IT201800004527A1 - NON-INVASIVE METHOD FOR PRENATAL DNA STUDY OF THE FETUS - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione avente per titolo: Description of the invention entitled:
“METODO NON INVASIVO PER LO STUDIO PRENATALE DEL DNA DEL FETO” "NON-INVASIVE METHOD FOR THE PRENATAL STUDY OF THE DNA OF THE FETUS"
Descrizione Description
Campo della tecnica Field of technique
La presente invenzione si riferisce al campo della diagnosi genetica e della medicina diagnostica prenatale non invasiva. Più in dettaglio la presente invenzione si riferisce ad un innovato metodo di analisi prenatale non invasiva per la determinazione del rischio di presenza di anomalie a carico dei cromosomi presenti nel DNA fetale in un campione di sangue materno previamente prelevato. Ancor più dettagliatamente la presente invenzione si riferisce all’utilizzo nel detto metodo di una peculiare piattaforma per digital PCR per l’ottenimento di risultati ancor più affidabili rispetto ai test convenzionali. The present invention relates to the field of genetic diagnosis and non-invasive prenatal diagnostic medicine. More in detail, the present invention refers to an innovative method of non-invasive prenatal analysis for determining the risk of the presence of anomalies affecting the chromosomes present in the fetal DNA in a previously drawn maternal blood sample. Even more in detail, the present invention refers to the use in said method of a particular platform for digital PCR to obtain even more reliable results than conventional tests.
Arte nota Known art
Il NIPT (Non Invasive Prenatal Test) è un test predittivo e non diagnostico effettuato mediante un prelievo di sangue materno basato sull’identificazione nel sangue materno prelevato di frammenti del DNA fetale e sulla lettura e analisi delle loro sequenze. In alcuni casi (4-5%) il materiale genetico di origine fetale estratto risulta troppo scarso e l’esame non è pertanto eseguibile. La lettura del DNA fetale, oltre a rivelare il sesso del nascituro, oggi, per la maggior parte dei test attualmente in commercio, permette di riconoscere la presenza di anomalie cromosomiche (errori nel numero di cromosomi), in particolare per il cromosoma 21 (sindrome di Down), e per le altre trisomie più comuni (cromosomi 13, Patau, e 18, Edwards). Il NIPT è un esame che può essere eseguito a partire dalla decima settimana di gestazione, presenta un’elevata attendibilità ma variabile sulla base dei tanti test commerciali oggi offerti. La percentuale dei falsi positivi è bassa, attestata tra lo 0,1 e lo 0,5%. Il test non è diagnostico (ovvero il suo risultato non può essere considerato definitivo, principalmente perché alcune possibili differenze tra il DNA del feto e della parte fetale della placenta possono introdurre degli errori) ma è utilissimo per individuare le donne ad alto rischio di avere un bimbo con malattie cromosomiche. Un eventuale risultato positivo del Test sul DNA libero rende necessari esami di diagnostica prenatale invasivi, ovvero amniocentesi o villocentesi. The NIPT (Non Invasive Prenatal Test) is a predictive and non-diagnostic test carried out by taking maternal blood based on the identification of fetal DNA fragments in the maternal blood taken and on the reading and analysis of their sequences. In some cases (4-5%) the genetic material of fetal origin extracted is too scarce and the examination is therefore not executable. The reading of the fetal DNA, in addition to revealing the sex of the unborn child, today, for most of the tests currently on the market, allows to recognize the presence of chromosomal anomalies (errors in the number of chromosomes), in particular for chromosome 21 (syndrome of Down), and for the other more common trisomies (chromosomes 13, Patau, and 18, Edwards). The NIPT is an exam that can be performed starting from the tenth week of gestation, it has a high reliability but variable based on the many commercial tests offered today. The percentage of false positives is low, ranging between 0.1 and 0.5%. The test is not diagnostic (i.e. its result cannot be considered definitive, mainly because some possible differences between the DNA of the fetus and the fetal part of the placenta can introduce errors) but it is very useful for identifying women at high risk of having a baby with chromosomal diseases. A positive free DNA test result requires invasive prenatal diagnostic tests, i.e. amniocentesis or CVS.
Il test del DNA fetale presenta alcuni limiti che riguardano la sensibilità (capacità di riconoscere la patologia se presente) e la specificità (capacità di non dare falsi positivi) del test. Dati questi che non sono elevati per tutti i cromosomi. The fetal DNA test has some limitations regarding the sensitivity (ability to recognize the pathology if present) and the specificity (ability not to give false positives) of the test. These data are not elevated for all chromosomes.
