HUT73320A - A method of detecting the presence of and converting of a polypeptide - Google Patents

A method of detecting the presence of and converting of a polypeptide Download PDF

Info

Publication number
HUT73320A
HUT73320A HU9503020A HU9503020A HUT73320A HU T73320 A HUT73320 A HU T73320A HU 9503020 A HU9503020 A HU 9503020A HU 9503020 A HU9503020 A HU 9503020A HU T73320 A HUT73320 A HU T73320A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
growth hormone
hgh
hydrophobic
derivative
rhgh
Prior art date
Application number
HU9503020A
Other languages
Hungarian (hu)
Other versions
HU9503020D0 (en
Inventor
Thorkild Christensen
Hans Holmegaard Sorensen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of HU9503020D0 publication Critical patent/HU9503020D0/en
Publication of HUT73320A publication Critical patent/HUT73320A/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K1/00General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K1/00General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/61Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575Hormones
    • G01N2333/61Growth hormones [GH] (Somatotropin)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

A találmány háttereBACKGROUND OF THE INVENTION

Az emberből és a közönséges háziállatokból származó növekedési hormonok megközelítően 191 aminosavból álló proteinek, melyeket a hipofízis elülő lebenye szintetizál és szekretál. A humán növekedési hormon 191 aminosavból áll, molekulasúlya 22125 D. Négy cisztein maradék található benne, melyek jelenléte 2 diszulfid híd kötést eredményez. Az 53-as és a 165-ös pozícióknál található ciszteinek közötti diszulfid híd eredményezi a fő hurkot és a 182-es és a 189-es pozícióban található ciszteinek közötti diszulfid híd egy kisebb hurkot képez.Growth hormones from humans and domestic animals are proteins of approximately 191 amino acids synthesized and secreted by the anterior pituitary lobe. Human Growth Hormone is composed of 191 amino acids and has a molecular weight of 22,125 D. Four cysteine residues are present, the presence of which results in 2 disulfide bridge bonds. The disulfide bridge between the cysteines at positions 53 and 165 results in the main loop and the disulfide bridge between the cysteines at positions 182 and 189 forms a smaller loop.

A növekedési hormon egy olyan kulcs hormon, mely nemcsak a szomatikus növekedés szabályozásában vesz részt, hanem a proteinek, szénhidrátok és a lipidek metabolizmusának szabályozásában is.Growth hormone is a key hormone that not only regulates somatic growth but also regulates the metabolism of proteins, carbohydrates and lipids.

A növekedési hormon hatása alatt álló szerv rendszerek közé közé tartoznak a csontváz, a kötőszövet, az izomzat és a zsigerek, mint pl. a máj, a bélrendszer és a vesék.Organ systems that are under the influence of growth hormone include skeleton, connective tissue, muscle and viscera, such as. liver, intestine and kidneys.

A rekombináns technológia és a növekedési hormon gén klónozásának kifejlesztéséig - mely most pl. a humán növekedési hormon (hGH) és a Met-hGH ipari méterű termeléséhez vezetett - a humán növekedési hormont csupán humán holttestek hipofíziséből lehetett kinyerni.Until the development of recombinant technology and the cloning of the growth hormone gene - now e.g. led to the industrial production of human growth hormone (hGH) and Met-hGH - human growth hormone could only be obtained from the pituitary gland of human bodies.

A növekedési hormon nagyon korlátozott mennyisége ennek használatát a gyermekkori és serdülőkori longitudinális növekedés serkentésére korlátozta a törpeség kezelésére, bár javasolták a kis termet (a növekedési hormon deficiencia következtében fellépő, a normális kis termet és a Turner szindróma) a felnőttkori növekedési hormon deficiencia, a terméketlenség, az égési sérülések, a sérülések, a dystrophia, a csont összeforrás, az osteoporosis, a diffúz gyomor vérzés és a pseudoarthrosis kezelésére.A very limited amount of growth hormone has limited its use to stimulate longitudinal growth in childhood and adolescence for the treatment of dwarfism, although small size (normal small size due to growth hormone deficiency, Turner syndrome), adult growth hormone deficiency, infertility have been suggested , for the treatment of burns, injuries, dystrophy, bone fusion, osteoporosis, diffuse gastric bleeding and pseudoarthrosis.

Továbbá, a növekedési hormon használatát javasolták a háziállatok növekedési sebességének növelésére, az emberi fogyasztásra szánt állatok zsír mennyiségének csökkentésére, valamint a tejelő állatok tejtermelésének fokozására.In addition, the use of growth hormone has been suggested to increase the growth rate of domestic animals, to reduce the amount of fat in animals intended for human consumption, and to increase milk production in dairy animals.

A rekombináns technikákban a humán növekedési hormont normálisan a humán növekedési hormont kódoló gén expresszálásával termelik, az említett gén egy mikroorganizmusba való inzertálásán keresztül. Ezután a növekedési hormont a táplevesböl izolálják, lehetőleg a mikroorganizmusok lizálása után. A hGH expreszszálására leggyakrabban használt gazda az E. coli.In recombinant techniques, human growth hormone is normally produced by expressing a gene encoding human growth hormone by inserting said gene into a microorganism. The growth hormone is then isolated from the broth, preferably after lysing the microorganisms. The most commonly used host for hGH expression is E. coli.

