IT201600115242A1 - Dispositivo medicale per la valutazione quali-quantitativa del latte materno durante l’allattamento - Google Patents

Description

Titolo: Dispositivo medicale per la valutazione quali-quantitativa del latte materno durante l’allattamento

Campo di applicazione: In accordo con l’Organizzazione Mondiale della Sanità (www.who.int) l’allattamento al seno è il modo più naturale e salutare per fornire ai neonati tutti i nutrienti necessari per la crescita e garantire loro un corretto sviluppo fisiologico. In generale tutte le mamme sono in grado di allattare al seno, a patto che esse ricevano un’accurata informazione, un supporto familiare ed un sistema sanitario adeguato. Il primo punto evidenziato da WHO riguarda appunto l'importanza di una corretta informazione riguardante l'allattamento e la nutrizione dei neonati. È’ del tutto naturale che le mamme siano ansiose per ciò che riguarda la crescita del proprio figlio, pertanto è necessario che esse vengano rassicurate e preparate ad affrontare il delicato periodo dell'allattamento. Il punto fondamentale di questo processo è la certezza che il proprio latte sia in quantità sufficiente ed adeguato per la crescita del neonato. In questo contesto è necessario fornire alle madri un metodo di valutazione semplice e valido per controllare, quotidianamente la qualità e la quantità del loro latte. Si è pensato quindi allo sviluppo di un dispositivo medicale in grado di monitorare alcuni parametri biologici presenti nel latte materno, per migliorare l’integrazione della poppata mancante e il benessere psicofisico della mamma.

Oggetto dell’invenzione: Scopo della presente invenzione è la realizzazione di un dispositivo medicale semplice ed agevole adatto alla determinazione qualiquantitativa quotidiana del latte materno.

Stato dell’arte: Attualmente, meno del 40% dei neonati sono allattati con latte materno, WHO persegue l'obiettivo di raggiungere almeno il 50% dei neonati allattati al seno entro il 2025 dichiarando: “Se tutti i neonati fossero allattati al seno entro la prima ora di vita e tale allattamento continuasse fino ai 2 anni, circa 800.000 neonati sarebbero salvati ogni anno”. È’ ormai acclarato come l’allattamento al seno contribuisca ad una migliore conformazione della bocca, proteggendo il nascituro contro le infezioni respiratorie e l’asma, le otiti, la diarrea, riducendo inoltre il rischio sviluppare in età adulta diabete e sindrome metabolica. A fronte di tutti questi vantaggi, spesso la mamma decide di non allattare al seno per una comprensibile paura di inadeguatezza del proprio latte alle esigenze nutrizionali del neonato. Allo stato attuale non esistono metodi rapidi e semplici di utilizzo quotidiano per la verifica quali-quantitative del latte materno. L’unico metodo empirico è quello di valutare giorno per giorno il peso corporeo del neonato e la sua crescita ponderale. Tali metodi non sono in grado di assicurare una verifica della corretta alimentazione del neonato se non a tempi lunghi con il reale pericolo che una sotto-nutrizione possa indurre carenze nutrizionali che possono sfociare in danni fisici permanenti. L’alternativa potrebbe essere la spremitura del latte dal seno con manipolazioni o l’ausilio di tiralatte manuale od elettrico, la sua quantificazione ponderale e la somministrazione con un biberon. Tale procedura, anche se fattibile, è del tutto inapplicabile in condizioni di normalità ed esplicabile solo in situazioni particolari ed eccezionali. Inoltre la pratica tiralatte, bypassa la suzione del nascituro al seno materno, questo comporta una diminuzione fisiologica della produzione di latte. Lo scopo della presente invenzione è quello di fornire un dispositivo di utilizzo semplice ed immediato che permetta alle madri di valutare quotidianamente il valore qualiquantitativo del loro latte minimizzando l’ansia e la preoccupazione delle neomamme riguardo alla corretta alimentazione del neonato e favorendo la pratica dell’allattamento naturale.

