HUT76099A

HUT76099A - Compositions and treatment for multiple sclerosis

Info

Publication number: HUT76099A
Application number: HU9603116A
Authority: HU
Inventors: Di-Hwei Hsu; Jia Dong Shi; Dawn Smilek
Original assignee: Immulogic Pharma Corp
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1995-05-04
Publication date: 1997-06-30
Also published as: CZ329596A3; EP0758902A1; PL317197A1; JPH10500109A; HU9603116D0; AU2470595A; SK145896A3; IL113661A0; WO1995030435A3; WO1995030435A2; SI9520059A; CA2189990A1

Description

Az autoimmun betegségek komoly egészségügyi problémát jelentenek az emberiség számára, ráadásul viszonylag kevéssé értjük őket. Mivel jelenleg nem ismerünk közvetlenül felelős mikrobiális vagy virális okozót, ezért ezeknek a betegségeknek a megelőzése, kezelése és diagnosztizálása a betegség kóroktanán kell hogy alapuljon. Ez mindig magában foglalja endogén metabolikus intermedierek, szerkezeti komponensek, sejtek, stb. komplex sorozatát. Az autoimmun állapot természetéből következik azonban, hogy legalább egy autoantigénnek szerepet kell játszania az eseménysorozat létrejöttében, aminek az eredménye a tünetek. Az autoimmun demielinező betegségek, mint például a szklerózis multiplex, sem kivételek ez alól.

A humán szklerózis multiplexnek egy általánosan használt állatmodellje a kísérleti allergiás enkefalomielítisz, a központi idegrendszer egy demielinező megbetegedése, ami érzékeny egértörzsekben indukálható a mielin bázikus fehérjével (MBP) vagy immundomináns T-sejt determinánsával (azaz a T-sejt epitopokkal). Az MBP az egyik feltételezett autoantigén a szklerózis multiplexben (MS), és epitopjait feltérképezték mind emberi [Óta és mtsai: Natúré 346, 183-187 (1990)], mind rágcsáló [Zamvil és mtsai: Natúré 324, 258-260 (1986)] rendszerekben. Óta és munkatársai azonosítottak egy, a szklerózis multiplex betegek által felismert fő T-sejt epitopot, a 84-102-es MBP aminosav csoportokat [Óta és mtsai: Natúré 346, 183-187 (1990)]. Leírtak szklerózis multiplex betegek T-sejtjei által felismert minor epitopokat is (143-168, 61-82, 124-142 és 31-50 MBP aminosav csoportok). Zamvil és munkatársai kimutatták, hogy az 1-11 MBP aminosav csoport tartalmazza az EAE-t okozó fő T-sejt epitopo(ka)t, érzékeny rágcsálótörzsekben.

Az elmúlt évtizedben nyilvánvalóvá vált, hogy a természetes fehérje antigéneknek megfelelő fő T-sejt epitopokat arra lehet használni, hogy T-sejt válaszképtelenséget indukáljanak saját maguk, vagy a természetes fehérje antigén ellen. Gaur és munkatársainak vizsgálata igazolta, hogy az MBP T-sejt epitopjai csökkent T-sejt válaszképességet indukálnak MBP ellen felnőtt egerekben [Gaur és mtsai: Science 258, 1491-1494]. Ezekben a vizsgálatokban az MBP fő immundomináns determinánsai (Ac 1-11 és 35-47) szintetikus peptidekkel, vagy a teljes MBP fehérjével szembeni toleranciát, a peptid vagy a fehérje emulzióját egy nem-immunogén formában (inkomplett Freund féle adjuváns) alkalmazva váltják ki, amint azt korábban leírták az egyéb fehérjékkel vagy proteinekkel való tolerancia indukcióval kapcsolatban [F. Ria és mtsai: Natúré 343, 381 (1990)]. A T-sejtnek ez a redukált válaszképessége, amit MBP T-sejt epitopok beadásával indukáltunk, képes volt megakadályozni az MBP-vel indukált EAE-t. Ezek a vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy az Ac 1-11, a két epitop közül a dominánsabb, csak körülbelül 50 százalékos csökkenést okozott a beadást követő, MBP-elleni T-sejt válaszban, és a kevésbé immunogén 35-47-es peptid csak körülbelül 20 százalékos csökkenést okozott a beadást követő, MBP elleni válaszban. A két peptid keveréke együtt azonban nagyobb csökkenést okozott a beadást követő, MBP elleni T-sejt válaszban.

