IT201800003639A1 - Derivati arilfenolici, loro metodo di preparazione e loro usi - Google Patents
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Description
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 K 31 085
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 K 31 09
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 K 31 343
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 K 31 357
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 K 31 381
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 K 31 385
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 P 25 28
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 P 19 10
Sezione Classe Sottoclasse Gruppo Sottogruppo
A 61 P 11 06
Titolo
Derivati arilfenolici, loro metodo di preparazione e loro usi
DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo:
“Derivati arilfenolici, loro metodo di preparazione e loro usi”
SETTORE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a derivati arilfenolici di formula (I), al loro metodo di preparazione, ai loro usi e alle loro formulazioni farmaceutiche. In particolare, i composti dell’invenzione sono dotati di attività inibitoria della 5-lipossigenasi (5-LOX) e di una rilevante attività antitumorale.
TECNICA ANTERIORE
Si identifica con il termine di lipossigenasi (Linoleato ossigeno ossidoreduttasi, nota più comunemente con l’abbreviazione di LOX) una famiglia eterogenea di enzimi in grado di perossidare i lipidi e di causare l’ossigenazione di acidi grassi polinsaturi trasformandoli, così, nei corrispettivi derivati idroperossidici. Tali ossidoreduttasi sono ampiamente espresse in organismi sia di origine animale che vegetale e la loro attività è di fondamentale importanza per la sintesi di differenti segnali molecolari responsabili, altresì, di profondi cambiamenti metabolici e strutturali all’interno delle cellule (Maccarrone et al., 2001) (Kühn et al., 1999). Le lipossigensi metabolizzano l’acido arachidonico liberato dalle membrane cellulari ad opera della fosfolipasi A2 ed in base alla posizione in cui viene addizionato l’ossigeno all’acido arachidonico, durante il processo catalitico, sono distinte varie isoforme di LOX come la 5-LOX (Hammarberg T., 2002), la 12-LOX (Yoshimoto and Takahashi, 2002), la 15-LOX1 e la 15-LOX2 (Kuhn et al., 2002).
La biosintesi degli ormoni lipidici, porta alla sintesi di leucotrieni, lipossine e/o acidi grassi idrossidici. I leucotrieni costituiscono gli elementi di una delle più potenti classi di mediatori biologici, definiti nello specifico come derivati lipidici dall’acido arachidonico (Funk et al., 2001). I leucotrieni (LT) sono stati riconosciuti fra i vari mediatori di una vasta gamma di reazioni infiammatorie e allergiche quali artrite reumatoide, malattie infiammatorie intestinali, psoriasi, rinite allergica anche se la loro implicazione fisiopatologica primaria è legata all’asma bronchiale (Samuelsson et al, 1987; Lewis et al, 1990). Nell’uomo, la 5lipossigenasi (5-LOX, NCBI Reference Sequence: NM_000698.4) è presente in prevalenza nei leucociti maturi, compresi granulociti, monociti/macrofagi, mastociti, linfociti B e nelle cellule dendritiche, dove la capacità di esprimere l’enzima è acquisita durante la maturazione cellulare (Steinhilber et al., 1999). Recenti studi (Gilbert e Bartlett et al., 2011) hanno permesso di ottenere informazioni alquanto dettagliate sulla struttura cristallografica della 5-LOX. Essa presenta un dominio N-terminale “C2-like” (aa 1-120), a struttura β-barrel, ed un esteso dominio catalitico C-terminale (aa 121-673) (Allard et al., 2005). Il primo svolge diverse funzioni, come quella di legare vari lipidi (tra cui i lipidi di membrana) e ioni, quali Ca<2+ >e Mg<2+>. In particolare l’interazione con gli ioni Ca<2+ >si è rivelata fondamentale per l’attivazione enzimatica (Chen. et al.,1998) (Chen et al., 2001) (Hammarberg et al., 2002) (Kulkarni et al., 2002). Il secondo ha principalmente una struttura secondaria α-elicoidale e contiene il ferro, responsabile della catalisi, coinvolto in quattro legami di coordinazione, tre dei quali con tre istidine altamente conservate (Hys<367>, Hys<372 >e Hys<550>) ed il rimanente con il gruppo carbossilico terminale di una isoleucina (Ile<673>). Nella sua forma inattiva, il ferro è presente allo stato ferroso (Fe<2+>). Gli amminoacidi presenti nel sito attivo della 5-LOX sono Tyr<181>, Ala<603>, Ala<606>, His<600 >e Thr<364>. Le piccole catene laterali delle alanine Ala<603 >e Ala<606 >sono fondamentali per stabilizzare, tramite interazioni di Van der Waals, la conformazione della tirosina Tyr<181>, che insieme alla fenilalanina Phe<177>, forma una sorta di “tappo” a ridosso della cavità catalitica. La presenza di un amminoacido addizionale, il triptofano Trp<599>, sembra rafforzare l’occlusione della cavità mentre l’asparagina Asn<407 >e l’istidina His<432 >aiutano a definire i limiti del sito attivo.
La 5-LOX catalizza l’ossidazione dell’acido arachidonico mediante introduzione di una molecola di ossigeno e conseguente formazione dell’idroperossido corrispondente, precursore dei leucotrieni, quest’ultimi costituiscono gli elementi di una delle più potenti classi di mediatori biologici, definiti nello specifico come derivati lipidici dall’acido arachidonico (Funk et al., 2001). La loro biosintesi richiede un’attivazione cellulare che stimola la conversione dell’acido arachidonico in messaggeri biologicamente attivi. In presenza di uno stimolo esterno, la Fosfolipasi A2 libera l’acido arachidonico dai fosfolipidi di membrana; tale intermedio diventa substrato di differenti enzimi come le ciclossigenasi (COX-1 e COX-2) che portano alla formazione di prostaglandine (PG) e trombossano A2 (TXA2) e le lipossigenasi responsabili della sintesi dei leucotrieni (Dahlén S.E. et al, 2006). Lo step iniziale della biosintesi dei leucotrieni è rappresentato dall’acquisizione dell’acido arachidonico da parte della 5-lipossigenasi, 5-LOX (Werz, 2002). Questa diossigenasi solubile incorpora l’ossigeno molecolare alla posizione 5 dell’acido grasso, catalizzando la sua conversione nell’acido 5(S)-idroperossieicosatetranoico (5-HPETE). Quest’ultimo, per azione della stessa lipossigenasi, è ulteriormente convertito ad un derivato epossidico instabile, noto come Leucotriene A4 (LTA4). Il destino dell’epossido LTA4 dipenderà, poi, dal tipo di cellula presa in considerazione e dal tipo di enzimi in essa presenti: 1) LTA4 può essere convertito nel leucotriene B4 (LTB4) per azione di una LTA4 idrolasi, un enzima zinco-dipendente citosolico di 69 kDa, presente nella maggior parte delle cellule dei mammiferi; 2) LTA4 può essere metabolizzato a Leucotriene C4 (LTC4) sia per azione di una LTC4 sintetasi (localizzata, in prevalenza, nei mastociti e negli eosinofili) che per azione di alcuni membri appartenenti alla famiglia enzimatica delle proteine associate alla membrana coinvolte nel metabolismo degli eicosanoidi e del glutatione (MAPEG) quali la MGST2 (“microsomal glutathione S-transferase type2”, glutatione-S-transferasi microsomiale di tipo 2) o la MGST3 (“microsomal glutathione S-transferase type3” glutatione-S-transferasi microsomiale di tipo 3,) in grado di coniugare LTA4 al glutatione per ottenere il corrispettivo LTC4. Quest’ultimo viene rilasciato nell’ambiente extracellulare e qui per successivo taglio di uno o due aminoacidi porta alla formazione dei Leucotrieni LTD4 ed LTE4. In alternativa, LTA4 rilasciato dalla 5-LOX, piuttosto che essere impiegato dalla cellula in cui è sintetizzato, può essere trasferito in cellule vicine che non sono in grado di produrne autonomamente, ma che comunque esprimono gli enzimi LTA4 idrolasi o LTC4 sintasi/ MAPEG (ad esempio le cellule parenchimali o eritrociti). È da aggiungere, infine, che l’azione combinata di 5-LOX, 12-LOX e 15-LOX può portare alla produzione delle Lipossine (LX) (Serhan et al., 1999), lipidi contenenti una porzione triidrossitetraenica, che fungono da segnali di stop del processo infiammatorio e da promotori della guarigione della ferita (Werz O. et al., 2006).
È oramai noto che il metabolismo dell’acido arachidonico promuove l’insorgenza e la progressione del cancro (Hoque A, 2005) e che vari tipi di tumori solidi, come i carcinomi al pancreas (Ding et al., 1999; Tong et al.2001; Kennedy et al.2003) alla prostata (Ghosh and Myers, 1998) e al colon (Wachtershauser A. et al 2000) sovra-esprimono almeno una delle diverse isoforme di LOX; l’attività di questi enzimi è basalmente accompagnata da una produzione di perossidi, necessaria per mantenere l’atomo di ferro al sito catalitico nella forma funzionale ossidata. È stato, inoltre, evidenziato come alcune delle forme più aggressive di cancro intervengono nelle alterazioni endocrine, attraverso l’aumentata sintesi di prostaglandine e leucotrieni, che formano un sistema integrato per regolare la crescita del tumore. Il coinvolgimento diretto del pathway della 5-LOX nella proliferazione e sopravvivenza delle cellule tumorali è stato convalidato da diverse indagini, in particolare si è visto che:
(I) gli enzimi necessari per la biosintesi dei LTs, così come i recettori per i LTs, sono presenti o addirittura over-espressi in cellule trasformate o in tessuti neoplastici; (II) una cospicua formazione di prodotti della 5-LOX avviene in questi siti;
(III) l’aggiunta dall’esterno di prodotti della 5-LOX stimola la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule tumorali,
(IV) l'inibizione farmacologica o genetica della 5-LOX inibisce la crescita delle cellule tumorali e induce l'apoptosi.
In letteratura vari sono gli esempi in cui la 5-LOX è stata rilevata in abbondanza in linee cellulari di cancro di origine animale o umana quali cancro al cervello (Boado, R. et al., 1992), seno (Przylipiak A., et al.1998) colon (Wachtershauser A. et al., 2000), mucosa esofagea (Zhi H, 2003, Hoque A 2005), polmone (Avis I.M 1996), reni (Matsuyama M., 2005), mesotelio (Romano M., 2001), pancreas (Knab L.M., 2014), e della prostata (Ghosh J. 1999), e nella maggior parte di questi studi si ha anche un concomitante aumento dei prodotti della 5-LOX (el-Hakim I.E,1990, Ghosh J., 1997). Studi effettuati presso il Medical College di New York (Kummer N.T., 2012) hanno mostrato che l’espressione della 5-LOX nel carcinoma papillare della tiroide (PTC) promuove l’attecchimento della patologia tramite l’induzione delle metalloproteinasi (MMPs). Tali enzimi, attivati sia dalla 5-LOX che dal suo prodotto, l’acido 5-idrossieicosatetranoico, sono in grado di degradare e rimodellare la matrice extracellulare, promuovendo l’invasione cellulare. Per confermare l'implicazione della 5-LOX nella patofisiologia del cancro, molti ricercatori hanno applicato l’impiego di strumenti farmacologici come gli inibitori della 5-LOX (Ding X.Z., 1999, Tong W.G,2002 Kennedy T.J., 2003), inibitori della FLAP (Przylipiak A., 1998), inibitori della LTA4 idrolasi (Chen X, 2003, Chen X.2004) ed antagonisti dei LTs (Nakano R, 1998, Tong W.G.
2002) che hanno attenuato gli effetti attribuiti alla 5-LOX e ai suoi metaboliti, bloccando la proliferazione delle cellule e inducendo apoptosi, in vitro e in vivo. Trattando, sia le cellule della linea BL41, sia i cloni E2b ed E2R, con inibitori della 5-LOX (NDGA, BWA4C, AA861, MK886) è stato possibile evidenziare un forte effetto di riduzione dei livelli ossidativi basali. Un simile effetto antiossidante non è stato mai riscontrato utilizzando inibitori di altri sistemi enzimatici, per esempio della xantina ossidasi, della forma inducibile dell’ossido nitrico sintasi o inibitori delle ciclossigenasi. Queste ultime evidenze suggeriscono l’ipotesi di un preponderante contributo dato in particolare dalla 5-LOX alla generazione dello stato ossidativo spontaneo dopo uno stimolo pro-infiammatorio. Anche nel sistema cellulare di linfoma di Burkitt è stata studiata, mediante RTPCR qualitativa, l’espressione delle varie isoforme lipossigenasiche, ed è stato trovato che sono sovraespresse nella linea EBV+ E2R rispetto a BL41, le isoforme 12-LOX e 5-LOX, mentre le altre lipossigenasi sono solo debolmente espresse o assenti, così come le ciclossigenasi. L’analisi di espressione della isoforma 5-LOX è stata effettuata anche mediante PCR quantitativa in Real-Time (Light Cycler) estendendola a tutti i cloni cellulari ed è stato possibile dimostrare una chiara e diretta correlazione tra i livelli ossidativi e l’espressione di questo enzima: la presenza extra di perossidi nelle linee EBV+ potrebbe quindi essere la spia di una elevata attività della 5-LOX e i ROS dei sottoprodotti dell’attività lipossigenasica. Gli stimoli che nei linfociti B comportano l’attivazione della 5-lipossigenasi sono: l’acido arachidonico, i perossidi, il Ca++, ma anche lo shock osmotico; inibitori di proteintirosin fosfatasi, citochine infiammatorie; inoltre l’attività della 5-LOX è dipendente da eventi fosforilativi che interessano la Serina 271, fosforilata tramite la via della p38MAPK e la Serina 663, fosforilata tramite la via di ERK1/2 (Werz et al.2002).
Analizzando i dati presenti in letteratura si evince come i polifenoli costituiscono una sorgente ricca di inibitori della sintesi dei prodotti della 5-LOX, questi composti variano enormemente nella struttura e di conseguenza nella loro efficacia. Sebbene sembri che un incremento della lipofilia (dovuto a estese catene alchiliche) e del numero di gruppi fenolici governi la potenza, in realtà confrontando le strutture così differenti di questi composti, le SAR risultano poco chiare (Wagner et al., 1989). Per alcuni di questi, la potenza nell’inibizione della 5-LOX è correlata alla loro capacità di neutralizzare i radicali liberi o sopprimere la perossidazione dei lipidi (Laughton et al., 1991). Uno studio finalizzato ad indagare sulle caratteristiche di legame di inibitori tipici della 5-LOX, quali NDGA, acido caffeico ed esculetina, ha rivelato che questi composti, in aggiunta all’azione antiossidante, possiedono la capacità di legare l’enzima (Du L et al., 2006). Ad ogni modo resta il fatto che, essendo i vari polifenoli strutturalmente e chimicamente molto differenti tra loro, è molto difficile dedurre con precisione le SAR e il meccanismo d’azione per questa classe di composti. Tra i composti che mostrano una buona potenza nell’inibire la 5-LOX vanno citati: iperforina (IC50=1,2µM in cellula e 0,09µM sulla 5-LOX purificata); mirtucommulone (IC50=1,8µM in cellula e 5µM sulla 5-LOX purificata); medicarpina (IC50=0,5 in cellula) e 6-idrossi-2-(2-idrossi-4-metossifenil)-benzofurano (IC50=0,05µM in cellula e 0,08µM sulla 5-LOX purificata); 3,4,2’,4’-tetraidrossi-2-geranildiidrocalcone (IC50=1µM in cellula e 0,05µM sulla 5-LOX purificata); curcumina (IC50=2,7 µM in cellula e 0,7-30 µM sulla 5-LOX purificata) e gingeroli (IC50=0,004-3 µM in cellula). Infine, va citato il resveratrolo di cui è stata dimostrata la capacità di inibire la biosintesi dei LTs in cellule di PMNL con un valore di IC50=1,37-8,9µM (Kimura et al., 1985). Tuttavia anche composti carenti di proprietà antiossidanti mostrano di essere altamente efficienti (Feisst et al., 2004).