Definizioni: qui di seguito sono elencate le definizioni dei principali termini utilizzati nella presente invenzione:

1) Fosfo-Perilipina, PhosphoPerilipin (p-LAP), appartiene ad una classe di proteine identificate nelle specie eucariote di vertebrati, insetti e amebe. La composizione e la struttura sono filogeneticamente altamente conservate ed hanno un’alta distribuzioni per i tessuti contenenti i lipidi neutri (adipociti) (AR Kimmel et al. J Lipid Res. 2010 Mar; 51(3): 468-71), incluso il latte umano. Con il termine generale Perilipina, Perilipin nella presente invenzione vengono identificati tutti i componenti della famiglia ed in particolare: perilipin 1 identificato da National Center for Biotechnology Information (NCBI) con Enterez GeneID: 5346; perilipin 2 Enterez GeneID: 123; perilipin 3 Enterez GeneID: 10226; perilipin 4 Enterez GeneID: 729359; perilipin 5 Enterez GeneID: 440503. Con il termine Fosfo-Perilipina, PhosphoPerilipin (p-LAP) si intendono tutti i componenti sopra descritti sottoposti a fosforilazione, ovvero ad aggiunta di ioni fosfato (PO4<3->) alla catena proteica.

2) Sandwich Immunoassay: tecnica biochimica, in cui la proteina (biomarker) si trova in soluzione (esempio urine e sangue) nel nostro caso il latte materno ed è possibile rilevarla tramite l’uso di anticorpo specifico (o suo aptamero) adeso ad una matrice. La visualizzazione avviene grazie allo spostamento per capillarità delle gold particle.

3) Western Blot: tecnica biochimica, in cui la proteina (biomarker) da determinare è fissata su una matrice rilevandola con uno specifico anticorpo quando questa è quantitativamente troppo bassa per essere visualizzata con altre tecniche. La visualizzazione avviene su lastra fotografica.

4) Analisi densitometrica: derivata dal western blot e prevede l’utilizzo di software dedicati per analizzare il numero di pixel della banda.

5) microRNA: biomolecole specifiche la cui espressione (profilo) descrivono una condizione fisiologica (come nel nostro caso) o patologica. A questa classe appartengono: miR21 noto anche come hsa-mir-21 o miRNA21, miR146a (MIR146), miR155 (MIR155) e miR16 noto anche come hsa-miR-16-5p.

6) Aptamero: molecole sintetiche stabili di RNA o DNA che hanno specificità e selettività per il biomarcatore da individuare.

Descrizione: I nostri studi condotti su latte materno hanno dimostrato la stretta correlazione tra uno specifico biomarker e la composizione quali-quantitativa del latte materno. In particolare la presenza di p-LAP è inversamente proporzionale alla quantità di latte generato durante il ritmo circadiano. La proteina p-LAP è fortemente associata ai siti citoplasmatici dei depositi lipidici negli adipociti. In condizioni basali p-LAP è capace di inibire la lipolisi. La fosforilazione di LAP mediata dal c-AMP risulta nell’inibizione delle lipasi e della liberazione di acidi grassi (PM McDonough et al. PLoS One. 2013; 8(2): e55511). Come riportato in Esempio 1, i nostri studi hanno dimostrato una stretta correlazione tra la quantità di p-LAP determinata nel latte materno e la quantità della stessa prodotta durante il ritmo circadiano. Come evidenziato in Figura 1 l’analisi western blot delle proteine del latte prelevato a differenti orari giornalieri indica la presenza di p-LAP nel periodo 2 (ore 17.00) mentre negli altri periodi 1 e 3 (ore 8.00 e 22.00 rispettivamente) p-LAP non è stata evidenziata. Analogamente l’analisi densitometrica di p-LAP ha confermato la presenza significativamente più elevata nel periodo 2 in confronto con i periodi 1 e 3 (Figura 2). A questa elevata presenza di p-LAP (periodo 2) corrisponde una quantità di latte materno significativamente più bassa rispetto ai periodi 1 e 3 (Figura 3). Questi risultati indicano come il dosaggio di p-LAP nel latte materno sia un biomarker unico ed affidabile per prevedere la quantità del latte materno. La quantificazione del biomarker p-LAP può essere eseguita utilizzando metodiche differenti. Una delle metodiche più vantaggiose è l’uso di un immunodosaggio, comunemente conosciuto dalla comunità scientifica come sandwich immunoassay, di serina 497 p-LAP. Esempio 2 esemplifica in breve il metodo sopra descritto. La metodologia descritta in esempio 2 può essere agevolmente trasferita in un dispositivo che possa permettere la sua industrializzazione. Esempio 2 riporta in breve le caratteristiche salienti di un dispositivo idoneo alla misura di p-LAP e/o suoi metaboliti o derivati idonei allo scopo della presente invenzione. In particolare l’uso di membrane di nitrocellulosa o di polivinilidene fluoruro (PVDF) come materiale di supporto per il dosaggio immunologico è particolarmente preferito nella presente invenzione in quanto tale materiale possiede caratteristiche di assorbimento e di lavaggio che raggiungono un ottimo compromesso tra le esigenze tecniche specifiche richieste ed il costo e reperibilità sul mercato.