A szklerózis multiplex kezelésének egy teljesen eltérő megközelítési módja szerint a klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy az interferonok ígéretesek lehetnek a szklerózis multiplex kezelésében. Kimutatták, hogy a γ-interferon beadása elősegíti a szklerózis multiplex súlyosbodását, míg a rekombináns β-interferonról kontrollált klinikai vizsgálatokban kiderült, hogy elnyomja a betegséget [Hillel és Bever: J. Neuroimmunology 46, 155-164 (1993)]. Annak ellenére azonban, hogy a β-interferon beadása a szklerózis • · · multiplextől szenvedő betegeknek bizonyítottan csökkenti a szklerózis multiplex rohamok gyakoriságát és súlyosságát, a β-interferon nem az a régen várt gyógyszere a szklerózis multiplexnek, amiben a gyógyítók közössége reménykedett [Amason: Neurology 43, 641-643 (1993)]. Az Amason által ismertetett klinikai vizsgálatban majdnem mindegyik β-interferonnal kezelt betegnek voltak végül rohamai, és négy közül egynek romlott az állapota.

A jelen találmány tárgyát képezik a szklerózis multiplex kezelésére használható készítmények és módszerek. A találmány szerinti készítmények tartalmazzák a mielin bázikus fehérjének (MBP) legalább egy peptidjét vagy módosított peptidjét, amely legalább egy T-sejt epitopot tartalmaz, valamint β-interferont, alkalmas, gyógyászatilag elfogadható közegben, orális, szubkután vagy intravénás beadáshoz. A találmány szerinti módszerek közé tartozik azoknak a betegeknek a kezelése, akiknek vagy van szklerózis multiplex betegségük, vagy feltételezik róluk, hogy érzékenyek a szklerózis multiplexre, a találmány szerinti készítmény gyógyászatilag hatásos mennyiségének beadásával, vagy egy terápiás mód szerinti beadásával, egy olyan készítményt alkalmazva, amely az MBP-nek legalább egy peptidjét vagy módosított peptidjét tartalmazza, amely legalább egy T-sejt epitopot hordoz, és tovább adagolva a β-interferont.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrák leírását.

Az 1a. ábra egy kísérlet grafikus formában való ismertetése, amelyben a β-interferon hatásai láthatók az EAE-re egerekben két, 10 (SJL x TLP) F₁nőstény egérből álló csoportban, amelyekben EAE-t indukáltunk tengerimalac MBP-vel komplett adjuvánsban (plusz szamárköhögés toxint alkalmazva) a 0. napon és vagy csak Freund féle inkomplett adjuvánst adtunk be nekik (kont5 roll) vagy 2000 egység β-interferonnal kezeltük őket interperitoneálisan a 9., 12., 16. és 20. napon (az x-tengelyen nyilakkal jelezzük), az y-tengely pedig az átlagos klinikai értékszámot (MCS) mutatja az egyes csoportoknál, ahol 0 jelentése az, hogy nincsenek EAE tünetek, 1 jelentése puha erőtlen, nem reagáló farok, 2 jelentése a hátsó végtag részleges bénulása, 3 jelentése teljes hátsó végtag bénulás, 4 jelentése az első végtagok teljes vagy részleges bénulása, 5 jelentése haldoklás.

