IT201800004172A1 - Inibitori della chinasi nek6 utili per il trattamento dei tumori solidi - Google Patents
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Description
“INIBITORI DELLA CHINASI NEK6 UTILI PER IL TRATTAMENTO DEI
TUMORI SOLIDI”
DESCRIZIONE
Campo tecnico dell’invenzione
Le chinasi mitotiche che regolano la dinamica dei centrosomi e le funzioni del fuso mitotico sono potenziali target per la terapia antitumorale. Nella presente invenzione sono state identificate alcune molecole con attività inibitoria su NEK6. Sono oggetto della presente invenzione tali molecole e le composizioni che le comprendono per uso come inibitori di NEK6 in un metodo di trattamento dei tumori sia in mono terapia che in combinazione con altri farmaci.
Stato della tecnica anteriore
NEK6 è una serin treonin protein chinasi appartenente alla famiglia delle “NIMA-related kinase”. Questa famiglia comprende undici proteine (NEK1-NEK11), implicate nella progressione del ciclo cellulare e/o nell’organizzazione dei microtubuli. I livelli proteici e l’attività catalitica di NEK6 aumentano durante la mitosi.
In particolare, NEK6 sembra essere richiesta nella separazione dei centrosomi e nella transizione metafase-anafase del ciclo cellulare dove ha un ruolo nel mantenimento del fuso mitotico (Fry AM J, Cell Sci.
2012;125:4423-33). Studi precedenti hanno dimostrato come l’inibizione dell’attività di NEK6, tramite RNA silencing o utilizzo di mutanti inattivi per l’attività chinasica, determinasse l’arresto mitotico e l’apoptosi (Belham C et al. J Biol Chem. 2003;278:34897-909; Nassirpour et al. Mol Cancer Res.
2010;8:717-28). È stato inoltre riportato che NEK6 rappresenta un target diretto del checkpoint del danno al DNA (Lee MY et al. Cell Cycle.
2008;7:2705-9). In linea con questi dati, negli ultimi anni si sono consolidate evidenze sperimentali a supporto di un ruolo di NEK6 nella tumorigenesi. Diversi tipi di tumori solidi over-esprimono NEK6, tra cui fegato, stomaco, mammella, colon-retto, polmone, laringe, ovaio e prostata (Nassirpour et al. Mol Cancer Res. 2010;8:717-28; De Donato et al. Am J Cancer Res. 2015;5:1862-77). NEK6 rappresenta inoltre un fattore prognostico negativo indipendente nel carcinoma epatico (Cao X et al. Pathol Oncol Res.2012;18:201-7) e ovarico (De Donato et al. Am J Cancer Res. 2015;5:1862-77; brevetto WO2015/006262 A1), nonché un biomarcatore prognostico e diagnostico nel tumore del colon-retto (Gerçeker E. et al. Oncol Rep.2015;34:1905-14).
Il ruolo di NEK6 nella patogenesi tumorale è stato dimostrato in diverse linee cellulari tumorali umane nelle quali i livelli di espressione correlano con l’aggressività delle cellule. L’over-espressione di NEK6 è in grado di promuovere la crescita ancoraggio indipendente, mentre la deplezione funzionale, mediante silencing dell’mRNA o tramite l’espressione di un mutante chinasico inattivo dominante, annulla tale effetto, inducendo apoptosi in varie linee di carcinoma umano, ma non nei fibroblasti (Nassipour et al. Cancer Res.2010; 8:717-28). NEK6 risulta essere anche un potente inibitore della senescenza indotta da p53 (Jee HJ et al. Cell Cycle. 2010;9:4703-10). La domanda di brevetto US2005216961A1 descrive l’uso di varie chinasi, tra cui NEK6, nella prognosi e nello screening di nuove molecole utili nel trattamento di differenti tumori.
NEK6 è quindi un importante target terapeutico per lo sviluppo di farmaci antitumorali (Dominguez-Brauer C. et al. Mol Cell.2015; 60:524-36). Le terapie antitumorali attualmente utilizzate hanno lo svantaggio di non essere selettive per le cellule maligne. Pertanto, i farmaci utilizzati in passato designati a bloccare specificatamente il ciclo cellulare durante la mitosi, hanno dato risultati clinici limitati a causa del basso indice terapeutico legato alla citotossicità sulle cellule non tumorali (Dominguez-Brauer C. et al. Mol Cell. 2015; 60:524-36). Al fine di sviluppare terapie personalizzate nel trattamento dei tumori è importante identificare nuovi farmaci con attività selettiva nei confronti delle cellule tumorali. Tali farmaci potranno essere usati da soli o in associazione alle terapie già utilizzate in prima linea o in linee terapeutiche successive. In quest’ottica, le chinasi NEK, che svolgono un ruolo critico per l’organizzazione dei microtubuli e lo svolgimento della mitosi, rappresentano dei target emergenti interessanti per lo sviluppo di composti da utilizzare in associazione con farmaci antitumorali (Dominguez-Brauer et al 2015). L’importante risultato descritto da Nassirpour e colleghi (Mol Cancer Res. 2010; 8:717-28), mostra come l’inibizione di NEK6 induca l’apoptosi in varie linee cellulari di carcinoma umano, ma non nelle linee cellulari primarie normali, confermando l’importanza dello sviluppo d’inibitori selettivi di questa proteina nello sviluppo di nuove terapie antitumorali.
Sommario dell’invenzione
La serin treonin protein chinasi NEK6 rappresenta un target terapeutico importante per lo sviluppo di nuovi farmaci contro il tumore.
La presente invenzione nasce dalla ricerca di composti capaci di inibire NEK6. È stata innanzitutto esaminata la capacità d’inibire in vitro l’attività chinasica di NEK6 in diversi saggi d’inibizione e successivamente è stata dimostrata l’attività citotossica di tali inibitori su diverse linee cellulari tumorali di origine umana. Inoltre Il composto C8 secondo la presente invenzione è stato saggiato in combinazione con altri farmaci chemioterapici su una linea di carcinoma ovarico mostrando un effetto sinergico. Sono state così individuate due famiglie di composti capaci d’inibire NEK6 e di inibire la crescita di linee cellulari tumorali. I composti identificati dalla presente invenzione potrebbero avere l’ulteriore vantaggio di migliorare l’efficacia terapeutica e ridurre gli effetti tossici. L’inibizione dell’attività di NEK6, infatti, potrebbe determinare un effetto citotossico selettivo sulle cellule neoplastiche e non sulle cellule normali.