Metodi di quantificazione di p-LAP e/o suoi isomeri o derivati chimicamente e/o biologicamente ugualmente utilizzabili e rivendicati dalla presente invenzione sono altresì: serina 522 p-LAP. L’uso di aptameri specifici è inoltre rivendicato nella presente invenzione.

Analogamente dispositivi di qualsiasi dimensione e configurazione adatti ad un uso quotidiano in ambiente domestico e/o professionale come studi medici, ospedali e case di cura, ambulatori, centri analisi e di ricerca, ecc. possono essere opportunamente realizzati e rientrano nelle rivendicazioni della presente invenzione. In esempio 3 viene riportato in modo schematico un dispositivo medico in vitro utilizzabile per il dosaggio di p-LAP.

Se desiderato è altresì rivendicato nella presente invenzione anche l’uso combinato con metodiche adatte alla determinazione immediata di componenti del latte materno quali ad esempio: microRNAs, caseina e proteine del siero, per determinare rispettivamente, la capacità immuno modulante ed il valore nutritivo del latte materno analizzato.

ESEMPIO 1- Il biomarker p-LAP è stato identificato nel latte materno ottenuto da 35 donne in allattamento al seno. Come dimostrato dalla Figura 2 l’analisi western blot eseguita utilizzando la metodologia qui di seguito descritta (in breve: è un metodo che permette il trasferimento delle proteine da un gel di poliacrilammide ad una membrana di nitrocellulosa per poter effettuare un’analisi dettagliata di una singola proteina. La tecnica prevede l’utilizzo di anticorpi primari diretti contro la proteina di interesse e di anticorpi secondari capaci di riconoscere la porzione costante della molecola di IgG utilizzata come anticorpo primario. L’anticorpo secondario è opportunamente marcato con un enzima per poter essere riconosciuto una volta legato all’anticorpo primario), ha evidenziato la presenza di quantità apprezzabili di p-LAP nel latte materno in esatta corrispondenza di quantità minime di latte materno come evidenziato nella Figura 4. Analogamente l’utilizzo della metodica densitometrica per evidenziare le proteine del biomarker mostra la medesima correlazione negativa già riscontrata con l’analisi western blot tra p-LAP e quantità di latte materno.

E’ altresì rivendicato l’utilizzo dei microRNA quali miR21, miR146a, miR155, miR16 che hanno proprietà immuno modulanti e permettono inoltre la valutazione qualitativa, sotto il profilo immunologico del latte materno. Questi microRNA saranno visualizzati con oligonucleotidi sintetici fosforescenti.