Az 1 b. ábra egy kísérlet grafikus formában való ismertetése, amelyben az MBP Ac 1-11 peptid hatásai láthatók az EAE-re egerekben két, 10 (SJL x x TLP) F·, nőstény egérből álló csoportban, amelyekben EAE-t indukáltunk tengerimalac MBP-vel komplett adjuvánsban (plusz szamárköhögés toxint alkalmazva) a 0. napon és vagy csak PBS-t adtunk be nekik (kontroll) vagy 250 nmol Ac 1-11-gyei kezeltük őket intravénásán a 10., 13., 17. és 21. napon (az x-tengelyen nyilakkal jelezzük), az y-tengely pedig az átlagos klinikai értékszámot (MCS) mutatja az egyes csoportoknál, az 1a. ábránál ismertetett módon.

Az 1c. ábra egy kísérlet grafikus formában való ismertetése, amelyben az MBP Ac 1-11 peptid β-interferonnal kombinált beadásának hatásai láthatók az EAE-re egerekben két, 10 (SJL x TLP) F-, nőstény egérből álló csoportban, amelyekben EAE-t indukáltunk tengerimalac MBP-vel komplett adjuvánsban (plusz szamárköhögés toxint alkalmazva) a 0. napon és vagy csak PBS-t adtunk be nekik (kontroll) vagy 250 nmol Ac 1-11-gyei kezeltük őket intravénásán a 10., 13., 17. és 21. napon (az x-tengelyen nyilakkal jelezzük), vagy 2000 egység β-interferonnal kezeltük őket interperitoneálisan a 9., 12., 16. és 20. napon (az x-tengelyen fekete nyilakkal jelezzük),az y6

-tengely pedig az átlagos klinikai értékszámot (MCS) mutatja az egyes csoportoknál, az 1a. ábránál ismertetett módon.

A 2. ábra egy kísérlet grafikus formában való ismertetése, amelyben a különböző dózisokban (10000 egység és 2000 egység) beadott β-interferon hatásai láthatók az EAE-re egerekben két, 10 (SJL x TLP) F-, nőstény egérből álló csoportban, amelyekben EAE-t indukáltunk tengerimalac MBP-vel komplett adjuvánsban (plusz szamárköhögés toxint alkalmazva) a 0. napon és vagy csak PBS-t adtunk be nekik (kontroll) vagy 10000 illetve 2000 egység β-interferonnal kezeltük őket interperitoneálisan a 9., 12., 16. és 20. napon (az x-tengelyen nyilakkal jelezzük), az y-tengely pedig az átlagos klinikai értékszámot (MCS) mutatja az egyes csoportoknál, az 1a. ábrán ismertetett módon.

A 3. ábrán a humán MBP teljes aminosav szekvenciája látható.

A 4. ábrán a jelen találmány gyakorlati végrehajtásában jól alkalmazható MBP peptidek aminosav szekvenciái láthatók.

A jelen találmány tárgyát képezik a szklerózis multiplex kezelésére alkalmas eljárások, amik abban állnak, hogy az MBP legalább egy antigén peptidjének egy terápiásán hatásos mennyiségét adjuk be egy olyan kezelési módban, ami magában foglalja a β-interferon egy terápiásán hatásos mennyiségének beadását is. A továbbiakban a “peptid” szakkifejezés jelentése egy olyan aminosav szekvencia, amely kevesebb aminosavat tartalmaz mint az a peptid, amelyből a peptid származik. Az “antigén peptid szakkifejezés jelentése a továbbiakban bármely olyan peptid, amely legalább egy T-sejt epitopot tartalmaz, vagy egy ilyen pepiidnek bármelyik része, amely még legalább egy T-sejt epitopot tartalmaz.

Ha epitopról beszélünk, akkor ez alatt azt értjük, hogy ez az alapeleme, vagy legkisebb egysége egy receptornak, főleg az immunglobulinoknak, hisztokompatibilitási antigéneknek és T-sejt receptoroknak, aholis az epitop a természetes fehérjének azaz az antigénnek azokat az aminosavait tartalmazza, amelyek lényegesek a receptor-felismeréshez. A T-sejt epitopokról az a vélemény alakult ki, hogy az autoimmun válaszok iniciálásában és fenntartásában játszanak szerepet. Ezekről a T-sejt epitopokról azt gondolják, hogy korai eseményeket indítanak be a T-sejt segítő sejtben, azáltal, hogy egy megfelelő HLA molekula mutatja be őket egy antigén bemutató sejt felszínén, ezzel serkentve az epitopnak megfelelő T-sejt receptorral rendelkező T-sejt alpopulációkat. Ezek az események a T-sejtek szaporodását, a limfokinek szekrécióját, a lokális autoimmun reakciókat, további immunsejteknek az antigén/T-sejt kölcsönhatás helyére való toborzását és a B-sejt kaszkád aktiválását eredményezik, aminek az ellenanyagok termelődése a következménye.

