IT201600124288A1

IT201600124288A1 - Diagnosi e trattamento dei tumori

Info

Publication number: IT201600124288A1
Application number: IT102016000124288A
Authority: IT
Inventors: Irene Bozzoni; Ivano Legnini; Timoteo Gaia Di; Francesca Rossi; Carlo Dominici; Francesca Megiorni
Original assignee: Univ Degli Studi Roma La Sapienza
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2018-06-07

Description

“Diagnosi e trattamento dei tumori”

Campo tecnico dell’invenzione

La presente invenzione è relativa a nuovi agenti, composizioni e metodi per l’uso nel trattamento e nella diagnosi di tumori e più in particolare dei tumori dei tessuti molli e del rabdomiosarcoma.

La presente invenzione è dunque relativa alla quantificazione in vitro dei livelli dell’RNA circolare Circ-ZNF-RMS e ad agenti polinucleotidici per l’uso nella down-regolazione dell’RNA circolare Circ-ZNF-RMS.

Arte nota

Negli ultimi anni l’attenzione dei ricercatori si è concentrata su una nuova classe di molecole di RNA, gli RNA circolari (circRNA). Studi recenti descrivono come queste molecole poliribonucleotidiche chiuse covalentemente ad anello, fino ad ora ritenute generate da eventi rari, siano comunemente prodotte da migliaia di geni (Salzman et al, 2012; Jeck et al, 2013;. Memczak et al, 2013) e possano essere originate mediante differenti meccanismi molecolari.

É stato dimostrato che l'espressione dei circRNA è spesso altamente conservata nell'evoluzione e che è particolarmente abbondante nei tessuti neuronali di mammifero (Rybak-Wolf et al., 2015).

Molto poco si sa circa le loro funzioni biologiche e al momento sono stati descritti solamente alcuni meccanismi d'azione: alcuni circRNA sono in grado di svolgere una funzione di spugna per micro-RNA (Memczak et al, 2013; Hansen et al 2013.), mentre altri sembrano funzionare come piattaforme per l’interazione proteica (Hentze and Preiss, 2013). Diverse nuove evidenze sperimentali suggeriscono un possibile ruolo dei circRNA in diverse patologie umane (Shao e Chen, 2016;. Chen et al, 2016 Guarnerio et al, 2016).

Nonostante queste evidenze a favore di importanti ruoli funzionali degli RNA circolari, il loro impatto sui processi biologici e le possibilità terapeutiche ad essi associate sono ancora in gran parte inesplorati.

Il Rabdomiosarcoma (RMS) rappresenta circa il 5% di tutti i tumori infantili ed è il sarcoma dei tessuti molli più comune in età pediatrica.

Il RMS è un tumore eterogeneo, con cellule tumorali che originano da cellule mesenchimali primitive e che esprimono alcuni marcatori dei muscoli scheletrici pur mostrando un fenotipo di differenziamento muscolare incompleto. I due sottotipi istologici principali sono il RMS Embrionale (ERMS) ed il RMS Alveolare (ARMS), associato ad alterazioni genetiche specifiche. I tumori embrionali sono più frequenti (70-80% dei casi) e colpiscono generalmente neonati e bambini piccoli (fino a 4 anni), mentre i tumori alveolari (20-30% dei casi) si sviluppano generalmente nei bambini più grandi e negli adolescenti e sono caratterizzati da un andamento più aggressivo con scarsa risposta alla terapia ed una prognosi significativamente peggiore.

La prognosi relativa al RMS è migliorata negli ultimi decenni grazie ad un approccio terapeutico multidisciplinare arrivando a raggiungere un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 60%.

La terapia attuale del RMS comprende chirurgia, chemioterapia e radioterapia, tuttavia lo sviluppo di resistenze alla chemio/radioterapia o all’insorgenza di malattia metastatica è spesso un fattore limitante che porta a fallimento terapeutico e scarsa sopravvivenza. Negli ultimi anni, i miglioramenti terapeutici nei pazienti con RMS metastatico o refrattario hanno però raggiunto uno stato di plateau. (Rhabdomyosarcoma: Advances in Molecular and Cellular Biology. Sun X1, Guo W2, Shen JK3, Mankin HJ3, Hornicek FJ3, Duan Z3. Sarcoma.

2015;2015:232010 Epub 2015 Sep 1.).

La diagnosi istologica, basata sia su colorazioni tradizionali che sull’immunoistochimica e sulla microscopia elettronica, è resa estremamente complessa dall’eterogeneità e dalla complessità della classificazione e deve essere eseguita da patologi esperti in patologia muscoloscheletrica.

Risultano dunque necessarie, per migliorare le percentuali di sopravvivenza e le condizioni cliniche dei pazienti con RMS, una più approfondita comprensione della biologia molecolare di questo tumore e l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per ottenere terapie mirate ed efficaci e tale da rendere il processo di diagnosi più veloce e accurato.

Sommario dell'invenzione

È sentita l’esigenza, in campo medico, di identificare nuovi bersagli terapeutici al fine di migliorare le percentuali di sopravvivenza e le condizioni cliniche dei pazienti con RMS. È inoltre sentita l’esigenza di ottenere metodi accurati per la diagnosi in vitro, in alternativa o in affiancamento alla diagnosi istologica, che si presenta estremamente complessa a causa dell’eterogeneità di questi tumori.

