IT201800000641A1 - Topical composition for the treatment and / or prevention of cutaneous and / or adnexal fungal infections. - Google Patents
Topical composition for the treatment and / or prevention of cutaneous and / or adnexal fungal infections. Download PDFInfo
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Description
Titolo: Composizione topica per il trattamento e/o la prevenzione delle infezioni micotiche cutanee e/o annessiali Title: Topical composition for the treatment and / or prevention of cutaneous and / or adnexal fungal infections
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Campo di applicazione Field of application
La presente invenzione si riferisce in generale al campo medico, in particolare al campo delle infezioni micotiche. The present invention relates in general to the medical field, in particular to the field of fungal infections.
In particolare, l’invenzione riguarda una composizione topica per il trattamento e/o la prevenzione delle infezioni micotiche cutanee e/o annessiali. In particular, the invention relates to a topical composition for the treatment and / or prevention of cutaneous and / or adnexal fungal infections.
Arte nota Known art
I funghi sono un gruppo di microorganismi che provocano le micosi cutanee (o dermatomicosi), in particolare dell’epidermide, e degli annessi della pelle, più comunemente le unghie (onicomicosi). Fungi are a group of microorganisms that cause cutaneous mycosis (or dermatomycosis), in particular of the epidermis, and of the appendages of the skin, most commonly the nails (onychomycosis).
I funghi che infettano la pelle e annessi dell’uomo possono essere dermatofiti, muffe, o lieviti. Fungi that infect human skin and appendages can be dermatophytes, molds, or yeasts.
Le candide e il Pityrosporum (Malassezia) sono lieviti, solitamente presenti allo stato di saprofiti sulla cute e delle mucose, che possono diventare patogeni invasivi a determinate condizioni, comportandosi come microorganismi opportunisti, provocando così una malattia. Candida and Pityrosporum (Malassezia) are yeasts, usually present in the state of saprophytes on the skin and mucous membranes, which can become invasive pathogens under certain conditions, behaving as opportunistic microorganisms, thus causing disease.
Le muffe in genere danno patologia solo nelle persone immunodepresse. Molds usually cause pathology only in immunosuppressed people.
Al gruppo dei dermatofiti appartengono le specie Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton, altamente cheratinofili e che danno luogo alle dermatofitosi (dette anche tigne, o tinee), che si manifestano con chiazze cutanee a forma di coccarda, a bordi netti ed evoluzione centrifuga. L’invasione della cute avviene nel sito di inoculazione (vale a dire di contagio) e diventa visibile dopo 1-3 settimane. The Epidermophyton, Microsporum and Trichophyton species belong to the group of dermatophytes, highly keratinophilic and which give rise to dermatophytoses (also called tigne, or tinee), which manifest themselves with rosette-shaped skin patches, with sharp edges and centrifugal evolution. The invasion of the skin occurs at the injection site (ie contagion) and becomes visible after 1-3 weeks.
In base alla zona di comparsa, si parla di tinea corporis (se coinvolge la cute glabra del tronco, il volto, gli arti), tinea pedis (o piede d’atleta, se compare sui piedi), tinea unguium o onicomicosi(se compare sulle unghie), tinea capitis (che coinvolge il cuoio capelluto), tinea manum (se compare sulle mani) e tinea cruris (se compare all’inguine). Depending on the area of appearance, we speak of tinea corporis (if it involves the hairless skin of the trunk, face, limbs), tinea pedis (or athlete's foot, if it appears on the feet), tinea unguium or onychomycosis (if it appears on the nails), tinea capitis (involving the scalp), tinea manum (if it appears on the hands) and tinea cruris (if it appears in the groin).
La tinea corporis è dovuta all’infezione, solitamente da parte di Microsporum canis, e si manifesta con lesioni eritemato-desquamative a limiti netti, con bordi eritemato squamosi e tendenza alla risoluzione centrale. Tinea corporis is due to infection, usually by Microsporum canis, and manifests itself with clear-cut erythematous-desquamative lesions, with scaly erythematous edges and a tendency to central resolution.
La tinea cruris è provocata più frequentemente da Epidermophyton e Tricophyton rubrum, si manifesta con chiazze eritemato-desquamative simmetriche a livello delle pieghe inguinali a limiti netti, con estensione centrifuga, bordi eritemato squamosi e tendenza alla risoluzione centrale. Tinea cruris is most frequently caused by Epidermophyton and Tricophyton rubrum, it manifests itself with symmetrical erythematous-desquamative patches at the level of the inguinal folds with sharp limits, with centrifugal extension, scaly erythematous edges and a tendency to central resolution.
La tinea pedis (detta anche piede d’atleta), frequentemente provocata da Tricophyton rubrum, si localizza a livello degli spazi interdigitali e si manifesta con macerazione della pelle. Tinea pedis (also called athlete's foot), frequently caused by Tricophyton rubrum, is localized in the interdigital spaces and manifests itself with maceration of the skin.
La tinea manum può essere provocata da Tricophyton rubrum o Tricophyton interdigitale. Si manifesta più frequentemente come ipercheratosi palmare monolaterale, ma può essere anche vescicolare, papulosa e desquamativa. Tinea manum can be caused by Tricophyton rubrum or Tricophyton interdigitale. It most commonly manifests as unilateral palmar hyperkeratosis, but can also be vesicular, papular, and desquamative.
La tinea capitis che colpisce quasi esclusivamente i bambini ha manifestazioni variabili a seconda dell’agente patogeno. Nel caso della tigna microsporica, si osservano chiazze alopeciche rotondeggianti a limiti netti con desquamazione all’interno. Nel caso della tinea tricofitica, le chiazze alopeciche sono più piccole e tonde con capelli tronchi a livello degli osti follicolari. La desquamazione è minima. Tinea capitis, which almost exclusively affects children, has variable manifestations depending on the pathogen. In the case of microsporic ringworm, roundish alopecic patches are observed at clear limits with internal desquamation. In the case of ringworm, the alopecic patches are smaller and rounder with truncated hair at the level of the follicular ostia. The flaking is minimal.
La tinea unguium può frequentemente essere provocata da Tricophyton rubrum o Tricophyton interdigitale e si manifesta con un inspessimento e uno sfaldamento della lamina ungueale. Tinea unguium can frequently be caused by Tricophyton rubrum or Tricophyton interdigitale and is manifested by thickening and flaking of the nail plate.
L’infezione da dermatofitica cutanea (e annessiale) può avvenire per contagio diretto o indiretto interumano, animale o ambientale; o per autocontagio da un punto all’altro della superficie corporea, ad esempio mediante grattamento. Il contagio indiretto può avvenire ad esempio tramite, spazzole, poltrone di luoghi pubblici, cappelli, biancheria da letto, tappeti, pavimenti degli spogliatoi e basi per docce, ecc. Skin (and adnexal) dermatophytica infection can occur by direct or indirect human, animal or environmental contagion; or by self-contagion from one point to another on the body surface, for example by scratching. Indirect contagion can occur, for example, through brushes, armchairs in public places, hats, bed linen, carpets, floors in changing rooms and shower bases, etc.
La tinea versicolor o pitiriasi versicolor è causata da lieviti e si manifesta come alterazioni della pigmentazione cutanea, con macchie irregolari ben demarcate e piane di colore più chiaro o più scuro rispetto alla pelle. Il patogeno responsabile è la Malassezia furfur, più raramente Malassezia symptodiali, Malassezia globosa e Malassezia obtusa. Tinea versicolor or pityriasis versicolor is caused by yeasts and manifests itself as changes in skin pigmentation, with well-demarcated, flat irregular spots that are lighter or darker in color than the skin. The responsible pathogen is Malassezia furfur, more rarely Malassezia symptodiali, Malassezia globosa and Malassezia obtusa.
Per lesioni che interessano solo la cute il trattamento comprende solitamente una terapia locale e sistemica a base di derivati imidazolici e terbinafina. Quando le micosi interessano le unghie, oltre ad applicare preparati topici si deve fare una terapia sistemica con terbinafina, itraconazolo o fluconazolo. Lo stesso dicasi per le tinee della cute glabra che abbiano interessato il pelo vello. For lesions affecting only the skin, treatment usually includes local and systemic therapy based on imidazole derivatives and terbinafine. When mycoses affect the nails, in addition to applying topical preparations, systemic therapy with terbinafine, itraconazole or fluconazole must be done. The same can be said for the tines of the hairless skin that have affected the fleece hair.
Nel caso in cui le micosi coinvolgono il cuoio capelluto solitamente sono efficaci solo terapie sistemiche con griseofulvina o derivati imidazolici. In the event that mycoses involve the scalp, only systemic therapies with griseofulvin or imidazole derivatives are usually effective.
Questi principi attivi hanno tuttavia l’inconveniente che possono essere aggressivi e pertanto alcuni non possono essere usati ad esempio in gravidanza e in allattamento. Inoltre, poiché possono interagire con altri farmaci, il loro uso non è consigliato in persone anziane che stanno seguendo altre terapie nello stesso periodo. However, these active ingredients have the drawback that they can be aggressive and therefore some cannot be used, for example during pregnancy and breastfeeding. Furthermore, as they can interact with other drugs, their use is not recommended in older people who are following other therapies at the same time.
Inoltre, questi principi attivi possono dar luogo a effetti collaterali tra cui nausea, diarrea, cefalea e reazioni di orticaria. Furthermore, these active ingredients can give rise to side effects including nausea, diarrhea, headache and hives reactions.
Esistono rimedi naturali, come l’aloe vera, olio essenziale del Tea Tree, olio essenziale di geranio, ecc. Tuttavia, questi non sono sempre efficaci nel caso di un’infezione ormai estesa. There are natural remedies, such as aloe vera, tea tree essential oil, geranium essential oil, etc. However, these are not always effective in the case of a now extensive infection.
E’ sentita quindi nel settore la necessità di mettere a disposizione un trattamento per le infezioni micotiche cutanee e annessi che sia efficace ma allo stesso tempo sostanzialmente privo di effetti collaterali rispetto ai trattamenti farmacologici attualmente disponibili. The need is therefore felt in the sector to provide a treatment for fungal skin and related infections that is effective but at the same time substantially free of side effects compared to currently available pharmacological treatments.
Il problema tecnico alla base della presente invenzione è quindi quello di mettere a disposizione una composizione per la prevenzione e/o il trattamento delle infezioni micotiche cutanee e annessi che sia efficace e allo stesso tempo presenti effetti collaterali in misura minore (o nulla) rispetto alle composizioni farmaceutiche attualmente disponibili. The technical problem underlying the present invention is therefore that of providing a composition for the prevention and / or treatment of cutaneous and related fungal infections that is effective and at the same time has less (or no) side effects than currently available pharmaceutical compositions.
E’ altresì oggetto della presente invenzione quello di mettere a disposizione una siffatta composizione che sia adatta a tutte le fasce di età e che non interagisca con l’assunzione di farmaci. It is also the object of the present invention to provide such a composition which is suitable for all age groups and which does not interact with the intake of drugs.
Sommario dell’invenzione Summary of the invention
Il suddetto problema è stato risolto secondo l’invenzione da una composizione topica comprendente il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) vitale e un veicolo farmaceuticamente accettabile. The aforementioned problem was solved according to the invention by a topical composition comprising the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516) viable and a pharmaceutically acceptable vehicle.
Il suddetto ceppo è stato depositato presso DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH, Germania) in data 16 maggio 2017 in conformità con il Trattato di Budapest. Al ceppo è stato assegnato il numero DSM 32516. The aforementioned strain was deposited with DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH, Germany) on 16 May 2017 in accordance with the Budapest Treaty. The strain was assigned the DSM number 32516.
Preferibilmente, il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis è un ceppo isolato. Preferably, the Lactobacillus brevis 1C3Ma strain is an isolated strain.
Preferibilmente, il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis è presente nella composizione in una concentrazione, in unità formanti colonie (CFU) sul volume della composizione, compresa tra 1x10<5 >e 1x10 CFU/ml, più preferibilmente compresa tra 1x10<6 >e 1x10<11 >CFU/ml, il più preferibilmente compresa tra 1 x 10<7 >e 1 x 10<10 >CFU/ml. Preferably, the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis is present in the composition in a concentration, in colony forming units (CFU) on the volume of the composition, comprised between 1x10 <5> and 1x10 CFU / ml, more preferably between 1x10 <6> and 1x10 <11> CFU / ml, most preferably between 1 x 10 <7> and 1 x 10 <10> CFU / ml.