Ha egy szervezetet egy olyan peptiddel vagy fehérjével hozunk érintkezésbe, amely az autoantigénnek legalább egy T-sejt epitopját tartalmazza, akkor ez úgy módosíthatja a T-sejtek szubpopulációit, hogy azok nem lesznek képesek reagálni az autoantigénre, és nem vesznek részt az immunválasz serkentésében. Emellett egy olyan fehérjének vagy pepiidnek a beadása, amely legalább egy T-sejt epitopot tartalmaz, módosíthatja a limfokin szekréciós profilt, ahhoz hasonlítva, ha a természetes autoantigénnel hozzuk érintkezésbe a szervezetet (azaz például az interleukin-4 csökkenése és/vagy az interleukin-2 növekedése, ami a TH1 és TH2 populációk módosítását okozza). Továbbá egy ilyen peptiddel való érintkeztetés befolyásolhatja a T-sejt szubpopulációkat, amelyek normális körülmények között • « s

részt vesznek az autoantigénre adott válaszban, úgy, hogy ezek a T-sejtek elvonódnak az autoantigénnel való normális érintkezés helyétől (azaz például a központi idegrendszer (CNS) szöveteiből), az ebből származó peptiddel való terápiás kezelés helyére. A T-sejt szubpopulációknak ez az újra eloszlása csökkenti az egyed immunrendszerének azt a képességét, hogy serkentse a szokásos immunválaszt az autoantigénnel való normális érintkezés helyén, aminek eredménye a tünetek csökkenése.

Bármelyik MBP-ből származó peptid, amely befolyásolja az egyednek az MBP autoantigénre adott válaszát, a találmány szerinti módszerek és készítmények közé tartozik. Ezeket a peptideket például úgy lehet azonosítani, hogy megvizsgáljuk a szerkezetüket, és kiválasztjuk a megfelelő régiókat, amelyeket peptidek formájában előállítunk (rekombináns expreszsziós rendszerekben, szintetikusan vagy másképpen), hogy megvizsgáljuk azt a képességüket, tudják-e befolyásolni a T-sejtek válaszát az MBP-re, majd kiválasztjuk azokat a peptideket, amelyek az ezek a sejtek által felismert epitopokat tartalmazzák. Számos olyan humán MBP pepiidet leírtak a szakirodalomban, amelyek T-sejt epitopokat tartalmaznak.

A jelen találmány megvalósítása során jól használhatók a módosított antigén peptidek. Például egy peptid úgy módosítható, hogy megtartja azt a képességét, hogy T-sejt anergiát képes indukálni és az MHC fehérjéhez kötődni, anélkül, hogy képes lenne egy erős szaporodási választ indukálni, vagy esetleg bármely szaporodási választ, ha immunogén formában adjuk be. Ebben az esetben a T-sejt receptorhoz való kötődés kritikus kötési csoportjait meg lehet határozni, ismert technikák alkalmazásával (azaz az egyes csoportok helyettesítésével, és a T-sejt reaktivitás meglétének vagy hiányának meghatározásával). Emellett azok az aminosavak, amelyek nem lényegesek a T-sejt receptorral való kölcsönhatáshoz, módosíthatók, egy másik aminosawal való helyettesítés útján, amelynek a beépítése fokozhatja, csökkentheti vagy eliminálhatja, vagy éppen egyáltalán nem érinti a T-sejt reaktivitását. Emellett azok az aminosavak, amelyek nem lényegesek a T-sejt receptorral való kölcsönhatáshoz, módosíthatók, egy másik aminosawal való helyettesítés útján, amelynek a beépítése fokozhatja, csökkentheti, vagy éppen egyáltalán nem érinti a T-sejt reaktivitását, de nem eliminálja a megfelelő MHC-hez való kapcsolódását.