Gli inventori hanno sperimentalmente trovato e selezionato un RNA circolare, circ-ZNF-RMS (SEQ ID NO:1) i cui livelli sono risultati, in linee cellulari di Rabdomiosarcoma, alterati rispetto ai livelli riscontrati in controlli WT. Gli inventori hanno dunque sviluppato agenti polinucleotidici specifici in grado di regolare i livelli di circRNA-ZNF-RMS e hanno dimostrato l’efficacia dell’inibizione di tale molecola per l’uso nel trattamento di tumori, anche in caso di sviluppata resistenza a farmaci già noti, per l’utilizzo da soli o in associazione con altri agenti terapeutici. Gli inventori hanno inoltre verificato i livelli di circ-ZNF-RMS in campioni isolati da pazienti affetti da differenti tipi di Rabdomiosarcoma; i livelli di circ-ZNF-RMS sono risultati alterati in tutti i campioni isolati da donatori affetti analizzati e gli inventori hanno chiaramente identificato detto RNA circolare come marker accurato utilizzabile per una prima diagnosi in vitro rapida e affidabile su campioni biologici isolati dai pazienti.

L’invenzione è dunque relativa a un agente polinucleotidico per l’inibizione dell’RNA circolare circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1, tale agente è un agente polinucleotidico a doppio o a singolo filamento che può essere soggetto a modificazioni chimiche atte a migliorarne la stabilità e l’efficacia.

L’agente secondo l’invenzione ha almeno un filamento antisenso di sequenza complementare alla sequenza dell’RNA circolare circ-ZNF-RMS (SEQ ID NO:1), preferibilmente complementare alla porzione di sequenza (SEQ ID NO:17) in cui è localizzata la sua giunzione “testa-coda” come di seguito descritta.

È ulteriore oggetto dell’invenzione l’uso di detti agenti nel trattamento dei tumori, preferibilmente dei tumori dei tessuti molli, più preferibilmente del rabdomiosarcoma e nel trattamento di soggetti con livelli alterati del trascritto di SEQ ID NO:1. È altresì oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente detto agente da solo o in combinazione con altri agenti terapeutici, anche chemioterapici ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.

È inoltre oggetto dell’invenzione un metodo per la diagnosi in vitro di una malattia tumorale basato sull’analisi dei livelli del trascritto circolare circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 in un campione biologico isolato da un soggetto e un kit per la diagnosi di malattia tumorale in vitro, comprendente almeno un primer o sonda per la quantificazione del trascritto circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1.

È ulteriormente oggetto dell’invenzione un kit per la diagnosi di malattia tumorale in vitro, comprendente almeno un primer o sonda per la quantificazione del trascritto circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1, reagenti e enzimi per l’estrazione di acidi nucleici in quantità predefinite, reagenti e enzimi per l’amplificazione e la quantificazione e/o per il rilevamento degli acidi nucleici in quantità predefinite, e istruzioni per l’uso.

Ulteriori aspetti risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata dell’invenzione

Breve descrizione delle Figure

Figura 1: Grafico a barre che mostra il livello di circ-ZNF-RMS in cellule muscolari, derivate da controllo sano (WT) e cellule di Rabdomiosarcoma (RD e RH4).

Figura 2: Risultati dell’analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare. La proporzione di cellule RD di controllo (a sinistra) e trattate con siRNA specifico contro circ-RMS-ZNF (a destra) in ciascuna fase del ciclo cellulare è riportata in grafico.

Figura 3: Analisi di Northern blot di circ-ZNF-RMS in seguito a trattamento di cellule RD con siRNA specifico contro l’RNA circolare. A sinistra si trova una schematizzazione dei due RNA riconosciuti dal probe: l’RNA circolare circ-ZNF-RMS (in nero) e il suo trascritto ospite in forma lineare (in grigio, con evidenziata in nero la regione corrispondente alla sequenza dell’RNA circolare).

A destra sono presenti due pannelli: uno con la colorazione del gel con bromuro d’etidio (EtBr) al fine di mostrare la quantità di RNA caricata su gel per entrambi i campioni (controllo e siRNA). Sono contrassegnate le bande corrispondenti agli RNA ribosomiali 28S e 18S. L’altro mostra invece la membrana ibridata con la sonda che lega la sequenza di circ-ZNF-RMS. Le due bande contrassegnate sono indicate con un cerchio (corrispondente all’RNA circolare) ed una linea (corrispondente all’RNA lineare).

Figura 4: Grafico a barre che mostra il livello di alcuni marcatori del ciclo cellulare analizzati mediante qRT-PCR in seguito a trattamento di cellule RD con siRNA specifico contro circ-ZNF-RMS. In grigio i livelli di tali marcatori nelle cellule di controllo, in bianco i livelli in seguito a trattamento.

Figura 5: Risultati dell’analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare. La proporzione di cellule RD di controllo (a sinistra) e trattate con siRNA in grado di legare sia circ-RMS-ZNF che il suo mRNA lineare (a destra) in ciascuna fase del ciclo cellulare è riportata in grafico,.

Figura 6: Risultati dell’analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare. La proporzione di cellule RD di controllo (a sinistra) e trattate con siRNA in grado di legare esclusivamente l’mRNA lineare che ospita circ-ZNF-RMS (a destra) in ciascuna fase del ciclo cellulare è riportata in grafico.