La concentrazione batterica vitale nella composizione è misurata secondo metodi noti nel settore, ad esempio mediante il metodo della conta in piastra, in particolare con semina per spatolamento in superficie utilizzando il terreno di coltura MRS (De Man Rogosa & Sharpe (De Man, et al. (1960) A medium for the cultivation of Lactobacilli. J. Appl. Bact, 23 (1), 130-135)). The viable bacterial concentration in the composition is measured according to methods known in the art, for example by the plate count method, in particular by sowing by spatulation on the surface using the MRS culture medium (De Man Rogosa & Sharpe (De Man, et al . (1960) A medium for the cultivation of Lactobacilli. J. Appl. Bact, 23 (1), 130-135)).
Preferibilmente, il veicolo comprende una fase acquosa. Preferably, the carrier comprises an aqueous phase.
Preferibilmente, la fase acquosa comprende uno o più terreni di coltura scelti tra MRS (De Man Rogosa & Sharpe), MRS-G (De Man Rogosa & Sharpe 0,2% glucosio), PBS (tampone fosfato salino, “phosphate buffered saline”), PBS glu (20%) (con 20% di glucosio), più preferibilmente MRS-G. Preferably, the aqueous phase comprises one or more culture media chosen from MRS (De Man Rogosa & Sharpe), MRS-G (De Man Rogosa & Sharpe 0.2% glucose), PBS (phosphate buffered saline, "phosphate buffered saline" ), PBS glu (20%) (with 20% glucose), more preferably MRS-G.
Preferibilmente, la composizione è una composizione antimicotica. Per “antimicotica” si intende capace di inibire la crescita degli organismi fungini, in particolare muffe e lieviti. Preferably, the composition is an antifungal composition. By “antifungal” we mean capable of inhibiting the growth of fungal organisms, in particular molds and yeasts.
Preferibilmente, la composizione comprende inoltre uno o più polimeri, più preferibilmente polimeri ad azione idratante della pelle e/o annessi. Preferably, the composition further comprises one or more polymers, more preferably polymers with skin moisturizing action and / or annexes.
Preferibilmente, tali uno o più polimeri sono compresi nella fase acquosa. Preferably, such one or more polymers are included in the aqueous phase.
Preferibilmente il polimero è scelto tra acido ialuronico e/o suoi sali, gomma xantana, HPMC (idrossipropil metil cellulosa), il più preferibilmente acido ialuronico e/o suoi sali. Preferably the polymer is selected from hyaluronic acid and / or its salts, xanthan gum, HPMC (hydroxypropyl methyl cellulose), most preferably hyaluronic acid and / or its salts.
Preferibilmente, l’acido ialuronico e/o suoi sali presenta un peso molecolare compreso tra 10 e 4000 kDa, più preferibilmente compreso tra 100 e 3000 kDa, il più preferibilmente compreso tra 200 e 2000 kDa. Preferably, hyaluronic acid and / or its salts have a molecular weight between 10 and 4000 kDa, more preferably between 100 and 3000 kDa, most preferably between 200 and 2000 kDa.
Preferibilmente, l’acido ialuronico e/o suoi sali è sodio ialuronato. Preferably, the hyaluronic acid and / or its salts is sodium hyaluronate.
Preferibilmente, il sodio ialuronato è scelto tra sodio ialuronato a basso peso molecolare, sodio ialuronato ad alto peso molecolare, e loro miscele. Preferably, the sodium hyaluronate is selected from low molecular weight sodium hyaluronate, high molecular weight sodium hyaluronate, and their mixtures.
Con “sodio ialuronato a basso peso molecolare” si intende qui sodio ialuronato con un peso molecolare compreso tra 10 e 1000 kDa, preferibilmente compreso tra 200 e 600 kDa, più preferibilmente compreso tra 300 e 500 kDa. By "low molecular weight sodium hyaluronate" we mean here sodium hyaluronate with a molecular weight between 10 and 1000 kDa, preferably between 200 and 600 kDa, more preferably between 300 and 500 kDa.
Con “sodio ialuronato ad alto peso molecolare” si intende qui sodio ialuronato con un peso molecolare superiore a 1000 kDa e pari o inferiore a 4000 kDa, preferibilmente compreso tra 1200 e 2000 kDa, più preferibilmente compreso tra 1300 e 1700 kDa. By "high molecular weight sodium hyaluronate" is meant here sodium hyaluronate with a molecular weight greater than 1000 kDa and equal to or less than 4000 kDa, preferably between 1200 and 2000 kDa, more preferably between 1300 and 1700 kDa.
Preferibilmente, l’uno o più polimeri è presente nella composizione a una concentrazione, in percentuale in peso sul volume totale della composizione, compresa tra 0,01 e 5%, più preferibilmente compresa tra 0,05 e 3%, il più preferibilmente compresa tra 1 e 2,5%. Preferably, the one or more polymers is present in the composition at a concentration, in percent by weight on the total volume of the composition, comprised between 0.01 and 5%, more preferably between 0.05 and 3%, most preferably comprised between 1 and 2.5%.
In un forma di realizzazione preferita, l’uno o più polimeri comprende sodio ialuronato a basso peso molecolare e sodio ialuronato ad alto peso molecolare in un rapporto ponderale tra sodio ialuronato a basso peso molecolare e sodio ialuronato ad alto peso molecolare compreso tra 1 e 10, più preferibilmente compreso tra 2 e 8, il più preferibilmente compreso tra 3 e 6. In a preferred embodiment, the one or more polymers comprises low molecular weight sodium hyaluronate and high molecular weight sodium hyaluronate in a weight ratio of low molecular weight sodium hyaluronate to high molecular weight sodium hyaluronate between 1 and 10 , more preferably between 2 and 8, most preferably between 3 and 6.
Preferibilmente, la composizione è in forma di un gel, più preferibilmente un idrogel. Preferably, the composition is in the form of a gel, more preferably a hydrogel.
Preferibilmente, il pH della composizione è compreso tra 4 e 7, più preferibilmente compreso tra 4,5 e 6,5, il più preferibilmente compreso tra 5 e 6. Preferably, the pH of the composition is between 4 and 7, more preferably between 4.5 and 6.5, most preferably between 5 and 6.
Preferibilmente, la composizione è confezionata in un dosatore da 30 ml a tenuta d’aria. Preferably, the composition is packaged in an airtight 30 ml dispenser.
Preferibilmente, la composizione si conserva a 4 °C per almeno 60 giorni, più preferibilmente almeno 90 giorni, ancora più preferibilmente per almeno 120 giorni. La composizione dell’invenzione viene prodotta secondo metodi ben noti nel settore, ad esempio per inoculazione e incubazione del ceppo in un mezzo di coltura, con eventuale successiva aggiunta e miscelazione di uno o più polimeri e/o altri additivi. Per esempio, un metodo consiste nel preparare una beuta (ad esempio da 400 ml) sterile con brodo di coltura (ad esempio 200 ml, ad esempio di MRS-G) e inoculare una colonia del ceppo nel brodo; incubare, ad esempio a 37 °C in microaerofilia per 18h; eventualmente aggiungere una predeterminata quantità di un polimero, e/o eventuali ulteriori additivi; e lasciare in agitazione (ad esempio con agitatore magnetico) a temperatura ambiente, ad esempio per almeno 24h, fino all’ottenimento di un preparato dall’aspetto omogeneo. Il preparato può poi essere trasferito asetticamente in contenitori finali sterili. Preferably, the composition is kept at 4 ° C for at least 60 days, more preferably at least 90 days, even more preferably for at least 120 days. The composition of the invention is produced according to methods well known in the field, for example by inoculation and incubation of the strain in a culture medium, with the possible subsequent addition and mixing of one or more polymers and / or other additives. For example, one method consists in preparing a sterile flask (for example of 400 ml) with culture broth (for example 200 ml, for example of MRS-G) and inoculating a colony of the strain in the broth; incubate, for example at 37 ° C in microaerophilicity for 18h; optionally adding a predetermined quantity of a polymer, and / or any further additives; and leave under stirring (for example with a magnetic stirrer) at room temperature, for example for at least 24 hours, until a homogeneous-looking preparation is obtained. The preparation can then be transferred aseptically to sterile final containers.
La presente invenzione riguarda inoltre la composizione topica dell’invenzione per l’uso come medicamento. The present invention also relates to the topical composition of the invention for use as a medicament.
La presente invenzione riguarda inoltre la composizione topica dell’invenzione per l’uso topico nella prevenzione e/o il trattamento di infezioni micotiche cutanee e/o annessi. The present invention also relates to the topical composition of the invention for topical use in the prevention and / or treatment of cutaneous and / or related fungal infections.
La presente invenzione riguarda inoltre il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516). The present invention also relates to the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516).
Preferibilmente, il ceppo di Lactobacillus brevis è un ceppo isolato. Il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) è stato selezionato in seguito a isolamento da formaggio sardo ovino. Questo microorganismo non è quindi il frutto di tecniche di manipolazione genica e non è stato quindi geneticamente modificato. Preferably, the Lactobacillus brevis strain is an isolated strain. Lactobacillus brevis strain 1C3Ma (DSM 32516) was selected following isolation from Sardinian sheep cheese. This microorganism is therefore not the result of gene manipulation techniques and has therefore not been genetically modified.
Sono da considerarsi ricompresi nell’ambito della presente invenzione anche ceppi mutanti o ceppi modificati geneticamente derivanti dal ceppo della presente invenzione. Tali mutanti o ceppi modificati geneticamente possono essere ceppi in cui uno o più geni endogeni del ceppo dell’invenzione è stato sottoposto a mutazione, ad esempio per modificare le sue caratteristiche metaboliche (ad esempio la capacità di fermentare certi zuccheri). Possono anche essere ceppi da modificazione genetica del ceppo dell’invenzione, ad esempio per conferire determinate caratteristiche fisiologiche al ceppo o per alterare la sua espressione proteica. Preferibilmente, il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis è nella forma di una coltura biologicamente pura, vale a dire che non presenta contaminazioni da altri microorganismi. Mutant strains or genetically modified strains deriving from the strain of the present invention are also to be considered within the scope of the present invention. Such mutants or genetically modified strains can be strains in which one or more endogenous genes of the strain of the invention has been mutated, for example to modify its metabolic characteristics (for example the ability to ferment certain sugars). They can also be strains from genetic modification of the strain of the invention, for example to give certain physiological characteristics to the strain or to alter its protein expression. Preferably, the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis is in the form of a biologically pure culture, i.e. it does not have contamination from other microorganisms.
Preferibilmente, il ceppo di Lactobacillus brevis è in una forma scelta tra liofilizzata, in sospensione in un liquido, in sospensione in un gel, più preferibilmente in sospensione in un gel, ancora più preferibilmente un idrogel. Preferably, the Lactobacillus brevis strain is in a form selected from lyophilized, in suspension in a liquid, in suspension in a gel, more preferably in suspension in a gel, still more preferably a hydrogel.
La presente invenzione riguarda inoltre il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) vitale per l’uso come medicamento. The present invention also relates to the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516) vital for use as a medicament.
La presente invenzione riguarda inoltre il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) vitale per l’uso topico nella prevenzione e/o il trattamento di infezioni micotiche cutanee e/o annessi. The present invention also relates to the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516) vital for topical use in the prevention and / or treatment of cutaneous and / or attached fungal infections.
Con il termine “annessi” e “annessiali” ci si riferisce qui agli annessi cutanei, vale a dire quelle parti del corpo non cutanee che possono essere interessate da tigna, come ad esempio le unghie, i capelli e i peli. Preferibilmente, nella prevenzione e/o trattamento, la composizione è applicata a un individuo che ne necessita sulla parte di cute e/o annessi interessata e/o che può essere interessata da un’infezione micotica cutanea e/o annessi. The term "appendages" and "appendages" refers here to the skin appendages, that is to say those non-cutaneous parts of the body that can be affected by ringworm, such as nails, hair and dander. Preferably, in the prevention and / or treatment, the composition is applied to an individual who needs it on the affected part of skin and / or appendages and / or who may be affected by a fungal infection of the skin and / or appendages.
