IT201800007535A1 - Metodo per identificare intermedi - Google Patents
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Description
Metodo per identificare intermedi
DESCRIZIONE
Viene qui descritto un metodo per identificare intermedi target di ripiegamento di una proteina, adatti per essere testati come target per procedure di scoperta di farmaci. Il metodo è effettuato mediante computazione elettronica.
Stato dell’arte
Il problema di come le proteine si piegano, perché si piegano in questo modo, e in che modo è il percorso di piegamento di ciascuna proteina è codificato nella sua sequenza e struttura sono di fondamentale significato per la struttura e design delle proteine, folding e misfolding, regolazione e funzione, problemi clinici, e applicazioni industriali.
B. Nolting 1999 (Protein Folding Kinetics: Biophysical Methods, Springer, Berlin); W. A. Eaton et al. 2000(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 327); V. Daggett and A. Fersht 2003 (Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 497) descrivono i tentativi di comprendere la cinetica di ripiegamento proteico. La necessità di identificare nuovi target terapeutici da bersagliare è un bisogno sentito da lungo tempo.
Qui, è stato innanzitutto dimostrato come un nuovo approccio computazionale, in grado di identificare rilevanti percorsi del processo di ripiegamento delle proteine, si sia rivelato utile nell'identificazione di intermedi ripiegati di proteine target farmacologico, aprendo nuove strade per la scoperta di nuovi farmaci su target farmacologici non trattati in precedenza.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
L'oggetto dell'invenzione è definito dalle rivendicazioni che seguono.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
Figura 1: istogramma di frequenza delle conformazioni nel percorso di ripiegamento del PrPC umano, calcolato con l’approccio Bias Functional (BF). Le traiettorie sono state proiettate su due variabili collettive descritte nel testo: la frazione di contatti nativi Q e lo scarto quadratico medio (in inglese root-mean-squaredeviation RMSD) dalla struttura nativa (PPB codice: 1QLZ).
Figura 2: tre cluster principali (indicati come cluster C1, C2 e C3) che rappresentano le strutture più visitate negli intermedi ripiegati di PrPC.
Figura 3: regioni potenzialmente bersaglio farmacologico nell’intermedio ripiegato di Prion Protein PrP (FI-PrP).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Viene qui descritto un metodo per identificare intermedi target di ripiegamento (in inglese “folding”) di una proteina, adatti per essere testati come target per procedure di scoperta di farmaci (in inglese “drug discovery”).
Il metodo comprendente le fasi qui di seguito illustrate, che sono eseguite mediante calcolo elettronico.
Il metodo prevede una fase di modellizzare una sequenza nel tempo di eventi che definiscono un percorso di ripiegamento di una proteina, che comprende modellizzare e/o calcolare proprietà strutturali e/o energetiche e/o fisico-chimiche di uno o più stati intermedi di ripiegamento della proteina proteico lungo il percorso di ripiegamento.
Poi, il metodo comprende il passo di identificare almeno un intermedio di ripiegamento di proteina candidato, lungo il percorso di ripiegamento modellizzato, sulla base di proprietà di identificazione (comprese tra le suddette proprietà strutturali ed energetiche e/o fisico-chimiche); e il passo di selezionare uno o più intermedi target di ripiegamento di proteina, tra detti almeno un intermedio di ripiegamento di proteina candidato, sulla base di proprietà di selezione (comprese tra le suddette proprietà strutturali ed energetiche e/o fisico-chimiche).
Le proprietà di selezione sono correlate alla potenzialità di utilizzo farmacologico (in inglese “druggability”) dell’intermedio di ripiegamento di proteina.
Secondo la presente descrizione, il “percorso di ripiegamento” descrive la transizione da una proteina non ripiegata al suo stato nativo ripiegato lungo lo scorrere del tempo, cioè come una catena di aminoacidi raggiunge il suo stato termodinamicamente stabile. Secondo la presente descrizione, la potenzialità di utilizzo farmacologico (“druggability”) è la capacità di una proteina, o di un qualunque isomero conformazionale (in inglese “conformer”) di una proteina, di permettere di legarsi ad un farmaco (per esempio, una piccola molecola, qualsiasi altro composto organico, un peptide o un anticorpo), così causando potenziali benefici terapeutici per pazienti. Un isomero conformazionale è qualunque conformazione alternativa dello stesso poli-peptide. Esso riflette l’isomeria conformazionale dei poli-peptidi e il carattere statistico degli stati termodinamici delle macro-molecole.
Come notato sopra, il metodo prevede due distinte fasi di “identificare intermedi di ripiegamento di proteina candidati”, sulla base di un primo insieme di stati intermedi di ripiegamento, chiamate in questa descrizione “proprietà di identificazione”; e "selezionare intermedi target di ripiegamento di proteina”, sulla base di un secondo insieme di proprietà di stati intermedi si ripiegamento, chiamate in questa descrizione “proprietà di selezione”.