Figura 7: Rappresentazione grafica della strategia di misurazione dei livelli di circ-ZNF-RMS mediante qRT-PCR. È evidenziata una coppia di primer divergenti sulla sequenza di circ-ZNF-RMS (evidenziato in nero all’interno del suo mRNA lineare ospite in grigio, schema in alto). Al contrario, nell’RNA circolare rappresentato in nero in basso, la coppia di primer risulta convergente intorno alla giunzione di splicing “testa coda”, ed è pertanto in grado di amplificare la molecola circolare.

Figura 8: Risultati di qRT-PCR per circ-ZNF-RMS in biopsie. La qRT-PCR effettuata con i primer schematizzati in figura 7 mostra i livelli di circ-ZNF-RMS nelle biopsie derivate da pazienti con rabdomiosarcoma a fenotipo alveolare (ARMS) ed embrionale (ERMS).

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Definizioni:

Ai fini della presente invenzione per Primer si intende: un oligonucleotide di DNA con un gruppo ossidrilico 3’ libero, complementare ad una catena di DNA stampo, necessario come innesco per la replicazione del DNA catalizzata da una DNA polimerasi durante la cosiddetta reazione a catena della polimerasi (PCR).

Per Agente Polinucleotidico si intende: qualsiasi molecola naturale o sintetica di almeno due nucleotidi naturali o sintetici, chimicamente modificati o non.

Per Sonda si intende: qualsiasi molecola, marcata o non, in grado di riconoscere un’altra molecola polinucleotidica attraverso complementarietà di sequenza. Le sonde possono essere utilizzate per consentire una marcatura indiretta della molecola da esse riconosciuta e valutarne la presenza, l’assenza, la quantità e la localizzazione in un campione di origine chimica o biologica.

Per RNA circolare o circRNA si intende: una molecola di RNA chiusa covalentemente ad anello, dunque, mancante di estremità 5’ e 3’. Negli eucarioti superiori le estremità 5’ e 3’ di specifici esoni vengono legate tra loro con un legame fosfodiestere 5’-3’ introdotto in seguito ad una reazione di splicing particolare denominata back-splicing. Tale circolarizzazione risulta in una molecola di RNA circolare avente sequenza indistinguibile da quella dell’esone di provenienza, ad esclusione della regione generata dal processo di back-splicing, che viene comunemente denominata giunzione “testa-coda”.

Per siRNA si intende: una molecola di RNA a doppio filamento capace di interferire con l’espressione di specifici geni mediante il riconoscimento per complementarietà di sequenza e il successivo taglio endonucleolitico dei trascritti da essi codificati. Tale processo è definito interferenza a RNA o iRNA.

Gli inventori hanno sperimentalmente trovato e selezionato un RNA circolare, circ-ZNF-RMS (SEQ ID NO:1) i cui livelli sono risultati alterati in linee cellulari di RMS rispetto ai controlli WT.

In particolare, sono state utilizzate la linea cellulare “RD” (ATCC CCL-136), originariamente ottenuta da biopsia di Rabdomiosarcoma (RMS) a carico di una paziente di 7 anni, con tumore localizzato in zona pelvica e ad istologia embrionale (Hinson et al., Frontiers in Oncology 2013), e la linea cellulare “RH4” (Missiaglia E, et al. Genes Chromosomes Cancer. 2009), come modello di RMS alveolare (Figura 1).

Gli inventori hanno dunque sviluppato agenti polinucleotidici in grado di interferire specificamente con i livelli di circ-ZNF-RMS e hanno sperimentalmente dimostrato la possibilità di utilizzare questo RNA come bersaglio terapeutico per contrastare la proliferazione tumorale. Gli inventori hanno dunque verificato la sua presenza anche in campioni biologici derivati da pazienti RMS e da donatori sani. Gli inventori hanno sorprendentemente trovato livelli alterati di questo RNA circolare in tutti i campioni isolati da individui affetti analizzati.

CircRNA come target terapeutico

Gli inventori hanno condotto esperimenti di iRNA, al fine di verificare la possibilità di utilizzare circ-ZNF-RMS come target terapeutico.

Tali esperimenti sono stati condotti nella linea cellulare umana “RD” (ATCC CCL-136). Tali esperimenti sono stati condotti trasfettando le cellule in coltura con una soluzione 30 nM di siRNA (SEQ ID NO:2) diretti contro circ-ZNF-RMS, le cellule sono state raccolte e sono state trattate per le successive analisi citofluorimetriche e dell’RNA. Le cellule di controllo sono state trattate allo stesso modo utilizzando per la trasfezione una miscela di 4 siRNA con sequenza ottimizzata per non avere target cellulari (Dharmacon ON-Target plus Non-targeting control pool).

L’analisi di citofluorimetria condotta al fine di analizzare il ciclo cellulare delle cellule trattate per investigare la possibilità di utilizzare circ-ZNF-RMS come target terapeutico ha rivelato come, in seguito all’abbattimento del livello di espressione di circ-ZNF-RMS con il siRNA disegnato specificamente sulla giunzione di splicing “testa-coda”, le cellule abbiano fortemente ridotto la propria proliferazione, con un drastico calo della frazione di cellule in fase S e G2/M ed un conseguente aumento di quelle in fase G1 (figura 2).

Al fine di verificare che tale arresto della proliferazione delle cellule tumorali fosse effettivamente e specificamente associato a circ-ZNF-RMS, il livello di espressione dell’RNA circolare e del relativo gene ospite sono stati misurati mediante Northern blot (come descritto negli esempi).