Attualmente, l’unico inibitore presente in commercio in grado di bloccare l’azione della 5-LOX è lo zileuton. Esso è stato approvato dall’FDA per la profilassi ed il trattamento cronico dell’asma negli adulti e nei bambini a partire dai 12 anni di età. La posologia attualmente utilizzata prevede una somministrazione di una compressa da 600 mg, quattro volte al giorno. Per convenienza può essere assunto in prossimità dei pasti e prima di andare a letto, per tutta la durata dei sintomi. Chimicamente esso corrisponde all’ (±)-1-(1-Benzo[b]tien-2-iletil)-l-idrossiurea e viene somministrato oralmente come miscela racemica dei due enantiomeri R(+) and S(-). Lo zileuton inibisce selettivamente la 5-LOX nella sintesi dei leucotrieni. Diversi studi hanno, infatti, dimostrato che esso produce effetti scarsi o nulli sull’inibizione di altri enzimi correlati, quali 12-lipossigenasi (12-LOX), 15-lipossigenasi (15-LOX) e cicloossigenasi a concentrazioni superiori a 100 µM. (Bell et al.1992).
Lo zileuton appartiene alla classe degli inibitori “leganti il ferro”. Tali composti, rappresentati da acidi idrossammici o da derivati N-idrossiureidici espletano la loro attività chelando il ferro del sito attivo, pur essendo in possesso di deboli proprietà riducenti. Lo zileuton (con una IC50 = 0,5-1µM nei leucociti stimolati) ha fornito un miglioramento nelle compromissioni acute e croniche delle funzioni delle vie aeree, tale da ridurre la necessità di un trattamento a base di β-agonisti o glucocorticoidi; per tali ragioni è stato approvato negli Stati Uniti per il trattamento dell'asma con il nome commerciale di Zyflo<®>. Tuttavia, il suo impiego nel trattamento della rinite allergica, dell’artrite reumatoide e della malattia infiammatoria intestinale, è risultato non soddisfacente (Werz, & Steinhilber, 2005).
Per quanto concerne il profilo di sicurezza sono stati riscontrati dei problemi a livello epatico (idiosincrasia metabolica) con aumento dei valori delle transaminasi soprattutto nel primo trimestre di terapia. Per tale motivo ne è sconsigliato l’uso a pazienti con sofferenza epatica o aumento dei valori delle transaminasi, inoltre è consigliabile la valutazione delle transaminasi sia prima di iniziare la terapia che durante la somministrazione. Pertanto l’utilizzo di zileuton è strettamente collegato ad una applicazione nelle patologie di infiammazione acuta e prevede una dose di utilizzo estremamente alta.
Pertanto, vi è la necessità di sviluppare inibitori selettivi della 5-LOX che siano efficaci nel trattamento di diverse patologie mediate dai leucotrieni (quali asma, rinite allergica, artrite reumatoide e malattie infiammatorie intestinali) e con un elevato profilo di sicurezza, che ad esempio non causino problemi a livello epatico né aumento dei valori delle transaminasi. Inoltre, nonostante il forte potenziale della terapia anti-LTs nella prevenzione e trattamento del cancro, finora, poche prove cliniche sono state attuate per la valutazione dell’efficacia di farmaci inibitori della 5-LOX nella terapia antitumorale. A tal proposito l'inibizione di un singolo gene o di una singola via di segnale risulta tuttavia poco influente, è necessario disporre di composti con attività sinergiche che hanno per target geni e vie di segnale in modo da modificarne rispettivamente l'espressione e l'attività. La conoscenza dei network di segnali che risultano disregolati ed al tempo stesso rilevanti in una determinata neoplasia rappresenta un elemento essenziale nella strategia chemiopreventiva e terapeutica. Difatti alcune delle forme più aggressive di cancro al seno sono più vulnerabili alla chemioterapia quando il regime terapeutico prevede una classe multitarget di agenti anti-cancro, ossia in grado di agire sulla regolazione di numerose cascate biochimiche, inclusi fattori di trascrizione, fattori di crescita, citochine infiammatorie, protein-chinasi ed altri enzimi. E’ quindi di notevole interesse terapeutico la scoperta di agenti in grado di inibire contemporaneamente sia l’attività enzimatica della 5-lipossigenasi che la regolazione di proteine che sono alla base della trasformazione neoplastica. Tra i vari target molecolari risulta rilevante la via di trasduzione del segnale della PI3K/AKT/mTOR che ha una funzione critica nella proliferazione cellulare, nella sua progressione, nell’apoptosi e nel metabolismo. AKT è la serinatreonina chinasi che viene direttamente attivata in risposta a PI3K, ed è il più importante effettore della PI3K (Engelman et al., 2006). E' stato dimostrato che gli eicosanoidi (PGE2 e LTB4) promuovono la sopravvivenza delle cellule tumorali umane attraverso l'attivazione di percorsi di PI3K/AKT/mTOR, cascate overespresse nel carcinoma mammario. Attualmente, vi è uno sviluppo clinico di molti composti che hanno come bersaglio l’asse di sopravvivenza di PI3K/AKT/mTOR; in particolare sono state sviluppate molecole in grado di inibire PI3K, AKT ed inibitori di mTOR, sia allosterici (rapamicina e derivati) che del sito catalitico. Di notevole importanza è la complessa regolazione di mTORC1, che gioca un ruolo fondamentale da un punto di vista terapeutico, ed infatti è per questo che attualmente si stanno sviluppando doppi inibitori di PI3K ed mTOR. Questa nuova strategia potrebbe infatti offrire un vantaggio terapeutico, non essendo la PI3K l’unico regolatore di mTOR (Engelman, 2009).
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive la sintesi e mostra l’efficacia biologica di nuovi derivati fenolici utili come inibitori della 5-lipossigenasi in grado di modulare l’asse di sopravvivenza di PI3K/AKT/mTOR. In particolare, i nuovi derivati fenolici sono composti di formula generale (I) e presentano un sostituente arilico (Ar) variamente funzionalizzato legato ad un nucleo polifenolico.
I composti oggetto della presente invenzione sono rappresentati dalla formula generale (I)
in cui X e Y sono indipendentemente OH oppure H;
Ar è selezionato dal gruppo costituito da: fenil, diidrobenzodiossinil, benzofuranil, benzotiofenil, naftalenil, tiantrenil, antracenil, dibenzotienil e dibenzofuranil ed è opzionalmente sostituito da uno o più sostituenti selezionati dal gruppo costituito da: R, OR ed alogeno, in cui R è selezionato dal gruppo costituito da: H, C1-C6 alchile e fenile.
Lo studio di drug design mirato all'ottenimento di molecole in grado di inibire la 5-LOX ha rivelato che la potenza dei composti dipende fortemente dalle caratteristiche strutturali dei residui lipofili. Sorprendentemente, il composto più attivo della serie dei derivati 3-eteroarilfenolici sopprime potentemente la biosintesi dei leucotrieni mediante inibizione diretta della 5-LOX, con una notevole efficacia in vivo su modelli animali di infiammazione cronica. In particolare, inibisce la sintesi dei leucotrieni in cellule intatte con potenza costante, non influenzati dal tipo di cellula o dal tipo di stimolo, e riduce marcatamente l'attività enzimatica della mPGES-1 umana (Numero Accesso in banca dati NCBI: NP_004869.1, versione: O14684 GI:7387730).
Forma pertanto un oggetto della presente invenzione un composto di formula generale (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili:
in cui X e Y sono indipendentemente OH oppure H;
Ar è selezionato dal gruppo costituito da: fenil, diidrobenzodiossinil, benzofuranil, benzotiofenil, naftalenil, tiantrenil, antracenil, dibenzotienil e dibenzofuranil ed è opzionalmente sostituito da uno o più sostituenti selezionati dal gruppo costituito da: R, OR ed alogeno, in cui R è selezionato dal gruppo costituito da: H, C1-C6 alchile e fenile.
Preferibilmente, Ar è selezionato dal gruppo costituito da: fenil, clorofenil, diidrobenzodiossinil, fenossifenil, benzofuranil, benzotiofenil, naftalenil, etossinaftalenil, tiantrenil, antracenil, dibenzotienil e dibenzofuranil.
Preferibilmente, Ar è selezionato dal gruppo costituito da: fenil, 4-clorofenil, 3-clorofenil, 2,3-diidrobenzo[b][1,4]diossin-7-il, 3-fenossifenil, 4-fenossifenil, 2-fenossifenil, benzofuran-2-il, benzo[b]tiofen-2-il, benzo[b]tiofen-3-il, naftalen-7-il, 2-etossinaftalen-1-il, tiantren-9-il, antracen-9-il, 4-dibenzotienil, 4-dibenzofuranil, 3-dibenzofuranil.
Ancora più preferibilmente, il composto di formula generale (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili come definito sopra è selezionato dal gruppo costituito da: 1-fenil-3,4-benzediolo;
1-(4-clorofenil)-3,4-benzenediolo;
1-(3-clorofenil)-3,4-benzenediolo;
1-(4-idrossifenil)-3,4-benzenediolo;
4-(2,3-diidrobenzo[b][1,4]diossin-6-il)benzene-1,2-diolo;
1-(3-fenossifenil)-3,4-benzenediolo;
1-(4- fenossifenil)-3,4-benzenediolo;
4-(benzofuran-2-il)benzene-1,2-diolo;
4-(benzo[b]tiofen-2-il)benzene-1,2-diolo;
4-(benzo[b]tiofen-3-il)benzene-1,2-diolo;
4-(naftalen-7-il)benzene-1,2-diolo;
4-(2-etossinaftalen-1-il)benzene-1,2-diolo;
4-(tiantren-6-il)benzene-1,2-diolo;
4-(antracen-10-il)benzene-1,2-diolo;
4-(dibenzotiofen-2-il) benzene-1,2-diolo;
4-(dibenzofuran-2-il)benzene-1,2-diolo.
In una forma di realizzazione, il composto di formula generale (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili come definito sopra è caratterizzato dal fatto di essere un inibitore della 5-lipossigenasi.
In un’ulteriore forma di realizzazione, l’invenzione fornisce il composto di formula generale (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili come definito sopra per uso come medicamento, preferibilmente per uso nel trattamento di una patologia mediata dai derivati lipidici dall’acido arachidonico, preferibilmente i derivati lipidici dall’acido arachidonico sono leucotrieni, lipossine o acidi grassi idrossidici.
Preferibilmente, il composto di formula generale (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili sono per uso nel trattamento di una patologia infiammatoria; autoimmune; allergica; neurodegenerativa; vascolare; del tratto respiratorio; iperproliferativa; di osteoporosi o di una patologia caratterizzata dall’accumulo di liquidi. Preferibilmente, la patologia infiammatoria è selezionata dal gruppo costituito da artrite reumatoide e malattie infiammatorie intestinali; la patologia autoimmune è la psoriasi; la patologia allergica è la rinite allergica; la patologia neurodegenerativa è la patologia di Alzheimer; la patologia vascolare è l’aterosclerosi, la patologia del tratto respiratorio è selezionata dal gruppo costituito da asma e edema polmonare; la patologia iperproliferativa è il cancro, preferibilmente un carcinoma mammario o una forma tumorale in cui l’asse di PI3K e/o AKT e/o mTOR e/o una combinazione di essi è overespressa; la patologia caratterizzata dall’accumulo di liquidi è l’edema.
In un’ulteriore forma di realizzazione, l’invenzione fornisce una composizione farmaceutica comprendente almeno un composto di formula generale (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili come definito sopra, assieme ad almeno un eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
In un aspetto, l’invenzione fornisce un procedimento per la preparazione di un composto di formula (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili come sopra definiti, comprendente: 1. una prima reazione di coupling di Suzuki palladio-catalizzata tra il 4-bromo-1,2 dimetossibenzene ed un acido arilbornoico per ottenere un composto intermedio; 2. una seconda reazione di demetilazione del composto intermedio per ottenere un composto di formula generale (I) o suoi sali farmaceuticamente accettabili.
Preferibilmente, la prima reazione è eseguita alle microonde per tra circa 5 e 60 minuti ad una temperatura tra circa 80 e 140 °C, preferibilmente per 25 minuti ad una temperatura di circa 110 °C, oppure è eseguita alle microonde per tra circa 5 e 60 minuti ad una temperatura tra circa 120 e 180 °C, preferibilmente per circa 15 minuti ad una temperatura di circa 150 °C e/o la seconda reazione avviene in presenza di BBr3.
Nella presente invenzione, il termine “C1-C6 alchile” si riferisce a una catena idrocarburica radicalica lineare o ramificata, costituita solamente da atomi di carbonio e idrogeno, avente da uno a sei atomi di carbonio. Appropriati esempi di C1-6 alchile includono ma non sono limitati a etile, n-propile, isopropile, butile, sec-butile, tert-butile, pentile, isopentile, tertpentile, esile.
Nella presente invenzione, il termine “alogeno” si riferisce a fluoro (F), cloro (Cl), bromo (Br), iodio (I) e astatina (At). Preferibilmente, l’alogeno è cloro (Cl).
Per “inibitore dell’asse di PI3K/AKT/mTOR” si intende ad esempio un inibitore di PI3K, un inibitore di AKT, un inibitore mTOR, un doppio inibitore di PI3K/mTOR e qualsiasi combinazione di essi.
Nell'ambito dell'invenzione sono anche compresi i sali dei composti della presente invenzione. A causa del loro potenziale impiego in medicina, i sali dei composti di formula (I) sono preferibilmente farmaceuticamente accettabili. Sali farmaceuticamente accettabili comprendono i sali non tossici convenzionali ottenuti per salificazione di un composto di formula (I) con acidi inorganici (per esempio acido cloridrico, bromidrico, solforico o fosforico), o con acidi organici (ad esempio acido acetico, propionico , succinico, benzoico, solfanilico, 2-acetossi-benzoico, cinnamico, mandelico, salicilico, glicolico, lattico, ossalico, malico, maleico, malonico, fumarico, tartarico, citrico, p-toluensolfonico, metansolfonico, etansolfonico, o naftalensulfonico). Per una review su sali farmaceutici adatti si veda Berge S. M. et al., J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19; Gould P. L. Int. J. Pharm 1986, 33, 201-217 e Bighley et al. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Marcel Dekker Inc, New York 1996, Volume 13, page 453-497. Altri sali, che non sono farmaceuticamente accettabili, per esempio il sale trifluoroacetato, possono essere utili nella preparazione di composti della presente invenzione e questi formano un ulteriore aspetto dell'invenzione. L'invenzione comprende nel suo ambito tutte le possibili forme stechiometriche e non stechiometriche dei sali dei composti di formula (I).