Nella parte seguente della descrizione, parecchi esempi di “proprietà di identificazione” e “proprietà di selezione” verranno illustrate. Risulterà evidente che le “proprietà di identificazione” e le “proprietà di selezione” possono essere differenti, e sono in effetti differenti nelle forme di realizzazione preferite dell’invenzione.
In accordo con una forma di realizzazione del metodo, dette proprietà di identificazione comprendono proprietà energetiche e/o fisicochimiche dell’intermedio di ripiegamento di proteina.
Secondo un’opzione implementativa di questa forma di realizzazione, le proprietà di identificazione comprendono una barriera di energia libera tra uno stato intermedio e lo stato nativo della proteina, o tra uno stato intermedio e il prossimo stato intermedio verso lo stato nativo. In questo caso, il passo di identificare comprende identificare come “intermedio di ripiegamento di proteina candidato” un intermedio caratterizzato dal fatto che la barriera di energia libera tra detto intermedio e lo stato nativo o il prossimo intermedio verso lo stato nativo è maggiore di una soglia di energia libera.
In un esempio implementativo, la soglia di energia libera è 7.5 kJ/mol.
Secondo un’altra opzione implementativa di questa forma di realizzazione, le proprietà di identificazione comprendono un periodo di vita dell’intermedio, definito come l’inverso del tasso di transizioni dall’intermedio allo stato nativo o ad un prossimo intermedio lungo il percorso di ripiegamento.
In questo caso, il metodo comprende l’ulteriore passo di stimare detto periodo di vita dell’intermedio, e il passo di identificare comprende identificare come “intermedio di ripiegamento di proteina candidato” un intermedio avente un periodo di vita più lungo di una soglia di minimo periodo di vita.
In un esempio implementativo, la soglia di periodo di vita dell’intermedio può essere almeno tre volte la emi-vita della proteina in condizioni fisiologiche.
Secondo una forma di realizzazione del metodo, il passo di identificare almeno un intermedio di ripiegamento di proteina candidato comprende identificare stati metastabili.
Considerando ora il secondo insieme di proprietà, cioè le “proprietà di selezione”, vengono forniti i seguenti dettagli.
Secondo una forma di realizzazione del metodo, le proprietà di selezione comprendono proprietà strutturali relative alla potenzialità di utilizzo farmacologico (“druggability”) dell’intermedio di ripiegamento di proteina candidato considerato. In accordo con un’altra forma di realizzazione del metodo, le proprietà di selezione comprendono parametri di scoring per identificazione di hot-spot in proteine.
Nella presente descrizione, in coerenza con una terminologia comunemente usata nella ricerca farmaceutica, un “hot-spot” è un sito su una proteina target che ha elevata propensione per un legame con un ligando e di conseguenza è potenzialmente importante per la scoperta di farmaci.
In accordo con una forma di realizzazione del metodo, il passo di selezionare comprende inoltre selezionare come intermedio target di ripiegamento di proteina un intermedio avente proprietà di selezione non presenti nello stato nativo.
Secondo un’opzione implementativa, il passo di selezionare comprende selezionare come intermedio target di ripiegamento di proteina un intermedio avente una tasca farmacologicamente accessibile (in inglese “druggable pocket”) non presente nello stato nativo.
Nella presente descrizione, in coerenza con una terminologia comunemente usata nella ricerca farmaceutica, il termine “tasca” (“pocket”) indica una regione spaziale della struttura terziaria della proteina adatta per legarsi ad una piccola molecola.
In particolare, il concetto di “tasca farmacologicamente accessibile” (“druggable pocket”) si riferisce ad uno specifico sito di legame, di una proteina target collegata ad una malattia, capace di legarsi a molecole di tipo farmaco ottenendo così una modulazione della funzione biologica della proteina.
Quando il sito di legame non è noto da una struttura 3D (per esempio, complesso proteina-ligando) o da altri dati sperimentali (per esempio mutazioni farmaco-resistenti), metodi computazionali possono essere impiegati per suggerire collocazioni probabili.
Nelle parti seguenti di questa descrizione, saranno menzionati parecchie proprietà e/o parametri e/o descrittori globali di tasca (e rispettivi valori esemplificativi) usati nel metodo descritto per caratterizzare tasche/siti di legame.
Secondo un’altra opzione implementativa, il passo di selezionare comprende selezionare come intermedio target di ripiegamento di proteina o un intermedio avente una tasca farmacologicamente accessibile caratterizzata da uno scarto quadratico medio (rootmean-square-deviation RMSD) maggiore di una soglia di scarto quadratico medio dalla tasca presente nello stato nativo.
In esempi implementativi, detta soglia di scarto quadratico medio è uguale a 2 Å (Ångström) o maggiore di 2 Å (Ångström).