Preferibilmente, la composizione è applicata in una quantità compresa tra 0,1 e 1 g, più preferibilmente compresa tra 0,3 e 0,7 g, ancora più preferibilmente di 0,5 g circa di composizione, avente una carica vitale del ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis di 1 x 10<9 >CFU/ml, per 300 cm<2 >di cute e/o annessi interessata. E’ nelle capacità del tecnico del ramo, a partire da queste indicazioni, fare le opportune variazioni di dosaggio della composizione a seconda della sua carica vitale. Preferably, the composition is applied in an amount ranging from 0.1 to 1 g, more preferably from 0.3 to 0.7 g, still more preferably about 0.5 g of composition, having a vital charge of the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis of 1 x 10 <9> CFU / ml, for 300 cm <2> of affected skin and / or adnexa. It is in the skills of the skilled person, starting from these indications, to make the appropriate dosage variations of the composition according to its vital charge.
Preferibilmente, la composizione è applicata con una frequenza compresa tra 1 e 5 volte al giorno, più preferibilmente tra 1 e 3 volte al giorno, il più preferibilmente 2 volte al giorno. Preferably, the composition is applied with a frequency comprised between 1 and 5 times a day, more preferably between 1 and 3 times a day, most preferably 2 times a day.
Preferibilmente, nel trattamento la composizione dell’invenzione è applicata sulla cute e/o annessi di un paziente che presenta i sintomi di infezione micotica cutanea e/o di annessi, più preferibilmente un paziente affetto da uno o più tra tinea manum, tinea pedis, tinea corporis, tinea unguium, tinea capitis, tinea faciei, e tinea cruris, ancora più preferibilmente uno o più tra tinea manum, tinea pedis, tinea corporis, tinea faciei, e tinea cruris. Preferably, in the treatment, the composition of the invention is applied to the skin and / or appendages of a patient who has the symptoms of cutaneous fungal infection and / or appendages, more preferably a patient suffering from one or more between tinea manum, tinea pedis, tinea corporis, tinea unguium, tinea capitis, tinea faciei, and tinea cruris, even more preferably one or more of tinea manum, tinea pedis, tinea corporis, tinea faciei, and tinea cruris.
Preferibilmente i sintomi dell’infezione micotica sono uno o più tra chiazze (o lesioni) eritematodesquamative, macerazione della pelle interdigitale, ipercheratosi, inspessimento dell’unghia con lisi della lamina e alopecia per parassitamento del pelo. Preferably, the symptoms of mycotic infection are one or more of erythematodesquamative patches (or lesions), maceration of the interdigital skin, hyperkeratosis, thickening of the nail with lysis of the lamina and alopecia due to parasitic hair.
Preferibilmente, il paziente presenta una infezione da uno o più ceppi appartenenti a uno o più generi scelti tra Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton spp., più preferibilmente Microsporum spp. o Trichophyton spp.. Preferably, the patient has an infection with one or more strains belonging to one or more genera selected from Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton spp., More preferably Microsporum spp. or Trichophyton spp ..
Preferibilmente, il paziente presenta una infezione da uno o più ceppi appartenenti a una o più specie scelte tra Microsporum canis, Tricophyton rubrum, Tricophyton mentagrophytes e Tricophyton interdigitale. Preferably, the patient has an infection with one or more strains belonging to one or more species selected from Microsporum canis, Tricophyton rubrum, Tricophyton mentagrophytes and Tricophyton interdigitale.
Preferibilmente, nella prevenzione la composizione dell’invenzione è applicata sulla cute e/o annessi di un paziente asintomatico. Preferably, in prevention, the composition of the invention is applied to the skin and / or appendages of an asymptomatic patient.
Preferibilmente, nella prevenzione la composizione dell’invenzione è applicata sulla cute e/o annessi di un paziente che è suscettibile a una infezione micotica cutanea e/o di annessi, più preferibilmente a un paziente a cui è stata curata una infezione micotica cutanea e/o di annessi e/o che si trova in fase di ristabilimento della flora saprofita. Preferably, in prevention, the composition of the invention is applied to the skin and / or adnexa of a patient who is susceptible to a skin and / or adnexal fungal infection, more preferably to a patient who has been treated for a skin and / or fungal infection. or annexes and / or which is in the process of re-establishing the saprophytic flora.
Vantaggiosamente, la prevenzione conferisce una protezione nei confronti di una recidiva o di una nuova infezione. Advantageously, prevention confers protection against a relapse or a new infection.
Preferibilmente, il trattamento ha una durata fino a 60 giorni, più preferibilmente 45 giorni, il più preferibilmente 28 giorni. Preferably, the treatment has a duration of up to 60 days, more preferably 45 days, most preferably 28 days.
Preferibilmente, la prevenzione ha una durata fino a 30 giorni, più preferibilmente 20 giorni, il più preferibilmente 15 giorni. Preferably, the prevention lasts up to 30 days, more preferably 20 days, most preferably 15 days.
La presente invenzione è inoltre riferita a un metodo per la prevenzione e/o il trattamento di infezioni micotiche cutanee e/o di annessi che comprende l’applicazione topica del ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) vitale sulla cute e/o annessi a un paziente che ne necessita. The present invention also relates to a method for the prevention and / or treatment of cutaneous and / or adnexal fungal infections which includes the topical application of the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516) viable on the skin and / or adnexa a patient who needs it.
La Richiedente ha infatti sorprendentemente trovato che il trattamento con la composizione dell’invenzione porta a completa o parziale guarigione da infezioni micotiche cutanee e/o di annessi, in particolare da infezioni di tigna pedis (T. rubrum, T. mentagrophytes), tigna cruris (T. rubrum), tigna manum (T. rubrum), tigna faciei (M. canis) e tigna corporis (M. canis). Ciò è stato dimostrato tramite test clinici riportati nel seguito. The Applicant has in fact surprisingly found that the treatment with the composition of the invention leads to complete or partial healing from fungal infections of the skin and / or of the appendages, in particular from infections of tinea pedis (T. rubrum, T. mentagrophytes), tigna cruris (T. rubrum), tigna manum (T. rubrum), tigna faciei (M. canis) and tigna corporis (M. canis). This has been demonstrated in clinical tests below.
Senza per questo voler essere vincolati a qualsivoglia teoria, la Richiedente ipotizza che le proprietà antifungine del ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) siano da attribuirsi alla produzione di acidi organici da parte del microorganismo (quali ad esempio acido fenil-lattico, acido idrossi-butirrico, acido citrico e acido acetico). Without wishing to be bound by any theory, the Applicant hypothesizes that the antifungal properties of the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516) are due to the production of organic acids by the microorganism (such as for example phenyl-lactic acid, hydroxy acid -butyric acid, citric acid and acetic acid).
La composizione dell’invenzione può inoltre comprendere acido ialuronico e/o un suo sale, in particolare sodio ialuronato, che ha una elevata proprietà idratante, grazie alla sua elevata idrofilia. La sua presenza nella composizione permette di conferire idratazione e tonicità alla pelle. Inoltre, la sua struttura a maglie strette forma una barriera sulla pelle al passaggio di molti virus e batteri, attivando e coadiuvando così i processi riparativi. The composition of the invention may also include hyaluronic acid and / or a salt thereof, in particular sodium hyaluronate, which has a high moisturizing property, thanks to its high hydrophilicity. Its presence in the composition allows to give hydration and tone to the skin. Furthermore, its tight mesh structure forms a barrier on the skin to the passage of many viruses and bacteria, thus activating and assisting the reparative processes.
La presenza dell’acido ialuronico e/o suoi sali è quindi funzionale sia nel caso in cui la composizione dell’invenzione sia usata per prevenzione che per il trattamento delle infezioni. The presence of hyaluronic acid and / or its salts is therefore functional both in the event that the composition of the invention is used for the prevention and treatment of infections.
I batteri del genere Lattobacillus sono possessori dello status di “Qualified presumption of safety” (QPS), cioè con dimostrata sicurezza d’impiego nell’uomo in base a quanto indicato dall’Autorità Europea per la sicurezza alimentare (EFSA Journal 14:4522, 2016 Appendix: The 2013 updated list of QPS Status recommended biological agents in support of EFSA risk assessments – 4th revision). Bacteria of the genus Lattobacillus are holders of the status of "Qualified presumption of safety" (QPS), that is, with demonstrated safety of use in humans according to what is indicated by the European Food Safety Authority (EFSA Journal 14: 4522, 2016 Appendix: The 2013 updated list of QPS Status recommended biological agents in support of EFSA risk assessments - 4th revision).
L’applicazione del ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516), della presente invenzione, e quindi della composizione della presente invenzione, è quindi sicura e non dà luogo a effetti collaterali. The application of the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516), of the present invention, and therefore of the composition of the present invention, is therefore safe and does not give rise to side effects.
Rispetto alle terapie farmacologiche attualmente disponibili e raccomandate, quindi, la composizione della presente invenzione ha il vantaggio di essere sia efficace che sostanzialmente priva di effetti collaterali. Nel caso in cui la composizione comprenda acido ialuronico (o suoi sali), essa ha inoltre il vantaggio di conferire particolare idratazione e tonicità alla pelle. Compared to currently available and recommended pharmacological therapies, therefore, the composition of the present invention has the advantage of being both effective and substantially free of side effects. If the composition includes hyaluronic acid (or its salts), it also has the advantage of giving particular hydration and tone to the skin.
Queste caratteristiche portano a una maggiore gradevolezza nell’uso della composizione e quindi a una migliorata “compliance” del paziente alla terapia. These characteristics lead to greater pleasantness in the use of the composition and therefore to an improved "compliance" of the patient with the therapy.
Inoltre, poiché il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) è di origine naturale, essendo stato isolato da formaggio sardo ovino, e poiché non è stato geneticamente modificato, la composizione dell’invenzione è idonea in particolare per quei pazienti che preferiscono soluzioni il più possibile naturali. Furthermore, since the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis (DSM 32516) is of natural origin, having been isolated from Sardinian sheep cheese, and since it has not been genetically modified, the composition of the invention is particularly suitable for those patients who prefer solutions the as natural as possible.
Breve descrizione delle figure Brief description of the figures
La Figura 1 rappresenta il confronto della sequenza nucleotidica della porzione del gene 16S RNA rilevata nel ceppo di Lactobacillus brevis (Lb. brevis) DSM 32516 e di quella rilevata nel ceppo di Lb. brevis ATCC 367. Figure 1 represents the comparison of the nucleotide sequence of the portion of the 16S RNA gene detected in the Lactobacillus brevis (Lb. brevis) DSM 32516 strain and that detected in the Lb strain. brevis ATCC 367.
Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention
Il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) è stato isolato da formaggio sardo ovino. Non è stato geneticamente modificato. Lactobacillus brevis strain 1C3Ma (DSM 32516) was isolated from Sardinian sheep cheese. It has not been genetically modified.
In Tabella 1 sono riportate le caratteristiche fisiologiche e biochimiche del microorganismo. Table 1 shows the physiological and biochemical characteristics of the microorganism.
Tabella 1. Caratteristiche fisiologiche e biochimiche del ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis (DSM 32516) Table 1. Physiological and biochemical characteristics of Lactobacillus brevis strain 1C3Ma (DSM 32516)
*testato in brodo Falcow decarbossilasi (Microbiol. Cagliari, Italia; Composizione: Peptone 5 g/l; Estratto di lievito 3 g/l; Glucosio 1 g/l; Arginina 10 g/l) con o senza arginina incubato a 30 °C per 2 giorni. * tested in Falcow decarboxylase broth (Microbiol. Cagliari, Italy; Composition: Peptone 5 g / l; Yeast extract 3 g / l; Glucose 1 g / l; Arginine 10 g / l) with or without arginine incubated at 30 ° C for 2 days.
** determinato mediante API® 50 CH con CHL Medium (BioMérieux) ** determined by API® 50 CH with CHL Medium (BioMérieux)
L’invenzione verrà ora descritta ulteriormente con riferimento a degli esempi di realizzazione forniti a scopo illustrativo e non limitativo. The invention will now be described further with reference to examples of embodiments provided for illustrative and non-limiting purposes.
ESEMPIO 1 EXAMPLE 1
Selezione del microorganismo e deposito del ceppo presso DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) Selection of the microorganism and storage of the strain at DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
E’ stata determinata l’attività antifungina di 120 ceppi di batteri lattici (LAB) appartenenti al genere Lactobacillus isolati da latte crudo e formaggi artigianali ovini e caprini, appartenenti alla collezione del laboratorio di Igiene del Dipartimento di Scienze Mediche e Sanità Pubblica (DSMSP) dell’Università di Cagliari utilizzando come ceppi indicatori le specie fungine Microsporum spp., Trichophyton spp., Aspergillus spp., Candida spp. e Fusarium spp. (in quanto isolate con maggiore frequenza dai soggetti affetti da micosi cutanea). The antifungal activity of 120 strains of lactic acid bacteria (LAB) belonging to the genus Lactobacillus isolated from raw milk and artisanal sheep and goat cheeses, belonging to the collection of the Hygiene laboratory of the Department of Medical Sciences and Public Health (DSMSP) was determined. of the University of Cagliari using the fungal species Microsporum spp., Trichophyton spp., Aspergillus spp., Candida spp. and Fusarium spp. (as they are more frequently isolated from subjects affected by cutaneous mycosis).