La maggior parte dei test di NIPT presenti in commercio, in tutto il mondo, sono caratterizzati, in linea generale, dai seguenti principali limiti: Most of the NIPT tests present on the market, all over the world, are generally characterized by the following main limitations:
Sensibilità non elevata per tutti i cromosomi: attualmente, i NIPT identificano circa il 50% delle anomalie identificate di routine con la diagnosi prenatale invasiva. Low sensitivity for all chromosomes: Currently, NIPTs identify about 50% of abnormalities routinely identified with invasive prenatal diagnosis.
● Il test non distingue tutte le possibili aneuploidie (presenza di specifici cromosomi in numero anormale). ● The test does not distinguish all possible aneuploidies (presence of specific chromosomes in abnormal numbers).
● Presenza (seppur con bassa frequenza) di falsi positivi e negativi. ● Presence (albeit with low frequency) of false positives and negatives.
● Il risultato del test è condizionato dalla quantità di DNA fetale presente nel plasma materno, che deve essere superiore al 5%. ● The test result is affected by the amount of fetal DNA present in the maternal plasma, which must be greater than 5%.
● Nei casi di gravidanza gemellare non è possibile distinguere la condizione del singolo feto. ● In cases of twin pregnancy it is not possible to distinguish the condition of the single fetus.
● La diagnosi di certezza delle aneuploidie fetali può dunque essere ottenuta esclusivamente con l’amniocentesi o la villocentesi. ● The diagnosis of certainty of fetal aneuploidy can therefore only be obtained with amniocentesis or CVS.
Le Società Scientifiche Internazionali ritengono che i test prenatali non invasivi debbano essere eseguiti in laboratori selezionati, accreditati per le attività di Genetica Medica e qualificati a svolgere tali indagini. Il test va considerato un metodo di “screening avanzato” per la valutazione del rischio di trisomie. The International Scientific Societies believe that non-invasive prenatal tests should be performed in selected laboratories, accredited for Medical Genetics activities and qualified to carry out such investigations. The test should be considered an "advanced screening" method for assessing the risk of trisomies.
Da alcuni decenni sono stati portati avanti molti progetti di ricerca finalizzati allo sviluppo di procedure non invasive, con l’intento di ridurre i rischi per il feto e di anticipare i tempi della diagnosi prenatale. Sulla base di questi progetti si era ampiamente dimostrato che sin dalle prime settimane di gravidanza era possibile rilevare nel circolo ematico materno la presenza di cellule fetali intatte e di DNA libero di origine fetale (cffDNA, cell-free fetal DNA) e che questa fonte di materiale genetico fetale poteva essere utilizzata per la diagnosi prenatale non invasiva (NIPT Non Invasive Prenatal Testing). Il DNA fetale costituisce una frazione variabile generalmente compresa tra il 3 e il 20% del DNA totale extracellulare rilevabile nel circolo materno, ha una concentrazione che tende ad aumentare progressivamente nel corso della gravidanza e può variare in presenza di aneuploidie fetali (diminuisce in trisomie 13 e 18, aumenta nella trisomia 21); esso è presente sotto forma di frammenti di dimensioni ridotte rispetto a quelli che costituiscono la frazione materna. La placenta e, in particolare, le cellule del sincizio trofoblasto in apoptosi, sono la fonte principale di cffDNA <[3, 4] >il quale è poi completamente rimosso dalla circolazione materna, probabilmente attraverso l’escrezione renale, entro poche ore dal parto <[5]>. Un punto critico dell’analisi del cffDNA è che esso rappresenta, in media, il 10% del DNA totale estratto dal plasma, mentre la frazione predominante è rappresentata dal DNA materno. Nonostante questi limiti, diversi studi hanno dimostrato come, attraverso l’utilizzo di tecnologie a elevata sensibilità (digital PCR, Massively Parallel Sequencing – MPS – sull’intero genoma o su sequenze target, SNP-based NGS, Digital Analisys of Selected Regions - DANSR) e l’applicazione di algoritmi dedicati, sia possibile eseguire il test di screening prenatale delle più comuni aneuploidie fetali (trisomia dei cromosomi 21, 13 e 18, aneuploidie dei cromosomi sessuali). Il test di screening prenatale non invasivo basato sull’analisi del DNA libero circolante nel plasma materno ha rappresentato finora un metodo accurato per la determinazione del rischio di aneuploidie fetali a carico dei cromosomi 21, 18 e 13. Per lo screening della trisomia 21 (T21) in donne a rischio aumentato il test presenta l’attendibilità maggiore, con sensibilità e specificità superiori al 99% (in particolare 99,3% riferita ai falsi negativi e 99,8% ai falsi positivi). Tali dati sono molto consistenti e suffragati da ampia letteratura scientifica. Nelle donne a rischio aumentato un’attendibilità di poco inferiore è stata riportata per l’identificazione della trisomia del cromosoma 18 (T18, sensibilità 97,4%, specificità 99,8%), sensibilmente inferiore per la trisomia del cromosoma 13 (T13, sensibilità 91,6%, specificità 99,8%), e per le aneuploidie dei cromosomi sessuali (sensibilità 91%, specificità 99,6%). Il