In accordo con una forma di realizzazione del metodo, le proprietà di selezione comprendono la presenza di una tasca farmacologicamente accessibile nell’intermedio di ripiegamento di proteina candidato considerato, in cui la tasca farmacologicamente accessibile è definita in termini di parametri di tasca.
Secondo una forma di realizzazione del metodo, il passo di selezionare comprende le fasi di identificazione di tasche di legame, caratterizzazione di tasche di legame, e predizione della potenzialità farmacologica (“druggability”) della tasca di legame. In questo caso, il passo di selezionare comprende selezionare uno o più intermedi target di ripiegamento di proteina tra gli intermedi di ripiegamento di proteina candidati identificati, sulla base di una comparazione di detti parametri di tasca con rispettive soglie. In accordo con differenti opzioni implementative di questa forma di realizzazione, i summenzionati parametri di tasca comprendono parametri dimensionali, e/o parametri di forma, e/o parametri di posizione, e/o quoziente tra carattere idrofobico e carattere idrofilico.
In particolare, i parametri dimensionali di tasca possono comprendere volume della tasca e/o profondità della tasca e/o chiusura (in inglese “enclosure”) o esposizione (in inglese “exposure”) della tasca. Le proprietà di esposizione e chiusura forniscono una differente misura di quanto il sito sia aperto ad un solvente.
In un esempio implementativo, la soglia di volume di tasca è almeno 350 Å<3>.
In un esempio implementativo, la soglia di esposizione di tasca è inferiore a 0.49 e la soglia di chiusura di tasca è almeno 0.78. In un esempio implementativo, la soglia di profondità di tasca è almeno 13 Å.
Tra le proprietà di selezione, sono stati precedentemente menzionati parametri di scoring per identificazione di hot-spot in proteine. Rispetto a questa caratteristica, differenti forme di realizzazione del metodo prevedono che tali parametri di scoring comprendono “SiteScore”, e/o “Dscore”, e/o “DrugScore”, e/o “pocket balance”.
Questi parametri sono di per sé noti, nel campo della modellizzazione di proteine o intermedi di proteine, e sono basati su un mix di valori, relativi a differenti proprietà, atti a valutare la potenzialità di utilizzo farmacologico di uno stato nativo di una proteina o di un intermedio di ripiegamento di una proteina.
Infatti, tali parametri di scoring derivano da pacchetti software di valutazione noti.
Per esempio, SiteMap (Halgren TA (2009) “Identifying and characterizing binding sites and assessing druggability”, J Chem Inf Model 49: 377–389) predice un punteggio di sito (SiteScore) e un punteggio di “Druggability” (Dscore) attraverso una combinazione lineare di solo tre singoli descrittori: la dimensione della tasca di legame, la sua “enclosure” e una penalità per la sua idrofilia. Un altro esempio è DoGSiteScorer (A. Volkamer, D. Kuhn, T. Grombacher, F. Rippmann, M. Rarey, “Combining global and local measures for structure-based druggability predictions” J. Chem. Inf. Model. 2012,52,360-37), che genera anche un punteggio di “druggability” (DrugScore) che può variare da zero a uno.
Ovviamente, in altre forme realizzative del presente metodo, altri parametri di scoring noti possono essere usati, e/o si possono definire e adottare nuovi parametri di scoring.
La selezione, anche in questo caso, si basa sul confronto dei parametri di scoring con rispettive soglie.
In alcune forme realizzative del presente metodo, le soglie dei parametri di scoring sono scelte come segue.
In un esempio implementativo, la soglia di SiteScore di tasca è 0,8. In un esempio implementativo, la soglia di DScore di tasca è 0,98. In un esempio implementativo, la soglia di DrugScore di tasca è 0,5. In un esempio implementativo, la soglia di “pocket balance” è 1,0. Come sopra illustrato, il presente metodo fornisce proprietà da usare come base per la identificazione di intermedi di ripiegamento di proteina e la selezione di intermedi target di ripiegamento di proteina.
Inoltre, il presente metodo fornisce anche criteri per le summenzionate fasi di identificazione e selezione. Questi criteri sono basati, per esempio, su una comparazione di parametri e/o valori relativi alle proprietà scelte per la identificazione e/o selezione con rispettive soglie.
Valori esemplificativi per le soglie sono stati forniti nella descrizione sopra riportata. Ciononostante, l’esperto del settore può comprendere che il metodo non è limitato dai valori esemplificativi menzionati, poiché le soglie possono essere scelte caso per caso, a seconda del tipo di proteina o di altri requisiti. In accordo con una forma di realizzazione del metodo, il passo di modellizzare una evoluzione nel tempo di un percorso di ripiegamento di una proteina è effettuato mediante simulazioni computerizzate basate sugli approcci Molecular Mechanics (MM) o Quantum-Mechanics Molecular Mechanics (QM-MM).