Pertanto sono oggetto dell’invenzione i composti dotati di attività d’inibizione della proteina NEK6 aventi formula generale scelta tra le formule di struttura (A) o (B) come qui definite loro enantiomeri, tautomeri sali, ed il loro uso nel trattamento di un tumore.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione sono i composti aventi formula generale scelta tra le formule di struttura (A) o (B) come qui definite per uso come inibitori della proteina NEK6 in un metodo di trattamento, in particolare in un metodo di trattamento di un tumore.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione sono composizioni farmaceutiche comprendenti le formule di struttura (A) o (B) come qui definite ed eccipienti farmaceuticamente idonei.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione sono composizioni farmaceutiche comprendenti le formule di struttura (A) o (B) come qui definite ed eccipienti farmaceuticamente idonei ed uno o più ulteriori farmaci chemioterapici.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione sono kit comprendenti i composti aventi formula generale scelta tra le formule di struttura (A) o (B) come qui definiti ed uno o più ulteriori farmaci chemioterapici ed il loro uso in un metodo di trattamento di un tumore.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione sono procedimenti per la preparazione dei composti aventi formula generale scelta tra le formule di struttura (A) o (B) come qui definite.
Descrizione delle figure
Figura 1. Inibizione attività NEK6. Grafico a barre rappresentante i risultati dello screening di diversi composti a 30 µM utilizzando il LANCE-Ultra NEK6 kinase assay (PerkinElmer) incubati con 4 nM NEK6, 50 nM ULightp70 S6K Peptide e 100 μM ATP per 90 min a T.A. Come inibitore di controllo è stata utilizzata la quercetina. I composti più attivi sono quelli di formula A e B esemplificati come composto C8 e C21.
Figura 2. In figura 2 sono rappresentate le molecole identificate con attività inibitoria su NEK6 utilizzando il LANCE-Ultra NEK6 kinase assay (PerkinElmer). Le curve rappresentano la % di attività di NEK6 in funzione della concentrazione dell’inibitore.
A) Il composto 8 (ZINC05007751) è in grado di inibire l’attività di NEK6 con un IC50=3.4 ± 1.2 µM; B) il composto 21 (ZINC04384801) inibisce NEK6 ad un IC50= 2.6 ± 0.05 µM. Il valore dell’IC50 deriva dalla media degli IC50 di 4 esperimenti indipendenti ± SEM. Ogni punto della curva rappresenta la media di un triplicato ± SEM di un esperimento rappresentativo.
Figura 3. Il western blot mostra i livelli di espressione di NEK6 in un pannello di linee cellulari tumorali rappresentative di quattro tumori solidi: MDA-MB231 e MCF7 (tumore mammella), PEO1 e COV318 (tumore ovarico), NCI-H1299 e NCI-H1975 (tumore polmone), HCT-15 e SW948 (tumore colon). L’immunoreazione con l’actina è stata utilizzata come controllo di caricamento.
Figura 4. Il grafico rappresenta le curve di crescita della linea cellulare tumorale MDA-MB-231 in presenza di concentrazioni crescenti dei composti C8 e C21. Ciascun punto della curva rappresenta la media ± SEM di un quadruplicato di un esperimento rappresentativo. Il valore dell’IC50 è stato calcolato, considerando la media ± SEM di almeno 2 esperimenti indipendenti, con il programma di analisi statistica Graphpad 5.0.
Figura 5. Il grafico rappresenta le curve di crescita delle linee cellulari tumorali PEO-1, HCT-15 e NCI-1299 in presenza di concentrazioni crescenti del composto C8. Ciascun punto della curva rappresenta la media ± SEM di un quadruplicato di un esperimento rappresentativo. Il valore dell’IC50 è stato calcolato, considerando la media ± SEM di almeno 2 esperimenti indipendenti, con il programma di analisi statistica Graphpad 5.0.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
I composti dell’invenzione sono composti accomunati dalla stessa attività farmacologica, vale a dire l’inibizione della proteina NEK6, in particolare della proteina NEK6 umana (codice in banca dati UniProtKB-Q9HC, NEK6_Human). Sono oggetto dell’invenzione i composti aventi formula generale scelta tra la formula (A) o (B) riportate in seguito.
Un primo gruppo di composti oggetto della presente invenzione sono i composti della formula generale (A)
in cui R<1 >è un sostituente scelto tra uno qualsiasi dei seguenti gruppi
e
in cui R<2 >è un sostituente scelto tra uno qualsiasi dei seguenti gruppi:
Il composto sarà preferibilmente scelto tra uno dei seguenti composti di formula A in cui i sostituenti sono scelti secondo le formule A1-A15:
Secondo una forma di realizzazione preferita il composto di formula A è il composto
(5Z)-2-idrossi-4-metil-6-ossi-5-[(5-fenilfuran-2il)metilidene]-5,6-diidropiridina-3-carbonitrile identificato nella descrizione con la sigla C8 e di cui è riportata a seguire la formula di struttura:
.
Un secondo gruppo di composti oggetto della presente invenzione sono i composti della formula generale (B):
in cui R è un sostituente scelto tra i gruppi B1-B15 riportati di seguito:
Secondo una forma di realizzazione preferita il composto di formula B è il composto
6-amino-2-fenil-5,7,9-triazatetraciclo[8.7.0.0³,⁸.0¹¹,¹⁶]eptadeca-1(10),3(8),6,11,13,15 esaene-4, 17-dione identificato nella descrizione con la sigla C21 e di cui è riportata a seguire la formula di struttura:
Nel caso in cui per uno qualsiasi dei composti qui descritti risulta un centro di asimmetria fanno parte dell’invenzione sia la miscela racemica che i singoli enantiomeri (R) o (S) separati che una miscela arricchita di uno degli enantiomeri. Fanno parte dell’invenzione anche tutti i composti di formula (A) e (B) qui descritti in forma salificata e loro tautomeri.