A hipofízisből kivont, vagy a rekombináns technikával előállított növekedési hormont mindig megfelelő standardekkel hasonlítják össze egy autentikus termékkel való azonosság biztosítása céljából.Growth hormone extracted from the pituitary gland or recombinantly produced is always compared to appropriate standards to ensure identity to an authentic product.

A hipofízisből kivont hGH-t vizsgálat alá vetették az aberráns formák detektálása céljból, valamint ezek specifikus aktivitásának meghatározásához. A fent említett molekulasúlyú növekedési hormonon túl számos egyláncú forma is termelődik, ahol a 32-46 aminosav maradékok hiányoznak. Ezek az úgynevezett 20 k fomájú hGH-k. Ez a variáns az eredménye az mRNS szinten történő váltakozó hasításnak is. A hipofíziből izolált hGH készítményekről azt Írták, hogy tartalmaznak tömeg, töltés, elrendezödési, és oxidált variánsokat, valamint hasítási variánsokat is. Az új vizsgálatok kifejlesztése lehetővé tette a készítményekben és a standardekben nagyon kis mennyiségekben levő növekedési hormon származékok jelenlétének detektálását. így egy ezideig ismeretlen hidrofób, szennyeződés került detektálásra a humán növekedési hormon készítmények tisztításával kapcsolatban, Hidrofób Interaction Kromatográfiét (HIC) használva speciális közülmények között. Ezt a származék normális esetben nem kerül detektálásra a humán növekedési hormon minták tesztelésére használt semmilyen más módszerrel (ideértve az SDS-PAGE, RP-HPLC, IE-HPLC és GPC módszereket vagy a más körülmények között végzett HIC módszert).HGH extracted from the pituitary gland was tested for the detection of aberrant forms and their specific activity. In addition to the above-mentioned molecular weight growth hormone, many single-chain forms are produced in which the 32-46 amino acid residues are absent. These are the so-called 20k hGHs. This variant is also the result of alternating cleavage at the mRNA level. HGH preparations isolated from the pituitary have been reported to contain weight, charge, arrangement, and oxidized variants as well as cleavage variants. The development of new assays has made it possible to detect the presence of very small amounts of growth hormone derivatives in formulations and standards. Thus, a hitherto unknown hydrophobic impurity has been detected in the purification of human growth hormone formulations using Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) under special circumstances. This derivative will normally not be detected by any other method used to test human growth hormone samples (including SDS-PAGE, RP-HPLC, IE-HPLC and GPC, or the HIC assay under other conditions).

A gyógyszerészeti készítmények előállításához általában előnyben részesül a lehető legtisztább formában levő aktív alkotórészek alkalmazása és ha lehetséges előnyben részesül a monokomponensü vegyületek formájában levő aktív alkotórészek alkalmazása.For the preparation of pharmaceutical compositions, it is generally preferable to use the active ingredients in the purest form possible and, where possible, to use the active ingredients in the form of the monocomponent compounds.

Kívánatos egy olyan módszer kifejlesztése, mellyel könnyen lehet detektálni az itt leírt növekedési hormon hidrofób származékait, valamint szükség van a növekedési hormon tételekből a származékok eltávolítására szolgáló módszerre.It is desirable to develop a method that can readily detect hydrophobic derivatives of the growth hormone described herein and a method for removing the derivatives from growth hormone batches.

Lehetőség van a hidrofób származékok fizikai szeparációs technikákkal való eltávolítására. Azonban egy ilyen eljárás magában kevésbé kívánatos az aktív alkotórészek menyiségi vesztesége miatt.It is possible to remove hydrophobic derivatives by physical separation techniques. However, such a process per se is less desirable due to the quantitative loss of active ingredients.

így szükség van egy olyan eljárásra is, mely biztosítja a növekedési hormon hidrofób származékainak natív termékké való kvantitatív konverzióját.Thus, there is also a need for a method for quantitative conversion of hydrophobic derivatives of growth hormone to native products.

A találmány rövid leírásaBrief Description of the Invention

Azt találtuk, hogy a találmányban leírt humán növekedési hormon hidrofób származéka könnyen detektálható kromatográfiás módszerekkel és könnyen konvertálható a humán növekedési hormon natív formájává.It has now been found that the hydrophobic derivative of the human growth hormone described herein is readily detectable by chromatography and readily converted to the native form of human growth hormone.

így egy első aspektusban, a találmány egy növekedési horon egy hidrofób származéka jelentlétének detektálására szolgáló módszerrel kapcsolatos, mely hidrofób származék egy extra kénatomot tartalmaz a natív növekedési hormonhoz viszonyítva, és ahol a növekedési hormont egy hidrofób interakciós kromatográfiának vetjük alá, melynek során az oszlopot ammónium szulfát gradiensével eluáljuk és a hidrofób származék jelenlétét detektáljuk.Thus, in a first aspect, the invention relates to a method for detecting the presence of a hydrophobic derivative of a growth hormone, which hydrophobic derivative contains an extra sulfur atom relative to native growth hormone, and wherein the growth hormone is subjected to hydrophobic interaction chromatography with ammonium sulfate. gradient and detecting the presence of the hydrophobic derivative.