passo successivo era stato quello di proporre il test alle più frequenti microdelezioni (es. microdelezioni 22q11) ma questi test non sono stati ancora validati in trials clinici. For several decades, many research projects have been carried out aimed at developing non-invasive procedures, with the aim of reducing the risks for the fetus and anticipating the timing of prenatal diagnosis. On the basis of these projects it was widely demonstrated that from the first weeks of pregnancy it was possible to detect in the maternal bloodstream the presence of intact fetal cells and free DNA of fetal origin (cffDNA, cell-free fetal DNA) and that this source of fetal genetic material could be used for non-invasive prenatal diagnosis (NIPT Non Invasive Prenatal Testing). Fetal DNA constitutes a variable fraction generally between 3 and 20% of the total extracellular DNA detectable in the maternal circulation, has a concentration that tends to increase progressively during pregnancy and can vary in the presence of fetal aneuploidies (decreases in trisomies 13 and 18, increases in trisomy 21); it is present in the form of fragments of reduced size compared to those that make up the maternal fraction. The placenta and, in particular, the syncytium trophoblast cells in apoptosis, are the main source of cffDNA <[3, 4]> which is then completely removed from the maternal circulation, probably through renal excretion, within a few hours of delivery. <[5]>. A critical point of the analysis of cffDNA is that it represents, on average, 10% of the total DNA extracted from the plasma, while the predominant fraction is represented by maternal DNA. Despite these limitations, several studies have shown how, through the use of highly sensitive technologies (digital PCR, Massively Parallel Sequencing - MPS - on the whole genome or on target sequences, SNP-based NGS, Digital Analysis of Selected Regions - DANSR ) and the application of dedicated algorithms, it is possible to perform the prenatal screening test of the most common fetal aneuploidies (trisomy of chromosomes 21, 13 and 18, aneuploidy of sex chromosomes). The non-invasive prenatal screening test based on the analysis of free DNA circulating in maternal plasma has so far represented an accurate method for determining the risk of fetal aneuploidy affecting chromosomes 21, 18 and 13. For the screening of trisomy 21 (T21 ) in women at increased risk the test has the highest reliability, with sensitivity and specificity higher than 99% (in particular 99.3% referring to false negatives and 99.8% to false positives). These data are very consistent and supported by extensive scientific literature. In women at increased risk, a slightly lower reliability has been reported for the identification of the trisomy of chromosome 18 (T18, sensitivity 97.4%, specificity 99.8%), significantly lower for the trisomy of chromosome 13 (T13, sensitivity 91.6%, specificity 99.8%), and for sex chromosome aneuploidies (sensitivity 91%, specificity 99.6%). The next step was to propose the test to the most frequent microdeletions (eg 22q11 microdeletions) but these tests have not yet been validated in clinical trials.
Attualmente valgono le seguenti raccomandazioni in merito alla somministrazione del test di NIPT nella popolazione di gravide: The following recommendations currently apply regarding the administration of the NIPT test in the pregnant population:
- Nei casi positivi è quindi fondamentale una conferma con il test invasivo, preferenzialmente attraverso prelievo di liquido amniotico; - In positive cases, confirmation with the invasive test is therefore essential, preferably through the collection of amniotic fluid;
- Nei casi di gravidanza gemellare non è possibile distinguere la condizione del singolo feto; - In cases of twin pregnancy it is not possible to distinguish the condition of the single fetus;
- Il test non è raccomandato in caso di anomalie fetali strutturali evidenziate ecograficamente; - The test is not recommended in case of structural fetal abnormalities evidenced by ultrasound;
- Il test non è attualmente raccomandato per lo screening di microdelezioni; - Il risultato del test è condizionato dalla quantità percentuale di DNA fetale presente nel plasma che deve essere superiore al 3-4% <[6]>, quantità inferiori possono esitare in risultati falsi negativi. La quantità relativa di DNA fetale risulta ridotta in particolari condizioni quali età gestazionale inferiore alla 10a settimana ed un indice di massa corporea materna elevato; - The test is currently not recommended for the screening of microdeletions; - The test result is conditioned by the percentage of fetal DNA present in the plasma which must be higher than 3-4% <[6]>, lower quantities can lead to false negative results. The relative quantity of fetal DNA is reduced in particular conditions such as gestational age less than 10 weeks and a high maternal body mass index;
- L’esame ha un rischio globale di fallimento di circa 1-4%, a seconda delle casistiche, dovuto a basse percentuali di DNA fetale o ad altre cause. - The exam has an overall risk of failure of about 1-4%, depending on the case, due to low percentages of fetal DNA or other causes.