Per questa determinazione sono stati usati i metodi di Guo et al. (2012) (Guo et al. (2012) Antifungal activity of Lactobacillus against Microsporum canis, Microsporum gypseum and Epidermophyton floccosum, Bioengioneered Bugs 3:2, 104-113) e di Strus et al. For this determination the methods of Guo et al. Were used. (2012) (Guo et al. (2012) Antifungal activity of Lactobacillus against Microsporum canis, Microsporum gypseum and Epidermophyton floccosum, Bioengioneered Bugs 3: 2, 104-113) and by Strus et al.
(Strus et al. (2005) The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida. Infect. Dis. Obstet. Gynecol., 13(2), 69-75) rispettivamente per muffe e lieviti, come meglio descritto nel seguito. (Strus et al. (2005) The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida. Infect. Dis. Obstet. Gynecol., 13 (2), 69-75) respectively for molds and yeasts, as better described below .
Come controllo positivo per il saggio in vitro di attività antifungina è stata utilizzata una preparazione a base di Tioconazolo (Trosyd, 1% tioconazolo crema, Giuliani), una delle terapie topiche correntemente in uso clinico per il trattamento delle dermatomicosi. E’ stato osservato che la presenza di inibizione nei confronti delle specie fungine saggiate è risultata variabile anche tra ceppi appartenenti alla stessa specie. A preparation based on Tioconazole (Trosyd, 1% tioconazole cream, Giuliani), one of the topical therapies currently in clinical use for the treatment of dermatomycoses, was used as a positive control for the in vitro antifungal activity assay. It was observed that the presence of inhibition against the tested fungal species was also variable between strains belonging to the same species.
In particolare, per il saggio della attività antagonista dei lattobacilli contro le muffe è stata allestita una sospensione fungina contenente sia spore che micelio in Soluzione Fisiologica (SF) addizionata dello 0,5% tween 80. Una aliquota di 100 µl della sospensione fungina è stata spatolata uniformemente su terreno MRS agar (distribuito da Microbiol (Cagliari) modificato secondo Guo et al. 2012) e le piastre sono state lasciate asciugare per 30 minuti sotto cappa a flusso laminare. Successivamente sulle piastre così asciugate è stato seminato il ceppo lattico effettuando due strisci paralleli. Le piastre sono state lasciate ulteriormente asciugare per 30 minuti sotto cappa a flusso laminare e sono poi state incubate a 37°C in microaerofilia (condizioni ottimali di crescita per il LAB) per 48h, quindi a 30°C per 48h, ed infine a 25°C per 7 giorni. La misurazione dell’inibizione è stata valutata misurando la distanza tra il lato dello striscio batterico e l’inizio della zona di crescita del micete, con la seguente interpretazione: -, zona di inibizione < 3 mm; , zona di inibizione ≥ 3 mm; +, zona di inibizione ≥ 5 mm; ++, zona di inibizione ≥ 8 mm (si veda la Tabella 2). In particular, for the assay of the antagonist activity of lactobacilli against molds, a fungal suspension containing both spores and mycelium in Physiological Solution (SF) added with 0.5% tween 80 was prepared. A 100 µl aliquot of the fungal suspension was spread evenly on MRS agar medium (distributed by Microbiol (Cagliari) modified according to Guo et al. 2012) and the plates were allowed to dry for 30 minutes under a laminar flow hood. Subsequently, the lactic strain was sown on the plates thus dried, making two parallel smears. The plates were left to dry further for 30 minutes under a laminar flow hood and then incubated at 37 ° C in microaerophilic (optimal growth conditions for the LAB) for 48h, then at 30 ° C for 48h, and finally at 25 ° C for 7 days. The measurement of inhibition was evaluated by measuring the distance between the side of the bacterial smear and the beginning of the fungal growth zone, with the following interpretation: -, zone of inhibition <3 mm; , zone of inhibition ≥ 3 mm; +, zone of inhibition ≥ 5 mm; ++, zone of inhibition ≥ 8 mm (see Table 2).
Per il saggio dell’attività antagonista dei lattobacilli contro i lieviti del genere Candida, i ceppi di lattobacilli cresciuti in MRS brodo per 16 h, sono stati seminati in quantità di 10 µl sulla superficie di piastre di MRS agar effettuando uno striscio largo 2 cm. Dopo incubazione a 37°C per 24 h in anaerobiosi, sulle piastre sono stati versati 7 ml di SAB soft agar. Dopo solidificazione, sulla superficie del terreno è stato seminato il ceppo di Candida ad una densità pari a 1x10<5 >CFU/ml. Le piastre sono state pre-incubate in frigorifero a 4°C per 4 h, e in seguito incubate a 37°C in aerobiosi per 24 h. Prima di misurare la zona di inibizione le piastre sono state lasciate a temperatura ambiente per circa 24 h. La misurazione dell’inibizione della crescita di Candida è stata valutata nel seguente modo: -, assenza di inibizione sopra la coltura; /-, minima inibizione sopra la coltura; , parziale inibizione sopra la coltura; +, totale inibizione sopra la coltura; ++, totale inibizione sopra e intorno alla coltura (si veda la Tabella 3). For the assay of the antagonist activity of lactobacilli against yeasts of the genus Candida, the strains of lactobacilli grown in MRS broth for 16 h, were sown in quantities of 10 µl on the surface of MRS agar plates by making a 2 cm wide smear. After incubation at 37 ° C for 24 h in anaerobiosis, 7 ml of SAB soft agar was poured onto the plates. After solidification, the Candida strain was sown on the surface of the medium at a density of 1x10 <5> CFU / ml. The plates were pre-incubated in a refrigerator at 4 ° C for 4 h, and then incubated at 37 ° C in an aerobic atmosphere for 24 h. Before measuring the zone of inhibition, the plates were left at room temperature for approximately 24 h. The measurement of Candida growth inhibition was assessed as follows: - absence of inhibition above the culture; / -, minimal inhibition over the crop; partial inhibition over the crop; +, total inhibition over the crop; ++, total inhibition on and around the crop (see Table 3).
Per valutare la natura delle sostanze antimicrobiche prodotte dai ceppi di lattobacilli selezionati, il supernatante è stato analizzato mediante la tecnica dell’agar well diffusion (Schillinger & Lucke, (1989) Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat” Applied and Environmental Microbiology, 55:1901–1906). I ceppi di lattobacilli sono stati coltivati in 50 ml di MRS brodo e incubati per 48 h a 37°C in agitazione. Dopo centrifugazione delle colture a 5000 rpm per 20 min., i supernatanti così ottenuti, sono stati neutralizzati a pH 6,5 usando NaOH 5M e filtrati per eliminare le cellule residue mediante filtri di acetato di cellulosa con pori di 0,45 µl di diametro. Quindi, 20 ml di Sabouraud agar sono stati inoculati con i ceppi fungini indicatori (muffe e lieviti separatamente) e versati in piastre Petri. Dopo solidificazione, nel terreno agarizzato sono stati ricavati 3 pozzetti di diametro di 6 mm i quali sono stati riempiti con 100 µl dei supernatanti. Le piastre sono state refrigerate a 4°C per 4 h per permettere la diffusione dei composti antimicrobici presenti nei supernatanti e sono poi state incubate a 30°C per 3-4 giorni. L'attività antimicrobica residua è stata valutata in base alla misura della zona di inibizione in mm (si vedano le Tabelle 4 e 5). To evaluate the nature of the antimicrobial substances produced by the selected lactobacilli strains, the supernatant was analyzed using the well diffusion agar technique (Schillinger & Lucke, (1989) Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat "Applied and Environmental Microbiology, 55 : 1901–1906). Lactobacilli strains were cultured in 50 ml of MRS broth and incubated for 48 h at 37 ° C under agitation. After centrifugation of the cultures at 5000 rpm for 20 min., The supernatants thus obtained were neutralized to pH 6.5 using 5M NaOH and filtered to eliminate the residual cells by cellulose acetate filters with pores of 0.45 µl diameter. . Then, 20 ml of Sabouraud agar was inoculated with the indicator fungal strains (molds and yeasts separately) and poured into Petri dishes. After solidification, 3 wells with a diameter of 6 mm were obtained in the agar medium and filled with 100 µl of the supernatants. The plates were refrigerated at 4 ° C for 4 h to allow diffusion of the antimicrobial compounds present in the supernatants and were then incubated at 30 ° C for 3-4 days. The residual antimicrobial activity was evaluated based on the measurement of the zone of inhibition in mm (see Tables 4 and 5).
I risultati ottenuti con tale tecnica hanno inoltre permesso di dedurre che, vista l’incapacità del supernatante neutralizzato a pH 6,5 di inibire la crescita delle diverse specie fungine saggiate, l’attività antimicotica non sia presumibilmente legata alla produzione di batteriocine ma piuttosto alla produzione di acidi organici o perossido di idrogeno. The results obtained with this technique also allowed us to deduce that, given the inability of the supernatant neutralized at pH 6.5 to inhibit the growth of the various fungal species tested, the antifungal activity is presumably not linked to the production of bacteriocins but rather to the production of organic acids or hydrogen peroxide.
In seguito a questo primo screening sono stati selezionati 15 ceppi appartenenti alle specie Lactobacillus brevis (2 ceppi), Lactobacillus rhamnosus (2 ceppi), Lactobacillus plantarum (8 ceppi), Lactobacillus paracasei (1 ceppo), Lactobacillus casei (1 ceppo) e Lactobacillus sakei (1 ceppo) dotati di buone capacità antagoniste nei confronti dei ceppi fungini saggiati, in particolare Microsporum spp. e Trichophyton spp. Following this first screening, 15 strains belonging to the Lactobacillus brevis (2 strains), Lactobacillus rhamnosus (2 strains), Lactobacillus plantarum (8 strains), Lactobacillus paracasei (1 strain), Lactobacillus casei (1 strain) and Lactobacillus species were selected. sakei (1 strain) with good antagonistic abilities against the tested fungal strains, in particular Microsporum spp. and Trichophyton spp.
Da questi 15 ceppi è stato selezionato il ceppo finale, ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis, in base alle principali caratteristiche della superficie cellulare: la capacità autoaggregante, la capacità di coaggregazione con Candida albicans e il grado di idrofobicità, misurate secondo i metodi descritti qui di seguito. I risultati di queste ultime misurazioni sono riassunte alle Tabelle 6-8. From these 15 strains, the final strain, 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis, was selected based on the main characteristics of the cell surface: the self-aggregating ability, the ability to co-aggregate with Candida albicans and the degree of hydrophobicity, measured according to the methods described here. following. The results of these latter measurements are summarized in Tables 6-8.
Tabella 6. Saggio della capacità autoaggregante. Le reazioni sono state considerate positive quando si è osservato un precipitato sabbioso chiaramente visibile sul fondo della provetta, sovrastato da un supernatante limpido, entro 2 h dall’incubazione (ref. Reniero et al. (1992) High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor, J. Gen. Microbiol., 138:763-768). Table 6. Assay of self-aggregating capacity. The reactions were considered positive when a clearly visible sandy precipitate was observed at the bottom of the tube, topped by a clear supernatant, within 2 h of incubation (ref. Reniero et al. (1992) High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor, J. Gen. Microbiol., 138: 763-768).
Tabella 7. Saggio della capacità coaggregante. La reazione è stata valutata positiva quando si è osservato un precipitato sabbioso chiaramente visibile sul fondo della provetta, sovrastato da un supernatante limpido, entro 2h dall’incubazione (ref. Kmet et al. (1995) Aggregation-promoting factor in pig intestinal Lactobacillus strains, Lett. Appl. Microbiol., 21:351-353). Table 7. Assay of the coaggregating capacity. The reaction was evaluated as positive when a clearly visible sandy precipitate was observed at the bottom of the tube, overlaid by a clear supernatant, within 2h of incubation (ref. Kmet et al. (1995) Aggregation-promoting factor in pig intestinal Lactobacillus strains , Lett. Appl. Microbiol., 21: 351-353).