Tale analisi ha confermato che l’uso del siRNA (SEQ ID NO:2) ha un effetto specifico su circ-ZNF-RMS (banda in basso, indicata da un cerchio nero in figura 3), mentre non ha effetti sull’mRNA del gene ospite (banda in alto, contrassegnata da una linea nera in figura 3). Ad ulteriore conferma dell’effetto di circ-ZNF-RMS sul ciclo cellulare, il livello di espressione di alcuni geni legati al ciclo cellulare, Ciclina A2, Ciclina B1 Ciclina B2, CDK, E2F1, (con i primer senso e antisenso denominati rispettivamente SEQ ID NO:4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13) è stato misurato in seguito al trattamento con siRNA (SEQ ID NO:2) mediante qRT PCR: per tutti questi geni si è ritrovata una sostanziale diminuzione in seguito a trattamento (figura 4).

Inoltre, l’uso di un secondo siRNA disegnato su un’altra regione di circ-ZNF-RMS (SEQ ID NO:14) ha permesso di escludere ulteriori effetti non specifici (figura 5), confermando che circ-ZNF-RMS è in grado di regolare da solo e specificamente il ciclo cellulare in cellule di Rabdomiosarcoma.

Come ulteriore controllo e per ottenere conferma dell’effetto specifico della forma circolare di ZNF-RMS si è utilizzata una miscela di due siRNA (Dharmacon ON target plus, cat. #J-02225719 e #J-02225720), avente come bersaglio l’mRNA lineare del gene ospite ZNF609, in una regione esterna alla sequenza dell’RNA circolare. Tale siRNA non ha sortito effetti sullo stato proliferativo delle cellule di rabdomiosarcoma, confermando ulteriormente la specificità dell’azione di circ-ZNF-RMS (figura 6) che si configura dunque come target terapeutico specifico efficace nel contrastare la proliferazione delle cellule tumorali. I risultati ottenuti sono stati anche oggetto di esperimenti in modello murino che hanno confermato i dati già descritti.

È dunque oggetto dell’invenzione l’uso di agenti polinucleotidici diretti contro circ-ZNF-RMS per l’uso in medicina umana e veterinaria in tutti quei soggetti con livelli aumentati di circ-ZNF-RMS, preferibilmente per l’uso nel trattamento dei tumori, più preferibilmente nel trattamento dei tumori dei tessuti molli, più preferibilmente nel trattamento del rabdomiosarcoma. Gli agenti secondo l’invenzione sono agenti polinucleotidici a doppio o a singolo filamento.

Gli agenti polinucleotidici a doppio filamento comprendono una sequenza senso e una sequenza antisenso.

Il filamento antisenso comprende una sequenza complementare ad almeno 16 nucleotidi del trascritto circ-ZNF-RMS (SEQ ID NO:1), preferibilmente complementare alla giunzione “testa-coda” avente sequenza SEQ ID NO:17.

Il filamento senso ha sequenza complementare alla sequenza antisenso.

Gli agenti polinucleotidici a doppio filamento secondo l’invenzione hanno una lunghezza compresa tra 16 e 28 più preferibilmente tra 18 e 24, ancora più preferibilmente di 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 nucleotidi.

Gli agenti polinucleotidici a doppio filamento secondo l’invenzione possono essere sottoposti a modificazioni chimiche atte ad aumentarne la stabilità, la specificità o l'intensità del legame con circ-ZNF-RMS, come ad esempio descritto in “Ya-Lin Chiu and Tariq M. Rana, RNA. 2003“e come noto all’esperto del ramo, preferibilmente metilazioni o modifiche con fosfotiorato.

Gli agenti polinucleotidici a singolo filamento comprendono una sequenza complementare ad almeno 10 nucleotidi del trascritto circ-ZNF-RMS (SEQ ID NO:1), preferibilmente complementare alla giunzione “testa-coda” avente sequenza SEQ ID NO:17. Gli agenti polinucleotidici a singolo filamento secondo l’invenzione hanno una lunghezza compresa tra 10 e 30 più preferibilmente tra 16 e 20, ancora più preferibilmente di 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidi.

Gli agenti polinucleotidici a singolo filamento secondo l’invenzione possono essere sottoposti a modificazioni chimiche, note all’esperto del ramo, atte ad aumentarne la stabilità, la specificità o l'intensità del legame con circ-ZNF-RMS, preferibilmente 2-OMe, fosforotioato, fosforoamidato, morfolino, LNA.

Gli agenti utilizzati per l’inibizione di circ-ZNF-RMS possono essere basati su principi diversi dall’RNAi noti all’esperto del ramo, come ad esempio oligonucleotidi di DNA, LNA o altri acidi nucleici con sequenza complementare a circ-ZNF-RMS il cui legame ne blocca il funzionamento o ne induce la degradazione mediata da RNasi H.

Gli agenti polinucleotidici secondo l’invenzione possono essere inclusi o incorporati in sistemi di delivery, vettori di espressione, preferibilmente virali, liposomi, micro o nanobolle, micro o nanoparticelle. L’iRNA di circ-ZNF-RMS può essere altresì condotta mediante l’utilizzo di precursori degli siRNA (short hairpin RNA o shRNA), anche introdotti in vettori di espressione eterologa.