Sono oggetto dell’invenzione i composti sopra descritti (sia quelli di formula generale A che B) per uso come inibitori della proteina NEK6 in un metodo di trattamento, in particolare in un metodo di trattamento di un tumore. Nella presente descrizione con il termine “inibitore della proteina NEK6” s’intende una sostanza in grado d’inibire selettivamente l’attività della proteina NEK6. I composti della presente descrizione potranno essere usati con una qualsiasi condizione patologica associata all’attività della chinasi NEK6. I composti della presente descrizione potranno essere usati nel trattamento di pazienti affetti da cancro, preferibilmente in associazione ad uno o più chemioterapici, ad esempio Paclitaxel e suoi derivati, farmaci appartenenti alla classe dei taxani, Cisplatino e composti a base di platino, o altri composti antitumorali o farmaci biologici di potenziale impiego terapeutico nel trattamento dei tumori. Il tumore trattato potrà essere il tumore ovarico o altri tipi di tumore come ad esempio il tumore della ghiandola mammaria, del polmone e del colon-retto.
Sono oggetto dell’invenzione anche le composizioni farmaceutiche che contengono uno o più composti dell’invenzione in qualità di principio attivo assieme ad un eccipiente farmaceuticamente accettabile ed eventualmente additivi e stabilizzanti usuali nella farmaceutica. Tale composizioni sono idonee per uso sistemico o locale e possono essere tanto in formulazione liquida, che in formulazione solida, o semi-solida o di supposta. Esempi di formulazioni liquide sono soluzione, sospensione, emulsione, idonee per esempio per somministrazione parenterale o parenterale locale, orale o anche in forma di spray. Esempi di formulazioni solide sono compresse, confetti, capsule, granulato, liofilizzato, idonee per somministrazione orale. Esempi di formulazioni semisolide sono paste, pomate, gel, unguenti, idonee per un’applicazione topica. È oggetto della presente anche una composizione farmaceutica comprendente e uno o più inibitori di NEK6 qui descritti ed un veicolante e/o un diluente per uso come in un metodo di trattamento di una qualsiasi delle condizioni da trattare qui descritte. La composizione comprendente l’inibitore di NEK6 potrà essere orale, parenterale, rettale, transdermica, topica o idonea per altra via di somministrazione. Le composizioni per uso secondo la presente invenzione potranno essere somministrate mediante qualsiasi mezzo convenzionale disponibile per uso unitamente a farmaci, o come agenti terapeutici individuali o in una combinazione di agenti terapeutici. Essi possono essere somministrati da soli, ma generalmente somministrati con un veicolante farmaceutico scelto sulla base della via di somministrazione scelta e della pratica farmaceutica standard. Il dosaggio somministrato, ovviamente, varierà dipendentemente da fattori noti, come le caratteristiche farmacodinamiche del particolare agente e dalla sua modalità e via di somministrazione; dall'età, salute e peso del ricevente; dalla natura e grado dei sintomi, dal tipo di trattamento concomitante; dalla frequenza di trattamento; e dall'effetto desiderato. Si può prevedere che un dosaggio giornaliero di ingrediente attivo sia di circa 0,001 fino a 1000 milligrammi (mg) per chilogrammo (kg) di peso corporeo, con la dose preferita che è di 0,1 fino a circa 30 mg/kg. Forme di dosaggio (composizioni adatte per somministrazione) tipicamente contengono da circa 1 mg a circa 100 mg di ingrediente attivo per unità di dosaggio. In queste composizioni farmaceutiche, l'ingrediente attivo sarà normalmente presente in una quantità di circa 0,1-95% in peso in base al peso totale della composizione. Uno o più inibitori di NEK6 qui descritti può essere somministrato per via orale in forme di dosaggio solide, come capsule, compresse, e polveri, o in forme di dosaggio liquide, come elisir, sciroppi, e sospensioni. Esso può essere somministrato anche per via parenterale, in forme di dosaggio liquide sterili. Capsule di gelatina contengono l'ingrediente attivo e veicoli polverizzati, come lattosio, amido, derivati di cellulosa, stearato di magnesio, acido stearico, e simili. Diluenti simili possono essere usati per preparare compresse pressate. Sia compresse che capsule possono essere fabbricate come prodotti a rilascio prolungato per fornire rilascio continuo di medicazione per un periodo di alcune ore. Compresse pressate possono essere rivestite di zucchero o rivestite con pellicola per coprire qualsiasi sapore sgradevole e proteggere la compressa dall'atmosfera, o rivestite con rivestimento enterico per la disintegrazione selettiva nel tratto gastro-intestinale. Forme di dosaggio liquide per somministrazione orale possono contenere coloranti e aromi per aumentare l'accoglienza da parte del paziente. In generale, acqua, un olio adatto, soluzione salina, destrosio acquoso (glucosio), e soluzioni di zuccheri collegati e glicoli come glicole propilenico o glicoli polietilenici sono veicoli adatti per soluzioni parenterali. Soluzioni per somministrazione parenterale contengono preferibilmente un sale solubile in acqua dell'ingrediente attivo, adatti agenti stabilizzanti, e, se necessario, sostanze tamponanti. Agenti antiossidanti come sodio bisolfito, sodio solfito, o acido ascorbico, da soli o combinati, sono agenti stabilizzanti adatti. Vengono usati anche acido citrico e suoi sali e sodio EDTA. Inoltre soluzioni parenterali possono contenere conservanti, come cloruro di benzalconio, metil- o propil-parabene, e clorobutanolo. Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione oltre agli inibitori di NEK6 qui descritti potranno comprendere uno o più ingredienti attivi, cioè sostanze farmacologicamente attive, in particolare chemioterapici. Sono qui descritti anche i metodi di trattamento terapeutico delle condizioni patologiche sopra dette comprendente un passaggio di somministrazione di uno dei composti qui descritti o delle composizioni che li comprendono. Il metodo potrà essere di trattamento del tumore e comprendere un passaggio precedente alla somministrazione dell’inibitore in cui un campione del paziente è analizzato per rivelare la presenza o di espressione o meno della proteina NEK6.
Tutti, i composti di formula generale (A) possono essere preparati attraverso il metodo di sintesi schematizzato e descritto di seguito e nell’esempio 1. Tale metodo è esemplificato di seguito:
Secondo una forma di realizzazione preferita le condizioni di reazione dei passaggi del metodo di preparazione dei composti di formula generale (A) saranno quelli riportati nel seguente schema:
Tutti, i composti di formula generale (B) possono essere preparati attraverso il metodo di sintesi schematizzato e descritto di seguito e nell’esempio 2. Tale metodo è esemplificato di seguito:
Secondo una forma di realizzazione preferita le condizioni di reazione dei passaggi del metodo di preparazione dei composti di formula generale (B) saranno quelli riportati nel seguente schema:
Sono oggetto della presente invenzione anche kit comprendenti i composti aventi formula generale scelta tra le formule di struttura (A) o (B) come qui definiti ed uno o più ulteriori farmaci chemioterapici ed il loro uso in un metodo di trattamento di un tumore. Il kit potrà essere realizzato ad esempio per la somministrazione orale o parenterale, sequenziale o simultanea.