Tabella 8. Saggio dell’idrofobicità di superficie. La percentuale di idrofobicità è stata valutata come la percentuale di riduzione della densità ottica della fase acquosa, applicando la seguente formula: %H= [(ODiniziale- ODfinale) /ODiniziale]*100. La determinazione è stata effettuata in doppio per ogni ceppo, i dati sono riportati come valore medio±deviazione standard delle misurazioni (ref. Kos et al. (2003) Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92, J. Appl. Microbiol., 94:981-987). Table 8. Surface hydrophobicity test. The percentage of hydrophobicity was evaluated as the percentage of reduction of the optical density of the aqueous phase, applying the following formula:% H = [(Initial OD- Final OD) / Initial OD] * 100. The determination was carried out in duplicate for each strain, the data are reported as mean value ± standard deviation of the measurements (ref. Kos et al. (2003) Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92, J. Appl. Microbiol. , 94: 981-987).
Per il saggio di auto aggregazione (metodo descritto da Reniero et al. (1992) (Reniero et al. (1992) High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor, J. Gen. Microbiol., 138:763-768), le cellule batteriche sono state coltivate in brodo MRS per 18h a 37°C, centrifugate a 3000xg per 15 minuti, lavate tre volte con PBS e risospese in un egual volume di PBS. La sospensione batterica è stata incubata a temperatura ambiente in presenza dell’1% (v/v) del supernatante sterilizzato per filtrazione della coltura fresca dello stesso ceppo. Le reazioni sono state considerate positive quando si è osservato un precipitato sabbioso chiaramente visibile sul fondo della provetta, sovrastato da un supernatante limpido, entro 2 h dall’incubazione. Per ognuno dei ceppi la determinazione è stata fatta in doppio. For the self-aggregation assay (method described by Reniero et al. (1992) (Reniero et al. (1992) High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor, J. Gen. Microbiol., 138: 763- 768), the bacterial cells were cultured in MRS broth for 18h at 37 ° C, centrifuged at 3000xg for 15 minutes, washed three times with PBS and resuspended in an equal volume of PBS. The bacterial suspension was incubated at room temperature in presence of 1% (v / v) of the supernatant sterilized by filtration of the fresh culture of the same strain. Reactions were considered positive when a clearly visible sandy precipitate was observed at the bottom of the tube, topped by a clear supernatant, within 2 h from incubation For each of the strains the determination was made in duplicate.
Per il saggio di coaggregazione dei lattobacilli nei confronti di ceppi fungini patogeni è stata utilizzata la Candida albicans (metodo descritto da Kmet et al. (1995) Aggregation-promoting factor in pig intestinal Lactobacillus strains, Lett. Appl. Microbiol., 21:351-353). I lattobacilli sono stati coltivati “overnight” in MRS brodo a 37°C, una aliquota (4×10<8 >CFU in 250 µl) è stata centrifugata, lavata, ed è stata unita ad un’uguale concentrazione di Candida albicans (cresciuta overnight in brodo Sabouraud), e sono stati poi aggiunti 500 µl di PBS. La coaggregazione è stata valutata positiva quando si è osservato un precipitato sabbioso chiaramente visibile sul fondo della provetta, sovrastato da un supernatante limpido, entro 2h dall’incubazione. Il saggio è stato effettuato su ogni ceppo di lattobacillo utilizzando due ceppi diversi di Candida albicans, ceppo 772 e ceppo M72954. Come controlli sono state utilizzate sospensioni di Lactobacillus e di Candida albicans da soli. For the coaggregation assay of lactobacilli against pathogenic fungal strains Candida albicans was used (method described by Kmet et al. (1995) Aggregation-promoting factor in pig intestinal Lactobacillus strains, Lett. Appl. Microbiol., 21: 351 -353). Lactobacilli were grown "overnight" in MRS broth at 37 ° C, an aliquot (4 × 10 <8> CFU in 250 µl) was centrifuged, washed, and added to an equal concentration of Candida albicans (grown overnight in Sabouraud broth), and 500 µl of PBS was then added. Coaggregation was evaluated as positive when a clearly visible sandy precipitate was observed at the bottom of the tube, dominated by a clear supernatant, within 2 hours of incubation. The assay was performed on each lactobacillus strain using two different strains of Candida albicans, strain 772 and strain M72954. Suspensions of Lactobacillus and Candida albicans alone were used as controls.
Il livello di idrofobicità è stato valutato secondo il metodo descritto da Kos et al. (2003) (Kos et al. (2003) Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92, J. Appl. Microbiol., 94:981-987) misurando l’affinità delle cellule batteriche ad una fase idrofobica, in un sistema a due fasi (acqua:esadecano). In breve, i ceppi di lattobacilli sono stati fatti crescere per 24 ore a 37°C in MRS brodo. Il brodo è stato centrifugato a 6000 giri per 15 minuti. Dopo due lavaggi con PBS, è stato prelevato 1 ml della sospensione batterica per la lettura dell’OD a 600 nm. Successivamente, 1,5 ml della sospensione è stata addizionata ad un volume uguale di esadecano e vortexato per 2 minuti. La miscela è stata incubata per 1 h a temperatura ambiente per permettere la separazione delle fasi; è stato poi prelevato 1 ml della fase acquosa per la lettura dell’OD a 600 nm. La percentuale di idrofobicità è stata valutata come la percentuale di riduzione della densità ottica della fase acquosa, applicando la seguente formula: %H = [(ODiniziale-ODfinale)/ODiniziale]*100. La determinazione è stata effettuata in doppio per ogni ceppo. The level of hydrophobicity was assessed according to the method described by Kos et al. (2003) (Kos et al. (2003) Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92, J. Appl. Microbiol., 94: 981-987) by measuring the affinity of bacterial cells to a hydrophobic phase, in a system two-phase (water: hexadecane). Briefly, the lactobacilli strains were grown for 24 hours at 37 ° C in MRS broth. The broth was centrifuged at 6000 rpm for 15 minutes. After two washes with PBS, 1 ml of the bacterial suspension was taken for the OD reading at 600 nm. Subsequently, 1.5 ml of the suspension was added to an equal volume of hexadecane and vortexed for 2 minutes. The mixture was incubated for 1 h at room temperature to allow the separation of the phases; 1 ml of the aqueous phase was then taken to read the OD at 600 nm. The percentage of hydrophobicity was evaluated as the percentage of reduction of the optical density of the aqueous phase, applying the following formula:% H = [(Initial OD-Final OD) / Initial OD] * 100. The determination was carried out in duplicate for each strain.
In base a questi ultimi risultati, è stato selezionato il ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis come migliore candidato per le prove in vivo. Based on these latest results, Lactobacillus brevis strain 1C3Ma was selected as the best candidate for in vivo tests.
Il ceppo è stato sottoposto ad amplificazione del gene 16S rRNA (regione V3) mediante PCR (Polymerase Chain Reaction – reazione a catena della polimerasi) utilizzando i primer universali F357 (5’-TAC GGG AGG CAG CAG–3’) e R 518 (5’–ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’) che amplificano una regione di 193 bp di V3. The strain was subjected to amplification of the 16S rRNA gene (region V3) by PCR (Polymerase Chain Reaction) using universal primers F357 (5'-TAC GGG AGG CAG CAG-3 ') and R 518 ( 5'– ATT ACC GCG GCT GCT GG-3 ') which amplify a region of 193 bp of V3.
I prodotti della PCR sono stati purificati usando GenElute™PCR Clean-Up Kit (Sigma Aldrich) e successivamente sequenziati presso un servizio esterno di sequenziamento (BMR Genomics, Padova, Italia). La sequenza ottenuta è stata analizzata utilizzando il software Chromas 2.6.4. e sottoposto al programma BLAST per valutare l’omologia con le sequenze disponibili nella banca dati GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La sequenza ha mostrato una identità al 100% rispetto a Lactobacillus brevis ATCC 367 (si veda la Figura 1). The PCR products were purified using GenElute ™ PCR Clean-Up Kit (Sigma Aldrich) and subsequently sequenced at an external sequencing service (BMR Genomics, Padua, Italy). The obtained sequence was analyzed using the Chromas 2.6.4 software. and submitted to the BLAST program to evaluate the homology with the sequences available in the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). The sequence showed 100% identity to Lactobacillus brevis ATCC 367 (see Figure 1).
I campioni di coltura del ceppo 1C3Ma di Lactobacillus brevis sono stati depositati presso DSMZ e i campioni trasmessi da DSMZ per la verifica di controllo dell’identità sono stati nuovamente sequenziati confermando così la sua identità. The culture samples of the 1C3Ma strain of Lactobacillus brevis were deposited at DSMZ and the samples sent by DSMZ for identity verification were re-sequenced thus confirming its identity.
ESEMPIO 2 EXAMPLE 2
Realizzazione della composizione Realization of the composition
Una volta selezionato il microorganismo, è stata effettuata una prova di sopravvivenza del ceppo in diverse matrici (MRS-G (De Man Rogosa & Sharpe a ridotto contenuto di glucosio, 0,2%, distribuito da Microbiol (Cagliari)), PBS (Phosphate Buffered Saline) e PBS addizionato del 20% glucosio). I risultati hanno evidenziato una maggiore sopravvivenza del ceppo selezionato a 3 mesi della sospensione preparata in MRS-G e conservata a 4 °C. Once the microorganism was selected, a survival test of the strain was carried out in different matrices (MRS-G (De Man Rogosa & Sharpe with reduced glucose content, 0.2%, distributed by Microbiol (Cagliari)), PBS (Phosphate Buffered Saline) and PBS added with 20% glucose). The results showed a greater survival of the selected strain at 3 months of the suspension prepared in MRS-G and stored at 4 ° C.
Sono state fatte poi le prove per determinare la formulazione della composizione, suddivise in quattro fasi. Per l’allestimento del preparato per uso topico è stato scelto l’uso del ceppo in forma vitale in mezzo di coltura liquido MRS-G. Tests were then made to determine the formulation of the composition, divided into four phases. For the preparation of the preparation for topical use, the use of the strain in viable form in liquid culture medium MRS-G was chosen.
Fase 1) Sono state fatte opportune prove in vitro di attività antifungina nei confronti di Microsporum canis 10D e Trichophyton rubrum 11D per selezionare i polimeri più efficaci confrontando tra loro N-(2-idrossipropil)metacrilammide (HPMA), gomma xantano e acido ialuronico basso PM (peso molecolare) (400 kDa). Le preparazioni presentavano la seguente composizione: base acquosa (con mezzo di coltura) 100 ml; polimero 2 ml; ceppo 1C3Ma di Lb. brevis (1,0 x 10<9 >CFU/ml). E’ stata sperimentata anche l’aggiunta nei tre suddetti preparati di vescicole liposomiche (LS). Phase 1) Appropriate in vitro tests of antifungal activity against Microsporum canis 10D and Trichophyton rubrum 11D were made to select the most effective polymers by comparing N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA), xanthan gum and low hyaluronic acid with each other PM (molecular weight) (400 kDa). The preparations had the following composition: aqueous base (with culture medium) 100 ml; polymer 2 ml; 1C3Ma strain of Lb. brevis (1.0 x 10 <9> CFU / ml). The addition of liposomal vesicles (LS) in the three aforementioned preparations was also tested.
Per questa fase, come per le altre che seguono per la messa a punto della composizione, sono stati effettuati test volti a verificare l’attività antifungina delle preparazioni a base di lattobacilli vivi utilizzando il metodo dell’agar well diffusion (secondo il metodo Schillinger & Lucke, 1989 descritto sopra) e parallelamente sono stati effettuati saggi di sopravvivenza del ceppo di Lactobacillus nel veicolo (metodo della conta in piastra con semina per spatolamento in superficie) e l’analisi microbiologica per valutare la purezza (in termini di contaminanti) della preparazione (metodo della conta in piastra con semina per spatolamento in superficie). For this phase, as for the others that follow for the development of the composition, tests were carried out to verify the antifungal activity of the preparations based on live lactobacilli using the well diffusion agar method (according to the Schillinger & Lucke, 1989 described above) and in parallel survival assays were carried out for the Lactobacillus strain in the vehicle (plate count method with sowing by surface spatulation) and microbiological analysis to evaluate the purity (in terms of contaminants) of the preparation. (plate count method with sowing by surface trowelling).
Saggio di sopravvivenza del ceppo LAB nella preparazione: metodo della conta in piastra con semina per spatolamento in superficie. Survival assay of the LAB strain in the preparation: plate count method with sowing by surface spatulation.