Gli agenti secondo l’invenzione possono essere formulati in forma liquida, solida o semi solida, cristallina, parzialmente cristallina o amorfa. Gli agenti nucleotidici secondo l’invenzione possono essere utilizzati per la somministrazione locale o sistemica, per inalazione, topica, orale o parenterale da soli o in combinazione con eccipienti farmaceuticamente accettabili.

È inoltre oggetto dell’invenzione la formulazione di detti agenti polinucleotidici in composizioni farmaceutiche per l’uso nel trattamento dei tumori, preferibilmente nel trattamento dei tumori dei tessuti molli, più preferibilmente nel trattamento del rabdomiosarcoma.

Le composizioni contenenti l’agente polinucleotidico possono contenere eccipienti e carrier farmaceuticamente accettabili, ulteriori agenti polinucleotidici, agenti stabilizzanti, agenti chelanti, Sali, inibitori delle RNAsi e agenti terapeutici, quali ad esempio chemioterapici, cortisonici, fattori di crescita, agenti antiemetici e agenti antinausea, e relative miscele.

Dette composizioni possono essere realizzate per la somministrazione locale o sistemica, topica, orale o parenterale, per inalazione, in forma locale anche per iniezione diretta nel tessuto colpito da neoplasia.

Dette composizioni, possono essere realizzate in forma liquida, solida o semi solida, gassosa e cristallina o parzialmente cristallina.

Le composizioni oggetto dell’invenzione possono essere incluse o incorporate in sistemi di delivery, vettori di espressione, preferibilmente virali, liposomi, micro o nanobolle, micro o nanoparticelle.

CircRNA come target diagnostico

A fronte dei livelli alterati riscontrati nelle linee cellulari RMS, gli inventori hanno verificato i livelli di circ-ZNF-RMS anche in campioni isolati da pazienti affetti da differenti tipi di Rabdomiosarcoma (sia Arms che Erms) e in campioni isolati da donatori sani per confermare la possibilità di utilizzare circ-ZNF-RMS come target terapeutico e per verificare la possibilità di utilizzarlo come marker diagnostico.

Gli inventori hanno a tal fine sviluppato agenti polinucleotidici specifici per misurare i livelli di questo RNA in campioni biologici derivati da pazienti con RMS diagnosticato confrontandoli con i livelli riscontrati in campioni derivati da donatori sani.

Al fine di misurare specificamente la quantità di circ-ZNF-RMS mediante qRT-PCR sono stati disegnati due primer (SEQ ID NO:15 e 16) con direzionalità divergente intorno alla giunzione di splicing “testa coda” (figura 7). Tale coppia di primer è pertanto capace di rilevare in una reazione di PCR la presenza e la quantità della forma circolare di circ-ZNF-RMS e non il prodotto lineare del proprio gene ospite, innescando la reazione a catena della polimerasi a ridosso della giunzione di splicing “testa coda” e non sulla sequenza esonica. Tale strategia di PCR è stata applicata a campioni di RNA derivati da biopsie di pazienti con rabdomiosarcoma sia a forma embrionale (ERMS) che alveolare (ARMS), in confronto con biopsie di pazienti sani (WT).

I risultati mostrati in figura 8 indicano chiaramente che circ-ZNF-RMS è molto più abbondante (tra circa 5 e 60 volte) in tutti i campioni isolati da pazienti con rabdomiosarcoma rispetto ai donatori sani.

I livelli di circ-RNA-RMS sono quantificabili anche attraverso l’utilizzo di differenti primer il cui disegno è alla portata dell’esperto del ramo e Northen Blot, RT-PCR, ibridazione in situ con sonde fluorescenti o con sonde marcate in altro modo (ad esempio con digossigenina o biotina) e con ulteriori tecniche note all’esperto del ramo

La quantificazione di circ-ZNF-RMS può essere utilizzata per la diagnosi in vitro dei tumori anche in combinazione con altri metodi di diagnosi sia istologici che molecolari.

I livelli di circ-ZNF-RMS sono risultati alterati in tutti i campioni, isolati da donatori affetti, analizzati; e gli inventori hanno trovato in questo RNA circolare un marker accurato utilizzabile per una prima diagnosi in vitro rapida e affidabile su campioni biologici isolati dai pazienti.

È ulteriormente oggetto dell’invenzione un kit per la diagnosi di malattia tumorale in vitro, comprendente almeno un primer o sonda per la quantificazione di circRNA-ZNF-RMS come descritto sopra e negli esempi, reagenti e enzimi per l’estrazione e l’amplificazione e/o la quantificazione e/o il rilevamento di acidi nucleici in quantità predefinite, confezionate singolarmente o in miscela tra loro e istruzioni per l’uso.

Elenco delle sequenze.

SEQ ID NO:1

caaugauguu guccacuggg cauguacuga ccaauguggc aggucugaga acauagcuga 60 agcugaaaau aggaaagcug ggggcaagga agagccuuga aucuugaggu gggacguuga 120 cucuaagaug uccuugagca guggagccuc cggagggaaa ggaguggaug caaacccggu 180 ugagacauac gacagugggg augaauggga cauuggagua gggaaucuca ucauugaccu 240 ggacgccgau cuggaaaagg accagcagaa acuggaaaug ucaggcucaa aggagguggg 300 gauaccggcu cccaaugcug uggccacacu accagacaac aucaaguuug ugaccccagu 360 gccagguccu caagggaagg aaggcaaauc aaaauccaaa aggaguaaga guggcaaaga 420 cacuagcaaa cccacuccag ggacuucccu guucacucca agugaggggg cagcuagcaa 480 gaaagaggug caggggcgcu caggagaugg ugccaaugcu ggaggccugg uugcugcuau 540 ugcucccaag ggcucagaga aggcggcuaa ggcaucccgc aguguagccg guuccaaaaa 600 ggagaaggag aacagcucau cuaagagcaa gaaggagaga agcgaaggag uggggacuug 660 uucagaaaag gauccugggg uccuccagcc aguucccuug ggaggacggg guggucagua 720 ugauggaagu gcaggggugg auacaggagc uguggagcca cuugggagua uagcuauuga 780 gccuggggca gcgcucaauc cuuugggaac uaaaccggag ccagaggaag gggagaauga 840 gugucgccug cuaaagaaag ucaagucuga aaag 874 SEQ ID NO:2