Poiché la percentuale di aneuploidie riscontrate nelle gravidanze con risultato inconclusivo o non interpretabile si aggira intorno al 23% (ACOG 2015), nelle donne normopeso sarebbe opportuno che risultati di bassa frazione fetale o risultati non conclusivi, ottenuti su due prelievi distinti, eseguiti ad almeno una settimana di distanza l’uno dall’altro, e pertanto riconducibili a cause biologiche, venissero gestiti nell’ambito di una consulenza genetica volta a valutare un eventuale rischio aumentato di aneuploidie e una conseguente strategia di approfondimento diagnostico. Per tutti questi motivi il test non invasivo, secondo le linee guida scientifiche più accreditate, può essere collocato al momento all’interno del percorso degli screening prenatali nelle coppie a rischio aumentato, preceduto e seguito da consulenza genetica, con l’intento di aumentare in maniera considerevole l’efficienza diagnostica del percorso “combinato”. In questo contesto rappresenta un importante ausilio agli altri test ecografici e biochimici, che svolgono comunque una funzione al momento non sostituibile. In particolare, potrebbe rivelarsi di rilevante utilità nell’evitare la diagnosi invasiva nei casi in cui lo screening prenatale convenzionale definisse un rischio aumentato dovuto a un risultato “falso positivo”, evento che si verifica nel 5% dei casi e/o quando la coppia a rischio aumentato fosse contraria all’esecuzione di test invasivi. I criteri di inclusione nel rischio aumentato possono essere rappresentati da età materna maggiore di 35 anni, segni ecografici che depongono per un rischio aumentato di aneuploidie, risultato positivo del test di screening convenzionale (BI-test), precedenti gravidanze con feto trisomico, traslocazioni bilanciate nei genitori che predispongono a trisomie T 13 e T 21. Dal momento che si tratta di test di screening che sono in grado esclusivamente di fornire una predizione di rischio, secondo le indicazioni della comunità scientifica internazionale eventuali risultati positivi devono essere confermati mediante diagnosi prenatale invasiva e nessuna decisione in merito alla gravidanza deve essere presa sulla base esclusiva del risultato dell’indagine NIPT. In caso di risultato negativo, quando si richiede il limitato tipo di anomalie cromosomiche che sono oggetto del test (T21, T18 e T13), questo deve essere sottolineato che il test non identifica tutte le anomalie cromosomiche. Dal momento che il test non è in grado di fornire informazioni sull’eventuale presenza di difetti del tubo neurale o altri difetti congeniti o anomalie cromosomiche strutturali, sarebbe opportuno che questo test venisse offerto nell’ambito di un percorso assistito di gravidanza volto alla valutazione dello stato complessivo di salute del feto e della madre. La semplicità di accesso, attraverso un prelievo venoso, rende il test molto popolare ed un uso improprio o un abuso molto probabile. Pertanto è compito del consulente specialista in genetica medica individuare i casi in cui esso è appropriato e rendere questo concetto chiaro ai richiedenti. Durante la consulenza genetica pre-test risulta necessario chiarire che: Since the percentage of aneuploidy found in pregnancies with an inconclusive or uninterpretable result is around 23% (ACOG 2015), in normal-weight women it would be advisable that results of low fetal fraction or inconclusive results, obtained on two distinct samples, performed at least a week apart from each other, and therefore attributable to biological causes, were managed as part of a genetic consultation aimed at assessing a possible increased risk of aneuploidy and a consequent strategy of diagnostic investigation. For all these reasons, the non-invasive test, according to the most accredited scientific guidelines, can currently be placed within the path of prenatal screening in couples at increased risk, preceded and followed by genetic counseling, with the aim of increasing considerably the diagnostic efficiency of the "combined" path. In this context it represents an important aid to the other ultrasound and biochemical tests, which in any case perform a function that is currently not replaceable. In particular, it could prove to be of relevant utility in avoiding invasive diagnosis in cases where conventional prenatal screening defines an increased risk due to a "false positive" result, an event that occurs in 5% of cases and / or when the couple at increased risk was opposed to performing invasive tests. The criteria for inclusion in the increased risk may be represented by maternal age greater than 35 years, ultrasound signs that indicate an increased risk of aneuploidy, positive result of the conventional screening test (BI-test), previous pregnancies with trisomic fetus, balanced translocations in parents predisposing to trisomies T 13 and T 21. Since these are screening tests that are only able to provide a risk prediction, according to the indications of the international scientific community, any positive results must be confirmed by invasive prenatal diagnosis and no decision regarding pregnancy should be made based solely on the NIPT survey result. In case of a negative result, when requesting the limited type of chromosomal abnormalities that are the subject of the test (T21, T18 and T13), it must be emphasized that the test does not identify all chromosomal abnormalities. Since the test is not able to provide information on the possible presence of neural tube defects or other congenital defects or structural chromosomal abnormalities, it would be advisable for this test to be offered as part of an assisted pregnancy pathway aimed at evaluating the overall health of the fetus and mother. The simplicity of access, through a venous sampling, makes the test very popular and misuse or abuse very likely. It is therefore the duty of the medical geneticist consultant to identify the cases in which it is appropriate and to make this concept clear to applicants. During the pre-test genetic counseling it is necessary to clarify that:
Lo screening prenatale non invasivo delle più frequenti anomalie cromosomiche di numero su cfDNA non è un test di routine ma può essere una scelta della coppia dopo la consulenza genetica che includa anche un’accurata storia familiare per valutare l’appropriatezza dell’approccio diagnostico; Non-invasive prenatal screening of the most frequent chromosomal number abnormalities on cfDNA is not a routine test but can be a choice of the couple after genetic counseling that also includes an accurate family history to evaluate the appropriateness of the diagnostic approach;
Non è un test diagnostico, ma come test di screening presenta sensibilità e specificità elevate; It is not a diagnostic test, but as a screening test it has high sensitivity and specificity;
Il test è validato per le trisomie più frequenti, che rappresentano il 50-70% della patologia cromosomica fetale clinicamente rilevante, e non dà altre informazioni genetiche sul feto; The test is validated for the most frequent trisomies, which represent 50-70% of the clinically relevant fetal chromosomal pathology, and does not provide other genetic information on the fetus;
Un test negativo non assicura assenza di patologia; A negative test does not ensure the absence of pathology;
Un test positivo necessita di conferma diagnostica con approccio invasivo (amniocentesi); A positive test requires diagnostic confirmation with an invasive approach (amniocentesis);
Nel corso dell’esame si possono riscontrare incidentalmente dei risultati non correlati con il quesito diagnostico (dovuti a patologie materne quali anomalie del cariotipo e tumori), spesso anche di difficile interpretazione. Questo rischio deve essere menzionato durante la consulenza pre-test e nel consenso informato deve essere chiaramente espressa la volontà della donna di volere/non volere esserne informata; During the examination, results may be found incidentally unrelated to the diagnostic question (due to maternal pathologies such as karyotype abnormalities and tumors), which are often difficult to interpret. This risk must be mentioned during the pre-test consultation and the woman's willingness to want / not to be informed must be clearly expressed in the informed consent;
La quantità di DNA fetale può esser insufficiente all’esecuzione del test. Il rischio di fallimento dell’esame è di circa 1-4%; poiché un risultato non conclusivo o fallimento dell’esame è stato recentemente correlato con patologie fetali, nell’ambito della consulenza genetica post test dovrebbe essere consigliata in questi casi un’attenta valutazione ecografica ed eventualmente l’analisi del cariotipo fetale da valutare in team multidisciplinare e secondo le attitudini materne; The amount of fetal DNA may be insufficient for carrying out the test. The risk of exam failure is approximately 1-4%; since an inconclusive result or failure of the examination has recently been correlated with fetal pathologies, in the context of post-test genetic counseling a careful ultrasound evaluation and possibly the analysis of the fetal karyotype should be recommended in these cases to be evaluated in a multidisciplinary team and according to maternal attitudes;
Lo screening prenatale non invasivo non sostituisce la diagnosi prenatale invasiva (con amniocentesi o villocentesi) che deve rimanere un’opzione percorribile; Non-invasive prenatal screening does not replace invasive prenatal diagnosis (with amniocentesis or CVS) which must remain a viable option;
In caso di anomalie ecografiche fetali resta indicata la DPI per eseguire indagini genetiche mirate a seconda del quadro clinico fetale; In case of fetal ultrasound anomalies, PPE is indicated to perform targeted genetic investigations according to the clinical picture of the fetus;
In considerazione della complessità degli scenari illustrati, la consulenza genetica post-test dovrebbe sempre essere eseguita indipendentemente dall’esito del test; In consideration of the complexity of the scenarios illustrated, post-test genetic counseling should always be performed regardless of the outcome of the test;
I vantaggi rispetto agli screening combinati del primo trimestre sono: -Detection rate più alta; - Più alto valore predittivo positivo; - Alto valore predittivo negativo in particolare per T21 e T18 (importante per chi vuole evitare diagnosi prenatale invasiva); - Bassa percentuale di falsi positivi; -Minore dipendenza dall’età gestazionale (si può accedere dalla 11 settimana e per tutta la gravidanza). The advantages over the first trimester combined screenings are: - Higher detection rate; - Higher positive predictive value; - High negative predictive value in particular for T21 and T18 (important for those who want to avoid invasive prenatal diagnosis); - Low percentage of false positives; - Less dependence on gestational age (can be accessed from 11 weeks and throughout pregnancy).