ESEMPIO 2 – Il dispositivo può essere costituito da una striscia di supporto per il dosaggio immunologico; di norma la predetta striscia di supporto è ricoperta con anticorpi idonei allo scopo attraverso un sistema di assorbimento chimico-fisico ottenuto attraverso ad esempio: legami ionici, forze di van der Waals, legami elettrostatici e qualsiasi altro mezzo chimico-fisico idoneo allo scopo. Particelle di oro colloidale sono rivestite con anticorpi specifici. Il complesso oro-anticorpi immobilizzati sono in grado di reagire con il biomarker, quale ad esempio p-LAP, ed attraverso una serie di step nelle differenti zone, di norma 3, della striscia di supporto determinano una variazione di colore. In particolare quando una piccola dose di latte materno viene aggiunta alla striscia di supporto, si verifica una dissoluzione delle particelle di oro. Se il campione di latte contiene sufficienti quantità di proteina p-LAP, questa viene riconosciuta dallo specifico anticorpo, trasporta per capillarità e liberando in modo del tutto proporzionale quantità equivalenti di particelle di oro che a loro volta determinano delle variazioni colorimetriche facilmente osservabili e pertanto in grado di determinare l’efficacia del test. Quantità di oro colloidale non legato agli anticorpi specifici viene utilizzato come controllo positivo del test.

ESEMPIO 3 – In Figura 4 viene riportato un esempio di dispositivo adatto al dosaggio quali-quantitativo del latte materno. Il dispositivo può essere costituito da un semplice stick, costituito da un supporto solido di microcellulosa adsorbente l’anticorpo anti-p-LAP con un peso molecolare intorno a 55kDa e comunque compreso tra 35kDa e 75kDa. La microcellulosa o altro agente idoneo può avere una porosità compresa tra 0.25 e 0.95 nm, in particolare 0.45 nm. Particelle colloidali di oro aventi dimensioni comprese tra 0.3 e 0.9 nm, in particolare di 0.60 nm, sono addizionate allo stick. Le zone dello stick T e C come da Figura 4 rappresentano la zona di reazione tra anticorpo p-LAP e la proteina e l’eccesso di particelle di oro non reagite.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1) Metodi per la determinazione quali-quantitativa del latte materno utilizzando il dosaggio di Fosfo-Perilipina (p-LAP) come biomarker 2) Metodi come da rivendicazione 1 dove Fosfo-Perilina (p-LAP) sono le proteine fosforilate appartenenti alla classe di proteine identificate da National Center for Biotechnology Information (NCBI) con Enterez GeneID: 5346 perilipin 1; 123 perilipin 2; 10226 perilipin 3; 729359 perilipin 4; 440503 perilipin 5. 3) Metodi come da rivendicazioni precedenti dove il dosaggio quantitativo di Fosfo-Perilipina (p-LAP) e/o suoi isomeri o derivati chimici e/o biologici, sono immuno-dosaggio di serina 522 p-LAP, serina 497 p-LAP. 4) Metodi come da rivendicazioni precedenti abbinati all’utilizzo dei microRNA quali: miR16, miR21, miR146a, miR155. 5) Metodi come da rivendicazioni precedenti abbinati al dosaggio di caseina, proteine del siero del latte. 6) Metodi come da rivendicazioni precedenti utilizzando un dispositivo costituito da una striscia di supporto per il dosaggio immunologico, ricoperta con anticorpi e/o aptameri idonei allo scopo e associati a particelle di oro colloidale in grado di reagire con i biomarker. 7) Metodi come da rivendicazioni precedenti dove i biomarker sono Fosfo-Perilipina (p-LAP); microRNA; caseina, proteine del siero del latte. 8) Metodi come da rivendicazioni precedenti dove il dispositivo comprende: una striscia di supporto plastico (stick), un supporto di nitrocellulosa adsorbente un anticorpo anti-Fosfo-Perilipina (p-LAP), nitrocellulosa o altro agente idoneo, particelle colloidali di oro. 9) Dispositivo come da rivendicazioni precedenti dove: anticorpo anti-Fosfo-Perilipina (p-LAP) aventi un peso molecolare compreso tra 35kDa e 75kDa e preferibilmente 55kDa, nitrocellulosa o altro agente idoneo aventi porosità compresa tra 0.25 e 0.95 nm, e preferibilmente 0.45 nm, particelle colloidali di oro aventi dimensioni medie comprese tra 0.3 e 0.9 nm, e preferibilmente 0.6 nm. 10)Metodi come da rivendicazioni precedenti dove il dispositivo comprende: una striscia di supporto plastico (stick), un supporto di nitrocellulosa adsorbente un aptamero anti-Fosfo-Perilipina (p-LAP), nitrocellulosa o altro agente idoneo, particelle colloidali di oro.