agucaagucu gaaaagcaau 20 SEQ ID NO:3

ggaaccggcu acacugcggg augccuuagc cgccuucucu gagcccuugg gagcaauagc 60 agcaaccagg ccuccagcau uggcaccauc uccugagcgc cccugcaccu cuuucuugcu 120 agcugccccc ucacuuggag ugaacaggga agucccugga guggguuugc uagugucuuu 180 gccacucuua cuccuuuugg auuuugauuu gccuuccuuc ccuugaggac cuggcacugg 240 ggucacaaac uugauguugu cugguagugu ggc 273 SEQ ID NO:4

ctgagaatgg agcatctagt tttg 24 SEQ ID NO:5

gaggtatggg tcagcatcta tc 22 SEQ ID NO:6

ctgtgtcagg ctttctctga tg 22 SEQ ID NO:7

cgacccagta ggtattttgg 20 SEQ ID NO:8

ctctgcagtg actacgttaa g 21 SEQ ID NO:9

gtctcctgca gaagcctaaa c 21 SEQ ID NO:10

caggtcaagt ggtagccatg 20 SEQ ID NO:11

ggaatcctgc ataagcacat c 21 SEQ ID NO:12

gctggaccac ctgatgaata tc 22 SEQ ID NO:13

caatgctacg aaggtcctga c 21 SEQ ID NO:14

cacacuacca gacaacauca aguu 24 SEQ ID NO:15

aaaccggagc cagaggaagg 20 SEQ ID NO:16

cagctatgtt ctcagacctg c 21 SEQ ID NO:17

gucaagucug aaaagcaaug auguugucca 30 I seguenti esempi hanno scopo esplicativo e non sono da considerarsi limitativi della portata dell’invenzione.

Esempi

Colture Cellulari e trasfezioni

- le cellule “RD” (ATCC CCL-136), sono state poste in coltura e mantenute in un mezzo di coltura composto da DMEM supplementato con 10% di FBS, L-Glutammina 2mM, Penicillina e Streptomicina

In preparazione alla trasfezione, 250000 cellule sono mantenute in coltura per un giorno in piastre in polistirene da 3.5 cm di diametro, con un totale di 2 ml di mezzo di coltura;

- una miscela contente siRNA a concentrazione finale 30 nM,lipofectamine 2000 (agente trasfettante a base di liposomi, ThermoFisher) e mezzo di coltura Optimem (ThermoFisher) è stata preparata e lasciata riposare per 10 minuti ed in seguito aggiunta alle cellule in coltura;

- una miscela di controllo contenente una miscela di 4 siRNA ottimizzati per non avere target cellulari (Dharmacon ON-Target plus Negative control pool) è stata preparata allo stesso modo - 16 ore dopo la trasfezione, il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo fresco e le cellule sono state lasciate in coltura senza ulteriori manipolazioni per due giorni;

- dopo i due giorni, le cellule sono state staccate dalle piastre di coltura e suddivise: 1/5 sono state lisate in Qiazol (Qiagen) per la successiva analisi dell’RNA, e 4/5 sono state fissate in etanolo 70% per la successiva analisi citofluorimetrica.

Citofluorimetria

Per determinare la percentuale di cellule nelle varie fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare, è stata effettuata un’analisi di citofluorimetria mediante colorazione con ioduro di propidio (PI), una molecola in grado di legare direttamente il DNA. In particolare, le cellule sono state staccate con tripsina, lavate con CMF-PBS e contate utilizzando il contacellule automatico Countess II (ThermoFisher). Circa 10<6>cellule/campione sono state fissate con 2 ml di etanolo al 70%, aggiunto goccia a goccia, e conservate a 4°C per tutta la notte. Il giorno successivo, i campioni sono stati centrifugati a 1500 rpm per 5 min a 4°C ed il pellet cellulare è stato lavato due volte con CMF-PBS freddo. Dopo aver eliminato bene il supernatante, sono stati aggiunti 100 μl di CMF-PBS e 10 μl di RNase A 1 mg/ml incubando per 30 min a 37°C. I campioni sono stati colorati con 10 μl di PI 1 mg/ml per 5 min a RT, al buio, ed infine letti al BD FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences) utilizzando il software Cell Quest Pro (BD Biosciences). I dati ottenuti sono stati analizzati con il software ModFit 3.1 software (BD Biosciences).

