore di piastre . La percentuale di cellule è stata calcolata come rapporto tra le cellule seminate su supporto di plastica.
Caratterizzazione cellulare e analisi statistica
Il numero di celle per cm<2 >è stato ottenuto utilizzando ImageJ [58] e immagini 2D estratte dalle immagini acquisite al confocale dei campioni di colture 3D acquisite 24 ore, 3 giorni e 7 giorni dalla semina delle cellule. Le immagini 2D sono state scelte per osservare una distribuzione omogenea in cui la matrice era più sottile e non troppo denso (esempi delle colture 3D sono nel materiale supplementare). Per ogni immagine selezionata per il conteggio, sono stati disegnati tre quadrati per immagine per definire un'area di conteggio. In ognuno dei tre quadrati per immagine, è stato contato il numero di cellule. Il numero di cellule per cm<2 >è stato ricavato utilizzando l'area del quadrato selezionato. Infine, per ogni immagine sono stati valutati il numero medio di cellule per cm<2 >e la deviazione standard. Il numero di cellule in diverse fasi temporali è stato confrontato usando l’analisi ANOVA a una coda per verificare che la crescita cellulare fosse significativa.
Il diametro delle celle dei campioni 3D dopo 24 ore, 3 giorni e 7 giorni viene misurato mediante ImageJ su un'immagine 2D estratta dallo stack 3D. In particulare, sono state misurate alcune cellule per immagine. Dai diametri misurati sono stati calcolati il diametro medio e la deviazione standard.
Dalla descrizione precedente e dagli esempi sopra riportati, è evidente il vantaggio ottenuto dalla matrice solida reticolata descritta ed ottenuta secondo la presente invenzione.
Claims (10)
- Rivendicazioni 1. Una matrice solida reticolata comprendente almeno due peptidi autoassemblanti (SAP) e acido ialuronico, in cui la matrice è ottenibile mediante reticolazione con un agente reticolante scelto dal gruppo consistente in 1-Ethyl-3 (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC), Disuccinimidyl suberate (DSS), Sulfosuccinimidyl-4- (N-malimidometil) cicloesano-1-carbossilato (Sulfo SMCC), glutaraldeide (GTA), diidrazide adipica (ADH), butandiolo-diglicidil etere (BDDE), divinil solfone (DVS) e antenil succinica anidride (OSA).
- 2. La matrice solida reticolata secondo la rivendicazione 1, in cui: - detto peptide autoassemblante (SAP) è in una quantità nell'intervallo da 0,1 a 1% in peso rispetto al peso della soluzione iniziale; e - detto acido ialuronico è in una quantità nell'intervallo dallo 0,5 al 5% in peso rispetto al peso della soluzione iniziale.
- 3. La matrice solida reticolata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 2, in cui detti almeno due coniugati peptidici autoassemblanti sono uguali e hanno la sequenza di SEQ ID NO: 3.
- 4. Procedimento per la preparazione di una matrice solida reticolata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, comprendente le fasi di: a. preparare una soluzione di almeno due coniugati peptidici autoassemblanti; b. aggiungere acido ialuronico alla soluzione ottenuta nella fase a. per ottenere una seconda soluzione; c. liofilizzare della seconda soluzione della fase b. per ottenere una matrice solida; d. aggiungere un agente di reticolazione alla seconda matrice della fase c. per ottenere una matrice reticolata solida; e opzionalmente e. liofilizzare la matrice solida reticolata della fase d..
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui detta soluzione di almeno due coniugati peptidici autoassemblanti della fase a. si ottiene sciogliendo uno o più peptidi autoassemblanti in un solvente in una quantità dallo 0,1% all'1% rispetto al peso della soluzione iniziale, in cui detto solvente è preferibilmente acqua.
- 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4 o 5, in cui detti almeno due coniugati peptidici autoassemblanti della fase a. sono uguali e hanno la sequenza di SEQ ID NO: 3.
- 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 6, in cui detto acido ialuronico della fase b. è in una quantità dallo 0,5% al 5% rispetto al peso della soluzione iniziale e detto agente reticolante della fase d. è in una quantità da 15 mM a 0,58 M rispetto al peso della soluzione iniziale.
- 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui detta liofilizzazione opzionale della fase e. della matrice solida reticolata della fase d. è a -20 ° C e detta fase di liofilizzazione c. è in azoto liquido.
- 9. Una matrice solida reticolata ottenibile secondo il procedimento descritto in una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 8.
- 10. Uso della matrice solida reticolata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 o 9, per coltura cellulare, preferibilmente in cui detta coltura cellulare è per elettroporazione.
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Also Published As
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