Inoltre, i composti di formula (I) possono esistere in forme non solvatate così come in forme solvatate con solventi farmaceuticamente accettabili quali acqua, EtOH e simili. Alcuni composti di formula (I) possono esistere in forme stereoisomeriche (ad esempio, essi possono contenere uno o più atomi di carbonio asimmetrici). I singoli stereoisomeri (enantiomeri e diastereoisomeri) e miscele di questi sono inclusi nell'ambito della presente invenzione. La presente invenzione copre anche i singoli isomeri dei composti rappresentati dalla formula (I) come miscele con isomeri in cui uno o più centri chirali sono invertiti. Analogamente si intende che i composti di formula (I) possono esistere in forme tautomeriche diverse da quelle mostrate nella formula e questi sono inclusi nell'ambito della presente invenzione.
L'invenzione include anche tutte le variazioni isotopiche adatte di un composto dell'invenzione. Una variazione isotopica di un composto dell'invenzione è definita come quella in cui almeno un atomo è sostituito da un atomo avente lo stesso numero atomico ma una massa atomica differente dalla massa atomica che di solito si trova in natura. Esempi di isotopi che possono essere incorporati nei composti dell'invenzione includono isotopi quali
<2>H, <3>H, <13>C, <14>C, <15>N, <17>O, <18>O, 31P, <32>P, <35>S, <18>F e <36>Cl rispettivamente. Alcune variazioni isotopiche dell’invenzione, ad esempio, quelle in cui un isotopo radioattivo come <3>H o <14>C è incorporato, sono utili negli studi di distribuzione tissutale del farmaco e/o substrato. Inoltre, la sostituzione con isotopi come il deuterio <2>H, può fornire certi vantaggi terapeutici derivanti da una maggiore stabilità metabolica. Le variazioni isotopiche dei composti dell'invenzione possono generalmente essere preparate mediante procedure convenzionali così come con i metodi illustrativi o con le preparazioni descritte negli esempi qui di seguito utilizzando opportune variazioni isotopiche dei reagenti adatti.
L’invenzione comprende nel suo ambito anche la combinazione dei composti dell’invenzione come sopra definiti con ulteriori inibitori della 5-LOX non di formula (I). Appropriati esempi di ulteriori inibitori della 5-LOX non di formula (I) includono ma non sono limitati a: iperforina; mirtucommulone; medicarpina; 6-idrossi-2-(2-idrossi-4-metossifenil)-benzofurano; 3,4,2’,4’-tetraidrossi-2-geranildiidrocalcone; curcumina; gingeroli; resveratrolo e zileuton.
L'invenzione inoltre comprende anche composizioni farmaceutiche contenenti almeno un composto della presente invenzione o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un solvato dello stesso e uno o più vettori, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
Le composizioni farmaceutiche possono essere scelte in base alle esigenze di trattamento.
Tali composizioni sono preparate tramite miscelazione e sono opportunamente adattate alla somministrazione orale o parenterale, e come tali possono essere somministrate sotto forma di compresse, capsule, preparazioni orali, polveri, granuli, pillole, o soluzioni liquidi iniettabili o infusibili, sospensioni, supposte, preparazione per inalazione.
Compresse e capsule per la somministrazione orale sono generalmente presentate in forma di dosaggio unitario e contengono eccipienti convenzionali quali leganti, riempitivi (compresi cellulosa, mannitolo, lattosio), diluenti, agenti di compresse, lubrificanti (compresi stearato di magnesio), detergenti, disintegranti (ad esempio polivinilpirrolidone e derivati dell'amido come amido glicolato di sodio), coloranti, aromatizzanti e agenti bagnanti (per esempio sodio lauril solfato).
Le composizioni solide orali possono essere preparate con metodi convenzionali di miscelazione, riempimento o pastigliatura. L'operazione di miscelazione può essere ripetuta per distribuire il principio attivo in tutte le composizioni contenenti grandi quantità di riempitivi. Tali operazioni sono convenzionali.
Le preparazioni liquide orali possono essere nella forma di, ad esempio, sospensioni acquose o oleose, soluzioni, emulsioni, sciroppi o elisir, o possono essere presentate come prodotto secco da ricostituire con acqua o con un veicolo adatto prima dell'uso. Tali preparazioni liquide possono contenere additivi convenzionali quali agenti sospendenti, per esempio sorbitolo, sciroppo, metilcellulosa, gelatina, idrossietilcellulosa, carbossimetilcellulosa, gel di stearato di alluminio oppure grassi commestibili idrogenati; agenti emulsionanti, ad esempio lecitina, sorbitan monooleato, o acacia; veicoli non acquosi (che possono includere oli commestibili) quali olio di mandorle, olio di cocco frazionato, esteri oleosi quali esteri di glicerina, glicole propilenico, o alcool etilico; conservanti, come metile o propile pidrossibenzoato o acido sorbico, e se desiderato, aromatizzanti o coloranti convenzionali. Le formulazioni orali includono anche formulazioni convenzionali a lento rilascio come compresse o granuli gastro-resistenti rivestiti.
La preparazione farmaceutica per la somministrazione via inalazione può essere fornita da un insufflatore o da un nebulizzatore a pressione.
Per la somministrazione parenterale il dosaggio unitario di fluido può essere preparato, comprendendo il composto e un veicolo sterile. Il composto può essere sospeso o disciolto, a seconda del veicolo e della concentrazione. Le soluzioni parenterali sono normalmente preparate sciogliendo il composto in un veicolo, la sterilizzazione per filtrazione di quest’ultimo, riempimento dei flaconi idonei e sigillatura. Vantaggiosamente, adiuvanti quali anestetici locali, conservanti e agenti tampone possono essere sciolti nel veicolo. Per aumentare la stabilità, la composizione può essere congelata dopo aver riempito le fiale e rimosso l'acqua sotto vuoto. Le sospensioni parenterali sono preparate sostanzialmente nello stesso modo, eccetto che il composto può essere sospeso nel veicolo invece di essere sciolto, e sterilizzato mediante esposizione a ossido di etilene prima della sospensione nel veicolo sterile. Convenientemente, un tensioattivo o un agente bagnante possono essere inclusi nella composizione per facilitare la distribuzione uniforme del composto dell'invenzione.
Per somministrazione orale o sublinguale le composizioni possono essere tavolette, pastiglie, o gel.
I composti possono essere farmaceuticamente formulati come supposte o clisteri di ritenzione, ad esempio supposte contenenti basi convenzionali come burro di cacao, polietilenglicole, o altri gliceridi, per una somministrazione rettale.
Un’altra via di somministrazione dei composti della presente invenzione riguarda il trattamento topico. Le formulazioni topiche possono contenere ad esempio pomate, creme, lozioni, gel, soluzioni, paste e/o possono contenere liposomi, micelle e/o microsfere. Esempi di unguenti comprendono unguenti oleosi quali oli vegetali, grassi animali, idrocarburi semisolidi, unguenti emulsionabili come solfato idrossistearina, lanolina anidra, petrolato idrofilo, alcool cetilico, glicerolo monostearato, acido stearico, unguenti idrosolubili contenenti glicoli di polietilene di vario peso molecolare. Le creme, come noto agli esperti di formulazione, sono liquidi viscosi o emulsioni semisolide, e contengono una fase oleosa, un emulsionante e una fase acquosa. La fase oleosa contiene generalmente petrolato e un alcol come l’alcool cetilico o stearico. Le formulazioni adatte per la somministrazione topica oculare includono anche il collirio, in cui il principio attivo viene disciolto o sospeso in un adatto veicolo, in particolare in un solvente acquoso per l'ingrediente attivo.
Un ulteriore modo di somministrazione dei composti dell'invenzione riguarda la veicolazione transdermica. Formulazioni transdermiche tipiche comprendono vettori acquosi e non acquosi convenzionali, come creme, oli, lozioni o paste o possono essere sotto forma di membrane o cerotti medicati.
Un riferimento per le formulazioni è il libro di Remington (Remington “The Science and Practice of Pharmacy”, Lippincott Williams & Wilkins, 2000).
I composti della presente invenzione possono essere impiegati per l'uso nel trattamento e/o la prevenzione delle condizioni di cui sopra come unica terapia o in combinazione con altri agenti terapeutici o da somministrazioni separate oppure, comprendendo i due o più principi attivi nella stessa formulazione farmaceutica. I composti possono essere somministrati simultaneamente o sequenzialmente.
Gli altri agenti terapeutici possono essere farmaci antitumorali o composti attualmente sul mercato. La combinazione può essere somministrata come composizione separata (simultanea, sequenziale) dei singoli componenti del trattamento o come un’unica forma di dosaggio contenente entrambi gli agenti. Quando i composti della presente invenzione sono in combinazione con altri principi attivi, i principi attivi possono essere formulati separatamente in preparazioni ad un unico ingrediente di una delle forme sopra descritte e quindi dati come preparazioni combinate, che sono somministrate contemporaneamente o diverse volte, o possono essere formulati insieme in preparazione a due o più ingredienti. I composti di formula generale (I) possono essere somministrati ad un paziente in una dose giornaliera totale di, per esempio, da 0,001 a 1000 mg/kg di peso corporeo al giorno. Le composizioni delle unità di dosaggio possono contenere quantità di sottomultipli della stessa per compensare la dose giornaliera. Il composto può anche essere somministrato settimanalmente o qualsiasi altro giorno. La determinazione dei dosaggi ottimali per un particolare paziente è ben noto agli esperti del ramo. Come è prassi comune, le composizioni sono normalmente accompagnate da istruzioni per l'uso scritte o stampate nel trattamento in questione.
La presente invenzione verrà descritta in esempi non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure:
Figura 1. Analisi dei metaboliti della 5-LOX formati in sangue intero come descritto in materiali e metodi. La % di metaboliti della 5-LOX è misurata rispetto al controllo che è il campione non trattato.
Figura 2. Analisi dell’attività di mPGES1 da preparazione microsomiale isolata dopo stimolo da IL1β di cellule A549 attraverso l’analisi di PGE2. Preincubazione: Composto, 15 min, 37 °C, DMSO come controllo, n =3.
Figura 3. Vitalità a 24 e 48 ore di cellule MCF7 dopo trattamento con 4p a concentrazioni crescenti di farmaco (0,001, 0,01, 0,1, 0,5, 1 e 2,5 µM) (* P <0,05 vs CTL). In questa figura e nelle seguenti, CTL corrisponde a cellule non trattate.
Figura 4. Vitalità a 24 e 48 ore di cellule endoteliali primarie umane di vena ombelicale (HUVEC) esposte ad elevate dosi di 4p (2,5, 5 e 10 µM).
Figura 5. L’incubazione delle cellule MCF7 per 48 ore a concentrazioni crescenti di 4p (0,001, 0,01, 0,1, 0,5, 1 e 2,5 µM) induce un incremento della percentuale di morte cellulare valutato mediante tecnica di esclusione al trypan blue (* p <0.05 vs CTL).
Figura 6. Proliferazione a 24 e 48 ore di cellule MCF7 dopo trattamento a concentrazioni crescenti di 4p. Nel saggio di BrdU possiamo vedere una riduzione della proliferazione dopo trattamento con 4p (* p <0.05 vs CTL).
Figura 7. (a) I quattro pannelli riportano l’analisi FACS delle MCF7: arresto del ciclo cellulare delle MCF7 in fase G1/S dopo trattamento con 4p (48h) a concentrazioni crescenti (0,5, 1 e 2,5 µM) (* P<0.05). (b) Percentuale di cellule in fase G1, S e G3 dopo trattamento (48h) delle MCF7 a concentrazioni crescenti di 4p (0,5, 1 e 2,5 µM) (* P<0.05).
Figura 8. Livelli di espressione proteica di pAKT/AKT in cellule MCF7 in seguito al trattamento con 4p a 24 e 48 h (* P<0.05 vs CTL).
Figura 9. Livelli di espressione proteica di pGSK/GSK in cellule MCF7 in seguito al trattamento con 4p a 24 e 48 h (* P<0.05 vs CTL).
Figura 10. Livelli di espressione proteica di pERK/ERK in cellule MCF7 in seguito al trattamento con il composto 4p a 24 e 48 h (* P<0.05 vs CTL).
Figura 11. Livelli di espressione proteica di Bax/Bcl2 in cellule MCF7 in seguito al trattamento con il composto 4p a 24 e 48 h (* P<0.05 vs CTL).
Figura 12. Livelli di espressione proteica di Caspase-9 in MCF7 in seguito al trattamento con il composto 4p a 24 e 48 h (* P<0.05 vs CTL).
Figura 13. Livelli di espressione proteica di PARP in cellule MCF7 in seguito al trattamento con il composto 4p a 24 e 48 h(* P<0.05 vs CTL).
Figura 14. Livelli di espressione proteica di: (a) PIK3, (b) pmTOR/mTOR, (c) P-p4E-BP1/ p4E-BP1, (d) P-p70S6K/p70S6K in cellule MCF7 in seguito al trattamento con il composto 4p a 24 e 48 h (* P<0.05 vs CTL).
Figura 15. Analisi dell’espressione proteica mediante Western blotting in cellule di carcinoma mammario MCF7 trattate con 4p alle dosi indicate per 24 e 48 ore. Estratti proteici totali (20 µg) sono stati sottoposti a immunoblotting con gli anticorpi indicati come descritto in materiali e metodi.
Figura 16. Vitalità delle MCF7 dopo trattamento con il composto 4p ad intervalli di 48 ore per tre volte consecutive (pulse) (* P<0.05 vs CTL).
Figura 17. Vitalità delle MCF7 dopo trattamento con il composto 4p ad intervalli di 48 ore per due volte consecutive (pulse) e poi coltivate in mezzo senza farmaco per un'ulteriore settimana (chase) (* P<0.05 vs CTL).
Figura 18. Vitalità delle MCF7 dopo trattamento con il composto 4p ad intervalli di 48 ore per tre volte consecutive (pulse) e poi coltivate in mezzo senza farmaco per un'ulteriore settimana (chase) (* P<0.05 vs CTL).
Figura 19. Riduzione della bronco costrizione indotta dall’Acetilcolina (Ach) dopo trattamento con zileuton (0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 mg/kg i.p.). I risultati sono la media ± l’errore standard (n=5). * p<0.05,**p<0.01,***p<0.001. (two way ANOVA e Bonferroni post test).
Figura 20. Riduzione della bronco costrizione indotta dall’Acetilcolina (Ach) dopo trattamento con il composto 4p (0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 mg/kg i.p.). I risultati sono la media ± l’errore standard (n=5). * p<0.05,**p<0.01,***p<0.001. (two way ANOVA e Bonferroni post test).