Isolamento dell’RNA (sia per northern che per pcr)

Il lisato cellulare raccolto in Qiazol è stato lasciato riposare 5 minuti a temperatura ambiente, addizionato di 1/5 del volume di cloroformio, mescolato e centrifugato per 10 minuti a 13000 rpm. Il supernatante (fase acquosa) è stato raccolto e l’RNA contenuto è stato fatto precipitare con l’aggiunta di un volume di isopropanolo 100%, incubazione a -80°C per mezz’ora e successiva centrifugazione per 20 minuti a 13000 rpm. Il pellet così ottenuto è stato lavato con etanolo 70%, ricentrifugato per 5 minuti, essiccato all’aria ed infine risospeso in acqua bidistillata.

Northern blot

- 10 μg di RNA estratto da cellule trattate con siRNA (SEQ ID NO:2) e con siRNA di controllo (On-target plus non-targeting control pool, Dharmacon) come descritto in Colture Cellulari e trasfezioni sono stati denaturati a 50°C per mezz’ora con l’aggiunta di un volume di Northernmax-Gly loading dye (Ambion) e sottoposti a corsa elettroforetica in gel di agarosio 1.2% per 2 ore a 60V;

- L’RNA nel gel è stato successivamente trasferito su membrana di nylon (Hybond N+, GE Healthcare) per capillarità attraverso un tampone di SSC 10X (tampone di NaCl e Sodio Citrato) e il materiale trasferito su membrana è stato covalentemente legato al nylon tramite luce UV;

- La membrana è stata successivamente sottoposta a ibridazione con una sonda di RNA marcato con digossigenina (SEQ ID NO:3) ed il legame della sonda è stato rivelato mediante un anticorpo riconoscente la digossigenina coniugato con fosfatasi alcalina (anti-DIG AP, Roche), la quale produce chemioluminescenza in seguito ad incubazione con un substrato chiamato CDP star (Roche)

qRT-PCR (su RNA da linee cellulari e da biopsie)

1 μg di RNA è stato retrotrascritto con l’enzima Superscript VILO (Life technologies) secondo il protocollo previsto dal produttore. Per ciascuna reazione di qRT-PCR, una miscela di 15 μl è stata preparata miscelando 5 ng di cDNA ottenuto dalla reazione di retrotrascrizione e diluito in 6 μl, 7,5 μl di SYBR green mastermix (Qiagen) e 1,5 μl di primer 5 μM. La reazione è stata successivamente condotta in un termociclatore da Real Time ABI 7500 Fast (Applied Biosystems) secondo il seguente ciclo termico: 15 minuti a 95°C per l’attivazione della DNA polimerasi più 40 cicli così composti: 15 secondi a 95°C, 30 secondi a 55°C e 30 secondi a 72°C.

Estrazione RNA totale da tessuti tumorali di pazienti con rabdomiosarcoma (RMS)

Nello studio sono stati utilizzati 12 campioni di RMS, 5 alveolari e 7 embrionali, prelevati, alla diagnosi e prima di qualsiasi trattamento, da bambini ricoverati presso il Dipartimento di Oncologia dell’Alder Hey Children’s NHS Foundation Trust di Liverpool (Gran Bretagna). Per il controllo negativo abbiamo prelevato muscolo scheletrico normale (NSM) da 8 bambini sottoposti a chirurgia per patologie benigne non tumorali. Il consenso informato è stato ottenuto dai genitori dei pazienti o dai loro tutori legali. Lo studio è stato sottoposto a revisione etica ed è stato approvato secondo le linee guida istituzionali locali (Alder Hey Children’s NHS Foundation Trust Ethics Committee, approval number 09/H1002/88).

Dopo l’asportazione chirurgica, i campioni di tessuto sono stati congelati in azoto liquido e conservati a -80°C. L’RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen) come di seguito riportato: i campioni di tessuto tumorale sono stati polverizzati con pestello in azoto liquido e risospesi in 1 ml di TRIzol per 5 minuti (min) a temperatura ambiente (Room Temperature, RT) per consentire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici. In seguito all’aggiunta di 200 μl di cloroformio, i campioni sono stati vortexati, incubati 2-3 min a RT e centrifugati per 15 min a 14000 rpm a 4°C. La fase acquosa trasparente è stata recuperata e sono stati aggiunti 500 μl di isopropanolo in modo da far precipitare l’RNA. I campioni sono stati incubati 10 min a RT e centrifugati per 10 min a 14000 rpm a 4°C.

Il supernatante è stato completamente eliminato ed il pellet lavato con 1 ml di etanolo al 75% freddo e centrifugato per 5 min a 14000 rpm a 4°C. Il pellet è stato essiccato all’aria ed infine risospeso in un opportuno volume di acqua bidistillata, RNase free.