Secondo differenti possibili opzioni implementative di questa forma di realizzazione, le summenzionate simulazioni computerizzate sono effettuate mediante simulazioni computerizzate basate su un approccio computazionale “Ratchet-and-pawl molecular dynamics” o per mezzo di un approccio computazionale “Self Consistent Path Sampling”.
L’esperto del settore può facilmente comprendere che i summenzionati algoritmi e approcci computazionali sono solo esempi, forniti a scopo di chiarezza della divulgazione, e che il metodo può essere effettuato usando altri algoritmi e approcci computazionali, non esplicitamente menzionati qui che forniscono lo stesso tipo di risultati.
Ulteriori dettagli su algoritmi esemplificativi che possono essere efficacemente usati per effettuare il summenzionato passo di modellizzare l’evoluzione temporale di un percorso di ripiegamento di una proteina possono essere trovati negli articoli scientifici “S. Orioli, S. a Beccara e P. Faccioli, J. Chem. Phys. 147, 064108 (2017)”; “C. Camilloni, R. A. Broglia, e G. Tiana, J. Chem. Phys.
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Viene qui di seguito descritto un metodo per scoperta “in silico” di farmaci (in inglese “in silico drug discovery”) basato su individuazione come obiettivi di intermedi di ripiegamento, compreso nell’invenzione.
Tale metodo comprende i passi di eseguire un metodo per identificare intermedi target di ripiegamento di una proteina adatti per essere testati come target per procedure di scoperta “in silico” di farmaci, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra descritte. Sulla base di ciò, il metodo per scoperta “in silico” di farmaci prevede di effettuare una procedura di scoperta “in-silico” di farmaci sugli intermedi target di ripiegamento di proteina selezionati.
Secondo una forma di realizzazione di questo metodo, il passo di effettuare una procedura di scoperta “in-silico” di farmaci su ognuno degli intermedi target di ripiegamento di proteina selezionati, in cui una tasca farmacologicamente accessibile o un “hot-spot” sono stati identificati, comprende: identificare potenziali ligandi sulla base delle proprietà dell’una o più tasche farmacologicamente accessibili o “hot-spot” identificati nell’intermedio target di ripiegamento di proteina, in cui dette una o più tasche farmacologicamente accessibili o “hot-spot” sono considerate possibili siti di legame; poi, modellizzare l’interazione di ciascuno dei ligandi identificati con ciascuno dei siti di legame identificati attraverso le simulazioni “in-silico”; infine, selezionare ligandi sulla base della suddetta modellizzazione.
In differenti opzioni implementative del metodo, può essere utilizzata, in linea di principio, qualsiasi procedura nota di scoperta “in silico” di farmaci.
La presente divulgazione comprende anche un programma per computer, comprendente almeno un’istruzione di programma, che, quando eseguita da un computer, fa sì che il computer esegua il metodo per identificare intermedi target di ripiegamento di una proteina come descritto in una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra illustrate.
La presente divulgazione comprende anche un programma per computer, comprendente almeno un’istruzione di programma, che, quando eseguita da un computer, fa sì che il computer esegua il metodo per scoperta “in-silico” di farmaci come descritto in una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra illustrate.
Ovviamente, il termine “computer” deve essere inteso, nel contesto di questa descrizione, nella sua accezione più ampia, includendo super-computer e/o cluster di computer, o qualsiasi altro tipo di elaboratore elettronico noto.
La presente divulgazione comprende anche un portante e/o mezzo e/o supporto che supporta il summenzionato programma o programmi per computer.
Nella parte seguente della descrizione, ulteriori dettagli sono forniti su forme di realizzazione esemplificative e non limitative dell'invenzione.
Le fasi indicate di seguito descrivono le azioni effettive eseguite dall'esperto durante l'esecuzione del metodo.
(i) Identificazione del bersaglio.
Le attività di identificazione e selezione dei target sono state ampiamente descritte sopra.
(ii) Identificazione del druggable pocket.
Analisi in silico di selezionati intermedi di folding candidati porta alla selezione di intermedi di folding proteico bersaglio aventi druggable pocket esposte al solvente che sono uniche negli intermedi di folding proteico selezionati e non presenti nella forma nativa della proteina.
(iii) Identificazione di piccole molecole.
In una forma di realizzazione secondo la presente invenzione, la (e) tasca (e) più alta classificata (cioè la / le mediana / e di proteina bersaglio più alta classificata) è / sono impiegata per condurre campagne virtuali di screening per identificare piccoli ligandi potenziali. A seconda dell'area / obiettivo di ricerca, sono progettate e costruite librerie chimiche virtuali ad-hoc. Approcci / strumenti computazionali disponibili nello stato dell'arte, come docking-based virtual screening, valutazione dell'affinità del ligando, dell'efficienza del ligando (LE) e dell'efficienza della lipofilicità del ligando (LLE), rimozione dei composti di interferenza Pan-Assay e dei potenziali aggregatori, valutazione delle proprietà dei composti fisico-chimici e ADMET, analisi della somiglianza e del clustering dei composti virtuali candidati promettenti.