L’invenzione sarà di seguito illustrata in dettaglio nei seguenti esempi, che hanno finalità esemplificativa, ma non limitativa.
Esempio 1: sintesi del composto (5Z)-2-idrossi-4-metil-6-ossi-5-[(5-fenilfuran-2il)metilidene]-5,6-diidropiridina-3-carbonitrile C8. La sintesi è avvenuta secondo lo schema seguente:
I composti indicati nello schema come 1, 2 e 4 sono disponibili commercialmente rispettivamente con i numeri CAS 141979, 107915 e 13803399. Per la sintesi dell’esempio 1 sono qui incorporante le seguenti referenze: Würthner, F. et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2810, Würthner, F. J. Org. Chem. 2003, 23, 8943, Renck, D. J. Med. Chem.
2013, 56, 8892-8902
Karam A. El-Sharkawy Eur. Chem. Bull., 2013, 2 (8), 530-537 e W. Cai, C. Antiviral Research 2014, 108, 48-55.
Esempio 2: sintesi del composto 6-amino-2-fenil-5,7,9-triazatetraciclo[8.7.0.0³,⁸.0¹¹,¹⁶]eptadeca-1(10),3(8),6,11,13,15 esaene-4, 17-dione C21. La sintesi è avvenuta secondo lo schema seguente:
I composti indicati nello schema come 1 e 3 sono disponibili commercialmente rispettivamente con i numeri CAS 100527 e 606235. Il composto 2 è ottenibile con la sintesi descritta in Vyacheslav E. Saraev, J. Heterocyclic Chem., 54, 318 (2017) qui incorporato mediante referenza insieme a Tu, S.-J. et al Eur. J. Org. Chem.2007,1522.
Sezione sperimentale
1. Materiali e metodi
1.2 IDENTIFICAZIONE DI COMPOSTI CON ATTIVITA’ INIBITORIA SU
NEK6:
I composti in polvere (Molport, Riga, LV-1011, Latvia) sono stati disciolti in DMSO 100% ad una concentrazione stock di 10 mM. I composti freschi sono stati testati inizialmente ad una singola concentrazione (30 μM) con il LANCE NEK6 Ultra Kinase Assays (PerkinElmer, Monza (MB)), mentre la soluzione rimanente è stata aliquotata, conservata a -20°C ed utilizzata per le curve di inibizione enzimatica dei composti selezionati. La reazione è stata effettuata in piastre bianche da 384 OptiPlate™-384 (PerkinElmer # 6007290), utilizzando come reagenti l’Europium-labeled anti-phospho-p70 S6K (Thr389) Antibody (PerkinElmer # TRF0214), ULight-p70 S6K (Thr389) (PerkinElmer # TRF0126), NEK6 (Carna, Chuo-ku, Kobe, Japan, # 05-130), LANCE® Detection Buffer, 10X (PerkinElmer # CR97-100 ), ATP (Sigma-Aldrich, Saint Louis, U.S.A, # A2383 ). NEK6, l’ATP ed i composti sono stati diluiti in Kinase Buffer (50 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT e 0.01% Tween-20), e dove necessario è stato aggiunto DMSO per ottenere una concentrazione dello 0.3% nel volume finale di reazione. Per lo screening iniziale i composti sono stati testati alla concentrazione finale di 30 µM, DMSO 0.3% finale in kinase buffer ed incubati con 4 nM NEK6, 50 nM ULight-p70 S6K Peptide e 100 μM ATP, in un volume di reazione di 10 μL per 90 min a temperatura ambiente. Come inibitore di controllo è stata utilizzata la quercetina (Molport # 001-740-557). Per le curve di inibizione enzimatica, i composti selezionati C8 (Molport # 002-933-483), C21 (Molport # 000-911-820) sono stati diluiti serialmente (diluizioni 1:2) da 30 µM fino a 0.9375 μM (concentrazioni finali: 30 µM; 15 µM; 7.5 µM; 3.75; 1.875 µM; 0.9375 µM in 0.3% DMSO) ed incubati nelle stesse condizioni. Le piastre sono state coperte con la pellicola TopSeal™-A film (PerkinElmer # 6050195) per evitare l’evaporazione ed incubate a temperatura ambiente per 90 min. La reazione è stata bloccata con 5 μL di EDTA 40mM preparata in 1X LANCE Detection Buffer (STOP SOLUTION). Dopo 5 min a temperatura ambiente, sono stati aggiunti 5 μL di 4X Detection Mix (Eu-anti-phosphop70 S6K Antibody 8 nM in 1X LANCE Detection Buffer). La piastra è stata coperta con la pellicola TopSeal-A e incubata a temperatura ambiente per 1h. Dopo rimozione della pellicola, il segnale è stato letto al lettore di piastre Enspire (PerkinElmer) (eccitazione 320 nm ed emissione a 665 nm). La % di attività enzimatica di NEK6 è stata calcolata rispetto al controllo (100% attività), dopo sottrazione del bianco dell’esperimento. Per ogni composto è stata calcolata la concentrazione inibente del 50% l’attività di NEK6 (IC50) con il software GraphPad Prism5 Software (San Diego, CA, USA).