Emellett a találmány szerinti peptidek módosíthatók, oly módon, hogy egy olyan aminosavai, amely szükséges az MHC fehérjekomplexszel való kölcsönhatáshoz, egy másik, előnyösen hasonló, aminosav csoporttal helyettesítünk (konzervatív helyettesítés), amelynek a jelenlétéről ki lehet mutatni, hogy fokozza, csökkenti, de nem tünteti el vagy módosítja a T-sejt aktivitást. Emellett azok az aminosavak, amelyek nem szükségesek az MHC fehérjekomplexszel való kölcsönhatáshoz, módosíthatók, oly módon, hogy egy másik aminosawal lehet helyettesíteni őket, amelynek a beépítése fokozhatja, esetleg nem érinti, vagy csökkenti, de nem szünteti meg a T-sejt reaktivitást. A nem-esszenciális aminosavak helyettesítésére előnyösen használható aminosavak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alanin, a glutaminsav vagy egy metil-aminosav.

A peptidek módosítására egy másik példa a cisztein csoportok helyettesítése előnyösen szerinnel, treoninnal, leucinnal vagy glutaminsavval, a diszulfid hidakon keresztül történő dimerizáció eliminálása céljából. Emellett a peptidek úgy is módosíthatók, hogy fokozzuk egy peptid oldhatóságát puffereit vizes oldatokban, azaz például gyógyászatilag elfogadható hordozókban vagy higítószerekben való felhasználás céljából, funkciós cső10 portokat adva a pepiidhez, a peptid terminális részéhez, vagy úgy, hogy nem teszünk bele olyan hidrofób T-sejt epitopokat vagy régiókat, amelyek hidrofób epitopokat tartalmaznak a peptidekben, vagy nem tesszük bele a fehérje vagy a peptid hidrofób régióit. Az oldhatóság fokozására például töltéssel rendelkező aminosavakat vagy töltéssel rendelkező aminosav párokat vagy tripletteket adhatunk a peptid C-terminálisához vagy N-terminálisához. A töltéssel rendelkező aminosav lehet például az arginin (R), a lizin (K), a hisztidin (H), a glutaminsav (E) és az aszparaginsav (D).

Továbbá a “kriptikus epitopokat” tartalmazó peptideket is meg lehet határozni, és ezek szintén jól használhatók a találmány szerinti készítményekben és módszerekben. A kriptikus epitopok azok a determinánsok egy fehérje antigénben, amelyek a processzálás és a természetes fehérje antigénnek a megfelelő MHC molekulának való bemutatása következtében normális körülmények között nem válnak láthatóvá az immunrendszer számára. Azonban egy kriptikus epitopot tartalmazó peptid képes elérni azt, hogy a T-sejtek ne legyenek válaszképesek, és ha egy alanyt a pepiiddel oltunk be, akkor az alanyból kapott T-sejtek in vitro szaporodni fognak, arra a pepiidre vagy fehérje antigénre adott válaszként, amelyből a peptid származik. Azokat a peptideket, amelyek legalább egy, egy fehérje antigénből származó kriptikus epitopot tartalmaznak a továbbiakban “kriptikus peptideknek” nevezzük. A kriptikus peptidek jelenlétének megerősítésére egy T-sejt szaporodási vizsgálat használható, amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, amelyben egy antigén által vezérelt T-sejte-ket tenyésztünk in vitro, külön-külön az egyes peptidek jelenlétében, hogy megállapítsuk azt, hogy pepiidre reagáló T-sejt vonalakat hoztunk létre. Egy peptidet akkor tekintünk legalább egy kriptikus epitopot hordozónak, ha lét11 rehozható egy T-sejt vonal egy adott peptiddel, és a T-sejtek képesek szaporodni a peptiddel, és azzal a fehérje antigénnel, amelyből a peptid származik, való ingerlés hatására.