L'approccio qui descritto e rivendicato consente di selezionare in modo efficiente i candidati più promettenti per essere poi testati in esperimenti in vitro più costosi e dispendiosi in termini di tempo.
(iv) saggio basato su cellule
Ad esempio, i ligandi predetti dallo screening virtuale sono convalidati in sistemi di cellule eterologhe stabilmente trasfettate testando la loro capacità di ridurre post-traduzione l'espressione della proteina bersaglio in modo dose-dipendente.
In linea di principio, qualsiasi composto che si leghi a un folding intermedio di una proteina con sufficiente affinità potrebbe abbassare il suo stato energetico, stabilizzando la sua struttura ed estendendo così la sua emivita. In un contesto cellulare tale effetto di stabilizzazione può produrre un intermedio di folding insolitamente longevo che potrebbe essere riconosciuto dal meccanismo di controllo del folding della cellula, impedendo la corretta aggiunta di modifiche post-traduzionali, e / o portare alla sua degradazione (ad esempio attraverso degradazione associata a proteasoma e / o autofagia). Seguendo questo principio, i ligandi candidati in silico previsti dell'intermedio di folding identificato sono testati in sistemi cellulari eterologhi standard (ad esempio cellule HEK293, CHO, SH-SY5Y o HeLa), per selezionare composti in grado di ridurre o sopprimere completamente la sua espressione generale in una modalità dose-dipendente, come testata con tecniche biochimiche standard (ad esempio western blotting). Nel caso in cui la proteina bersaglio non sia espressa endogenamente nei sistemi cellulari disponibili, i vettori di espressione sono progettati e le cellule sono transfettate stabilmente per ottenere l'espressione della proteina bersaglio.
Esempio
Le malattie da prioni sono associate alla conversione conformazionale di PrPC, una glicoproteina endogena di superficie cellulare glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI), in una isoforma malformata chiamata "scrapie form of PrP" (o PrPSc) che si accumula nel sistema nervoso centrale di persone affette. PrPSc è una proteina infettante (prion) priva di qualsiasi acido nucleico rilevabile che codifica informazioni, che si replica legandosi direttamente alla PrPC e innescando il suo riarrangiamento conformazionale in nuove molecole di PrPSc. Una grande quantità di prove indica che le informazioni necessarie che specificano le proprietà biologiche dei prioni sono codificate esclusivamente nella struttura di PrPSc e che i diversi conformeri di PrPSc potrebbero generare diverse proprietà di ceppo, incluse le caratteristiche neuropatologiche e cliniche che stanno alla base delle varie forme di malattie da prioni. Si ritiene che le mutazioni associate alla malattia nel gene PrP favoriscano il misfolding della PrPC in forme aggregate e patogene di tipo PrPSc. Nonostante queste caratteristiche peculiari, le crescenti prove derivanti da studi genetici, biofisici e biochimici indicano che i meccanismi patogenetici che operano nelle malattie da prioni possono trovarsi alla radice dei percorsi neurodegenerativi che si verificano in diversi altri disturbi. Un ampio e crescente insieme di evidenze porta alla conclusione che i composti in grado di modulare l'espressione e / o l'attività della PrPC potrebbero fornire una prospettiva terapeutica completamente nuova per diversi disturbi neurodegenerativi.
Il metodo qui descritto è stato applicato per identificare piccole molecole che mirano a un intermedio pieghevole di PrPC, quindi potenzialmente in grado di inibire post-traduzione l'espressione di PrPC.
I percorsi di ripiegamento di PrP sono stati calcolati utilizzando la procedura BF in solvente esplicito, utilizzando il campo di forza Amber ff99SB-ILDN con il modello di solvente TIP3P utilizzando Gromacs 4.6.5, dove l'approccio BF è integrato nel plug-in Plumed 2.0.2. Sono state prese in considerazione 12 conformazioni di unfolded indipendenti ottenute da simulazioni MD di unfolding termico, iniziate dalla struttura nativa di PrP ridotta all'energia. Per ognuna delle 12 condizioni iniziali dispiegate, tutte le 20 traiettorie di trial rMD generate da rMD sono state valutate valutando il loro funzionale BF. Tre serie di traiettorie sono state scartate perché nessuno dei percorsi di piegatura convergeva allo stato nativo. Usando questo schema, sono state raccolte 9 traiettorie di piegatura indipendenti, selezionando le Traiettorie con Bias minimo (LBT) secondo la procedura BF, come descritto in S. a Beccara, L. Fant, and P. Faccioli, Phys. Rev. Lett. 114, 098103 (2015).