1.3 OFF-CHIP MOBILITY SHIFT ASSAY (MSA):
L’attività inibitoria su NEK6 dei composti C8 e C21 è stata verificata con la tecnica del Off-chip Mobility Shift Assay (MSA) (CARNA Biosciences Study ID: CBS170097, CARNA Biosciences, Kobe). I composti sono stati disciolti e diluiti in DMSO per ottenere una concentrazione 100x e testati alle seguenti diluizioni: 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003 μM, in presenza di NEK6, 1000 nM peptide CDK7, 5 mM Mg e Km app/Bin :69/75 μM ATP. L’inibitore PKR è stato utilizzato come controllo positivo. 5 mL della soluzione 4x dei composti, 5 mL della 4x Substrate/ATP/Metal solution, e 10 mL della 2x kinase solution sono stati preparati con il tampone di reazione (20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 1 mM DTT, pH7.5), miscelati ed incubati in pozzetti di polipropilene in piastra da 384 pozzetti per 5 ore a temperatura ambiente. In seguito sono stati aggiunti 70 mL di Termination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences). Si è proceduto all’analisi della reazione con il LabChip system (Perkin Elmer), separando e quantizzando i picchi del prodotto e del substrato. La reazione chinasica è stata quindi valutata in base al rapporto (P / (P S)) calcolato in base alle altezze del picco dei peptidi prodotto (P) e substrato (S). Il valore di lettura della reazione di controllo (mix di reazione completo) è stato posto come 0% di inibizione ed il valore di fondo (Enzima (-)) è stato posto come 100% di inibizione, quindi è stata calcolata la percentuale di inibizione di ogni campione. Il valore dell’IC50 è stato calcolato tramite un modello logistico a 4 parametri delle curve di inibizione mediante adattamento a una curva logistica a quattro parametri.
1.4 ANALISI DEI LIVELLI DI ESPRESSIONE DI NEK6 TRAMITE WESTERN BLOT:
I lisati cellulari totali sono stati ottenuti incubando le cellule in 20mM Tris-HCl pH 7.4, 5mM EDTA, 150 mM cloruro di sodio, 1% glicerolo e 1% Triton X-100, in presenza di inibitori di proteasi e fosfatasi. Quaranta microgrammi di lisato proteico sono stati corsi su gel SDS-PAGE 12% in presenza di un marcatore di peso molecolare (Benchmark, Life Technologies, Monza, MB) e trasferiti su membrana PVDF (Millipore, Bedford, MA). La membrana è stata incubata per 1 ora con latte scremato 5% in tampone Tris-buffered saline (Bio-Rad, Hercules, CA), 0.1% Tween-20 (TBST) e successivamente tutta la notte con l’anticorpo monoclonale di coniglio anti-NEK6 (1:5000, #ab109177 Abcam, Cambridge, UK) in latte 5%, TBST. Come controllo di caricamento è stato utilizzato l’anticorpo anti-β-actina (1:5000, #A5441 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Dopo 3 lavaggi da 15 minuti in TBST, la membrana è stata incubata con l’anticorpo secondario coniugato con la perossidasi di rafano (Bio-Rad, Hercules, CA) per 1 ora temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi successivi in TBST il segnale specifico per NEK6 è stato rivelato con un sistema chemioluminescente (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) utilizzando come strumento rivelatore di immagini il Versadoc (Bio-Rad, Hercules, CA).
1.5 ESPERIMENTI DI CITOTOSSICITÀ CON I COMPOSTI 8 E 21 IN LINEE CELLULARI TUMORALI UMANE:
I composti C8 e C21 identificati nel precedente saggio di attività enzimatica sono stati testati su 8 linee cellulari tumorali rappresentative di diversi tumori solidi: MDA-MB231 e MCF7 (tumore mammella; ATCC, LGC Standards S.r.L, Sesto San Giovanni, MI), PEO1 e COV318 (tumore ovarico; ECACC, Salisbury, UK), HCT-15 e SW948 (tumore colon; ECAC e ATCC, Sesto San Giovanni, MI), NCI-H1975 e NCI-H1299, (tumore polmone; ATCC). Attraverso esperimenti di citotossicità è stata valutata la capacità di tali composti di inibire la crescita cellulare.
Le linee cellulari sono state mantenute in coltura in fiasche medie da 75 cm<2 >in atmosfera umidificata con 5% CO2/95% aria nei seguenti terreni: DMEM supplementato con 10% FBS, 1% Kanamicina, 1% aminoacidi non essenziali per le MDA-MB231 e MCF7; RPMI 10% FBS, 1% Kanamicina, 1% aminoacidi non essenziali per le COV318, NCI-H1975 e NCI-H1299, con aggiunta di 2 mM Sodio Piruvato per le PEO-1; RPMI 20% FBS, 1% Kanamicina, 1% aminoacidi non essenziali per le HCT-15; LEIBOVITZ'S L15, 10% FBS, 1% Kanamicina, 1% aminoacidi non essenziali per le SW948. Tutti i reagenti sono stati acquistati alla Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) se non specificato altrimenti.
Per allestire gli esperimenti di citotossicità le cellule sono state tripsinizzate, contate con la camera di NEUBAUER e piastrate in piastra nera da 96 pozzetti per linea (Perkinelmer). Le MDA-MB231, PEO-1, COV318, SW948, NCI-H1975 e NCI-H1299, sono state piastrate a 100.000 cellule/ml, le HCT-15 e MCF-7 a 40.000 cellule/ml, In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti e/o i farmaci in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: 6x10<-6 >M; 1.2x10<-5 >M; 2.4x10<-5 >M; 4.8x10<-5 >M; 9.6x10<-5 >M; 1.92x10<-4 >M per il C8 (soluzione stock 10 mM, DMSO100%) e 8x10<-6 >M; 1.6x10<-5 >M; 3.2x10<-5 >M; 6.4x10<-5 >M; 1.28x10<-4 >M; 2.56x10<-4 >M per il C21 (soluzione stock 50 mM, DMSO 100%). Il cisplatino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) è stato aggiunto alle concentrazioni di 1x10<-7 >M; 1x10<-6 >M; 2x10<-6 >M; 5x10<-6 >M; 1x10<-5 >M ed il paclitaxel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) alle concentrazioni di 1x10<-9 >M; 1x10<-8 >M; 1x10<-7 >M; 1x10<-6 >M; 1x10<-5 >M. Per la valutazione dell’effetto sinergico nelle PEO-1 è stato aggiunto il composto 8 alla concentrazione fissa dell’IC50, al cisplatino o al paclitaxel. In parallelo sono state effettuate le singole curve di ogni farmaco e del C8. Dopo 72h dall’aggiunta dei composti e/o farmaci, è stato valutato l’effetto sulla crescita cellulare mediante l’utilizzo del kit ATPlite (PerkinElmer) seguendo le specifiche del produttore. Il segnale di luminescenza è stato letto allo strumento ENspire (PerkElmer). Per ogni linea trattata, è stata calcolata la % di inibizione della crescita rispetto al controllo e l’IC50 con il software GraphPad Prism5 Software (San Diego, CA, USA). L’indice di combinazione (CI) è stato calcolato utilizzando il programma Compusyn (scaricabile da www.combosyn.com), per l’analisi degli effetti combinati dei farmaci basato sull’equazione di Chou-Talalay (Chou-Talalay, Adv Enzyme Regul 1984;22:27- 55). CI <1, =1, e >1 indica rispettivamente sinergismo, effetto additivo ed antagonismo.