Sono state allestite delle diluizioni seriali in base 10 della preparazione da saggiare su un volume finale di 1 ml. Per ogni campione sono stati seminati 100 µl di tre differenti diluizioni mediante tecnica per spatolamento su MRS (De Man Rogosa & Sharpe) agar, che sono state poi incubate a 37°C per 48h. La conta è stata riportata in CFU/ml. Serial dilutions based on 10 of the preparation to be tested were prepared on a final volume of 1 ml. For each sample 100 µl of three different dilutions were sown by spatulation technique on MRS (De Man Rogosa & Sharpe) agar, which were then incubated at 37 ° C for 48h. The count was reported in CFU / mL.
Analisi microbiologica della preparazione (rilevazione contaminanti): metodo della conta in piastra con semina per spatolamento in superficie. Microbiological analysis of the preparation (contaminant detection): plate count method with sowing by surface spatulation.
Per ogni campione sono stati seminati 10 µl della preparazione per spatolamento su AT agar (Tryptose Agar), che sono state poi incubate a 30°C per 48h. La conta è stata riportata in CFU/ml. For each sample, 10 µl of the preparation by spatulation were sown on AT agar (Tryptose Agar), which were then incubated at 30 ° C for 48h. The count was reported in CFU / mL.
Saggio di attività antifungina della preparazione dermocosmetica a base di LAB vivi: metodo dell’agar well diffusion. Antifungal activity assay of the dermocosmetic preparation based on live LAB: agar well diffusion method.
È stata allestita una sospensione fungina a base contenente sia spore che micelio in Soluzione Fisiologica addizionata dello 0,5% tween 80. A fungal based suspension containing both spores and mycelium was prepared in a physiological solution added with 0.5% tween 80.
18 ml di Potato Dextrose Agar (nel caso delle muffe dermatofite) oppure di Sabouraud Agar (nel caso della Candida albicans) sono stati inoculati con la suddetta sospensione e versati in piastre Petri. Dopo solidificazione, nel terreno agarizzato è stato ricavato un pozzetto di diametro di 6 mm il quale è stato riempito con circa 200 µl della composizione. 18 ml of Potato Dextrose Agar (in the case of dermatophyte molds) or of Sabouraud Agar (in the case of Candida albicans) were inoculated with the above suspension and poured into Petri dishes. After solidification, a 6 mm diameter well was obtained in the agar medium which was filled with about 200 µl of the composition.
Le piastre sono state lasciate ulteriormente asciugare per 30 minuti sotto cappa a flusso laminare per permettere la diffusione del composto nell’agar, e sono poi state incubate a 37°C per 48h, e successivamente a 25°C per 7 giorni. La lettura degli aloni di inibizione è stata fatta dopo 7 giorni. La dimensione degli aloni è stata comunque monitorata fino a 15 giorni, per verificarne eventuali variazioni. The plates were left to dry further for 30 minutes under a laminar flow hood to allow the spread of the compound in the agar, and were then incubated at 37 ° C for 48h, and subsequently at 25 ° C for 7 days. The inhibition zones were read after 7 days. The size of the halos was however monitored for up to 15 days, to check for any changes.
Come controllo positivo per il saggio di attività antifungina è stata utilizzata una preparazione a base di Tioconazolo (Trosyd, 1% tioconazolo crema, Giuliani), una delle terapie topiche correntemente in uso clinico per il trattamento delle dermatomicosi. A preparation based on Tioconazole (Trosyd, 1% tioconazole cream, Giuliani), one of the topical therapies currently in clinical use for the treatment of dermatomycoses, was used as a positive control for the antifungal activity assay.
A seguito di questa prova, è stato trovato che il formulato migliore era quello comprendente acido ialuronico. Following this test, it was found that the best formulation was the one comprising hyaluronic acid.
I prodotti, fino a 15 giorni di conservazione, hanno mostrato un’elevata attività antifungina nei confronti dei ceppi dermatofiti 10D Microsporum spp. e 11D Trichophyton spp. The products, up to 15 days of storage, showed a high antifungal activity against dermatophyte strains 10D Microsporum spp. and 11D Trichophyton spp.
Per quanto riguarda i preparati contenenti le vescicole liposomiche, non è stata osservata una sostanziale differenza nella resa della attività antagonista rispetto ai corrispondenti preparati privi dei liposomi. Si presume che tale risultato sia dovuto al fatto che il microorganismo vivo non sia in grado, per le sue dimensioni, di essere assorbito all’interno delle vescicole. Regarding the preparations containing the liposomal vesicles, no substantial difference was observed in the yield of the antagonist activity compared to the corresponding liposome-free preparations. It is assumed that this result is due to the fact that the live microorganism is unable, due to its size, to be absorbed within the vesicles.
Fase 2) Per quanto riguarda la composizione, e utilizzando acido ialuronico come polimero, sono stati confrontati con opportune prove antifungine in vitro (nei confronti di Microsporum canis 10D, Trichophyton rubrum 11D e Candida albicans 1-E) i terreni di coltura MRS-G (brodo De Man Rogosa & Sharpe con lo 0,2 % di glucosio), PBS (phosphate buffered saline) e PBS+glu (PBS addizionato di 20% di glucosio). Le preparazioni presentavano la seguente composizione: base acquosa (con mezzo di coltura) 100 ml; polimero 2 ml; ceppo 1C3Ma di Lb. brevis (1,0 x 10<9 >CFU/ml). Phase 2) As regards the composition, and using hyaluronic acid as polymer, the MRS-G culture media were compared with appropriate antifungal tests (against Microsporum canis 10D, Trichophyton rubrum 11D and Candida albicans 1-E) (De Man Rogosa & Sharpe broth with 0.2% glucose), PBS (phosphate buffered saline) and PBS + glu (PBS added with 20% glucose). The preparations had the following composition: aqueous base (with culture medium) 100 ml; polymer 2 ml; 1C3Ma strain of Lb. brevis (1.0 x 10 <9> CFU / ml).
E’ stato trovato che il formulato migliore era quello comprendente MRS-G, sia in termini di sopravvivenza del lattobacillo, che di durata dell’attività antifungina, soprattutto nei confronti di Microsporum sp. fino a 120 giorni di conservazione. It was found that the best formulation was the one including MRS-G, both in terms of the survival of the lactobacillus and the duration of the antifungal activity, especially against Microsporum sp. up to 120 days of storage.
Fase 3) E’ stata poi fatta una prova per confrontare l’attività fungina del lattobacillo (nei confronti di Microsporum canis 10D, Trichophyton rubrum 11D e Candida albicans 1-E) nei suddetti tre terreni di coltura in seguito a conservazione a 4 °C e 25 °C fino a 90 giorni. Le preparazioni presentavano la seguente composizione: base acquosa (con mezzo di coltura) 100 ml; polimero 2 ml; ceppo 1C3Ma di Lb. brevis (1,0 x 10<9 >CFU/ml). E’ stato trovato che il più alto titolo è stato mantenuto nei prodotti con base acquosa di MRS-G conservati a 4°C. Il prodotto con base acquosa di MRS-G, analizzato fino a 90 giorni di conservazione, ha presentato una carica di contaminanti inferiore a 1x10<3 >CFU/ml. Phase 3) A test was then made to compare the fungal activity of the lactobacillus (against Microsporum canis 10D, Trichophyton rubrum 11D and Candida albicans 1-E) in the aforementioned three culture media following storage at 4 ° C and 25 ° C for up to 90 days. The preparations had the following composition: aqueous base (with culture medium) 100 ml; polymer 2 ml; 1C3Ma strain of Lb. brevis (1.0 x 10 <9> CFU / ml). It was found that the highest titer was maintained in products with aqueous base of MRS-G stored at 4 ° C. The aqueous based product of MRS-G, analyzed up to 90 days of storage, showed a contaminant load of less than 1x10 <3> CFU / ml.
Il prodotto con base acquosa di MRS-G ha mostrato un’elevata attività antifungina nei confronti di entrambi i ceppi dermatofiti Microsporum sp. 10D e Trichophyton sp. 11D fino ai 90 giorni. Il preparato non ha invece mostrato alcuna attività antagonista nei confronti del ceppo di Candida albicans saggiato. The aqueous-based product of MRS-G showed a high antifungal activity against both dermatophyte strains Microsporum sp. 10D and Trichophyton sp. 11D up to 90 days. On the other hand, the preparation did not show any antagonistic activity against the strain of Candida albicans tested.
Gli aloni di inibizione prodotti contro il Trichophyton sp. risultano di diametro sempre inferiore rispetto a quelli prodotti contro il Microsporum sp., ma rientrano sempre nel range di un’elevata attività. The halos of inhibition produced against Trichophyton sp. they are always smaller in diameter than those produced against Microsporum sp., but always fall within the range of high activity.
Fase 4) Utilizzando MRS-G come base acquosa, acido ialuronico come polimero, e temperature di conservazione di 4 °C e 25 °C sono state poi fatte prove di attività antifungina in vitro utilizzando due differenti PM (pesi molecolari)(400 kDa e 1500 kDa) di sodio ialuronato per migliorare le caratteristiche reologiche della composizione, e quindi la sua applicabilità sulla cute. Le preparazioni presentavano la seguente composizione: base acquosa (con mezzo di coltura) 100 ml; polimero 2 ml; ceppo 1C3Ma di Lb. brevis (1,0 x 10<9 >CFU/ml). Phase 4) Using MRS-G as aqueous base, hyaluronic acid as polymer, and storage temperatures of 4 ° C and 25 ° C, antifungal activity tests were then carried out in vitro using two different PM (molecular weights) (400 kDa and 1500 kDa) of sodium hyaluronate to improve the rheological characteristics of the composition, and therefore its applicability on the skin. The preparations had the following composition: aqueous base (with culture medium) 100 ml; polymer 2 ml; 1C3Ma strain of Lb. brevis (1.0 x 10 <9> CFU / ml).
Condizioni di conservazione: i prodotti sono stati conservati a due temperature: 4°C (frigorifero) e 25°C. Tutti i campioni prima di ogni procedura di analisi sono stati equilibrati a temperatura ambiente e agitati. Storage conditions: the products were stored at two temperatures: 4 ° C (refrigerator) and 25 ° C. All samples before each analysis procedure were equilibrated at room temperature and shaken.
Campionamento: per ogni lotto sono stati prelevati tre campioni ad ogni fase di valutazione (T0, T30 giorni, T60 giorni) e il valore riportato è il risultato della media delle conte microbiche ottenute dai tre campioni. Formulazione della composizione dell’invenzione (A) e tempo 0: Lactobacillus brevis 1C3Ma, 1,0 x 10<9 >CFU/ml (di composizione); sodio ialuronato basso PM (400 kDa), 1,5 g; sodio ialuronato alto PM (1500 kDa), 0,3 g; base acquosa, 100 ml. Preparazione topica di riferimento (B): Trosyd, 1% tioconazolo crema (Giuliani). Sampling: for each lot three samples were taken at each evaluation phase (T0, T30 days, T60 days) and the reported value is the result of the average of the microbial counts obtained from the three samples. Formulation of the composition of the invention (A) and time 0: Lactobacillus brevis 1C3Ma, 1.0 x 10 <9> CFU / ml (of composition); low PM sodium hyaluronate (400 kDa), 1.5 g; high PM sodium hyaluronate (1500 kDa), 0.3 g; aqueous base, 100 ml. Reference topical preparation (B): Trosyd, 1% tioconazole cream (Giuliani).
Ceppi fungini saggiati: Microsporum canis 10D, Microsporum canis C, Microsporum canis 71, Microsporum canis 77, Trichophyton rubrum 11D, Trichophyton rubrum 3D, Trichophyton rubrum A, Trichophyton metagrophytes 35, Trichophyton tonsurans 7D. Fungal strains tested: Microsporum canis 10D, Microsporum canis C, Microsporum canis 71, Microsporum canis 77, Trichophyton rubrum 11D, Trichophyton rubrum 3D, Trichophyton rubrum A, Trichophyton metagrophytes 35, Trichophyton tonsurans 7D.
Metodi di analisi utilizzati (come descritti sopra): Methods of analysis used (as described above):
- Saggio di sopravvivenza del ceppo LAB nella preparazione: metodo della conta in piastra con semina per spatolamento in superficie. La sopravvivenza è stata valutata fino a 60 giorni in seguito a conservazione a 4 °C e 25 °C. - Survival assay of the LAB strain in the preparation: plate count method with sowing by surface spatulation. Survival was evaluated for up to 60 days following storage at 4 ° C and 25 ° C.