A jelen találmány szerinti készítményekben és módszerekben használható antigén peptidek közé tartoznak az alábbi peptidek vagy azok részei, amelyeknek az aminosav számozása a 3. ábrán bemutatott MBP fehérje aminosavai számozásának felel meg:

a humán MBP 84-106-os aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 84-102-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 89-101-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 140-172-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 143-168-as aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 142-167-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 13-25-ös aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid.

A kiválasztott peptidek szekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be. Ezek közül a peptidek közül bármelyik a leírások szerint módosítható, illetve upstream vagy downstream meghosszabbítható a C-terminálisukról vagy az N-terminálisukról, mindaddig, ameddig megtartják az antigén minőségüket, azaz legalább egy T-sejt epitopot tartalmaznak.

A jelen leírásban ismertetett munka eredményeképpen az a felfedezés született, hogy egy MBP-ből származó antigén peptid és a β-interferon kombinációja, ha egy terápiás tartományban adjuk be őket, akkor szinergisztikus hatással rendelkeznek (1c.), ami meglepő módon sokkal nagyobb mértékben csökkenti az EAE klinikai tüneteit egerekben, mint az egyes komponensek külön-külön való beadásának hatása az EAE tüneteire (1a.-1b. ábrák), és ami nagyobb, mint ami várható lenne a peptid plusz a β-interferon puszta additív hatása alapján.

Mivei az EAE a humán szklerózis multiplex egérmodellje, és MBP-vel indukálható, ezért az várható, hogy hasonló hatások figyelhetők meg emberekben. Ennek következtében a jelen találmány tárgya eljárás egyes egyedek kezelésére, akik szklerózis multiplexben szenvednek, vagy akik a szklerózis multiplex kifejlődése kockázatának vannak kitéve, ami abban áll, hogy egy MBP-ből származó antigén peptid hatékony mennyiségét adjuk be nem-immunogén formában (azaz adjuváns nélkül) egy terápiás tartományban, ami magában foglalja a β-interferon beadását is.

Egy olyan készítménynek a beadását, amely legalább egy antigén MNB pepiidet tartalmaz, egy terápiás tartományban, ami magában foglalja a β-interferon beadását is, ismert eljárások alkalmazásával végezhetjük, olyan dózisokban és időpontokban, amelyek hatékonyan csökkentik, eliminálják vagy megakadályozzák a szklerózis multiplexszel kapcsolatos tüneteket. Mind az antigén pepiidnek, mind a β-interferonnak a hatékony mennyiségei egy terápiás tartományban való együttes beadás esetében számos faktornak megfelelően változnak, azaz ilyen például az adott egyed szklerózis multiplexre való érzékenységének mértéke, kora, neme, testsúlya, valamint az

MBP pepiidnek az a tulajdonsága, hogy mennyire képes antigén választ kiváltani az egyedben. Az aktív vegyületeket (azaz az MBP peptidet vagy annak készítményeit és a β-interferont) szokványos módon adhatjuk be, azaz például injekcióban (szubkután, intravénás, stb.), orálisan, inhalálással, transzdermálisan vagy rektálisan. A beadás módjától függően a hatóanyagot egy olyan anyaggal boríthatjuk, amely megvédi a vegyületet az enzimektől, savaktól és egyéb olyan természetes állapotoktól, amelyek inaktiválhatják a vegyületet.

Injekciónként például előnyösen körülbelül 1 pg - 3 mg, még előnyösebben körülbelül 20-500 μg MBP eredetű antigén peptid dózis adható be. Injekciónként előnyösen 100-10000 egység β-interferon dózis adható be.