2. RISULTATI DEI TEST SPERIMENTALI
Esempio 1. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle MDA-MB231.
Le MDA sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in figura 4 e tabella 1 indicano che la linea tumorale di mammella MDA-MB231, incubata per 72h con il composto 8 a varie diluizioni scalari, presenta un’inibizione della crescita cellulare. La dose del composto 8 inibente il 50% (IC50) della crescita cellulare è risulta pari a 65±15 µM. Analogamente il composto 21 inibisce la crescita del 50% a 75±12 µM.
Esempio 2. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle MCF-7.
Le MCF-7 sono state piastrate (40.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in tabella 1 indicano che la linea tumorale di mammella MCF-7, incubata per 72h con i composti 8 e 21 a varie diluizioni scalari, non presenta un’inibizione della crescita cellulare (IC50 > 100 µM). Esempio 3. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle HCT-15.
Le HCT-15 sono state piastrate (40.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in figura 5 indicano che la linea tumorale di colon HCT-15, incubata per 72h con il composto 8 a varie diluizioni scalari, presenta una debole inibizione della crescita cellulare. La dose del composto 8 inibente il 50% (IC50) la crescita cellulare è risulta pari a 98.5±0.5 µM. Il composto 21 non presenta attività inibitoria (IC50 > 100 µM), (Tab.1).
Esempio 4. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle SW948.
Le SW948 sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in tabella 1 indicano che la linea tumorale di colon SW948, incubata per 72h con i composti 8 e 21 a varie diluizioni scalari, non presenta un’inibizione della crescita cellulare (IC50 > 100 µM). Esempio 5. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle COV318.
Le COV318 sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in tabella 1 indicano che la linea tumorale di ovaio COV318, incubata per 72h con i composti 8 e 21 a varie diluizioni scalari, non presenta un’inibizione della crescita cellulare (IC50 > 100 µM). Esempio 6. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle PEO-1.
Le PEO-1 sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in figura 5 indicano che la linea tumorale di ovaio PEO-1, incubata per 72h con il composto 8 a varie diluizioni scalari, presenta un’inibizione della crescita cellulare. La dose del composto 8 inibente il 50% (IC50) la crescita cellulare è risulta pari a 44±6.5 µM. Il composto 21 non presenta attività inibitoria (IC50 > 100 µM) (Tab.1).
Esempio 7. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle NCI-H1975.
Le NCI-H1975 sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in tabella 1 indicano che la linea tumorale di polmone NCI-H1975, incubata per 72h con i composti 8 e 21 a varie diluizioni scalari, non presenta un’inibizione della crescita cellulare (IC50 > 100 µM).
Esempio 8. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 sulle NCI-H1299.
Le NCI-H1299 sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento sono stati aggiunti i composti in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: C8 (6 µM; 12 µM; 24 µM; 48 µM; 96 µM; 192 µM) e C21 (8 µM; 16 µM; 32 µM; 64 µM; 128 µM; 256 µM). I risultati mostrati in figura 5 indicano che la linea tumorale di polmone NCI-H1299, incubata per 72h con il composto 8 a varie diluizioni scalari, presenta un’inibizione della crescita cellulare. La dose del composto 8 inibente il 50% (IC50) la crescita cellulare è risulta pari a 87.8±10 µM. Il composto 21 non presenta attività inibitoria (IC50 > 100 µM), (Tab.1).
Esempio 9. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico del composto 8 in combinazione con il cisplatino nelle PEO-1.
Le PEO-1 sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento è stato aggiunto il cisplatino in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: 1x10<-7 >M; 1x10<-6 >M; 2x10<-6 >M; 5x10<-6 >M; 1x10<-5 >M in combinazione con il composto 8 alla concentrazione dell’IC50 pari a 44 µM. In parallelo sono state effettuate le singole curve di cisplatino e composto 8. I risultati mostrati in tabella 2 indicano che nella linea tumorale di ovaio PEO-1 la combinazione cisplatino composto 8 ha un effetto sinergico, maggiore per la combinazione cisplatino 10 µM C8 44 µM (CI=0.69±0.01). L’indice di combinazione (CI) è stato calcolato utilizzando un programma per l’analisi degli effetti combinati dei farmaci basato sull’equazione di Chou-Talalay (Adv Enzyme Regul 1984;22:27- 55), dove un CI <0.1 indica sinergismo molto forte; 0.1–0.3 sinergismo forte; 0.3–0.7 sinergismo; 0.7–0.85 sinergismo moderato; 0.85–0.90 sinergismo debole; 0.90–1.10 effetto quasi additivo; 1.10–1.20 antagonismo debole; 1.20–1.45 antagonismo moderato; 1.45–3.3 antagonismo; 3.3–10 antagonismo forte; >10 antagonismo molto forte (Chou TC. Pharmacol Rev. 2006;58:621-81). In particolare, l’aggiunta di composto 8 al cisplatino riduce l’IC50 del cisplatino nelle PEO-1 da 7.9±0.65 a 0.1±0.01 µM (Tab 3).
Esempio 10. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico del composto 8 in combinazione con il paclitaxel nelle PEO-1.
Le PEO-1 sono state piastrate (100.000 cellule/ml) in una piastra nera da 96 pozzetti. In ogni pozzetto della piastra sono stati aggiunti 200 µl di sospensione cellulare. Dopo 24h dal piastramento è stato aggiunto il paclitaxel in quadruplicato alle seguenti concentrazioni: 1x10<-9 >M; 1x10<-8 >M; 1x10<-7 >M; 1x10<-6 >M; 1x10<-5 >M in combinazione con il composto 8 alla concentrazione dell’IC50 pari a 44 µM. In parallelo sono state effettuate le singole curve del paclitaxel e composto 8. I risultati mostrati in tabella 4 indicano che nella linea tumorale di ovaio PEO-1 la combinazione paclitaxel composto 8 ha un debole effetto sinergico per la combinazione paclitaxel 1x10<-9 >M C844 µM (CI=0.87±0.023). L’indice di combinazione (CI) è stato calcolato utilizzando un programma per l’analisi degli effetti combinati dei farmaci basato sull’equazione di Chou-Talalay (Adv Enzyme Regul 1984;22:27- 55), dove un CI <0.1 indica sinergismo molto forte; 0.1– 0.3 sinergismo forte; 0.3–0.7 sinergismo; 0.7–0.85 sinergismo moderato; 0.85–0.90 sinergismo debole; 0.90–1.10 effetto quasi additivo; 1.10–1.20 antagonismo debole; 1.20–1.45 antagonismo moderato; 1.45–3.3 antagonismo; 3.3–10 antagonismo forte; >10 antagonismo molto forte (Chou TC. Pharmacol Rev. 2006;58:621-81). In particolare, l’aggiunta di composto 8 al paclitaxel riduce l’IC50 del paclitaxel nelle PEO-1 da 7.0±0.01 a 0.64±0.057 nM (Tab 5).