Per cercare gli intermedi di folding candidati le traiettorie di piegatura calcolate utilizzando l'algoritmo chiamato dinamica molecolare a ratchet-and-pawl (come dettagliato in S. a Beccara, L. Fant, and P. Faccioli, Phys. Rev. Lett. 114, 098103 (2015)) è stato utilizzato per calcolare un istogramma di frequenza bidimensionale della frazione della variabile collettiva di contatti nativi Q e il RMSD dalla struttura nativa. La variabile Q di una configurazione proteica è stata ottenuta dividendo il numero di coppie di atomi in detta configurazione con una distanza relativa inferiore a 7,5 Ångström per il numero di coppie di atomi con una distanza relativa inferiore a 7,5 Ångström nella configurazione nativa.
È stata osservata l'esistenza di un intermedio di folding su percorso a 0,5 nm <RMSD <0,9 nm e uno 0,65 <Q <0,85 (vedere la Figura 1, circondata). Per estrarre le conformazioni che descrivono il percorso di piegamento ottenuto, è stato applicato un filtraggio in due fasi dei LBT:
(i) Per ogni serie di conformazioni esplorate dai LBT, sono stati mantenuti solo quelli che risiedono in regioni altamente popolate del grafico di figura 1. Per eseguire questo compito, è stato calcolato il logaritmo negativo della probabilità di osservare una data conformazione (definita in termini di Q e RMSD) e tutti i punti con una deviazione di stabilità rispetto al minimo globale superiore a 3,5 kBT (regioni long living state) sono stati esclusi.
(ii) Al fine di concentrarsi solo sulla regione di interesse, le conformazioni sono state ulteriormente filtrate conservando solo quelle che mostrano: 0,5 nm <RMSD <0,9 nm e 0,65 <Q <0,85.
Il raggruppamento delle conformazioni intermedie è stato eseguito utilizzando k-means [RStudio: Integrated Development per R. RStudio, Inc., Boston, MA]. Il numero di cluster è stato scelto utilizzando il "Metodo del gomito". La distanza della mappa dei contatti è stata utilizzata come metrica di raggruppamento. La procedura di clustering ha prodotto 3 gruppi diversamente popolati, indicati come cluster C1, C2 e C3 (vedi Figura 2). Le conformazioni campionate dal più popolato di tali cluster (C2 e C3) mostrano una elica-1 spostata, che offre un potenziale sito di legame. Per identificare una singola rappresentazione rappresentativa in ciascuno dei tre cluster (C1, C2 e C2), in primo luogo, abbiamo calcolato la mappa di contatto media all'interno del gruppo e quindi abbiamo identificato la struttura in quel gruppo in modo tale che la distanza tra la sua mappa di contatto e la mappa di contatto media nel cluster fosse minima.
La modellazione in silico e lo screening virtuale dei farmaci sono stati impiegati per identificare potenziali ligandi per FI-PrP, concentrandosi su un sito di legame unico che era presente nell'elemento rappresentativo di C3 e assente nella forma nativa di PrPC (Figura 3). In silico lo screening farmacologico su questo sito è stato eseguito secondo la seguente procedura:
1) A partire dalla conformazione rappresentativa del cluster C3, abbiamo eseguito 50 ns di dinamica molecolare (MD) nel modello del solvente esplicito a 300 K. In tale simulazione, la posizione relativa degli atomi del backbone è stata mantenuta fissa, al fine di campionare esclusivamente la disposizione delle catene laterali.
2) Le conformazioni visitate da tale traiettoria MD erano strutturalmente raggruppate in due gruppi, in quanto la traiettoria MD suggeriva la presenza di due tasche principali. Abbiamo estratto in modo casuale 10 conformazioni per ciascun gruppo.
3) Abbiamo analizzato le risultanti 20 conformazioni utilizzando Sitemap, al fine di identificare quella contenente i siti con la massima druggability.
4) La conformazione identificata nella fase precedente è stata utilizzata come target per lo screening dei farmaci, utilizzando la libreria commerciale Asinex, che comprende circa 250.000 piccole molecole.
5) Il risultato di tale screening virtuale è stato filtrato in base alla farmacodinamica e alla farmacocinetica previste, portando a un pool finale costituito da 275 hit virtuali. A scopo illustrativo, riportiamo qui la struttura chimica del candidato farmaco in questo gruppo che si prevede abbia la massima affinità di legame:
In linea di principio, qualsiasi composto che si leghi a un intermedio pieghevole di una proteina con sufficiente affinità potrebbe abbassare il suo stato energetico, stabilizzando la sua struttura ed estendendo così la sua emivita. In un contesto cellulare, per proteine sintetizzate direttamente nel lume del reticolo endoplasmatico (ER), come PrPC, tale effetto di stabilizzazione può produrre un intermedio di piegatura insolitamente longevo che potrebbe essere riconosciuto dal macchinario ERQC (controllo di qualità ER), impedendo l'aggiunta corretta di modifiche post-traduzionali e che potrebbero portare a una degradazione (ad es. degradazione associata a ER e / o autofagia). Seguendo questo principio, i presunti ligandi di FI-PrP identificati mediante il protocollo di screening proposto possono essere testati per la loro capacità di indurre la degradazione e / o alterare l'elaborazione post-traduzionale di PrPC wild-type (WT) espressa in trasfezione stabile in cellule HEK293. Innanzitutto, le cellule devono essere incubate con concentrazioni crescenti (indicativamente 0,01-50 μM) di ciascuna molecola. Quindi, il livello risultante di espressione di PrPC dovrebbe essere analizzato mediante western blotting. Si prevede che piccole molecole con elevata affinità inducano una diminuzione dose-dipendente dell'espressione cellulare PrP.