Figura 21. Effetto del desametasone (dex, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 mg/kg, i.p.) e del composto 4p (0.001 mg/kg, i.p.) sull’edema della zampa indotto da carragenina rispetto al gruppo controllo, che ha ricevuto solo veicolo (DMSO). I risultati sono la media ± l’errore standard (n=5).
Figura 22. L’air pouch (sacca d’aria) è stato sviluppato mediante iniezione sottocutanea di 2,5 ml di aria sterile sul dorso dei topi, nella parte posteriore. I topi hanno ricevuto 4p (0.1 mg/kg ip) 30 minuti prima dell’induzione dell’infiammazione con zymosan. Dopo 4 h i topi sono stati sacrificati e l'essudato nella sacca è stato raccolto per la conta totale dei leucociti. I risultati sono la media ± l’errore standard (n=5). * p<0.05. (one way o two way ANOVA e Bonferroni post test).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Sintesi
Generale
Tutti i reagenti sono di grado analitico e acquistati dalla Sigma-Aldrich (Milano - Italia). Tutti gli esperimenti di irradiazione alle microonde sono stati effettuati in un apparato Microwave Initatior Biotage®. Le reazioni sono state condotte in tubi di vetro vessel da 10 mL, sigillati con tappo di Teflon, esponibili a temperature di 250 °C e a una pressione interna di 20 bar. Dopo il periodo di irraggiamento il recipiente di reazione è stato raffreddato rapidamente a temperatura ambiente mediante un getto di aria compressa. La purificazione mediante flash cromatografia è stata eseguita utilizzando gel di silice Carlo Erba 60 (230-400 mesh; Carlo Erba, Milano, Italia). Le TLC sono state effettuate utilizzando piastre rivestite con gel di silice 60 F254 acquistati dalla Merck (Darmstadt, Germania). Le rese delle reazioni si riferiscono ai prodotti puri cromatograficamente e spettroscopicamente. Gli spettri NMR sull’ <1>H sono stati effettuati su uno spettrometro AC 300 Bruker. I chemical shifts sono riportati in ppm rispetto al tetrametilsilano. La purezza (95% o superiore) di tutti i prodotti finali è stata valutata mediante l'analisi della combustione (Utilizzando un analizzatore elementare Carlo Erba 1106). L’analisi spettrometrica ESI-MS è stata eseguita su uno strumento di trappola Finnigan LCQ Deca.
Secondo una forma di attuazione dell’invenzione, i composti di formula (I) possono essere ottenuti in due step. Il primo step prevede una reazione di coupling di Suzuki palladiocatalizzata tra il 4-bromo 1,2 dimetossibenzene (composto 1) e differenti aril boronici (composti 2 a-v) La miscela di reazione è stata irradiata alle microonde per 25 minuti, ad una temperatura di 110 °C (condizioni (a), Schema 1) oppure per 15 minuti, ad una temperatura di 150 °C (condizioni (b), Schema 1).
Schema 1. Reagenti e condizioni: (a) K2CO3, PdCl2(dppf), Etanolo, MW; (b) Cs2CO3, Pd(Ph3P)4, Etanolo, MW
Nel secondo step, i composti 3 a-p sono sottoposti ad una reazione di demetilazione, in presenza di BBr3 in diclorometano anidro per ottenere i corrispettivi derivati catecolici, secondo lo Schema 2.
Schema 2. Reagenti e condizioni: (c) BBr3, CH2Cl2, da -15°C a temperatura ambiente.
Esempio 1 – condizioni (a): Procedura generale per la sintesi dei derivati 1-aril–3,4 dimetossibenzenici (3a, 3e-f, 3h-i, 3o-s)
4-bromo-1,2 dimetossibenzene 1 (0.100g, 1.0 equiv.), acido arilboronico (1.2 equiv.) e PdCl2 (dppf) (5%mol) sono stati disciolti in etanolo al 96% in una vessel di reazione di 10 mL contenente un magnete per l’agitazione. Successivamente è stato aggiunto K2CO3 (2.0 equiv.) e la vessel è stata sigillata ermeticamente con un tappo in Teflon®. La miscela è stata irradiata per 25 minuti ad una temperatura preselezionata di 110°C e con una potenza di irradiazione di 60 W. Dopo la reazione, la vessel è stata raffreddata a 50 °C mediante un getto di aria compressa.
La miscela grezza è stata quenchata mediante l'aggiunta di una miscela di etil acetato e acqua (13 mL di ognuno). Le due fasi sono state separate e la fase acquosa è stata estratta più volte con etil acetato (3x 13mL). Le fasi organiche riunite sono state anidrificate con sodio solfato anidro, filtrate e poi concentrate al rotavapor. I grezzi di reazione sono stati purificati mediante flash cromatografia su gel di silice con gli eluenti riportati di seguito per ciascun composto.
I seguenti composti sono stati ottenuti mediante la procedura generale dell’Esempio 1, condizioni (a).
1-fenil 3,4 dimetossibenzene (3a)
Il composto 3a è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2 dimetossibenzene 1(1.0equiv.) e dall’acido fenil boronico 2a (1.2 equiv.).
Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (da 90: 10 a 70:30)]. Resa: 90%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.94 (s, 3H); 4.00 (s, 3H); 7.0 (d,1 H, J = 7.9 Hz), 7.2 -7.4 (m,5H), 7.6(d, 2 H, J = 7.9 Hz).
2,3-diidro-6-(3,4-dimetossifenil)benzo[b][1,4]diossina (3e)
Il composto 3e è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2 dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido 2,3-diidrossibenzo[b][1,4]diossina-6- boronico 2e (1.2 equiv).
Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)]. Resa: 60%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.98 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 4.25-4.45 (m,4H), 6.99-7.01( m, 2H), 7.11-7.19 (m , 4H)
1-(3-fenossifenil)-3,4-dimetossibenzene (3f)
Il composto 3f è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2 dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido 3-fenossifenilboronico 2f (1.2 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)]. Resa: 62%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.72 (s,3H), 3.75(s,3H), 6.72(d,1H J = 7.9 Hz) , 6.88-6.99 (m, 6H), 7.20 (s,1H), 7.24-7.30 (m, 4H)
2-(3,4-dimetossifenil)benzofurano (3h)
Il composto 3h è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido benzofuranil-2-boronico 2h (1.2 equiv.).
Colonna cromatografica [eluizione in gradiente da esano/etilacetato (90:10) a (70:30) ]. Resa: 70%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.94 (s,3H), 4.00 (s,3H), 6.92 (s, 1H), 6.95 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.21-7.24 (m, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.44 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.51 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.55 (d, 1H, J = 7.9 Hz).
2-(3,4-dimetossifenil)benzo[b]tiofene (3i)
Il composto 3i è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido benzo[b]tiofen-2-boronico 2i (1.2 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)]. Resa: 61%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.78 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 6,72(d, 1H J= 7.4 Hz), 6.88 (s, 1H), 6.95 (d, 1H J= 7.4 Hz), 7.22-7.35 (m, 3H), 7.84 (d, 1H J= 7.1 Hz) , 7.89 (d, 1H J= 7.1 Hz)
1-(dibenzotiofen-2-il)-3,4-dimetossibenzene (3o)
Il composto 3o è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido dibenzotiofenil -2-boronico 2o (1.2 equiv.).
Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)]. Resa: 73%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 4.00 (s, 6H), 7.0 (d, 1H, J =7.9 Hz), 7.4 (s, 1H), 7.4-7.6 (m,5H), 7.9 (s,1H), 8.1 (d,1H, J = 7.9 Hz), 8.2 (s, 1H).
1-(dibenzofuran-4-il)-3,4-dimetossibenzene (3p)
Il composto 3p è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido dibenzofuranil-4-boronico 2p (1.2 equiv.).
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.78 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 6,92(d, 1H J= 7.4 Hz), 7.30(s, 1H), 7.40(d, 1H J= 7.3 Hz), 7.48 (t, 1H J=7Hz), 7,52 (t, 2H J=8.1Hz), 7.55-7.60 (m, 2H), 7.90 (dd, 2H J=5.9Hz).
1-(2,3-dimetossifenil)-3,4-dimetossibenzene (3q)
Il composto 3q è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido 2,3-dimetossifenilboronico 2q (1.2 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)]. Resa: 87%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.73(s, 6H), 3.78 (s, 6H), 6.62 (d, 1H J = 7.0Hz) 6.72 (d, 1H J = 8.0Hz) 6.77 (m, 1H), 6.88 (s, 1H), 7.12 (d, 2H, J = 2.4Hz)
1-(2,4-dimetossifenil)-3,4-dimetossibenzene (3r)
Il composto 3r è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido 2,4-dimetossifenilboronico 2r (1.2 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)]. Resa: 65%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.70 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 6.35(s, 1H), 6.44(dd, 1H J= 1.8Hz), 6.81(d, 1H J =7.2Hz), 6.90(s, 1H), 6.98 (d, 1H J= 2.4Hz), 7.42(d, 1H J= 7.8Hz) 1-(2,6-dimetossifenil)-3,4-dimetossibenzene (3s)
Il composto 3s è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido 2,6-dimetossifenilboronico 2s (1.2 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)]. Resa:75%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.63(s, 6H), 3.68 (s, 6H), 6.44 (d, 2H, J = 8.2Hz), 6.72 (d, 1H, J=7.8Hz), 6.88 (s, 1H), 6.93-7.05 (m, 2H)
Esempio 1 – condizioni (b): Procedura generale per la sintesi dei derivati 1-aril-3,4 dimetossibenzenici (3b-d, 3g, 3j-n, 3t-v)
4-bromo-1,2 dimetossibenezene 1 (0.100g, 1.0 equiv.), acido arilboronico (1.2 equiv.) e tetrakis (trifenilfosfina)palladio(0) (5%mol) sono stati disciolti in etanolo al 96%(2mL) in una vessel di 10 mL contenente un magnete per l’agitazione. Successivamente è stato aggiunto Cs2CO3 (3.0 equiv.) e la vessel è stata sigillata ermeticamente con un tappo di Teflon®. La miscela è stata irradiata per 15 minuti ad una temperatura preselezionata di 150°C e con una potenza di irradiazione di 100 W. Dopo la reazione, la vessel è stata raffreddata a 50 °C mediante un getto di gas.
La miscela grezza è stata quenchata mediante l'aggiunta di una miscela di etil acetato e acqua (13 mL di ognuno). Le due fasi sono state separate e la fase acquosa è stata estratta più volte con etil acetato (3x 13mL). Le fasi organiche riunite sono state anidrificate con sodio solfato anidro, filtrate e poi concentrate al rotavapor. I grezzi di reazione sono stati purificati mediante flash cromatografia su gel di silice con gli eluenti riportati di seguito per ciascun composto.
I seguenti composti sono stati ottenuti mediante la procedura generale dell’Esempio 1, condizioni (b).
1-(4-clorofenil)-3,4-dimetossibenzene (3b)
Il composto 3b è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1(1.0 equiv.) e dall’acido 4 clorofenil boronico 2b(1.3 equiv.).
Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa: 83%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ <1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.9(s,3H), 4.0 (s, 3H), 6.9 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.0(s,1H), 7.1 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.4 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.5 (d, 2H, J = 8.1 Hz).
1-(3-clorofenil)-3,4-dimetossibenzene (3c)
Il composto 3c è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido 3 clorofenil boronico 2c (1.3 equiv.).
Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 78%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.92 (s, 3H), 4.03 (s, 3H), 6.9 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.01 (s, 1H), 7.2 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.3 (s, 1H), 7.4 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.45(d,1H, J = 8.1 Hz), 7.6 (s,1H).
1-(4-idrossifenil)-3,4-dimetossibenzene (3d)
Il composto 3d è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido 4- idrossifenilboronico 2d (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (75:25) ] Resa : 50%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.73 (s, 6H), 6.75(d, 1H, J= 4.5), 6.93 (d, 2H, J=2.5Hz), 6.95 (s, 1H), 7.02-7.27 (m, 3H)
1-(4-fenossifenil)- 3,4-dimetossibenzene (3g)
Il composto 3g è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido 4-fenossifenilboronico 2g (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 80%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.92 (s, 3H), 4.01(s, 3H), 6.74 (d, 1H, J= 7.4Hz), 6.92 (s, 1H), 6.95-7.15(m, 6H), 7.20 (m, 2H), 7.55 (d, 2H, J= 0.8Hz)
3-(3,4-dimetossifenil)benzo[b]tiofene (3j)
Il composto 3j è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido benzo[b]tiofenil -3-boronico 2j (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 88%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.9(s,3H), 4.0(s,3H), 6.9 (d, 1H J = 8.1 Hz), 7.3 (s, 2H), 7.35- 7.54 (m,3H), 7.82-8.10 (m, 2H).
2-(3,4-dimetossifenil)naftalene (3k)
Il composto 3k è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido naftalenil-2-boronico 2k (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 65%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) =3.9(s,3H), 4.0(s,3H), 6.9 (d, 1H J = 8.1 Hz), 7.3 (s, 2H), 7.35- 7.54 (m,3H), 7.82-8.10 (m, 3H) 7.89 (s, 1H).
2-etossi-1-(3,4-dimetossifenil)naftalene (3l)
Il composto 3l è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido 2-etossinaftalenil -1-boronico 2l (1.3 equiv). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 73%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 1.4(t, 3H, J = 7.34 Hz), 3.9(s, 3H), 4.0(s, 3H),4.2(q,2H, J=7.34 Hz), 6.92-7.03 (m,3H), 7.30-7.50 (m,3H), 7.61-8.02 (m,3H)
1-(3,4-dimetossifenil)tiantrene (3m)
Il composto 3m è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido tiantrenil-1-boronico 2m (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 70%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.68(s, 3H), 3.70(s, 3H), 6.74 (d, 1H, J= 7.3Hz), 6.88-7.02 (m, 4H), 7.12(s, 1H), 7.16-7.22 (m, 4H).
10-(3,4-dimetossifenil)antracene (3n)
Il composto 3n è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido antracenil-10-boronico 2n (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 78%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.91(s,6H), 6.70 (d, 1H, J= 8.2Hz), 6.75(s, 1H), 6.78(d, 1H, J = 2.5Hz), 7.28-7.35 (m, 4H), 7.54-7.61(m, 5H)
1-(4-metilfenil)-3,4-dimetossibenzene (3t)
Il composto 3t è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido 4-metilfenilboronico 2t (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa : 68%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 2.81(s,3H), 3.90(s, 3H), 4.02(s, 3H), 6.68(d, 1H, J=7.8Hz), 6.88-6.93(m, 2H), 7.02(d, 2H, J=5.5Hz), 7.16 (d, 2H, J=2.4Hz)
1-(3-idrossifenil)-3,4-dimetossibenzene (3u)
Il composto 3u è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido 3-idrossifenilboronico 2u (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (75:25)] Resa : 55%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.78 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 6.58-6.62 (m, 3H), 6.75-6.87 (m, 2H), 6.92 (d, 1H, J= 7.4Hz), 7.04(t, 1H, J=7.24Hz)
9-(3,4-dimetossifenil)fenantrene (3v)
Il composto 3v è stato sintetizzato dal 4-bromo-1,2dimetossibenzene 1 (1.0 equiv.) e dall’acido fenantrenil-9-boronico 2v (1.3 equiv.). Colonna cromatografica [eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa :84%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 3.90 (s,3H), 4.04 (s, 3H), 6.45(d, 1H, J=7.9Hz), 6.88-6.93 (m, 2H), 7.74-7.92 (m, 5H), 8.07(d, 2H, J=2.7Hz), 8.21 (d, 2H, J= 8.1Hz)
La struttura di ciascun derivato 1-aril-3,4 dimetossibenzenico (3a-v) ottenuto secondo la procedura dell’Esempio 1, condizioni (a) e (b), è riportata nella Tabella 1. Per ciascun derivato 1-aril–3,4 dimetossibenzenici (3a-v), la Tabella 1 riporta inoltre: la struttura degli acidi arilboronici (2a-v) di partenza, il tempo e la temperatura di reazione e la resa.