Tabella 1. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico dei composti 8 e 21 su un pannello di linee cellulari tumorali.
Tabella 2. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico del composto 8 in combinazione con il cisplatino nella linea di carcinoma ovarico PEO-1.
C.I <0.1 Sinergismo molto forte; 0.1–0.3 Sinergismo forte; 0.3–0.7 Sinergismo; 0.7–0.85 Sinergismo moderato; 0.85–0.90 Sinergismo debole; 0.90–1.10 Quasi additivo; 1.10–1.20 Antagonismo debole; 1.20–1.45 Antagonismo moderato; 1.45–3.3 Antagonismo; 3.3–10 Antagonismo forte; >10 Antagonismo molto forte.
Tabella 3. Valori di IC50 per la combinazione cisplatino-composto 8 nelle
PEO-1.
Tabella 4. Valutazione in vitro dell’effetto citotossico del composto 8 in combinazione con il paclitaxel nella linea di carcinoma ovarico PEO-1.
C.I <0.1 Sinergismo molto forte; 0.1–0.3 Sinergismo forte; 0.3–0.7 Sinergismo; 0.7–0.85 Sinergismo moderato; 0.85–0.90 Sinergismo debole; 0.90–1.10 Quasi additivo; 1.10–1.20 Antagonismo debole; 1.20–1.45 Antagonismo moderato; 1.45–3.3 Antagonismo; 3.3–10 Antagonismo forte; >10 Antagonismo molto forte.
Tabella 5. Valori di IC50 per la combinazione Paclitaxel-composto 8 nelle PEO-1.
Tabella riassuntiva affinità di legame per NEK6 per tutti i composti di formula (A) e (B) calcolate dal programma Autodock
3. Discussione risultati e definizione di alcuni termini
Molecole con diversa struttura sono state saggiate ad una singola concentrazione pari a 30 µM in esperimenti di inibizione dell’attività chinasica di NEK6, utilizzando la tecnologia LANCE (Fig. 1). Dallo screening iniziale sono state identificate due molecole C8 e C21, rispettivamente (5Z)-2-hydroxy-4-methyl-6-oxo-5-[(5-phenylfuran-2-yl)methylidene]-5,6-dihydropyridine-3-carbonitrile e 6-amino-2-phenyl-5,7,9-triazatetraciclo[8.7.0.0³,⁸.0¹¹,¹⁶]heptadeca-1(10),3(8),6,11,13,15 hexaene -4, 17-dione, aventi IC50 pari a 3.4 ± 1.2 e 2.6 ± 0.05 µM (IC50 ± SEM), rispettivamente (Fig. 2). L’attività inibitoria dei due composti su NEK6 è stata verificata con una seconda metodica (Off-chip Mobility shift assay) che ha dato valori di IC50 pari a 13.8 µM e 49.8 µM per il C8 ed il C21, rispettivamente (CARNA Biosciences Study ID: CBS170097). I composti selezionati sono stati in seguito testati su un pannello di linee cellulari tumorali per valutarne l’attività citotossica. I livelli di espressione di NEK6 nelle linee utilizzate sono mostrati in figura 3 (Fig.3). Le cellule sono state incubate per 72h con i composti C8 e C21 a differenti concentrazioni, e l’effetto citotossico è stato determinato misurando i livelli di ATP (proporzionali al numero di cellule vitali). I risultati degli esperimenti di citotossicità mostrano che il composto 8 determina un’inibizione della crescita cellulare nelle linee cellulari tumorali di mammella (MDA-MB-231), ovaio (PEO-1), polmone (NCI-H1299) e colon (HCT-15). Per ognuna di queste linee è stato calcolato l’IC50 del composto che ha dato valori inferiori a 100 µM (Fig. 4, 5, Tab. 1). Il composto 8 non è risultato attivo nelle linee di colon (SW948), mammella (MCF-7), ovaio (COV318) e polmone (NCI-H1975) (IC50 > 100 µM). Il composto 21 ha mostrato attività citotossica con IC50 inferiore a 100 µM solo nelle MDA-MB-231, mentre non presenta attività minore sulle altre linee (IC50 > 100 µM) (Fig. 4, Tab.
1). I risultati ottenuti supportano lo sviluppo delle due molecole e di loro derivati per un trattamento personalizzato di patologie neoplastiche.
Nella presente invenzione è stato anche valutato l’effetto della combinazione del composto 8 con farmaci antitumorali noti nella linea PEO-1, dove il composto 8 è risultato essere più attivo. A tal fine, le cellule sono state trattate con diluizioni seriali di famaci citotossici (i.e. cisplatino e paclitaxel) in combinazione con una dose fissa del C8 (IC50) per 72h. Come riferimento sono state effettuate le curve dei singoli agenti. Per valutare l’attività citotossica dei singoli composti e della combinazione sono stati misurati i livelli di ATP. I risultati ottenuti mostrano che nella linea cellulare di tumore ovarico PEO-1, la combinazione cisplatino inibitore C8 ha un effetto sinergico (Tab.2) con una riduzione del’IC50 del cisplatino da 7.9±0.65 a 0.1±0.01 µM (Tab.3). Il valore di IC50 del cisplatino nelle PEO-1 è in accordo con quanto riportato in letteratura (3.2±1.4 µM ≥IC50≤ 12.79±1.15 µM) (Wang QE, et al. Mol Cancer. 2011;10:24; Stukova M, et al. J Inorg Biochem.2015;149:45-8). Nelle PEO-1 si è osservato inoltre un debole effetto sinergico per la combinazione paclitaxel inibitore C8 alla concentrazione di paclitaxel 1 nM (Tab. 4). L’aggiunta del C8 al paclitaxel determina una riduzione dell’IC50 da 7.0±0.001 nM a 0.64±0.057 nM (Tab.