Descrizione dell’invenzione Description of the invention
La presente descrizione si riferisce ad una innovata tecnica di screening prenatale non invasivo, ovvero ad una innovata tecnica di screening, non diagnostica, che analizza i frammenti di DNA libero circolante nel sangue materno, denominato fetal freeDNA o ffDNA, derivante dal trofoblasto (la struttura cellulare che forma la placenta). Questi frammenti di DNA ricalcano, nella stragrande maggioranza dei casi, la composizione del DNA fetale. È un test di screening in grado di valutare il rischio del feto di essere portatore di anomalie cromosomiche relative alle maggiori aneuploidie e in particolare quella riscontrabile al cromosoma 21. L’innovazione consiste nel fatto che questo è un test basato sull’applicazione di analisi molecolari, mediante l’utilizzo della Droplet Digital PCR. The present description refers to an innovative non-invasive prenatal screening technique, i.e. to an innovative non-diagnostic screening technique, which analyzes the fragments of free DNA circulating in the maternal blood, called fetal freeDNA or ffDNA, deriving from the trophoblast (the structure cell that forms the placenta). These DNA fragments trace, in the vast majority of cases, the composition of fetal DNA. It is a screening test capable of assessing the risk of the fetus of being a carrier of chromosomal anomalies related to major aneuploidies and in particular that found on chromosome 21. The innovation consists in the fact that this is a test based on the application of molecular analyzes , through the use of the Droplet Digital PCR.
Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention
L’invenzione viene qui di seguito descritta in riferimento ad una sua applicazione, esemplificativa e non limitativa, di screening fetale per la ricerca della trisomia 21. The invention is described below with reference to an exemplary and non-limiting application of fetal screening for the search for trisomy 21.
È dunque di interesse puntualizzare che la tecnica descritta è da intendersi utilizzabile, modificando esclusivamente la serie di probes, anche per altre aneuploidie ed è pertanto utilizzabile per lo screening fetale di trisomie quali la T 13 e la T 18, e per la determinazione del rischio di aneuploidie a carico dei cromosomi sessuali X Y. It is therefore of interest to point out that the described technique is intended to be used, by modifying only the series of probes, also for other aneuploidies and is therefore usable for the fetal screening of trisomies such as T 13 and T 18, and for the determination of the risk. of aneuploidy affecting the sex chromosomes X Y.
Più in dettaglio la presente descrizione consiste in un metodo di screening ad alta sensibilità per la ricerca di anomalie genetiche e cromosomiche in frammenti di DNA fetale presente in un campione di sangue materno previamente prelevato. Il detto metodo prevede una serie di fasi sequenziali ed in particolare: More in detail, the present description consists of a highly sensitive screening method for the search for genetic and chromosomal anomalies in fragments of fetal DNA present in a previously drawn maternal blood sample. This method involves a series of sequential steps and in particular:
- Una prima fase a) di estrazione e purificazione del cffDNA, una seconda fase b) di ampliamento dei filamenti degli acidi nucleici; ed una terza fase c) che prevede l’interpretazione dei dati. Il metodo si caratterizza per l’impiego della digital droplet PCR per l’attuazione delle detta fase b). - A first step a) of cffDNA extraction and purification, a second step b) of extension of the nucleic acid strands; and a third phase c) which provides for the interpretation of the data. The method is characterized by the use of the PCR digital droplet for the implementation of the said phase b).