Tabella 1: Composti 3 a-v preparati secondo la procedura dell’Esempio 1.
<a >Ottenuto impiegando il metodo a.
<b >Ottenuto impiegando il metodo b.
Esempio 2: Procedura generale per la sintesi dei derivati 1-aril-3,4 benzenediolici (4a-p) Ad una soluzione di derivati 1-aril-3,4-dimetossibenzenici (3 a-p, 1.0 equiv.), preparati secondo l’Esempio 1, in diclorometano anidro (12 mL) è stata aggiunta goccia a goccia una soluzione di BBr3 in CH2Cl2 (8.8 equiv), l’aggiunta viene fatta per un’ora a -15 °C. La miscela è stata portata a temperatura ambiente lentamente e mantenuta a questa temperatura per tempi differenti per i diversi composti (monitoraggio attraverso TLC) e quenchata con acqua ghiacciata (15mL). Il diclorometano è stato separato e la fase acquosa è stata lavata con dietil etere (15 mL x 2). La fase organica è stata poi anidrificata con sodio solfato anidro, filtrata e il solvente rimosso a pressione ridotta. Infine, i composti grezzi sono stati purificati mediante flash cromatografia su gel di silice.
I seguenti composti sono stati ottenuti mediante la procedura generale dell’Esempio 2. 1-fenil-3,4-benzediolo (4a)
Tempo di reazione: 3 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa: 65%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz): δ (ppm) = 6.9(d,1H. J=8.1 Hz); 6.95(d,1H J=8.1 Hz); 7.1(s,1H); 7.2-7.5(m,5H). <13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 114.7; 117.8; 121.9; 127.6; 127.7; 128.0; 128.1; 137.0; 147.0; 149.0 MS-ESI (m/z): 186.21[M-] Anal. Calcd. for C12H10O2 C, 77.40; H, 5.41; O, 17.18 Found C, 77.49; H, 4.84; O, 17.92
1-(4-clorofenil)-3,4-benzenediolo (4b)
Tempo di reazione: 2.5ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (85:15)] Resa: 60%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ(ppm)= 5.0(s,2H); 6.8-6.9(m,2H); 7.0(s,1H); 7.4-7.5(m,4H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 114.7, 119.0, 122.0, 130.0, 130.2, 130.5, 131.4, 131.8, 134.0, 135.5, 147.0, 148.0 MS-ESI (m/z): 220.65[M-] Anal. Calcd. for C12H9ClO2 C, 65.32; H, 4.11; Cl, 16.07; O, 14.50 Found C, 64.78; H, 4.09; Cl, 15.67; O, 13.85
1-(3-clorofenil)-3,4-benzenediolo (4c)
Tempo di reazione: 6 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (85:15)] Resa: 55%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ(ppm)= 6.9(d,1H J=8.1 Hz ); 7.1(d,1H J=8.1 Hz); 7.2(s,1H); 7.3(d,1H J=8.1 Hz ); 7.4(s,1H); 7.5(d, 1H J=8.1 Hz); 7.6(s, 1H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 115.0; 118.0; 121.0; 126.0; 128.1; 128.9; 130.7; 131.0; 135.0; 139.0; 146.2; 148.0 MS-ESI (m/z): 220.65[M-] Anal. Calcd. for C12H9ClO2 C, 65.32; H, 4.11; Cl, 16.07; O, 14.50 Found C, 65.44; H, 3.69; Cl, 15.97; O, 14.52
1-(4-idrossifenil)-3,4-benzenediolo (4d)
Tempo di reazione: 10 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (70:30)] Resa: 45%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm)= 6.7(d,1H J=7.8 Hz ); 6.8(s,1H); 6.9(d, 2H J=8.2 Hz); 7.0(d,1H J=7.1Hz); 7.4(d, 2H J=7.2 Hz).
<13>C NMR (d6-DMSO, 300MHz) δ (ppm) = 114.0; 115.9; 116.8; 121.9; 129.0; 130.0; 131.0; 146.2; 149.3; 158.2MS-ESI (m/z): 202.06[M-] Anal. Calcd. for C12H10O3 C, 71.28; H, 4.98; O, 23.74 Found C,71.53; H, 5.23; O, 22.85
4-(2,3-diidrobenzo[b][1,4]diossin-6-il)benzene-1,2-diolo (4e)
Tempo di reazione: 8 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa: 75% <1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 4.2(m,4H); 6.74(d, 1H J=8.1 Hz ); 6.88(m,2H); 7.02-7.2(m,3H). <13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 65.0; 65.3; 113.0; 115.0; 121.0; 122.0; 127.0; 129.0; 132.0; 133.0; 146.0; 146.9; 149.0; 151.0 MS-ESI (m/z): 244.07[M-] Anal. Calcd. for C14H12O4 C, 68.85; H, 4.95; O, 26.20 Found C, 68.25; H, 5.15; O, 25.89
1-(3-fenossifenil)-3,4-benzenediolo (4f)
Tempo di reazione: 6ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (80:20)] Resa: 60%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6.72(d, 1H J=8.2 Hz); 6.80 (s, 1H); 6.88-6.98 (m, 5H); 7.20(s, 1H); 7.30-7.33(m, 4H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 300MHz) δ (ppm) = 114.9; 115.0; 116.5; 119,2; 119.6; 122.2; 122.9; 128.8; 129.8; 131.5; 136.6; 147.5; 148.2; 157.0; 157
MS-ESI (m/z): 278.09[M-] Anal. Calcd. For C18H14O3 C, 77.68; H, 5.07; O, 17.25 Found C, 77.68; H, 4.67; O, 16.92
1-(4- fenossifenil)-3,4-benzenediolo (4g)
Tempo di reazione: 2ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (80:20)] Resa: 74%.
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6.81(d, 1H, J= 7.4Hz); 6.98 (s, 1H); 7.04-7.22(m, 6H); 7.31 (d, 2H, J= 2.4Hz); 7.64 (d, 2H, J= 0.8Hz)
<13>C NMR (d6-DMSO, 300MHz) δ (ppm) = 114.8, 118.0, 118.2, 119.4, 121.9, 128.5, 129.2, 129.8, 131.2, 146.2, 148.4, 155.9, 157.0 MS-ESI (m/z): 278,09[M-] Anal. Calcd. For C18H14O3 C, 77.68; H, 5.07; O, 17.25 Found C, 76.77; H, 5.12; O, 17.32
4-(benzofuran-2-il)benzene-1,2-diolo (4h)
Tempo di reazione: 16 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (85:15)] Resa: 65%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6.92 (s, 1H); 6.95 (d, 1H, J = 8.1 Hz); 7.21-7.24 (m, 2H); 7.38 (s, 1H); 7.44 (d, 1H, J = 8.1 Hz); 7.51 (d, 1H, J = 7.9 Hz); 7.55 (d, 1H, J = 7.9 Hz).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 103.0; 111.0; 112.0; 115.8; 121.0; 122.0; 124.0; 125.0; 125.2; 125.4; 149.0; 151.0; 156.0; 157.0
MS-ESI (m/z): 226,23 [M-] Anal. Calcd. For C14H10O3 C, 74.33; H, 4.46; O, 21.22 Found C, 72.32; H, 4.54; O, 20.17
4-(benzo[b]tiofen-2-il)benzene-1,2-diolo (4i)
Tempo di reazione: 16 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa:45%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) =4.91(s,1H); 6.94- 7.17(m, 2H); 7.22-7.35(m, 3H); 7.4(s, 1H); 7.6-8.0(m,2H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 113.0; 115.9; 120.0; 122.0; 123.0; 124.0; 125.9; 126.0; 127.5; 141.0; 142.0; 146.0; 150.3; 151.0
MS-ESI (m/z): 242,29 [M-] Anal. Calcd. For C14H10O2S C, 69.40; H, 4.16; O, 13.21; S, 13.23 Found C, 70.02; H, 5.14; O, 16,24; S, 14.22
4-(benzo[b]tiofen-3-il)benzene-1,2-diolo (4j)
Tempo di reazione:15 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa: 35%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6.9 (d, 1H J = 8.1 Hz); 7.35- 7.54 (m,4H); 7.82-8.10(m, 2H); 7.89 (s, 1H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 113.0; 116.0; 121.0; 123.0; 123.2; 124.3; 125.0; 125.6; 130.0; 139.0; 143.0; 144.0; 150.0; 152.0
MS-ESI (m/z): 242,29 [M-] Anal. Calcd. For C14H10O2S C, 69.40; H, 4.16; O, 13.21; S, 13.23 Found C, 68.77; H, 4.10; O, 14.11; S, 13.20
4-(naftalen-7-il)benzene-1,2-diolo (4k)
Tempo di reazione: 2 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa: 62%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6.91 (d, 1H J = 8.1 Hz); 7.3 (d, 2H, J=8.1Hz); 7.35-7.54 (m,3H); 7.82-8.10 (m, 3H); 7.89 (s, 1H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 113.5; 116.8; 123.0; 125.0; 126.2; 126.6; 126.7; 128.1; 128.4; 130.0; 132.0; 133.0; 134.5; 135.0; 148.6; 153.0
MS-ESI (m/z): 236,08 [M-] Anal. Calcd. For C16H12O2 C, 81.34; H, 5.12; O, 13.54 Found C, 80.24; H, 6.02; O, 13.53
4-(2-etossinaftalen-1-il)benzene-1,2-diolo (4l)
Tempo di reazione: 17 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (85:15)] Resa: 35%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 1.4(t, 3H, J = 7.34 Hz); 4.2(q,2H, J=7.34 Hz); 6.92-7.03 (m,3H); 7.30-7.50 (m,3H); 7.6(m,1H); 7.8-8.02 (m,2H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ (ppm) = 15.0; 66.0; 113.0; 118.0; 120.8; 122.0; 122.2; 125.0; 125.6; 127.0; 128.0; 128.9; 129.0; 130.1; 130.5; 130.8; 135.0; 149.0; 151.0; 159.0 MS-ESI (m/z): 280,11 [M-] Anal. Calcd. For C18H16O3 C, 77.12; H, 5.75; O, 17.12 Found C, 78.01; H, 5.90; O, 16.86
4-(tiantren-6-il)benzene-1,2-diolo (4m)
Tempo di reazione: 4.5 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa: 85%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6.74 (d, 1H, J= 7.3Hz), 6.88-7.02 (m, 4H), 7.12(s, 1H), 7.16-7.22 (m, 4H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75MHz) δ (ppm) = 115.0, 117.8, 122.2, 128.5, 128.8, 129.6, 131.5, 132.0, 133.4, 133.8, 138.7, 139.3, 148.2, 149.8
MS-ESI (m/z): 324,42 [M-] Anal. Calcd. For C18H12O2S2 C, 66.64; H, 3.73; O, 9.86; S, 19.77 Found C, 66.62; H, 4.13; O, 10.16; S, 19.45
4-(antracen-10-il)benzene-1,2-diolo (4n)
Tempo di reazione: 2 ore. Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (90:10)] Resa: 84%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6.75 (d, 1H, J= 8.2Hz); 6.85(s, 1H); 6.96(d, 1H, J = 2.5Hz); 7.28-7.35 (m, 4H); 7.56-7.78(m, 5H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75MHz) δ (ppm) = 114.9; 117.6; 123.0; 127.1; 128.1; 128.9; 129.1; 130.3; 134.8; 138.7; 145.6; 147.4 MS-ESI (m/z): 286,10 [M-] Anal. Calcd. For C20H14O2 C, 83.90; H, 4.93; O, 11.18 Found C, 83.90; H, 4.12; O, 11.68
4-(dibenzotiofen-2-il) benzene-1,2-diolo (4o)
Tempo di reazione: 2 ore Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (80:20)] Resa: 78%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 7.0(d, 1H, J =7.9 Hz); 7.4 (s, 1H); 7.4-7.6 (m,5H); 7.9 (s,1H); 8.1 (d,1H, J = 7.9 Hz); 8.2 (s, 1H).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75MHz) δ (ppm) = 114.7; 117.8; 122.1; 112.5; 122.7; 123.5; 124.1; 124.7; 125; 127.1; 127.9; 130.4; 136.7; 141.1; 142.6; 146.5; 147.7
MS-ESI (m/z): 292,06 [M-] Anal. Calcd. For C18H12O2S C, 73.95; H, 4.14; O, 10.95; S, 10.97 Found C, 73.88; H, 4.02; O, 10.86; S, 11.23
4-(dibenzofuran-2-il)benzene-1,2-diolo(4p)
Tempo di reazione: 2 ore Colonna cromatografica :[Eluizione con esano/etilacetato (80:20)] Resa: 87%
<1>H NMR (CDCl3, 300MHz) δ (ppm) = 6,94(d, 1H J= 7.4 Hz), 7.35(s, 1H), 7.50(d, 1H J= 7.3 Hz), 7.60 (t, 1H J=7Hz), 7,73 (t, 2H J=8.1Hz), 7.78-7.81 (m, 2H), 7.96 (dd, 2H J=5.9Hz).
<13>C NMR (d6-DMSO, 75MHz) δ (ppm) = 112.5; 114.0; 114.7; 118.2; 119.9; 122.2; 123.1; 123.9; 124.8; 125.0; 130.5; 135.4; 136.7; 144.7; 147.2; 148.2; 149.7; 150.8
MS-ESI (m/z): 276.08 [M-] Anal. Calcd. For C18H12O3 C, 78.25; H, 4.38; O 17.37 Found C, 78.45; H, 4.08; O 17.57
La struttura di ciascun derivato 1-aril-3,4 benzenediolico (4a-p) ottenuto secondo la procedura dell’Esempio 2 è riportata nella Tabella 2. Per ciascun derivato 4-aril-catecolici (4a-p), la Tabella 2 riporta inoltre il tempo di reazione e la resa.