Ennek a két vegyületnek a dózistartománya úgy állítható be, hogy az optimális terápiás választ kapjuk. Például a β-interferon és egy MBP eredetű antigén peptidet tartalmazó készítmény beadható egyidőben, vegy előnyösen legalább hatórás eltéréssel, előnyösen legalább 12 órás eltéréssel, még előnyösebben 24 órás eltéréssel. Az antigén peptid és a β-interferon beadásának terápiás tartománya napokig vagy hetekig folytatódhat, és csökkenthető vagy meghosszabbítható, a terápiás helyzet követelményeinek megfelelően.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan új készítmény, amely egy MBP-ből származó antigén peptid és β-interferon fizikai keverékéből áll, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban vagy higítószerben. Ezt a készítményt egy terápiás kezelési mód részeként lehet használni, egy adott egyedben a szklerózis multiplex kezelésére vagy megelőzésére.

• · ·· • * ·· ·· ·· • · · · « · · · · « · φ • * · · · ·· ·· * ·

A találmányt tovább illusztrálja az alábbi, nem korlátozó jellegű példa.

Példa

Az Ac 1-11 egér MBP peptid szintézise

Az Ac 1-11 egér MBP peptidet standard Fmoc/tBoc szintézissel állítjuk elő, majd HPLC-vel tisztítjuk.

Az EAE indukciója

Az EAE-t 6-8 hetes nőstény (SJL x PL^ egerekben (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) indukáljuk, az egereket 100 μg tisztított tengerimalac MBP-vel immunizálva CFA-ban (GIBCO Láb., Grand Island, NY), ami 400 μg

H37RA Mycobacterium tuberculosis törzset (DIFCO Láb., Detroit, Ml) tartalmaz, szubkután, a farok tövében. 200 ng Pertussis Toxint (JHL BIOSCIENCE, Lenexa, Kansas) adtunk kétszer intravénásán az immunizálás napján és 48 órával később is. Az egereket naponta megfigyeljük, hogy mutatnak-e tüneteket, majd a tünetek súlyossága alapján értékeljük, az alábbi skálát használva: 0 = nincsenek klinikai EAE tünetek; 1 = puha, nem reagáló farok; 2 = részleges hátsó végtag bénulás; 3 = teljes hátsó végtag bénulás; 4 = részleges vagy teljes első végtag bénulás; 5 = haldoklás. Az adatokat a betegség súlyossági értékszáma átlagában fejezzük ki az egyes napokon, ami a csoport összes állatára vonatkozik. Az egereket 26 napig figyeljük meg. Amikor egy egér meghal az EAE miatt, akkor attól a naptól kezdve 5-ös értéket írunk minden további napon a klinikai értékszámához.

• ·

A β-interferon hatása az EAE-re

Egy titrálási kísérletben, aminek az a célja, hogy meghatározzuk a különböző β-interferon dózisok hatását az EAE-re (2. ábra), egy egércsoportot PBS-sel kezelünk intraperitoneálisan a 9., 13. és 16. napon (kontroll) az EAE indukciója után, egy egércsoportot 10000 egység β-interferonnal kezelünk a 9., 13. és 16. napon (üres körök), egy egércsoportot kezelünk 2000 egység β-interferonnal a 9., 13. és 16. napon (fekete körök). Amint az a 2. ábrán látható, az EAE tünetei minden időpontban hasonlóak mind a két β-interferon dózisnál, ezzel jelezve, hogy a kisebb dózis megfelelő a β-interferonnal végzett kísérletekhez, és ez az előnyben részesített dózis, mivel ekkor kisebb a β-interferon toxikus hatásának valószínűsége. Ezután

2000 egység β-interferont használtunk a további kísérletekben (lásd 1a-1c.

ábrák), mivel ez a dózis a klinikai értékszámok javulását okozza.

Amint az az 1a. ábrán látható, egy kontroll egércsoportot PBS-sel kezeltünk, egy másik egércsoportot 2000 egység β-interferonnal kezeltünk a 9., 12., 16. és 20. napon. Amint az az 1a. ábrán látható, a csak β-interferonnal kezelt csoport csak valamivel kevésbé erős tüneteket mutatott a vizsgált időszakban mint a kontroll csoport.