- Analisi microbiologica della preparazione (rilevazione contaminanti): metodo della conta in piastra con semina per spatolamento in superficie. La rilevazione di contaminanti è stata valutata fino a 60 giorni in seguito a conservazione a 4 °C e 25 °C. - Microbiological analysis of the preparation (contaminant detection): plate count method with sowing by surface spatulation. Detection of contaminants was evaluated for up to 60 days following storage at 4 ° C and 25 ° C.
- Saggio di attività antifungina della preparazione: - Assay of antifungal activity of the preparation:
metodo dell’agar well diffusion (Schillinger & Lucke, 1989), con saggi eseguiti al tempo T0, T 30 (30 giorni) e T60 (60 giorni). Dopo il primo saggio (T0), un campione è stato incubato a 25 °C e l’altro a 4 °C. Sono state messe a confronto una composizione secondo l’invenzione (Preparazione A) e una composizione commerciale (Preparazione B) I risultati delle conte sono riportati in Tabella 9 e in Tabella 10 e si riferiscono alle medie di tre campioni e sono riportate in CFU/ml. agar well diffusion method (Schillinger & Lucke, 1989), with assays performed at time T0, T 30 (30 days) and T60 (60 days). After the first assay (T0), one sample was incubated at 25 ° C and the other at 4 ° C. A composition according to the invention (Preparation A) and a commercial composition (Preparation B) were compared. The results of the counts are reported in Table 9 and in Table 10 and refer to the means of three samples and are reported in CFU / ml.
Tabella 9. Saggio sopravvivenza inoculo nelle preparazioni conservate a 4°C (CFU/ml) (LAB = lattobacilli) Table 9. Inoculum survival assay in preparations stored at 4 ° C (CFU / ml) (LAB = lactobacilli)
Tabella 10. Saggio sopravvivenza inoculo nelle preparazioni conservate a 25°C (CFU/ml) (LAB = lattobacilli) Table 10. Inoculum survival assay in preparations stored at 25 ° C (CFU / ml) (LAB = lactobacilli)
E’ risultato che la maggiore sopravvivenza del lattobacillo si osservava alla temperatura di conservazione di 4 °C. It turned out that the greatest survival of the lactobacillus was observed at the storage temperature of 4 ° C.
Per quanto riguarda la carica di contaminanti, il prodotto analizzato fino a 60 giorni di conservazione è risultato con una carica di contaminanti inferiore a 1,0x10<3 >CFU/ml, ad entrambe le temperature di conservazione. Le conte sono riportate in Tabella 11 e in Tabella 12 e si riferiscono alle medie di tre campioni e sono riportate in CFU/ml. As for the contaminant charge, the product analyzed up to 60 days of storage resulted in a contaminant charge lower than 1.0x10 <3> CFU / ml, at both storage temperatures. The counts are reported in Table 11 and Table 12 and refer to the means of three samples and are reported in CFU / ml.
Tabella 11. Rilevazione contaminanti nelle preparazioni conservate a 4°C (CFU/ml) Table 11. Detection of contaminants in preparations stored at 4 ° C (CFU / ml)
Tabella 12. Rilevazione contaminanti nelle preparazioni conservate a 25°C (CFU/ml) Table 12. Detection of contaminants in preparations stored at 25 ° C (CFU / ml)
Per quanto riguarda il saggio di attività antifungina, il prodotto con base acquosa di MRS-G ha mostrato un’elevata attività antifungina nei confronti di tutti i ceppi dermatofiti di Microsporum spp. e Trichophyton spp. saggiati. As regards the antifungal activity assay, the aqueous-based product of MRS-G showed a high antifungal activity against all dermatophyte strains of Microsporum spp. and Trichophyton spp. tested.
Gli aloni di inibizione prodotti contro il Trichophyton risultano in alcuni casi di diametro (in mm) sempre inferiore rispetto a quelli prodotti contro il Microsporum, in particolare per quanto riguarda il ceppo 35 (che è un T. mentagrophytes) ma rientrano sempre nel range di un’elevata attività. Si vedano le Tabelle 13-17. The halos of inhibition produced against Trichophyton are in some cases always smaller in diameter (in mm) than those produced against Microsporum, in particular as regards strain 35 (which is a T. mentagrophytes) but always fall within the range of high activity. See Tables 13-17.
La prima lettura dell’attività inibente è stata effettuata dopo 5 giorni di incubazione, a cui è seguita la lettura dopo 30 giorni (T30) e 60 giorni (T60). The first reading of the inhibitory activity was carried out after 5 days of incubation, which was followed by the reading after 30 days (T30) and 60 days (T60).
Tabella 13. Misura degli aloni di inibizione al T5 Table 13. Measurement of the halos of inhibition at T5
Simbologia inibizione: Inhibition symbols:
: zona di inibizione ≥ 1 mm. : zone of inhibition ≥ 1 mm.
Tabella 14. Misura degli aloni di inibizione al T 30 giorni a 4°C Table 14. Measurement of the halos of inhibition at T 30 days at 4 ° C
Simbologia inibizione: Inhibition symbols:
: zona di inibizione ≥ 1 mm. : zone of inhibition ≥ 1 mm.
Tabella 15. Misura degli aloni di inibizione al T 30 giorni a 25°C Table 15. Measurement of the halos of inhibition at T 30 days at 25 ° C
Simbologia inibizione: Inhibition symbols:
: zona di inibizione ≥ 1 mm. : zone of inhibition ≥ 1 mm.
Tabella 16. Misura degli aloni di inibizione al T 60 giorni a 4°C Table 16. Measurement of the halos of inhibition at T 60 days at 4 ° C
Simbologia inibizione: Inhibition symbols:
: zona di inibizione ≥ 1 mm. : zone of inhibition ≥ 1 mm.
Tabella 17. Misura degli aloni di inibizione al T 60 giorni a 25°C Table 17. Measurement of the halos of inhibition at T 60 days at 25 ° C
Simbologia inibizione: Inhibition symbols:
: zona di inibizione ≥ 1 mm. : zone of inhibition ≥ 1 mm.
Si è osservato che alla concentrazione di acido ialuronico data dalla combinazione di 1,5% di acido ialuronico a basso peso molecolare e 0,3% acido ialuronico ad alto peso molecolare, la temperatura di conservazione migliore era ancora 4 °C. It was observed that at the concentration of hyaluronic acid given by the combination of 1.5% low molecular weight hyaluronic acid and 0.3% high molecular weight hyaluronic acid, the best storage temperature was still 4 ° C.
Il prodotto analizzato fino a 60 giorni di conservazione ha presentato una carica di contaminanti inferiore a 1x10<3 >CFU/ml ad entrambe le temperature di conservazione. Il prodotto ha mostrato un’elevata attività antifungina nei confronti di tutti i ceppi dermatofiti di Microsporum spp. e Trichophyton spp. saggiati. Gli aloni di inibizione prodotti contro il Trichophyton risultano in alcuni casi di diametro inferiore rispetto a quelli prodotti contro il Microsporum, in particolare per quanto riguarda il ceppo 35 (che è un T. mentagrophytes) ma rientrano sempre nel range di un’elevata attività. The product analyzed up to 60 days of storage showed a contaminant load of less than 1x10 <3> CFU / ml at both storage temperatures. The product showed high antifungal activity against all dermatophyte strains of Microsporum spp. and Trichophyton spp. tested. The inhibition halos produced against Trichophyton are in some cases smaller in diameter than those produced against Microsporum, in particular with regard to strain 35 (which is a T. mentagrophytes) but always fall within the range of high activity.
In base ai risultati ottenuti in vitro dalle formulazioni sperimentali, nella formulazione di acido ialuronico contenente il ceppo di lattobacillo vivo ed inoculato in mezzo acquoso di MRS-G in carica di circa 1x10<9 >CFU/ml, il ceppo è stato in grado di sopravvivere mantenendo una carica media di 1,0x10<8 >CFU/ml fino ad almeno 60 giorni di conservazione a 4°C, e mantenendo concomitantemente ottime capacità antagoniste, anche superiori alla preparazione topica di tioconazolo utilizzata come controllo positivo nel saggio, verso le specie Microsporum e Trichophyton, in modo particolare verso Microsporum. I preparati sperimentali non hanno invece in nessun caso mostrato attività antagonista nei confronti dei ceppi di Candida albicans saggiati. On the basis of the results obtained in vitro from the experimental formulations, in the formulation of hyaluronic acid containing the strain of live lactobacillus and inoculated in aqueous medium of MRS-G in charge of about 1x10 <9> CFU / ml, the strain was able to survive maintaining an average charge of 1.0x10 <8> CFU / ml up to at least 60 days of storage at 4 ° C, and concomitantly maintaining excellent antagonistic capacities, even higher than the topical preparation of tioconazole used as a positive control in the assay, towards Microsporum and Trichophyton species, especially towards Microsporum. On the other hand, the experimental preparations did not in any case show antagonistic activity against the strains of Candida albicans tested.
ESEMPIO 3 EXAMPLE 3
Prove in vivo In vivo tests
Preparazione della composizione Preparation of the composition
La composizione idrogel per le prove in vivo è stata quindi preparata con la seguente formulazione: Ceppo di lattobacillo (LAB) utilizzato: Lactobacillus <9>brevis 1C3Ma, 1,0x10 CFU/ml (conta iniziale) The hydrogel composition for in vivo tests was then prepared with the following formulation: Lactobacillus strain (LAB) used: Lactobacillus <9> brevis 1C3Ma, 1.0x10 CFU / ml (initial count)
Sodio ialuronato (g) basso PM (400 kDa): 1.5 g Sodium hyaluronate (g) low PM (400 kDa): 1.5 g
Sodio ialuronato (g) alto PM (1500 kDa): 0.3 g Sodium hyaluronate (g) high PM (1500 kDa): 0.3 g
Base acquosa (ml): 100 ml, MRSG: Lactobacillus brevis 1C3Ma in terreno di coltura brodo MRS-G (De Man Rogosa & Sharpe 0,2% glucosio). Aqueous base (ml): 100 ml, MRSG: Lactobacillus brevis 1C3Ma in MRS-G broth culture medium (De Man Rogosa & Sharpe 0.2% glucose).
Sono state preparate 4 provette Falcon da 50 ml sterili con 25 ml di MRS-G brodo ed è stata inoculata una colonia del ceppo in ciascuna provetta Falcon; le provette sono state incubate a 37 °C in microaerofilia per 18h; successivamente, le 4 brodocolture sono state unite in una beuta (totale di 100 ml) e sono stati aggiunti 0,3 g di sodio ialuronato a basso peso molecolare e 1,5 g di sodio ialuronato ad alto peso molecolare; è stato inserito nella beuta un magnete di grandezza adeguata alle sue dimensioni; la beuta è stata posta su un agitatore magnetico e lasciata in agitazione a temperatura ambiente per circa 30 ore, quando si è ottenuto un aspetto omogeneo. Il preparato è stato poi trasferito asetticamente in dosatori a tenuta d’aria da 30 ml ed è stato conservato a 4 °C. Four sterile 50 ml Falcon tubes were prepared with 25 ml of MRS-G broth and a colony of the strain was inoculated into each Falcon tube; the tubes were incubated at 37 ° C in microaerophilicity for 18h; subsequently, the 4 broth cultures were combined in a flask (total of 100 ml) and 0.3 g of low molecular weight sodium hyaluronate and 1.5 g of high molecular weight sodium hyaluronate were added; a magnet of suitable size for its dimensions was inserted into the flask; the flask was placed on a magnetic stirrer and left to stir at room temperature for about 30 hours, when a homogeneous appearance was obtained. The preparation was then transferred aseptically into 30 ml airtight dispensers and was stored at 4 ° C.
Valutazione dell’efficacia in vivo della composizione Sono stati arruolati 15 pazienti, afferenti agli ambulatori della UOC (Unità Operativa Complessa) di Dermatologia della AOU (Azienda Ospedaliera Universitaria) di Cagliari (Italia), che hanno aderito spontaneamente allo studio. Evaluation of the in vivo efficacy of the composition 15 patients were enrolled, belonging to the clinics of the UOC (Complex Operative Unit) of Dermatology of the AOU (University Hospital) of Cagliari (Italy), who spontaneously joined the study.