Tabella 2: Composti 4 a-p preparati secondo la procedura dell’Esempio 2
Dati biologici
Materiali e Metodi
Colture cellulari per valutazione attività antinfiammatoria
Le cellule di polimorfonucleati (PMNL) umani sono state isolate da concentrati di leucociti ottenuti al St. Markus Hospital (Francoforte, Germania), con il consenso informato dei donatori. In breve, un’aliquota di sangue venoso (prelevata da donatori adulti sani) è stata sottoposta a centrifugazione a 4000 g per 20 minuti ad una temperatura di 20 °C per recuperare i leucociti concentrati. I PMNL sono stati, poi, prontamente isolati per sedimentazione con destrano, centrifugazione (Laboratori PAA, Linz, Austria), e lisi ipotonica degli eritrociti. I PMNL (7.510<6 >cellule/mL; purezza > 96-97%) sono stati infine risospesi in un “buffer” salino contenente fosfato con un pH 7,4 (PBS) seguiti dall’aggiunta 1 mg/ml di glucosio.
Determinazione della formazione dei prodotti della 5-Lipossigenasi in cellule intatte Per le analisi in cellule intatte, un quantitativo di 10<7 >PMNL è stato risospeso in 1 mL di PBS addizionato con 1 mg/mL di glucosio e 1 mM di CaCl2. Dopo la preincubazione con i composti indicati (a 37 ° C, 10 minuti), la formazione dei prodotti della 5-LOX è stata avviata dall’aggiunta di 2,5 µM dello ionoforo A23187 (Calcimina) con o senza acido arachidonico (AA) 20 µM, come indicato in Tabella 3.
Dopo 10 min a 37 °C, la reazione è stata bloccata con 1 mL di metanolo, e 30 µL 1 N HCl, 200 ng di prostaglandina B1 e 500 µL di PBS sono stati ulteriormente addizionati. I metaboliti della 5-LOX formatisi sono stati estratti e analizzati mediante HPLC e la loro quantità è espressa in ng di prodotto per 10<6 >cellule in Tabella 3. Tra quelli identificati si citano LTB4 e i suoi all-trans isomeri: l’acido 5(S),12(S)-diidrossi-6-10-trans-8,14-ciseicosatetraenoico (5(S),12(S)-DiHETE), e l’acido 5(S)-idro(pero)ssi-6-trans-8,11,14-ciseicosatetraenoico (5-H(p)ETE). I Cisteinil-LT (LTC4, D4 e E4) non sono stati rilevati e prodotti di ossidazione di LTB4 non sono stati determinati.
Espressione, purificazione della 5-LOX ricombinante umana proveniente da E. coli, e determinazione dell’attività residua della LOX in test cell-free
La trasformazione di E. coli BL21 (Sigma Aldrich) con il plasmide pT3-5LO così come l’espressione e la purificazione della 5-LOX ricombinante sono stati condotti secondo modelli riportati in letteratura (Fischer et al., 2003) La 5-LOX purificata è stata immediatamente impiegata per il saggio di attività inibitoria, pertanto, 0.5 μg di enzima purificato sono stati diluiti mediante PBS/EDTA (volume finale di 1 ml) e pre-incubati con i derivati di interesse. Dopo 5-10 min a 4°C i campioni sono stati pre-riscaldati per 30 s a 37°C. Fatto ciò, 2mM di CaCl2 e l’adeguato apporto di AA vengono addizionati ai campioni per permettere la formazione dei prodotti della 5-LOX. Dopo 10 minuti a 37°C la reazione è stoppata ed addizionata di 1ml di metanolo raffreddato in ghiaccio, permettendo l’analisi dei metaboliti mediante HPLC.
Determinazione della formazione dei prodotti della 5-Lipossigenasi in sangue intero Per i saggi su sangue intero, il sangue appena prelevato da donatori adulti sani (previo ottenimento di consenso informato) è stato ottenuto mediante venipuntura e raccolto in provette contenenti 16 U eparina mL-1. Aliquote di 2 mL (A23187) o 3 mL (LPS e fMLP) sono state pre-incubate con 4p o con veicolo (0,1% DMSO) per 15 minuti a 37 °C, come indicato, e la formazione di prodotti 5-LOX è stata iniziata con l'aggiunta di 1 μM di fMLP dopo 30 minuti di adescamento con 1 μg · mL-1 LPS o con l'aggiunta di 30 μM di A23187. La reazione è stata interrotta su ghiaccio dopo 15 (LPS e fMLP) o 10 (stimolazione con A23187) min e i campioni sono stati centrifugati (600 × g, 10 min, 4 °C). Aliquote del plasma risultante (500 μL) sono state quindi miscelate con 2 ml di metanolo e 200 ng di PGB1 sono state aggiunte come standard interno. I campioni sono stati posti a -20 ° C per 2 ore e nuovamente centrifugati (600 × g, 15 minuti, 4 ° C). I surnatanti sono stati raccolti e diluiti con 2,5 mi di PBS e 75 μL di HC1 da 1 N. I metaboliti formati 5-LOX sono stati estratti e analizzati mediante HPLC come descritto per i neutrofili intatti.
Determinazione dell'attività residua di mPGES-1 in test cell-free
La preparazione delle cellule A549 e la determinazione dell'attività di mPGES-1 è stata eseguita come descritto in precedenza (Koeberle A et al., 2008). In breve, cellule A549 trattate con IL-1β iperespressione di mPGES-1 sono state sonicate e la frazione microsomiale è stata preparata mediante centrifugazione differenziale a 10.000 g per 10 minuti e 174.000 g per 1h).Le membrane microsomali risospese sono state preincubate con i composti o veicolo (DMSO). Dopo 15 minuti, è iniziata la formazione di PGE2 mediante aggiunta di PGH2 (concentrazione finale, 20 μM). Dopo 1 minuto a 4 ̊C, la reazione è stata terminata e la PGE2 è stata separata mediante estrazione in fase solida (Materiale RP-18) ed analizzato da RP-HPLC come descritto. L'estrazione in fase solida è stata eseguita con colonne RP18 contenenti un polimero in fase inversa. Il campione è stato aggiunto dopo aver condizionato la colonna con 1 ml 100% metanolo e 1 ml H2O. Dopo aver lavato le colonne due volte con 0,5 ml di H2O, gli eicosanoidi sono stati eluiti con 300 μl di metanolo al 100%. Il surnatante ottenuto dopo due fasi di centrifugazione (15000 x g, 5 min, 4 ° C) è stato utilizzato per l’analisi RP-HPLC.
Saggio DPPH
La prova permette di determinare il potere antiossidante di un campione, facendolo reagire con una soluzione di DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazile, PM 394.33, C18H72N5O6) ed analizzando all'UV la diminuzione del picco a 517 nm del radicale.
Il 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH<•>)
è un radicale azotato molto stabile, caratterizzato da un'intensa colorazione rosso porpora, che decolora quando viene ridotto in presenza di una molecola dotata di capacità antiossidante. Mediante misurazione spettrofotometrica a 517 nm della variazione di assorbanza della soluzione di DPPH dopo reazione con un composto antiossidante, è possibile quantificare la capacità riducente della sostanza in esame sia che essa agisca con trasferimento di idrogeno che per cessione di elettroni. Il risultato viene generalmente espresso come EC50, cioè la quantità di antiossidante in grado di ridurre del 50% la concentrazione iniziale di DPPH. Per condurre il saggio DPPH, è stata preparata una soluzione di DPPH in EtOH (1 ml, 5mM). I campioni da analizzare allo spettrofotometro sono stati preparati nel seguente modo (su cuvetta):
950 μl EtOH 50 μl Acqua Deionizzata
850 μl MeCN 100 μl DPPH 1 mM (C finale = 100 μM) 50 μl Acqua Deionizzata. Le soluzioni sono state agitate con vortex e l’assorbanza dei campioni è stata letta da 400 a 900 nm contro il bianco. L’assorbanza dei campioni è stata letta a 517 nm per 10 minuti contro il bianco con le seguenti modalità: Ciclo1 = Step 0.1 min per 0.5 min, aggiunta del campione indicato in Tabella 3 dopo la prima lettura e Ciclo2 = Step 0.05 min per 9.5 min.
Test FRAP
Il test FRAP misura la capacità riducente degli antiossidanti nei confronti degli ioni Ferro. Si tratta di un metodo basato sul trasferimento di elettroni, in cui gli ioni ferro passano da Fe<3+ >a Fe<2+>. In determinate condizioni di pH (3,6) e in presenza di TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine), tali ioni formano dei complessi con caratteristiche diverse, in particolare il derivato ridotto (Fe<2+>-TPTZ) assume una colorazione blu che presenta un assorbimento massimo a 593 nm misurabile per via spettrofotometrica Questo saggio è in grado di misurare solamente l’abilità riducente del composto in esame nei confronti dello ione ferrico. Il complesso ridotto è colorato, per cui la reazione può essere monitorata spettrofotometricamente alla lunghezza di massimo assorbimento localizzata intorno a 593 nm. Una unità FRAP è arbitrariamente definita come il numero di moli di Fe(III) ridotte a Fe(II) da una mole di antiossidante testato.
Colture cellulari per valutazione attività antitumorale
Le cellule MCF-7 e le HUVEC (cellule endoteliali umane estratte da vene di cordoni ombelicali) sono state acquistate dalla American Type Culture Collection (LGC Standards, Middlesex, Regno Unito). Le MCF-7 sono state coltivate in DMEM (Sigma, St. Louis, MO) supplementato con 10% FBS (Life Technologies, Inc.), 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (Gibco BRL). Le HUVEC sono state coltivate in terreno di coltura EGM-2 5LOX (EGM™-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit; Lonza) Tutte le cellule sono state poste in un incubatore ad atmosfera umidificata a 37°C, contenente il 5% di CO2. Tutte le procedure sono state effettuate in condizioni di sterilità.
Attività delle deidrogenasi mitocondriali (saggio MTT)
Il saggio del bromuro di metiltiazolildifenil-tetrazolo (MTT) è un saggio colorimetrico standard di vitalità cellulare, impiegato per la determinazione della citotossicità, che permette di misurare l’attività degli enzimi che riducono l’MTT a formazano (Mosman, 1983). Nelle cellule vive, e quindi metabolicamente attive, l’enzima mitocondriale succinato deidrogenasi converte l’MTT (giallo) in formazano (blu-violetto), grazie all’elevata lipofilia dell’MTT, che permette al composto di attraversare facilmente le membrane cellulari. La formazione del formazano è direttamente proporzionale al numero di cellule vive e la sua concentrazione può essere rilevata allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 570 nm. Pertanto, quanto più elevati sono i valori di assorbanza, maggiore è la concentrazione di formazano e più alto è il numero di cellule vitali. Tale metodica è stata utilizzata per valutare la citotossicità di un composto dell’invenzione sulle cellule MCF7 e quindi la vitalità cellulare al termine del trattamento con il composto. La soluzione di MTT è stata preparata sciogliendo 10 mg/ml di polvere di MTT (Sigma-Aldrich) nel terreno di coltura utilizzato per le MCF7: si è ottenuta una soluzione 10X che è stata opportunamente diluita e aggiunta alle MCF7 precedentemente piastrate in multiwell da 96 pozzetti e pretrattate con un composto dell’invenzione a concentrazioni di 0,001 - 0,01 - 0,1 - 0,5 - 1 e 2,5 µM e l’esposizione si è protratta per 24 e 48 ore, al fine di determinare gli effetti acuti del composto. Le cellule sono state tenute per 3 ore al buio in incubatore a 37°C, al termine delle quali si è osservata la formazione del formazano, presente sotto forma di cristalli insolubili. La solubilizzazione del formazano si è ottenuta mediante l’aggiunta di 200 ml di isopropanolo acidificato con HCl 0,2 N. La lettura allo spettrofotometro iMark Microplate Reader (Bio-Rad) è stata eseguita alla lunghezza d’onda di 560 nm dopo aver tenuto in agitazione le cellule per 30 minuti (Mosmann, 1983). La stessa procedura è stata seguita per le cellule HUVEC (Figura 4).
Analisi della vitalità cellulare con Trypan blue
La stima della vitalità cellulare è stata effettuata mediante colorazione con Trypan Blue (TB) (Invitrogen). Questo marker, aggiunto ad una sospensione cellulare, è in grado di attraversare esclusivamente membrane la cui integrità è stata modificata in maniera significativa. Il TB penetra soltanto in cellule danneggiate, la cui vitalità è compromessa, dando loro un colore blu al microscopio a luce visibile. Le cellule vitali, che non sono permeabili al marker, rimangono trasparenti. Le cellule MCF7 sono state piastrate in piastre da 12 pozzetti, in terreno completo, alla concentrazione di 240.000 cellule/pozzetto. Il giorno seguente, le cellule sono state trattate con concentrazioni differenti di un composto dell’invenzione e come controlli sono state utilizzate cellule non trattate. Alla fine del trattamento, della durata di 24 e 48 ore, le cellule sono state lavate per tre volte con PBS per eliminare il composto in eccesso, e quindi tripsinizzate. Le cellule completamente staccate sono state trasferite in falcon. La conta delle cellule morte è stata effettuata con Trypan Blue: 90μl di sospensione cellulare 10μl di Trypan Blue. Le cellule sono state contate e i risultati sono stati espressi come % del controllo.
SDS-PAGE e Western blot
Le MCF7 sono state lisate in un buffer contenente 0,1% Triton X-100, un cocktail di inibitori delle proteasi (Sigma-Aldrich) e delle fosfatasi (Sigma-Aldrich), NaF 50 mM, PMSF 2 mM e Na3VO4 0,1 mM. La concentrazione proteica dei campioni di lisato totale è stata determinata con il metodo di Bradford (Bradford, 1976). La lettura dell’assorbanza dei campioni è stata effettuata allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 595 nm. I campioni sono stati caricati su un gel di poliacrilammide al 8-10-12 % (in base al peso molecolare della proteina da analizzare), per separare le proteine in funzione del loro peso molecolare (SDS-PAGE); la corsa elettroforetica è stata effettuata a 80-100 V per 90 minuti e il trasferimento è stato effettuato overnight su una membrana di polivinildifluoride (PVDF, Thermo Scientific). La membrana è stata incubata, per 1 ora a temperatura ambiente in agitazione, con Tris Buffered Saline a pH 7,4 (TBS, Biorad) e 0,1% Tween 20 (Biorad), contenente 5% latte scremato (Biorad) o 10% albumina di siero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich). Successivamente le membrane sono state incubate a temperatura ambiente con gli anticorpi primari di interesse e quindi, dopo lavaggi TBS/0,1% Tween 20, sono state incubate con anticorpo secondario coniugato con perossidasi per 1 ora. Il segnale è stato visualizzato mediante chemiluminescenza ECL (Millipore) (Towbin, 1979) e immagini delle membrane sono state acquisite utilizzando il Gel Doc 2000 (Bio-Rad). La quantificazione densitometrica del segnale è stata effettuata utilizzando il software Molecular Analyst (Bio-Rad). I risultati sono stati espressi in unità arbitrarie.
Sono stati valutati i livelli di espressione delle seguenti proteine: Bcl-2, Bax, 5LOX (Santa Cruz Biotechnology), PARP e Caspase-9, fosfo-Akt, Akt, fosfo-Gsk, Gsk, fosfo-Erk, Erk, p70 S6 Kinase e fosfo-p70 S6 chinasi (Thr389), 4E-BP1 e fosfo-4E-BP1 (Thr37/46), mTOR e fosfo-mTOR (Ser2448) (Cell Signaling). Mentre la β-tubulin e il GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) sono stati utilizzati come controllo.