FIGURE – LEGENDA
FIG.1
Folding intermediate = Intermedio di Folding, ovvero intermedio di ripiegamento
RMSD to Native = RMSD dalla struttura nativa
Fraction of Native Contacts Q = Frazione dei contatti nativi Q
Claims (20)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per identificare intermedi target di ripiegamento di una proteina adatti per essere testati come target per procedure di scoperta di farmaci, il metodo comprendente le seguenti fasi, eseguite mediante calcolo elettronico: - modellizzare una sequenza nel tempo di eventi che definiscono un percorso di ripiegamento di una proteina, comprendente modellizzare e/o calcolare proprietà strutturali e/o energetiche e/o fisico-chimiche di uno o più stati intermedi di ripiegamento della proteina proteico lungo detto percorso di ripiegamento; - identificare almeno un intermedio di ripiegamento di proteina candidato, lungo il percorso di ripiegamento modellizzato, sulla base di proprietà di identificazione, tra dette proprietà strutturali ed energetiche e/o fisico-chimiche; - selezionare uno o più intermedi target di ripiegamento di proteina, tra detti almeno un intermedio di ripiegamento di proteina candidato, sulla base di proprietà di selezione, tra dette proprietà strutturali ed energetiche e/o fisico-chimiche, dette proprietà di selezione essendo correlate alla potenzialità di utilizzo farmacologico dell’intermedio di ripiegamento di proteina.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui dette proprietà di identificazione comprendono proprietà energetiche e/o fisicochimiche dell’intermedio di ripiegamento di proteina.
- 3. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, in cui dette proprietà di selezione comprendono: - proprietà strutturali relative alla potenzialità di utilizzo farmacologico dell’intermedio di ripiegamento di proteina candidato considerato, e/o - parametri di scoring per identificazione di hot-spot in proteine.
- 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui il passo di selezionare comprende inoltre: - selezionare come intermedio target di ripiegamento di proteina un intermedio avente proprietà di selezione non presenti nello stato nativo.
- 5. Metodo la rivendicazione 4, in cui il passo di selezionare comprende: selezionare come intermedio target di ripiegamento di proteina un intermedio avente una tasca farmacologicamente accessibile non presente nello stato nativo, o un intermedio avente una tasca farmacologicamente accessibile caratterizzata da uno scarto quadratico medio maggiore di una soglia di scarto quadratico medio dalla tasca presente nello stato nativo.
- 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui: dette proprietà di identificazione comprendono una barriera di energia libera tra uno stato intermedio e lo stato nativo della proteina, o tra uno stato intermedio e il prossimo stato intermedio verso lo stato nativo, e detto passo di identificare comprende identificare come intermedio di ripiegamento di proteina candidato un intermedio caratterizzato dal fatto che la barriera di energia libera tra detto intermedio e lo stato nativo o il prossimo intermedio verso lo stato nativo è maggiore di una soglia di energia libera.
- 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente inoltre: - stimare un periodo di vita dell’intermedio, definito come l’inverso del tasso di transizioni dall’intermedio allo stato nativo o ad un prossimo intermedio lungo il percorso di ripiegamento; in cui detto passo di identificare comprende identificare come intermedio di ripiegamento di proteina candidato un intermedio avente un periodo di vita più lungo di una soglia di minimo periodo di vita.
- 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto passo di identificare almeno un intermedio di ripiegamento di proteina candidato comprende identificare stati metastabili.
- 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui: dette proprietà di selezione comprendono la presenza di una tasca farmacologicamente accessibile nell’intermedio di ripiegamento di proteina candidato considerato, in cui la tasca farmacologicamente accessibile è definita in termini di parametri di tasca, e detto passo di selezionare comprende selezionare uno o più intermedi target di ripiegamento di proteina tra gli intermedi di ripiegamento di proteina candidati identificati, sulla base di una comparazione di detti parametri di tasca con rispettive soglie.
- 10. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui detti parametri di tasca comprendono parametri dimensionali, e/o parametri di forma, e/o parametri di posizione, e/o quoziente tra carattere idrofobico e carattere idrofilico.
- 11. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui detti parametri dimensionali di tasca comprendono volume della tasca e/o profondità della tasca e/o chiusura o esposizione della tasca.