In una delle sue forme di realizzazione il detto metodo comprende: In one of its embodiments the said method comprises:
- Una prima fase a) che prevede l’estrazione del cffDNA. Più in dettaglio il DNA circolante fetale viene estratto da un prelievo di campione plasmatico materno utilizzando, a titolo esemplificativo e non limitativo, le provette stretch tube ben note al tecnico del ramo. L’invenzione prevede che in detta fase a) venga, preferibilmente ma non limitatamente, utilizzato un protocollo automatizzato utilizzando il sistema QiaSymphony (QIAGEN, Valencia, CA, USA) anch’esso ben noto al tecnico del ramo. I kit QIAsymphony vengono utilizzati con procedure completamente automatizzate e simultanee di purificazione del DNA totale da sangue fetale, isolato da campioni di sangue materno. Più in dettaglio, la detta tecnologia è quella a particelle magnetiche che consente di purificare gli acidi nucleici di alta qualità che sono privi di proteine, nucleasi e altre impurità. Gli acidi nucleici purificati sono direttamente utilizzati in analisi successive; - A first phase a) which involves the extraction of the cffDNA. More in detail, the circulating fetal DNA is extracted from a maternal plasma sample by using, by way of non-limiting example, stretch tubes well known to those skilled in the art. The invention provides that in said step a) an automated protocol is used, preferably but not limitedly, using the QiaSymphony system (QIAGEN, Valencia, CA, USA) which is also well known to those skilled in the art. QIAsymphony Kits are used with fully automated and simultaneous purification procedures of total DNA from fetal blood, isolated from maternal blood samples. More in detail, the said technology is the magnetic particle technology which allows to purify the high quality nucleic acids which are free of proteins, nucleases and other impurities. The purified nucleic acids are directly used in subsequent analyzes;
- Una seconda fase b) in cui il detto metodo prevede l’impiego della Droplet Digital PCR. La reazione a catena della polimerasi digitale (Digital PCR, dPCR) è notoriamente un perfezionamento biotecnologico dei convenzionali metodi di reazione a catena della polimerasi che possono essere utilizzati per quantificare direttamente ed amplificare i filamenti di acidi nucleici. La dPCR misura quantitativamente una certa regione target ed esegue anche una singola reazione all’interno di un campione che viene separato in un gran numero di partizioni e la reazione viene eseguita singolarmente in ogni partizione. Questa separazione consente una raccolta più affidabile e una misurazione sensibile delle quantità di acido nucleico. Il principio di base della PCR digitale (dPCR) è quello di eseguire una quantificazione assoluta del DNA bersaglio presente in un campione, utilizzando diluizioni limitanti, l’amplificazione del DNA target e l’analisi dei risultati mediante la statistica di Poisson. Una peculiare piattaforma di dPCR è la “droplet digital PCR” (ddPCR) che si basa sulla ripartizione del campione in migliaia di goccioline in un’emulsione olio-acqua, la successiva amplificazione dell’emulsione contenente il DNA target, infine l’analisi delle “droplet” contenti il DNA target (positive) e non (negative) mediante la statistica di Poisson. La droplet digital PCR è una tecnica sviluppata per fornire una quantificazione assoluta di DNA, è in grado di analizzare fino a diecimila repliche dello stesso campione. - A second phase b) in which the said method involves the use of the Droplet Digital PCR. Digital PCR (dPCR) is a notorious biotechnological refinement of conventional polymerase chain reaction methods that can be used to directly quantify and amplify nucleic acid strands. The dPCR quantitatively measures a certain target region and also performs a single reaction within a sample that is separated into a large number of partitions and the reaction is performed individually in each partition. This separation allows for more reliable collection and sensitive measurement of nucleic acid quantities. The basic principle of digital PCR (dPCR) is to perform an absolute quantification of the target DNA present in a sample, using limiting dilutions, the amplification of the target DNA and the analysis of the results using the Poisson statistic. A peculiar dPCR platform is the "droplet digital PCR" (ddPCR) which is based on the partitioning of the sample into thousands of droplets in an oil-water emulsion, the subsequent amplification of the emulsion containing the target DNA, and finally the analysis of the “Droplets” containing the target DNA (positive) and not (negative) using the Poisson statistic. The digital PCR droplet is a technique developed to provide absolute quantification of DNA, capable of analyzing up to ten thousand replicates of the same sample.