Di seguito gli anticorpi utilizzati e gli Accession number delle proteine in banca dati UniProtKB/Swiss-Prot:
Bcl-2 sc-7382 Santa Cruz ACCESSION: P10415; VERSION: P10415.2 Bax sc-526 Santa Cruz ACCESSION; Q07812; VERSION; Q07812.1
Caspase-9 Antibody (Human Specific) ACCESSION: P55211; VERSION: P55211.3 PARP Antibody (9542) ACCESSION: P09874; VERSION: P09874.4
Phospho-Akt (Ser473) Antibody; ACCESSION P31749; VERSION P31749.2 Akt Antibody #9272 ACCESSION P31749; VERSION P31749.2 - ACCESSION P31751; VERSION P31751.2 – ACCESSION: Q9Y243; VERSION: Q9Y243.1 GSK3-b fosforilato 9336S Cell Signaling; ACCESSION: P49841; VERSION: P49841.2 GSK-3β (27C10) Rabbit mAb; ACCESSION: P49841; VERSION: P49841.2
p44/42 MAPK (Erk1/2) fosforilato (Thr202/Tyr204) 9101 Cell Signaling; ACCESSION: P27361; VERSION: P27361.4; ACCESSION: P28482; VERSION: P28482.3
p44/42 MAPK (Erk1/2) 9102 Cell Signaling; ACCESSION : P27361; VERSION: P27361.4; ACCESSION: P28482; VERSION: P28482.3
Phospho-p70 S6 Kinase (Thr389) Antibody; ACCESSION: P23443; VERSION: P23443.2 p70 S6 Kinase Antibody; ACCESSION: P23443; VERSION: P23443.2
phospho 4E-BP1 (Thr 37/46) 2855 Cell Signalling; ACCESSION: Q13541; VERSION: Q13541.3 4E-BP1 Antibody #9452; ACCESSION: Q13541; VERSION: Q13541.3 mTOR fosforilato (Ser2448) 2971 Cell Signaling ACCESSION: P42345; VERSION: P42345.1
mTOR Antibody ACCESSION: P42345; VERSION: P42345.1 β-tubulina
sc-9104 Santa Cruz ACCESSION: P07437; VERSION: P07437.2
GAPDH G8795 ACCESSION: P04406; VERSION: P04406.3
PI3K ABS234 Millipore ACCESSION NP_037137; VERSION NP_037137.1 Saggio per l’incorporazione della bromodesossiuridina (BrdU)
Il saggio della bromodesossiuridina (BrdU) è utilizzato per valutare l’indice di proliferazione cellulare. La BrdU è un analogo della timidina che viene incorporato dalle cellule in replicazione nella fase S del ciclo cellulare. Questo saggio è stato utilizzato per valutare la capacità di replicazione delle MCF7. Dopo il trattamento con un composto dell’invenzione a 24 e 48 h, le MCF7 sono state incubate con una soluzione contenente BrdU 10 µM per 1 ora a 37°C, seguendo il protocollo della casa produttrice (BrdU Labeling and detection Kit 1, Roche). Le cellule adese ad un vetrino sono state fissate per 30 minuti a -20°C con una soluzione di etanolo e glicina e in seguito sono state incubate, a 37°C, con un anticorpo primario anti-BrdU per 40 minuti in camera umida. Dopo alcuni lavaggi in PBS, le cellule sono state incubate in camera umida per 40 minuti con un anticorpo secondario coniugato con un fluorocromo TRITC (Tetrametilrodamina isotiocianato, Jackson ImmunoResearch) o FITC (Fluoresceina isotiocianato, Jackson ImmunoResearch); il TRITC assorbe ad un massimo di 543 nm ed emette nel rosso, il FITC a 488 nm ed emette nel verde. I nuclei sono stati colorati incubando le cellule per 15 minuti con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, Sigma-Aldrich). Infine, i vetrini sono stati lavati in PBS e successivamente chiusi con una goccia di Vectashield (Vector Laboratories) ed un vetrino coprioggetti. Le preparazioni sono state osservate in microscopia a fluorescenza (DM 5000B, Leica) e sono state acquisite immagini mediante fotocamera DC 300F (Leica), collegata al microscopio. La percentuale di cellule BrdU positive è stata calcolata su un totale di 1000 cellule identificate dalla colorazione nucleare (4',6-diamidin-2-fenilindolo ‘DAPI’) per campione.
Esperimenti di “Pulse and chase”
Allo scopo di simulare in vitro un trattamento a lungo termine dei composti dell’invenzione, le MCF-7 sono state piastrate in multiwell da 96 pozzetti ad una densità di 5000 cellule per pozzetto. Successivamente le cellule sono state trattate con un composto dell’invenzione (0,001, 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2,5 µM) secondo 3 disegni sperimentali:
1) Le MCF7 hanno ricevuto 4p ad intervalli di 48 h per tre volte consecutive (pulse), al termine del quale è stata determinata la vitalità cellulare mediante MTT; 2) Le MCF7 sono state sottoposte allo stesso trattamento per due volte consecutive (pulse) e sono state, quindi, coltivate in mezzo senza composto per un’ulteriore settimana (chase), al termine della quale è seguito il saggio di vitalità MTT; 3) Le MCF7 sono state sottoposte a trattamento con 4p ad intervalli di 48 h per tre volte consecutive (pulse) e sono state, quindi, coltivate in mezzo senza composto per un’ulteriore settimana (chase), al termine della quale è seguito il saggio di vitalità MTT.
Analisi citofluorimetrica dell’apoptosi
Lo ioduro di propidio (3,8–diammino–5dietilmetilamminopropil–6fenilfenantridin diioduro) (PI) è un colorante sintetico caratterizzato da una bassa fluorescenza (rossoarancio), in grado di legarsi selettivamente agli acidi nucleici. Il PI è un ottimo marker fluorescente degli acidi nucleici in doppia elica. Un parametro che viene sfruttato per valutare le cellule apoptotiche è il taglio internucleosomico del DNA della cellula apoptotica. Per valutare l’avvenuto taglio internucleosomico tipico delle cellule apoptotiche viene utilizzata la metodica d’analisi del ciclo cellulare. Il PI, legandosi stechiometricamente alla doppia elica del DNA fornisce un’informazione sulla quantità di DNA contenuta nelle cellule, in relazione all’intensità di fluorescenza (maggiore è il contenuto di DNA maggiore sarà la fluorescenza). E’ noto che il contenuto di DNA varia a seconda della fase del ciclo in cui si trova una cellula. In particolare, la fase G2 e la mitosi (M) hanno una quantità di DNA doppia rispetto alla fase G1, mentre durante la fase di sintesi del DNA (fase S), la cellula ha una quantità di DNA intermedia tra il contenuto in G1 e G2. Poiché le cellule apoptotiche, una volta risospese in un appropriato tampone, perdono i piccoli frammenti di DNA, è possibile osservare in esse una riduzione della fluorescenza del PI (correlata alla diminuzione del contenuto di DNA). In questo modo è possibile valutare la percentuale di cellule apoptotiche che si posizionano nel cosiddetto picco ipodiploide (fase pre-G1) e, oltre a questo, è possibile valutare la percentuale di cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare: G0/G1, S e G2/M (Riccardi, 2006). Per effettuare la colorazione con il PI è necessario ottenere una lisi della membrana citoplasmatica poiché il PI non è in grado di colorare in maniera stechiometrica le cellule con la membrana integra. Le MCF7 sono state raccolte, centrifugate e risospese in una soluzione ipotonica (0,1% sodio citrato; 0,1% Triton X-100; 50 µg/ml; dH2O), alla concentrazione di 10<6 >cellule/ml. La sospensione cellulare è stata incubata al buio per 30 min a temperatura ambiente per poi procedere con la lettura citofluorimetrica.
Analisi statistica
I risultati sono espressi come media ± deviazione standard. La significatività della differenza tra due misure è stata determinata dal test t di Student a due code spaiato. La significatività della differenza tra gruppi è stata determinata dal metodo di Bonferroni. Valori di probabilità p sono stati considerati significativi quando < 0,05.
Studi in vivo
I composti dell’invenzione sono stati sperimentati in vivo su topi CD1 maschi e su topi BALB/c femmine di sei settimane (Harlan, Milano, Italia). I topi BALB/c femmine sono stati usati per il modello animale di asma, mentre i topi CD1maschi sono stati usati per valutare l’edema della zampa e l’air pouch. Gli animali sono stati stabulati in ambiente climatizzato a temperatura costante di 22-24°C e range di umidità 40-50%, con cicli di lucebuio di 12 ore e con acqua e cibo sempre disponibili. Il protocollo sperimentale è stato approvato dall’Animal Care Committee della Seconda Università di Napoli. La tutela degli animali è conforme alla normativa italiana in materia di protezione degli animali usati a fini sperimentali e scientifici (Decreto Ministeriale 116/1992) nonché alle normative CEE (Gazzetta Ufficiale della C.E.358/1 12/18/1986). Tutti gli studi condotti sugli animali, sono stati riportati in accordo con le linee guida ARRIVE per esperimenti di segnalazione su animali (McGrath, 2010 #257).
Sensibilizzazione degli animali
I topi BALB/c femmine sono stati sensibilizzati all’ovalbumina (OVA) mediante iniezione sottocutanea di 0.2 ml di 10 μg di OVA disciolti in 3.3 mg di idrossido di alluminio in 0.4 ml di soluzione sterile salina al giorno 0 e 7. Successivamente gli animali sono stati divisi in tre gruppi sperimentali. Dal giorno 21, per tre giorni e tre settimane consecutive, ogni gruppo sperimentale ha subito un’ulteriore riesposizione dell’OVA (1% salino) (challenge) mediante aerosol, per 7 minuti. Inoltre, 30 minuti prima del challenge con OVA, gli animali sono stati pretrattati con iniezioni i.p. di sostanze sperimentali. In particolare, il primo gruppo ha ricevuto 100 µl di veicolo (DMSO, n=6), il secondo gruppo ha ricevuto 100 µl di 4p (0.1 – 0.01 – 0.001- 0.0001-0.00001 mg kg <-1 >, n=18), e l’ultimo gruppo ha ricevuto 100 µl di zileuton (0.1 – 0.01 – 0.001- 0.0001-0.00001 mg kg<-1>, n=18). Il gruppo naïve (n=6) non ha ricevuto trattamento. Le valutazioni broncopolmonari sono state condotte 24 h dopo l’ultimo challenge di OVA, come descritto di seguito.
Valutazione della funzione broncopolmonare
Le resistenze polmonari sono state valutate mediante la tecnica del polmone isolato e perfuso di topo. Il topo è stato alloggiato in una camera di resina acrilica costituita da un’intercapedine che permette l’entrata di acqua distillata riscaldata in un bagnetto termostatico settato a 37° C. Tale camera è posizionata in modo da formare un angolo di circa 20 gradi con l’asse orizzontale: in tal modo, la parte superiore della camera (apici dei polmoni) risulta essere elevata di circa 1 cm sul piano verticale rispetto alla parte inferiore (basi dei polmoni).
La camera, che funziona come gabbia toracica artificiale, è costruita in modo da consentire la chirurgia, la perfusione e la ventilazione del polmone di topo.
Una volta anestetizzato l’animale con ketamina HCl 40 mg/kg i.p. e medetomidina HCL 0.15 mg/kg i.p., è stata eseguita un’incisione della pelle in senso caudo–craniale, è stata esposta la trachea ed intubata mediante un piccolo taglio. E’ stata inserita così la cannula all’interno della trachea, che è risultata quindi collegata ad un pneumotacografo mediante un tubicino di silicone nel quale è stata inserita la cannula stessa, ed il polmone è stato ventilato con una pressione positiva (90 respiri/min, 250-300μl tidal volume). A questo punto è stato aperto l’addome, e rimosso il diaframma, ed il topo è stato eparinizzato mediante iniezione di eparina intracardiaca. Dopo dissanguamento, mediante incisione della vena renale, è stato aperto il torace e le due estremità sono state fissate alla cameretta, in modo da esporre cuore e polmoni. A questo punto è stata incannulata l’arteria polmonare, effettuando un piccolo taglio a livello del ventricolo destro, alla base dell’arteria, mediante una cannula di perfusione. Successivamente è stato effettuato un secondo taglio sotto il ventricolo sinistro, dove è stata inserita la seconda cannula che permette la fuoriuscita del perfusato. Chiudendo la camera e agendo su un’apposita pompa di scambio, si genera una pressione di ventilazione negativa oscillante tra –2 e –10 cm H2O, in modo da avere un volume respiratorio di 200 μl.(NPV).
I polmoni sono stati perfusi, attraverso l’arteria polmonare, in modo continuo e costante, con un flusso (generato da una pompa peristaltica, (Ismatec MS Reglo) di 0,6 ml/min, (che corrisponde circa all’ 8% del flusso cardiaco del topo), in grado di generare una pressione arteriosa polmonare di 2-3 cm H2O. Il buffer di perfusione (37º C) è costituito dal mezzo di coltura RPMI 1640, privato del rosso fenolo, e da albumina al 4% a basso contenuto di endotossine. La pressione toracica (camera artificiale) è stata misurata grazie ad un trasduttore differenziale di pressione (Validyne DP 45-24), ed il flusso respiratorio mediante un pneumotacografo connesso ad un altro trasduttore differenziale di pressione (Validyne 45-15). L’aria che arriva ai polmoni è stata umidificata da un apposito sistema, posizionato in prossimità della cannula tracheale. Si può monitorare continuamente la pressione arteriosa grazie ad un trasduttore di pressione (isotec Healthdyne) connesso alla cannula di perfusione dell’arteria polmonare. Tutti i dati sono stati trasmessi a un computer e analizzati da un “software Polmonare” (Hugo Sachs Elektronik, March Hugstetten, Germany). Dopo l’intervento chirurgico, i polmoni di ciascun gruppo (salina e OVA) sono stati perfusi e ventilati per circa 45 minuti senza alcun trattamento, ed è stata effettuata la registrazione delle funzioni polmonari basali.
I polmoni vengono trattati con Ach (Acetilcolina) effettuando curve dose-risposta (da 10<-8 >M a 10<-3 >M). Le dosi, vengono somministrate ad intervalli di 15 minuti l’una dall’altra con un volume di circa 50 µl ciascuna.