Di 153 pazienti visitati per sospetta infezione micotica cutanea (82 donne e 71 uomini), 92 sono risultati positivi all'esame microscopico diretto e quindi effettivamente affetti da infezione micotica. Di questi, 15 rispettavano i criteri di inclusione (Tabella 18) e sono stati arruolati (4 maschi e 11 femmine), mentre 77, per età e/o tipo di infezione (coinvolgimento pilare, ungueale o estrema diffusione dell’infezione), non rispettavano i criteri di inclusione e sono quindi stati esclusi dallo studio. Of 153 patients seen for suspected fungal skin infection (82 women and 71 men), 92 tested positive by direct microscopic examination and therefore effectively affected by fungal infection. Of these, 15 met the inclusion criteria (Table 18) and were enrolled (4 males and 11 females), while 77, by age and / or type of infection (pilar, nail or extreme spread of infection), did not they met the inclusion criteria and were therefore excluded from the study.
Tabella 18. Criteri di inclusione nello studio in vivo 1 Soggetti di età pari o superiore a 18 anni 2 Soggetti affetti da micosi cutanee (tinea corporis, cruris, pedis, e/o pitiriaris versicolor) Table 18. Criteria for inclusion in the in vivo study 1 Subjects aged 18 years and older 2 Subjects with cutaneous mycosis (tinea corporis, cruris, pedis, and / or pitiriaris versicolor)
3 Soggetti con una o più lesioni isolate da trattare 3 Subjects with one or more isolated lesions to be treated
4 Soggetti che non hanno fatto uso di antimicotici nella settimana precedente all’inclusione nello studio 4 Subjects who did not use antifungals in the week prior to inclusion in the study
5 Soggetti immunocompetenti 5 Immunocompetent subjects
6 Soggetti che non stanno effettuando altra terapia che possa influire significativamente sulla risposta alla terapia proposta (ad esempio corticosteroidi topici e/o sistemici e altri immunomodulanti sistemici) 6 Subjects who are not receiving other therapy that may significantly affect the response to the proposed therapy (e.g. topical and / or systemic corticosteroids and other systemic immunomodulators)
7 Soggetti in grado di leggere e scrivere italiano 7 Subjects able to read and write Italian
8 Soggetti in grado di fornire il consenso informato 8 Subjects able to provide informed consent
I 15 pazienti che soddisfacevano i criteri d’inclusione risultavano affetti da: 3 casi di pitiriasi versicolor; 1 caso di tinea faciei; 7 casi di tinea pedis, in due dei quali concomitava, per autocontagio, una tinea manum ed in 1 caso una tinea cruris, tre tinea corporis e 1 caso di tinea cruris. La Tabella 19 riassume il quadro dei pazienti. The 15 patients who met the inclusion criteria were affected by: 3 cases of pityriasis versicolor; 1 case of tinea faciei; 7 cases of tinea pedis, in two of which concomitant, by self-infection, a tinea manum and in 1 case a tinea cruris, three tinea corporis and 1 case of tinea cruris. Table 19 summarizes the patient picture.
Tabella 19. Quadro dei pazienti Table 19. Patient overview
A tutti i pazienti: To all patients:
1) è stato sottoposto un consenso informato scritto, dopo essere stati informati verbalmente sulle caratteristiche del prodotto e le modalità di applicazione. 1) a written informed consent was submitted, after having been verbally informed about the characteristics of the product and the methods of application.
2) è stato praticato un esame microscopico e colturale, su terreno di Sabouraud (T0) che ha consentito di identificare il micete in causa nella maggioranza dei casi (non è stato possibile effettuare un esame colturale delle infezioni da Malassezia furfur per le difficoltà colturali di questo lievito, note nel settore). 2) a microscopic and cultural examination was carried out on Sabouraud medium (T0) which made it possible to identify the fungus in question in the majority of cases (it was not possible to carry out a culture examination of Malassezia furfur infections due to the cultivation difficulties of this yeast, known in the sector).
3) è stato consegnato il prodotto in studio da applicare solo su un gruppo/una lesione micotica mentre è stato prescritto un topico antimicotico del commercio (Trosyd, 1% tioconazolo crema, Giuliani) per trattare le eventuali rimanenti lesioni dello stesso paziente, che hanno quindi avuto il ruolo di gruppo di controllo per il paziente. 3) the study product was delivered to be applied only on a group / fungal lesion while a commercial topical antifungal (Trosyd, 1% tioconazole cream, Giuliani) was prescribed to treat any remaining lesions of the same patient, who have therefore had the role of control group for the patient.
Sia per il preparato in oggetto che per il gruppo di controllo la quantità di farmaco da applicare è stata stabilita in FTU (finger tip units) di prodotto (una FTU è uguale a 0.5 g di crema considerando che il calibro dell’erogatore del tubo è di 5 mm) (Long CC, Finlay AY. The fingertip unit: A new practical measure. Cli Exp Dermatol. 1991;16:444–7). 1 FTU copre 300 cm<2 >di pelle/tessuto. Le quantità di crema da applicare sono state opportunamente calcolate sulla base della estensione della malattia. For both the preparation in question and for the control group, the quantity of drug to be applied was established in FTU (finger tip units) of product (one FTU is equal to 0.5 g of cream considering that the caliber of the tube dispenser is 5 mm) (Long CC, Finlay AY. The fingertip unit: A new practical measure. Cli Exp Dermatol. 1991; 16: 444–7). 1 FTU covers 300 cm <2> of leather / fabric. The quantities of cream to be applied were appropriately calculated on the basis of the extent of the disease.
4) il trattamento con il preparato oggetto dello studio e contemporaneamente, sulle eventuali altre lesioni, con un antimicotico topico di controllo, è stato effettuato per una durata di 4 settimane (28 giorni). Tutti i pazienti sono stati sottoposti a controlli clinici regolari, a 14 giorni dall’inizio del trattamento (T1), a 28 giorni (fine trattamento, T2) e dopo 30 giorni dalla sospensione del trattamento (T3 – in Tabella 20) e a controllo micologico, a 28 giorni (o 28 15 giorni) (T2) e dopo 30 giorni dalla sospensione del trattamento (T3 – in Tabella 20) per la valutazione della risposta alla terapia oggetto di studio. 4) the treatment with the preparation object of the study and at the same time, on any other lesions, with a control topical antifungal, was carried out for a duration of 4 weeks (28 days). All patients underwent regular clinical checks, at 14 days from the start of treatment (T1), at 28 days (end of treatment, T2) and after 30 days from the suspension of treatment (T3 - in Table 20) and mycological control , at 28 days (or 28 15 days) (T2) and after 30 days from the suspension of treatment (T3 - in Table 20) for the evaluation of the response to the therapy under study.
Per tutti i pazienti è stata compilata una scheda di valutazione della risposta clinica dove sono stati segnalati la presenza di segni e sintomi (prurito, desquamazione, vescicolazione, altro) prima dell’inizio del trattamento (T0), a 14 giorni dall’inizio del trattamento (T1), a 28 giorni coincidente con la fine del trattamento (T2) e dopo 30 giorni dalla sospensione del trattamento (T3). A clinical response assessment form was completed for all patients where signs and symptoms (itching, scaling, blistering, other) were reported prior to the start of treatment (T0), 14 days after the start of treatment. treatment (T1), at 28 days coinciding with the end of treatment (T2) and after 30 days from the suspension of treatment (T3).
Sono state rilevate le eventuali reazioni avverse intercorse durante il trattamento. Any adverse reactions occurred during treatment were noted.
La Tabella 20 riassume i risultati dello studio. Table 20 summarizes the results of the study.
Tabella 20. Sommario dei risultati dei test clinici (osservazione a tempo T3) (a ciascun paziente è assegnato lo stesso numero della Tabella 19) Table 20. Summary of clinical test results (observation at time T3) (each patient is assigned the same number as in Table 19)
M = maschio; F = femmina M = male; F = female
Controllo micologico positivo = presenza di miceti; Controllo micologico negativo = assenza di miceti; (*) = lesione singola; (**) = viraggio verso terapia convenzionale antimicotica; (***) = viraggio verso terapia convenzionale sistemica Abb = abbandono subito; Inv. = invariato; Recr. = recrudescenza; Rem. = remissione; Parz. = parziale Positive mycological control = presence of fungi; Negative mycological control = absence of fungi; (*) = single lesion; (**) = change towards conventional antifungal therapy; (***) = change towards conventional systemic therapy Abb = immediate abandonment; Inv. = Unchanged; Recr. = resurgence; Rem. = remission; Part. = partial
7 pazienti (n. 1, 3, 5, 8-11) hanno mostrato guarigione clinica e micologica, 2 pazienti (n. 6 e 12) hanno mostrato guarigione clinica ma positività micologica per infezione pilare (per definizione non curabile con creme, comprese quelle esistenti in commercio) (sia con il preparato oggetto dello studio che con il preparato tradizionale), 1 paziente (n. 7) ha mostrato miglioramento per due settimane e poi la comparsa di un peggioramento della sintomatologia pruriginosa, ed è quindi passato al trattamento convenzionale, 1 paziente (n. 2) ha abbandonato dopo due settimane. 1 paziente (n. 4) è fuoriuscito subito per scarsa compliance. 3 pazienti (n. 13-15) affetti da pitirasi versicolore non hanno risposto. 7 patients (# 1, 3, 5, 8-11) showed clinical and mycological healing, 2 patients (# 6 and 12) showed clinical cure but mycological positivity for pilar infection (by definition not curable with creams, including existing ones on the market) (both with the preparation under study and with the traditional preparation), 1 patient (n.7) showed improvement for two weeks and then the appearance of a worsening of the itchy symptoms, and then moved on to treatment conventional, 1 patient (# 2) dropped out after two weeks. 1 patient (n. 4) immediately escaped due to poor compliance. 3 patients (n. 13-15) affected by pityrase versicolor did not respond.
Escludendo i tre pazienti affetti da pitiriasi versicolore e il paziente che ha abbandonato subito, si può concludere che è stata ottenuta guarigione in 7 casi su 11. Va sottolineato che questi risultati sono stati ottenuti su forme cliniche di particolare gravità e non su quelle forme di micosi di lieve-moderata gravità che sono le più adatte al solo trattamento topico. Excluding the three patients suffering from pityriasis versicolor and the patient who abandoned immediately, it can be concluded that recovery was obtained in 7 cases out of 11. It should be emphasized that these results were obtained on clinical forms of particular severity and not on those forms of mycosis of mild to moderate severity which are the most suitable for topical treatment only.
Per quanto riguarda il confronto dell’efficacia della composizione dell’invenzione con il preparato topico convenzionale Trosyd, 1% tioconazolo crema (Giuliani), nella maggior parte dei casi, la guarigione si è ottenuta sia con il farmaco dell’invenzione che con farmaco tradizionale. In particolare, in due casi, in cui era presente un parassitamento pilare, e in cui è prevedibile la mancata guarigione con un solo preparato topico, l’efficacia del farmaco tradizionale è stato sovrapponibile a quella della composizione dell’invenzione e si è in entrambi i casi aggiunto un farmaco sistemico (si veda la Tabella 21). As regards the comparison of the effectiveness of the composition of the invention with the conventional topical preparation Trosyd, 1% tioconazole cream (Giuliani), in most cases, the cure was obtained both with the drug of the invention and with the traditional drug . In particular, in two cases, in which there was a pilar parasitization, and in which the failure to cure with a single topical preparation is foreseeable, the effectiveness of the traditional drug was comparable to that of the composition of the invention and in both the cases added a systemic drug (see Table 21).
Tabella 21 – Risultati del confronto dell’efficacia della composizione dell’invenzione con un preparato topico convenzionale (a ciascun paziente è assegnato lo stesso numero delle Tabelle 19 e 20). Table 21 - Results of comparing the effectiveness of the composition of the invention with a conventional topical preparation (each patient is assigned the same number of Tables 19 and 20).
M = maschio; F = femmina M = male; F = female
1. Trosyd, 1% tioconazolo crema (Giuliani) 1. Trosyd, 1% tioconazole cream (Giuliani)
(*) = lesione singola; (**) = viraggio verso terapia convenzionale antimicotica; (***) = viraggio verso terapia convenzionale sistemica (*) = single lesion; (**) = change towards conventional antifungal therapy; (***) = change towards conventional systemic therapy
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Non-Patent Citations (1)
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| SHARPE, M. E.: "A serological classification of Lactobacilli", JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY, vol. 12, 1955, pages 107 - 122, XP002784548 * |
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| WO2023232677A1 (en) * | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Lactobio A/S | Strains, compositions and methods of use |
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