- 12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 3-11, in cui detti parametri di scoring comprendono “SiteScore”, e/o “Dscore”, e/o “DrugScore”, e/o “pocket balance”.
- 13. Metodo secondo la rivendicazione 5 o 6 o 7 o 11 o 12, in cui: - detta soglia di energia libera è 7.5 kJ/mol; e/o - detta soglia di periodo di vita dell’intermedio è almeno tre volte la emi-vita della proteina in condizioni fisiologiche; e/o - detta soglia di scarto quadratico medio è uguale a o maggiore di 2 Å ; e/o - detta soglia di volume di tasca è almeno 350 Å<3>; e/o - detta soglia di profondità di tasca è almeno 13 Å; e/o - detta soglia di esposizione di tasca è 0.49; e/o - detta soglia di chiusura di tasca è ≥ 0.78; e/o - detta soglia di SiteScore di tasca è ≥ 0,8; e/o - detta soglia di DScore di tasca è ≥ 0,98; e/o - detta soglia di DrugScore di tasca è ≥ 0,5. - detta soglia di “pocket balance” è ≥ 1.
- 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il passo di modellizzare una evoluzione nel tempo di un percorso di ripiegamento di una proteina è effettuato mediante simulazioni computerizzate basate sugli approcci Molecular Mechanics (MM) o Quantum-Mechanics Molecular Mechanics (QM-MM).
- 15. Metodo secondo la rivendicazione 14, in cui detto passo di modellizzare una evoluzione nel tempo di un percorso di ripiegamento di una proteina è effettuato mediante simulazioni computerizzate basate su un approccio computazionale “Ratchet-and-pawl molecular dynamics” o per mezzo di un approccio computazionale “Self Consistent Path Sampling”.
- 16. Metodo per scoperta “in silico” di farmaci basato su individuazione come obiettivi di intermedi di ripiegamento, comprendente: - eseguire un metodo per identificare intermedi target di ripiegamento di una proteina adatti per essere testati come target per procedure di scoperta “in silico” di farmaci, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15; - effettuare una procedura di scoperta “in-silico” di farmaci sugli intermedi target di ripiegamento di proteina selezionati.
- 17. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui il passo di effettuare una procedura di scoperta “in-silico” di farmaci su ognuno degli intermedi target di ripiegamento di proteina selezionati, in cui una tasca farmacologicamente accessibile o un “hot-spot” sono stati identificati, comprende: - identificare potenziali ligandi sulla base delle proprietà dell’una o più tasche farmacologicamente accessibili o “hot-spot” identificati in detto intermedio target di ripiegamento di proteina, dette una o più tasche farmacologicamente accessibili o “hot-spot” essendo considerate possibili siti di legame; - modellizzare l’interazione di ciascuno dei ligandi identificati con ciascuno dei siti di legame identificati attraverso le simulazioni “in-silico”; - selezionare ligandi sulla base di detta modellizzazione.
- 18. Programma per computer, comprendente almeno un’istruzione di programma, che, quando eseguita da un computer, fa sì che il computer esegua il metodo per identificare intermedi target di ripiegamento di una proteina come rivendicato in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15.
- 19. Programma per computer, comprendente almeno un’istruzione di programma, che, quando eseguita da un computer, fa sì che il computer esegua il metodo per scoperta “in-silico” di farmaci come rivendicato in una qualsiasi delle rivendicazioni da 16 a 17.
- 20. Supporto per il programma per computer come rivendicato nella rivendicazione 19 o nella rivendicazione 20.
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| US20130130294A1 (en) * | 2010-07-05 | 2013-05-23 | Sigeng Han | Novel method for characterizing and multi-dimensionally representing the folding process of proteins |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANATHE O. M. PATSCHULL ET AL: "In Silico Assessment of Potential Druggable Pockets on the Surface of [alpha]1-Antitrypsin Conformers", PLOS ONE, vol. 7, no. 5, 8 May 2012 (2012-05-08), pages e36612, XP055262913, DOI: 10.1371/journal.pone.0036612 * |
| ZHENG XILIANG ET AL: "Pocket-Based Drug Design: Exploring Pocket Space", THE AAPS JOURNAL, SPRINGER US, BOSTON, vol. 15, no. 1, 22 November 2012 (2012-11-22), pages 228 - 241, XP035719344, DOI: 10.1208/S12248-012-9426-6 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210313007A1 (en) | 2021-10-07 |
| KR20210035850A (ko) | 2021-04-01 |
| IL280423A (en) | 2021-03-25 |
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| CN112703559A (zh) | 2021-04-23 |
| EP3827433A1 (en) | 2021-06-02 |
| WO2020021493A1 (en) | 2020-01-30 |
| JP7441837B2 (ja) | 2024-03-01 |
| CA3107408A1 (en) | 2020-01-30 |
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