Edema della zampa
I topi sono stati leggermente anestetizzati con enflurano e hanno ricevuto iniezione subplantare di 50 μL di carragenina 1% (w/v). Il volume della zampa è stato misurato utilizzando un idropletmismometro appositamente modificato per piccoli volumi (Ugo Basile, Milano, Italia) immediatamente prima dell'iniezione subplantare (valore basale) e successivamente 2, 4, 6, 24, 48 e 72 h. I topi sono stati divisi in 6 gruppi (n = 6) e hanno ricevuto una somministrazione i.p. del composto desametasone (dex) o 4p (0.1- 0.01-0.001-0.0001 mg kg-1) o veicolo (DMSO), 30 minuti prima dell'applicazione di carragenina. Air pouch
I topi (28-30 g, due gruppi, n = 6, ciascuno) hanno ricevuto una somministrazione i.p. del composto 4p (0,1 mg kg-1) o del veicolo (DMSO), 30 minuti prima dell'induzione dell'infiammazione. I topi sono stati quindi leggermente anestetizzati con enflurano. L’air pouch (sacca d’aria) è stato sviluppato mediante iniezione sottocutanea di 2,5 ml di aria sterile sul dorso dei topi, nella parte posteriore. Tre giorni dopo, 2,5 ml di aria sterile sono stati reinseriti nella stessa cavità. Dopo altri tre giorni, 1 ml di zymosan 1% (w/v) o un veicolo (salina) è stato iniettato nell’air pouch e dopo altre 4 h i topi sono stati sacrificati per esposizione a CO2 e l'essudato nella sacca è stato raccolto con 1 ml di soluzione salina e posizionato in tubi graduati e centrifugato a 125 g per 10 min. Il pellet è stato sospeso in 500 μL di salina e i leucociti sono stati valutati mediante microscopia ottica nella sospensione cellulare diluita con la soluzione di Turk. In primis è possibile affermare che lo scaffold catecolico è fondamentale per l'attività.
Esempio 3: Valutazione in vitro dell’attività inibitoria della 5-LOX
I tests biologici hanno permesso di identificare la capacità inibitoria delle molecole saggiate in maniera indiretta, determinando la percentuale di formazione dei leucotrieni (LTB4, HPETE, ecc.) prodotti dall'enzima. Cellule di polimorfonucleati (PMNL), sono state opportunamente trattate con l'aggiunta di 2.5 µM di Calcimicina (A23187, uno ionoforo del Ca<2+>), che mimando lo stimolo infiammatorio è in grado di stimolare la produzione di leucotrieni, promuovendo l'attivazione della cPLA2 responsabile del rilascio dell'acido arachidonico dai fosfolipidi di membrana.
In questo tipo di saggio, la riduzione della produzione dei leucotrieni, oltre che all’inibizione della 5-LOX, potrebbe essere legata anche all’inibizione di altri enzimi coinvolti nel pathway, quali FLAP e/o cPLA2. Per escludere quest’ultimo evento il saggio viene condotto anche in presenza di acido arachidonico esogeno (20 µM). È stato, altresì, condotto un test cell-free su lisati cellulari di E.coli esprimenti la 5-LOX ricombinante, con lo scopo di confermare l’attività inibitoria a carico dell’enzima. I risultati sono riportati nella Tabella 3. Dai risultati dei saggi in vitro riportati nelle Figg. 1 e 2 si evince come la maggior parte dei composti sintetizzati espleta una potente azione inibitoria a carico dell’enzima tal quale con valori di IC50 compresi fra 7nM e 79 nM nel test cell-free. I dati chiaramente dimostrano l’influenza dell’anello eterociclico nell’attività di inibizione enzimatica. Tale attività è stata confermata anche in test su sangue.
Esempio 4: Analisi dell’attività antiossidante
Mediante misurazione spettrofotometrica a 517 nm della variazione di assorbanza della soluzione di DPPH dopo reazione con i vari composti è stato possibile quantificare la capacità riducente delle sostanze in esame sia che esse agiscano con trasferimento di idrogeno che per cessione di elettroni. Il risultato è espresso come EC50, cioè la quantità di antiossidante in grado di ridurre del 50% la concentrazione iniziale di DPPH. Più è basso il valore dato, maggiore è la potenza antiossidante del prodotto. Il test FRAP misura la capacità riducente dei composti nei confronti degli ioni Ferro. Si tratta di un metodo basato sul trasferimento di elettroni, in cui gli ioni ferro passano da Fe3+ a Fe2+. In determinate condizioni di pH (3,6) e in presenza di TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine), tali ioni formano dei complessi con caratteristiche diverse, in particolare il derivato ridotto (Fe2+-TPTZ) assume una colorazione blu che presenta un assorbimento massimo a 593 nm misurabile per via spettrofotometrica Questo saggio è in grado di misurare solamente l’abilità riducente del composto in esame nei confronti dello ione ferrico. Più è alto il valore dato, maggiore è la potenza riducente del prodotto.
Tabella 3: Valutazione in vitro dell’attività inibitoria della 5-LOX (Esempio 3) e dell’attività antiossidante (Esempio 4) dei composti 4a-p.
Esempio 5: Analisi dell’attività antitumorale
Inibizione in vitro della vitalità cellulare dopo trattamento con un composto dell’invenzione in cellule di cancro al seno
Il saggio colorimetrico MTT è stato effettuato per valutare gli effetti sulla vitalità delle MCF7 trattate per 24 e 48 ore, del composto 4p alle concentrazioni di 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1 e 2,5 µM. Dopo 48 ore e alle dosi più elevate, la vitalità delle MCF7 si è fortemente ridotta. In particolare, dopo 48 ore, a concentrazioni di del composto dell’invenzione 0,5; 1 e 2,5 µM, la vitalità delle MCF7 si è ridotta del 73%, 41% e 35%, rispettivamente (Fig.3). Dai risultati ottenuti, si è evidenziata una maggior sensibilità delle cellule MCF7 dopo il trattamento con il composto 4p a 48 ore con un IC50 di 0,390 µM.
L'IC50 è stato calcolato utilizzando il metodo di interpolazione lineare applicando la seguente formula:
IC50 = [(50-A)/ (B-A)] x (D-C) C (Mahata S, 2012; Zhengyin Yan GC 2004).
Per valutare la tossicità del composto 4p, abbiamo effettuato un trattamento a dosi elevate (2,5 – 5 – 10 µM) di farmaco su una linea di cellule sane. Le HUVEC dopo il trattamento prolungato a 24 e 48 ore non hanno mostrato alcun effetto citotossico (Fig. 4). Per confermare ulteriormente il dato, la stima della vitalità cellulare è stata effettuata anche mediante colorazione con Trypan Blue. Le cellule vitali sono diminuite in maniera proporzionale alle dosi di 0,5, 1 e 2,5 µM di composto 4p a 48h, con una percentuale di cellule morte rispettivamente del 63%, 73% e 83% (Fig.5). Questo conferma ulteriormente il dato ottenuto con il saggio MTT.
Inibizione in vitro della proliferazione cellulare dopo trattamento con un composto dell’invenzione in cellule di cancro al seno
Al fine di determinare se una riduzione della vitalità cellulare fosse il risultato di una ridotta proliferazione delle MCF7, le cellule sono state incubate con BrdU. L’analisi del saggio di incorporazione di BrdU nelle MCF7 ha evidenziato una drastica riduzione della crescita. Al paragone con cellule non trattate, l’inibitore della 5-LOX ha determinato un’inibizione quasi completa della proliferazione cellulare ai tempi di esposizione più lunghi. Pertanto, le MCF7 risultano altamente sensibili al composto dell’invenzione, mostrando un aumento della morte cellulare ed una riduzione della crescita. La frazione di cellule in mitosi misurata a 48h è risultata diminuita del 21% a 0,5 µM, del 15% a 1 µM e del 12% a 2,5 µM (Fig. 6).
Effetti del trattamento con un composto dell’invenzione sulla distribuzione del ciclo cellulare e sull'apoptosi in linee cellulari di cancro al seno
Allo scopo di valutare l’espressione di proteine da lisati cellulari, coinvolte in pathway di proliferazione, sopravvivenza, apoptosi, e blocco del ciclo cellulare sono stati effettuati esperimenti mediante tecniche di Western Blot e citofluorimetria. I risultati ottenuti mostrano, nelle MCF7 trattate nel breve termine con il composto 4p (24 e 48 ore) marcata morte cellulare per apoptosi, cui si associa inoltre un’altrettanto marcata riduzione della capacità proliferativa. Inoltre, i dati del FACS confermano un arresto del ciclo cellulare in fase G1/S (Fig. 7 a, b).
Inoltre, risulta pesantemente ridotto il rapporto tra la forma fosforilata, ovvero attiva, e la forma non fosforilata di AKT e di GSK, serin-treonin chinasi coinvolte in processi di proliferazione, sopravvivenza cellulare, crescita ed angiogenesi (Fig.8; Fig. 9).
Analogamente, risulta ridotto il rapporto tra la forma fosforilata e non di ERK, MAP chinasi (Fig. 10). L’attivazione di essa richiede la sua fosforilazione con conseguente traslocazione all’interno del nucleo, dove funge da regolatore della trascrizione genica. Conseguentemente, risulta aumentato anche il rapporto tra Bax e Bcl-2 (attivati dalla Caspasi-3). Notoriamente, Bax ha funzione pro-apoptotica, mentre Bcl-2 ha funzione antiapoptotica. L’aumento osservato nel rapporto tra Bax e Bcl-2, della caspasi-9 e di PARP confermano la tesi per cui le MCF-7 vanno incontro a morte programmata per apoptosi (Fig. 11; Fig. 12; Fig.13).
Considerando che la via di trasduzione fortemente coinvolta nei meccanismi di proliferazione cellulare, progressione del ciclo, apoptosi e metabolismo è quella di PI3K/AKT/mTOR abbiamo analizzato un suo coinvolgimento. AKT è la serinatreonina chinasi che viene direttamente attivata in risposta a PI3K, ed è il più importante effettore della PI3K, proteina a monte di mTOR. Nello stato attivo, mTOR dà vita a due differenti complessi multiproteici. Il primo (complessoTOR rapamicina-sensibile o mTORC1) è costituito da Raptor (regulatory associated protein of TOR) e GβL (G-protein β-subunit-like) e fosforila p70S6K e l’inibitore 4E-BP1 (eucaryotic translationinitiation factor 4E-inhibitory binding protein) (Fingar et al., 2002), entrambi coinvolti nella regolazione della sintesi proteica.
P70S6K infatti attiva la traduzione di mRNA fosforilando la proteina S6 del complesso ribosomiale 40S, mentre la fosforilazione e inibizione di 4E-BP1 consente il rilascio del fattore eIF-4E che può così prendere parte alla formazione di un complesso d’inizio della traduzione. Il derivato 4p agisce in maniera dose-dipendente su AKT, inibendone la fosforilazione; si lega al dominio PH di AKT, impedendo al PIP3 di interagire e di ancorare AKT alla membrana cellulare. Infatti, i risulti ottenuti mostrano come il trattamento con il composto 4p sia anche in grado di inibire la cascata a valle di p-AKT, deregolando il livelli di mTOR, con conseguente inibizione della fosforilazione della proteina P4E-BP1 e della proteina ribosomale S6 chinasi (pp70S6K) (Fig.14).
La necessità di inibizione di molteplici target è correlata alla complessità della modulazione delle vie di segnalazione nella progressione tumorale e all’abilità della cellula tumorale di adattarsi agli stress. Per questa ragione vi è una sempre maggiore attenzione allo sviluppo di inibitori che abbiano molteplici bersagli. I dati ottenuti mostrano come 4p inibitore dell’asse di sopravvivenza di PI3K/AKT/mTOR possa essere determinante nel bloccare la crescita cellulare di cellule di cancro al seno e di indurre apoptosi.
Effetti del trattamento a lungo termine con un composto dell’invenzione sulla vitalità cellulare
Allo scopo di simulare un trattamento a lungo termine del farmaco sulle MCF7, sono stati effettuati esperimenti di pulse-chase. In pratica, alcune cellule sono state trattate ad intervalli di 48 h per tre volte consecutive (pulse), per poi effettuare un saggio di vitalità cellulare (MTT). I dati ottenuti mostrano, a concentrazioni di composto 4p di 0,5; 1 e 2,5 µM, una riduzione della vitalità cellulare di 42%, 38% e 30% rispettivamente (Fig. 16). Contemporaneamente, altre cellule sono state sottoposte allo stesso trattamento per due (Fig. 17) e per tre volte (Fig. 18) consecutive, al fine delle quali sono state lasciate in mezzo di coltura per un’ulteriore settimana (chase), seguito sempre da MTT. I risultati di questi esperimenti mostrano una inibizione ancora maggiore della crescita cellulare nel trattamento ripetuto, ma in modo ancor più rilevante il dato è confermato con il chase (assenza di trattamenti). Tali dati suggeriscono che l’attivazione dei sopraelencati meccanismi (blocco del ciclo cellulare, apoptosi e inibizione della proliferazione), promossi dall’utilizzo del composto 4p, permangono inalterati anche una settimana dopo la sospensione del farmaco.
Esempio 6: Valutazione in vivo dell’attività antinfiammatoria
Al fine di indagare se il composto 4p inibisca la sintesi dei leucotrieni in vivo abbiamo valutato il derivato contro la reattività bronchiale utilizzando un modello di polmone isolato e perfuso in topi OVA-sensibilizzati con Ach (Acetilcolina) (D'Agostino, 2010).
Effetto di un composto dell’invenzione sulla reattività bronchiale in vivo.
Per valutare l'effetto di 4p sulla reattività bronchiale in vivo, è stata utilizzata la tecnica del polmone isolato e perfuso di topo. Il veicolo, DMSO, ha ridotto significativamente le resistenze polmonari rispetto al gruppo OVA, inoltre il pre-trattamento (30 minuti prima di ogni challenge di OVA) con 4p (0.1 – 0.01 – 0.001- 0.0001 - 0.00001 mg kg-1 i.p.) o zileuton (0.1 – 0.01 – 0.001- 0.0001 - 0.00001 mg kg-1 i.p.), un inibitore noto della 5-LOX ha causato una marcata riduzione della broncocostrizione indotta da ACh rispetto al gruppo con veicolo (Figg. 19 e 20). L'effetto inibitorio è stato osservato in tutte le dosi sperimentate tranne 0.00001 mg kg-1 e non sono state osservate differenze significative tra zileuton e 4p a tutte le dosi utilizzate.
Questi dati risultano di notevole rilevanza mostrando questo composto un’attività antinfiammatoria paragonabile a quella dei derivati cortisonici ma non presentando nel contempo le problematiche connesse all’utilizzo di questa classe di farmaci.
Effetto antiinfiammatorio in vivo di un composto dell’invenzione.
Allo scopo di valutare l'efficacia di 4p in vivo, sono stati utilizzati due modelli animali ben accertati di infiammazione, come l'edema della zampa del topo indotto da carragenina e il modello di air pouch. Il pretrattamento dei topi (30 min prima dell'iniezione di carragenina) con desametasone (0.1- mg kg-1 intraperitonealmente) e con il composto 4p (0.001 mg/kg, i.p.) ha significativamente ridotto l’edema della zampa posteriore. L'effetto inibitorio di 4p è stato osservato sia nella prima (2-6 h) che nella seconda fase (24-72 h) dell'edema (Fig. 21). Visto il ruolo di LTB4 nella chemiotassi dei leucociti, abbiamo anche valutato se 4p potesse compromettere la migrazione cellulare in vivo nel modello di air pouch. Il composto 4p, somministrato i.p. alla dose di 0,1 mg kg-1, presentava una significativa azione inibitoria sulla migrazione di neutrofili indotta da zymosan. (Fig.22).
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