Az egér Ac 1-11 MBP peptid hatása az EAE-re

Az Ac 1-11 egér MBP peptid hatását meghatároztuk, az eredmények az 1b. ábrán láthatók. Egy egércsoportot intraperitoneálisan kezelünk PBS-sel (kontroll) az EAE indukció után, majd egy egércsoportot intravénásán kezelünk 250 nmol Ac 1-11 pepiiddel a 10., 13., 17. és 21. napon (üres nyilak), majd intraperitoneálisan kezeljük őket 2000 egység β-interferonnal a

9., 12., 16. és 20. napon. Amint az az 1c. ábrán látható a peptid és a β-interferon kombinációjával kezelt egércsoportban a tünetek súlyossága sokkal kisebb mint a kontroll csoportban, valamint kisebb mint abban a csoportban, amelyet csak β-interferonnal vagy csak a pepiiddel kezeltünk, amint az az 1a.

és az 1b. ábrán látható, jelezve a kombináció szinergisztikus hatását. Ennek következménye az, egy olyan kezelési tartomány, amely magában foglalja a peptid és a β-interferon kombinációját, erősebb hatással rendelkezik az EAE tünetei súlyosságának csökkentésében.

Jóllehet a találmányt az előnyös megvalósítási módoknak megfelelően írtuk le, más megvalósítási módokkal ugyanazok az eredmények érhetők el. A jelen találmány variációi és módosításai a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóak, szándékaink szerint a csatolt igénypontok ezekre és ekvivalenseikre is vonatkoznak.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás szklerózis multiplex kezelésére egy egyedben, azzal jellemezve, hogy az MBP legalább egy terápiásán hatásos mennyiségét adjuk be egy olyan terápiás tartományban, ami magában foglalja β-interferon terápiásán hatásos mennyiségét is.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antigén MBP peptidet és az említett β-interferont egyidőben adjuk be.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antigén MBP peptidet és az említett β-interferont legalább 24 órás eltéréssel adjuk be.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább az egyik antigén peptidet az alábbi csoportból választjuk:

a humán MBP 84-106-os aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 84-102-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 89-101-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 140-172-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 143-168-as aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 142-167-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

• · · · a humán MBP 13-25-ös aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid.
5. Készítmény, amely a humán MBP legalább egy antigén peptidjéből tartalmaz terápiásán hatásos mennyiséget, valamint terápiásán hatásos mennyiségű β-interferont tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban vagy higítószerben.
6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amelyben az említett legalább egy antigén pepiidet az alábbi csoportból választjuk ki:

a humán MBP 84-106-os aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 84-102-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 89-101-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 140-172-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 143-168-as aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 142-167-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 13-25-ös aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid.
7. Eljárás a szklerózis multiplex felléptének megakadályozására egy, a szklerózis multiplexre érzékeny egyedben, azzal jellemezve, hogy egy terápiásán hatásos mennyiséget adunk be legalább egy antigén MBP pép• · · tidből egy olyan kezeléstartományban, ami magában foglal egy terápiásán hatásos mennyiségű β-interferont is.
8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy antigén peptidet módosítunk.
9. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább két antigén peptidet használunk.
10. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amelyben az említett legalább egy antigén peptidet az alábbi csoportból választjuk ki:

a humán MBP 84-106-os aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 84-102-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 89-101-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 140-172-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 143-168-as aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 142-167-es aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid;

a humán MBP 13-25-ös aminosavait vagy azoknak egy részét tartalmazó peptid, mindegyiknek a szekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be.
11. Egy izolált MBP peptid, amely a 142-167-es aminosav csoportokat tartalmazza, a 4. ábrának megfelelően.
12. Készítmény, amely a 11. igénypont szerinti izolált peptidet tartalmazza.

• · ·
13. Egy izolált, a 142-167-es aminosavakat tartalmazó pepiidnek megfelelő C-terminálissal és N-terminálissal rendelkező MBP peptid, amely peptidet legalább egy aminosavval meghosszabbítunk a C-terminálisán.
14. A 13. igénypont szerinti izolált peptid, amely megtartja antigén tulajdonságait, legalább egy T-sejt epitopot tartalmazva.
15. A 13. igénypont szerinti izolált peptidet tartalmazó készítmény.