5). Il valore di IC50 del paclitaxel riscontrato nelle PEO-1 risulta essere nel range dei valori riportati in letteratura (6.5 nM ≥IC50≤ 37 nM) (Fader AN, et al. Anticancer Res. 2010;30:4791-8; Stukova M, et al. J Inorg Biochem.
2015;149:45-8). La presente invenzione, ha portato all’identificazione di due scaffold molecolari attivi su NEK6 in grado di inibire la crescita di linee cellulari tumorali. L’utilizzo di tali molecole da sole o in combinazione con i farmaci chemioterapici attualmente utilizzati potrebbe determinare nuove strategie terapeutiche personalizzate per il paziente, migliorando in ultima analisi l’indice terapeutico.
3. Esperimenti di Citotossicità: esperimenti che permettono di valutare in vitro la capacità di un agente di inibire la crescita cellulare. La riduzione nel numero delle cellule può derivare sia dal blocco della proliferazione che dall’induzione di morte cellulare.
IC50: IC50 o concentrazione inibente 50, è la concentrazione di un composto necessaria per inibire del 50% l’attività del bersaglio in esame rispetto ai valori misurati in assenza di inibitore. L'IC50 è un parametro utilizzato per valutare l'efficacia di una sostanza nell'inibire il target ed è uno dei metodi comunemente usati nella ricerca farmacologica per misurare la potenza di un antagonista.
Sinergismo: si ha quando l’effetto di due farmaci è superiore alla somma algebrica dei loro singoli effetti. Basandosi sull’equazione di Chou-Talalay (Adv Enzyme Regul 1984;22:27-55), l’indice di combinazione (C.I) CI< 1, =1, e >1 indica rispettivamente sinergismo, effetto additivo, e antagonismo. Indice terapeutico: parametro farmacologico indice della sicurezza di un farmaco. È definito come il rapporto tra la dose letale mediana e la dose efficace mediana. Maggiore è il rapporto maggiore sarà la relativa sicurezza. Oggi più comunemente con Indice Terapeutico si intende il rapporto fra la dose massima tollerata e la dose minima efficace, o semplificando ulteriormente, fra dose tossica e dose efficace.
4. NEK6 è una serin treonin chinasi implicata nella separazione dei centrosomi e nel mantenimento del fuso mitotico. È noto che un’anormale funzione dei centrosomi, derivante dall’attività de-regolata delle chinasi mitotiche, può causare difetti del fuso e segregazioni anomale dei cromosomi. Questo porta ad un aumento dell’instabilità genomica e allo sviluppo del tumore.
Pur non volendo legare la presente invenzione ad alcuna teoria si può dedurre sulla base degli esperimenti che l’inibizione dell’attività di NEK6 da parte dei composti C8 e C21 potrebbe aumentare l’instabilità genomica nelle cellule tumorali fino a livelli incompatibili con la sopravvivenza delle stesse, determinando quindi un effetto citotossico selettivo sulle cellule neoplastiche e non sulle cellule normali (Dominguez-Brauer C. et al. Mol Cell. 2015;60:524-36). D’altra parte diversi studi in vitro dimostrano che l’inibizione dell’attività di NEK6, tramite RNA silencing o utilizzo di mutanti inattivi per l’attività chinasica, determina l’arresto mitotico e l’apoptosi di cellule tumorali (Fry et al. J Cell Sci 2012;125:4423-33). In particolare Nassirpour e colleghi hanno dimostrato che il silenziamento di NEK6 determina un aumento dell’espressione totale di BAD ed un decremento della sua fosforilazione, un aumento dei livelli di BAX, del taglio della caspasi-3 e di PARP in diverse linee tumorali. Questi elementi innescano il processo apoptotico (Nassirpour et al. Mol Cancer Res.2010;8:717-28).
Claims (14)
- Rivendicazioni 1. Composto secondo la formula di struttura generale (A)in cui R<1 >è un sostituente scelto tra uno qualsiasi dei seguenti gruppie in cui R<2 >è un sostituente scelto tra uno qualsiasi dei seguenti gruppi:, in forma di miscela racemica o di enantiomeri isolati o loro Sali o loro tautomeri, per uso in un metodo di trattamento di un tumore.
- 2. Composto per uso secondo la rivendicazione 1 scelto tra uno dei seguenti composti di formula Ain cui i sostituenti R<1 >e R<2 >sono scelti secondo le formule A1-A15:
- 3. Composto per uso secondo la rivendicazione 1 in cui detto composto ha la seguente formula di struttura:
- 4. Composto per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detto tumore è scelto tra tumore ovarico, tumore della ghiandola mammaria, del polmone e del colon-retto.
- 5. Composto per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui detto composto è usato in detto metodo di trattamento in associazione ad un chemioterapico.
- 6. Composto secondo in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 per uso come inibitore dell’attività chinasica della proteina NEK6 in un metodo di trattamento.
- 7. Composizione farmaceutica comprendente, come principio attivo, un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 ed un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
- 8. Composizione secondo la rivendicazione 7 comprendente come principio attivo un ulteriore chemioterapico.
- 9. Composizione secondo la rivendicazione 8 in cui detto ulteriore chemioterapico è scelto tra Paclitaxel o suoi derivati, farmaci appartenenti alla classe dei taxani, Cisplatino e composti a base di platino, composti antitumorali biologici.
- 10. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 9 per uso in metodo di trattamento.
- 11. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 10 in cui detto tumore è scelto tra tumore ovarico, tumore della ghiandola mammaria, del polmone e del colon-retto.
- 12. Kit di parti per uso in metodo di trattamento di un tumore comprendente un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 ed un farmaco chemioterapico.
- 13. Composto secondo la formula di struttura generale (A)(A) in cui R<1 >è un sostituente scelto tra uno qualsiasi dei seguenti gruppie in cui R<2 >è un sostituente scelto tra uno qualsiasi dei seguenti gruppi:, in forma di miscela racemica o di enantiomeri isolati o loro Sali o loro tautomeri.
- 14. Metodo per la preparazione di uno qualsiasi dei composti della rivendicazione 13 comprendente i seguenti passaggi di sintesi:
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