Per valutare la concentrazione e la purezza degli RNA, 1 µl di ciascun campione è stato letto al Nanodrop (Thermo Scientific).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un agente polinucleotidico a doppio filamento per l’inibizione dell’RNA circolare circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 comprendente: i. un filamento antisenso di sequenza complementare ad almeno 16 nucleotidi del trascritto di sequenza SEQ ID NO:1; e ii. una sequenza senso complementare alla sequenza antisenso.
2. Un agente polinucleotidico a doppio filamento per l’inibizione dell’RNA circolare circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 comprendente: i. un filamento antisenso di sequenza complementare ad almeno 16 nucleotidi della sequenza gucaagucugaaaagcaaugauguugucca SEQ ID NO:17; e ii. una sequenza senso complementare alla sequenza antisenso.
3. Agente polinucleotidico secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il filamento antisenso ha una lunghezza compresa tra 16 e 28, preferibilmente tra 18 e 24, ancora più preferibilmente di 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 nucleotidi.
4. Agente polinucleotidico secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui i nucleotidi di detto agente sono modificati chimicamente, preferibilmente con fosfotiorato o mediante metilazione.
5. Un agente polinucleotidico a singolo filamento per l’inibizione dell’RNA circolare circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 comprendente un filamento antisenso di sequenza complementare ad almeno 10 nucleotidi della sequenza SEQ ID NO:1.
6. Un agente polinucleotidico a singolo filamento per l’inibizione dell’RNA circolare circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 comprendente un filamento antisenso di sequenza complementare ad almeno 10 nucleotidi della sequenza gucaagucugaaaagcaaugauguugucca SEQ ID NO:17.
7. Agente polinucleotidico secondo le rivendicazioni 5 o 6 in cui il filamento antisenso ha una lunghezza compresa tra 10 e 30 preferibilmente tra 16 e 20 ancora più preferibilmente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleotidi.
8. Agente polinucleotidico secondo le rivendicazioni 5, 6 o 7 in cui i nucleotidi di detto agente sono modificati chimicamente, preferibilmente 2-OMe, fosforotioato, fosforoamidato, morfolino, LNA.
9. Agente polinucleotidico secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti incluso in sistemi di delivery, preferibilmente vettori di espressione, liposomi, nanoparticelle o microparticelle.
10. Agente polinucleotidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l’uso in campo medico e veterinario.
11. Agente polinucleotidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l’uso nel trattamento dei tumori.
12. Agente secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l’uso nel trattamento dei tumori dei tessuti molli.
13. Agente secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l’uso nel trattamento del rabdomiosarcoma.
14. Agente secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l’uso nel trattamento di soggetti con livelli alterati del trascritto di SEQ ID NO:1.
15. Composizione farmaceutica comprendente almeno un agente polinucleotidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9.
16. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 15 ulteriormente comprendente almeno uno fra eccipienti farmaceuticamente accettabili, carrier farmaceuticamente accettabili, sali, agenti stabilizzanti, agenti chelanti, inibitori delle RNAsi e relative miscele.
17. Composizione secondo le rivendicazioni 15 o 16 ulteriormente comprendente almeno un agente terapeutico scelto nel gruppo costituito da chemioterapici, cortisonici, fattori di crescita, agenti polinucleotidici, agenti antiemetici e agenti antinausea, e relative miscele.
18. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 17 inclusa in sistemi di delivery, vettori di espressione, liposomi, nanoparticelle o microparticelle.
19. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 18 in forma liquida, solida o semi solida, cristallina o parzialmente cristallina.
20. Composizione secondo una delle rivendicazioni da 15 a 19 per l’uso in campo medico e veterinario.
21. Composizione secondo una delle rivendicazioni da 15 a 20 per l’uso nel trattamento dei tumori.
22. Composizione secondo una delle rivendicazioni da 15 a 21 per l’uso nel trattamento dei tumori dei tessuti molli.
23. Composizione secondo una delle rivendicazioni da 15 a 22 per l’uso nel trattamento del rabdomiosarcoma.
24. Composizione secondo una delle rivendicazioni da 15 a 23 per l’uso nel trattamento di soggetti con livelli alterati del trascritto di SEQ ID NO:1.
25. Un metodo per la diagnosi in vitro di una malattia tumorale che comprende i seguenti step fondamentali: a) analizzare i livelli del trascritto circolare circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 in un campione biologico isolato dal soggetto in esame; b) comparare i livelli misurati al punto a) con livelli di circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 riscontrati in campioni isolati da uno o più individui sani in cui la presenza di livelli aumentati di circ-ZNF-RMS nel campione isolato dal soggetto in esame rispetto ai livelli misurati in campioni isolati da individui sani indicano la presenza di malattia tumorale.
26. Metodo secondo la rivendicazione 25 in cui la presenza di livelli aumentati nel campione isolato dal soggetto in esame rispetto ai livelli misurati in campioni derivati da individui sani indicano la presenza di un tumore dei tessuti molli.
27. Metodo secondo la rivendicazione 25 o 26 in cui la presenza di livelli aumentati nel campione isolato dal soggetto in esame rispetto ai livelli misurati in campioni derivati da individui sani indicano la presenza di rabdomiosarcoma.
28. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 25 a 27 in cui il campione isolato è scelto nel gruppo che comprende tessuti, biopsie, linfonodi, urine, eiaculato, sangue, siero, plasma, cellule circolanti in sangue e linfonodi, metastasi.
29. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 25 a 28 in cui la misurazione dei livelli del trascritto circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1 viene effettuata con una tecnica scelta nel gruppo costituito da RT-PCR, PCR qRT-PCR, Northern blot o ibridazione su tessuti preferibilmente con sonde marcate con biotina o digossigenina o fluorescenti o radioattive.
30. Un kit per la diagnosi di malattia tumorale in vitro, comprendente: almeno un primer o sonda per la quantificazione del trascritto circ-ZNF-RMS di sequenza SEQ ID NO:1; reagenti e enzimi per l’estrazione di acidi nucleici, in quantità predefinite, predosati o predosabili, da soli o miscelati tra loro; reagenti e enzimi per l’amplificazione e la quantificazione e/o per il rilevamento degli acidi nucleici in quantità predefinite, predosati o predosabili, da soli o miscelati tra loro; istruzioni per l’uso.