- Una terza fase c) che prevede l’interpretazione dei dati mediante specifico software (QuantStudio™ 3D AnalysisSuite™, Software Relative Quantification) droplet digital PCR. - A third phase c) which involves the interpretation of data using specific software (QuantStudio ™ 3D AnalysisSuite ™, Software Relative Quantification) digital PCR droplet.
Qui di seguito viene fornita la descrizione di un esempio, non limitativo, relativo all’applicazione del metodo in oggetto per la determinazione del rischio di presenza di trisomia per il cromosoma 21. Below is a description of a non-limiting example relating to the application of the method in question for determining the risk of the presence of trisomy for chromosome 21.
È altresì di interesse puntualizzare che tutte le strumentazioni qui di seguito indicate con i loro nomi commerciali sono ben note al tecnico del ramo e pertanto ne viene omessa una loro descrizione dettagliata in termini di componenti strutturali, dando per scontata la loro conoscenza da parte del tecnico del ramo alla data di deposito del presente documento. It is also of interest to point out that all the instruments indicated below with their trade names are well known to the person skilled in the art and therefore a detailed description of them in terms of structural components is omitted, taking for granted their knowledge by the technician. of the branch at the filing date of this document.
Il detto metodo, quando utilizzato per la determinazione del rischio di presenza di trisomia a carico del cromosoma 21, prevede: This method, when used to determine the risk of the presence of trisomy on chromosome 21, provides:
- l’estrazione del cffDNA mediante QIAsymphony (QIAGEN,Valencia, CA, USA); - cffDNA extraction using QIAsymphony (QIAGEN, Valencia, CA, USA);
- il disegno di una serie di probes con la tecnologia TaqMan hydrolyses assay (Life Technologies, Carlsbad, CA,USA) dirette verso geni che mappano sul cromosoma 21, e di una probe usata come reference che mappa sul cromosoma 1; - the design of a series of probes with TaqMan hydrolyses assay technology (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) directed towards genes that map to chromosome 21, and of a probe used as a reference that maps to chromosome 1;
- l’analisi eseguita mediante l’utilizzo del sistema ProFlex™ PCR System (Thermo Fisher Scientific), disegnando una serie di probes con la tecnologia TaqMan hydrolyses assay (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dirette verso geni che mappano sui cromosomi 21 ed un gene che mappa sul cromosma 1: 4 saggi FAM TaqMan hydrolysis assays per i geni BRWD1, LTN1, NCAM2 e RUNX1 (ID assay: Hs03026207_cn, Hs02872951_Hs05556211_cn, Hs05550012_cn;) ed un saggio VIC per il gene ASTN1, Hs05795637_cn (Life Technologies, Carlsbad, CA, US), e 15 μL di mix composti da 7,5 μL di 2X ddPCR Supermix per probes, 3,75 μL di un mix equimolare delle TaqMan assays, e 3,75 μL di DNA plasmatico, 3 replicanti sono generati per campione. Condizioni di PCR utilizzate: 95°C per 10 min, 40 cycles of 94°C for 30 sec and 60°C for 1 min, ed una estensione finale a 98°C for 10 min. La fluorescenza viene misurata ed analizzata mediante la QuantStudio 3D Digital PCR Instrument; - the analysis performed using the ProFlex ™ PCR System (Thermo Fisher Scientific), designing a series of probes with the TaqMan hydrolyses assay technology (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) directed towards genes that map on chromosomes 21 and a gene that maps to chromosm 1: 4 FAM TaqMan hydrolysis assays for the BRWD1, LTN1, NCAM2 and RUNX1 genes (ID assay: Hs03026207_cn, Hs02872951_Hs05556211_cn, Hs05550012_cn; Carlsbad, CA, US), and 15 μL mix composed of 7.5 μL of 2X ddPCR Supermix per probes, 3.75 μL of an equimolar mix of the TaqMan assays, and 3.75 μL of plasma DNA, 3 replicants are generated per sample. PCR conditions used: 95 ° C for 10 min, 40 cycles of 94 ° C for 30 sec and 60 ° C for 1 min, and a final extension at 98 ° C for 10 min. Fluorescence is measured and analyzed using the QuantStudio 3D Digital PCR Instrument;
- Al termine, per eseguire l’analisi e l’interpretazione dei risultati; si utilizza il Software: QuantStudio™ 3D AnalysisSuite™, Software Relative Quantification. - At the end, to perform the analysis and interpretation of the results; Software is used: QuantStudio ™ 3D AnalysisSuite ™, Relative Quantification Software.
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