A hidrofób interakciós kromatográfia az LC & GC.INTL-beben került leírásra (Vol 5, No. 11 (1992) 14-29).Hydrophobic interaction chromatography is described in LC & GC.INTL (Vol 5, No. 11 (1992) 14-29).

A HIC egy fenil szuperóz oszlop FPLC készülékben való használatával végezhető el. A megfelelő készülék az FPLC készülék Fenil Szuperóz HR 5/5, melyet a Pharmaciától lehet beszerezni.HIC can be accomplished using a phenyl superose column in an FPLC instrument. A suitable device is the FPLC Apparatus Phenyl Superose HR 5/5 available from Pharmacia.

Az eluálás megfelelő sókkal végezhető el, mint amilyen az ammónium szulfátok és/vagy az ammónium acetát.Elution may be carried out with suitable salts such as ammonium sulfates and / or ammonium acetate.

A növekedési hormon hidrofób származékait tartalmazó HlC-ből származó eluátumok frakciói ezután peptid térképezésnek vethetők alá, a leírtaknak megfelelően (High Performance Liquid Chromatography in Biotechnology Ed. William S. Hancock, John Wiley & Sons Inc., 1990, Chapter 9.).Fractions of H1C eluate fractions containing growth hormone hydrophobic derivatives can then be subjected to peptide mapping as described (William S. Hancock, Ed., Wiley & Sons Inc., 1990, Chapter 9).

A növekedési hormon hidrofób származéka detektálható a retenciós idők öszszehasonlításával, mivel a triszulfid hidat tartalmazó fragment retenciós ideje hoszszabb, mint a diszulfid hidat tartalmazó megfelelő fragmenté.The hydrophobic derivative of growth hormone can be detected by comparing retention times, since the retention time of the trisulfide bridge fragment is longer than the corresponding disulfide bridge fragment.

Egy további aspektusban, a jelen találmány egy növekedési hormon hidrofób származékának a növekedési hormon natív formává való konvertálására szolgáló módszerrel kapcsolatos.In another aspect, the present invention relates to a method for converting a hydrophobic derivative of growth hormone to a native form of growth hormone.

Meglepően azt találtuk, hogy a növekedési hormon hidrofób származéka a növekedési hormon natív formájává egy merkapto vegyülettel való kezeléssel alakítható. A kezelést kényelmesen oldatban végezhetjük el, melyben a humán növekedési hormon hidrofób származéka egy oldószerben van.Surprisingly, it has been found that the hydrophobic derivative of growth hormone can be converted to the native form of growth hormone by treatment with a mercapto compound. The treatment may conveniently be carried out in solution in which the hydrophobic derivative of human growth hormone is in a solvent.

Azt találtuk, hogy az ilyen hidrofób származékok közvetlenül a natív formává konvertálhatók egy merkapto vegyületet használó enyhe kezeléssel. így a konverzió vagy a újra hajtogatás a találmány szerint elvégezhető a proteinek újra hajtogatásához való hagyományos pufferrel, de a proteinek újrahajtogatásakor normálisan várható diszulfid hidak törésére szolgáló megelőző redukciós vagy denaturációs lépés nélkül.It has been found that such hydrophobic derivatives can be directly converted to the native form by mild treatment using a mercapto compound. Thus, the conversion or refolding according to the invention can be carried out with a conventional buffer for refolding of proteins, but without the prior reduction or denaturation step normally required for refolding of disulfide bridges.

A találmány egy további aspektusa szerint a hGH hidrofob származékát a natív hGH-vá való konverzió végrehajtása előtt izoláljuk.In another aspect of the invention, the hydrophobic derivative of hGH is isolated prior to conversion to native hGH.

Előnyben részesítjük a növekedési hormon hidrofob származékát tartalmazó teljes növekedési hormon tétel közvetlen kezelését a növekedési hormon származék izolálása nélkül.We prefer to directly treat a complete growth hormone batch containing a hydrophobic derivative of growth hormone without isolating the growth hormone derivative.

A merkapto vegyület lehet bármely merkapto vegyület, mely nincs káros hatással a növekedési hormonra a reakció körülmények között. Az előnyben részesített vegyületek az olyan vegyületek, melyek képesek a növekedési hormon származék közvetlen natív formává való transzformálására, a növekedési hormon redukálása - a natív növekedési hormonban jelenlevő mindkét diszulfid híd teljes széttörésével nélkül. A merkapto vegyület lehet pl. cisztein, glutation, 2-merkapto-etanol vagy ditiotreitol (DTT). Az előnyben részsesített vegyületeket a ciszteint és a glutationt tartalmazó csoportból szelektáljuk. Leginkább a ciszteint részesítjük előnyben.The mercapto compound may be any mercapto compound that does not adversely affect growth hormone under the reaction conditions. Preferred compounds are compounds capable of transforming a growth hormone derivative into a direct native form without reducing the growth hormone without completely disrupting both disulfide bridges present in the native growth hormone. The mercapto compound may be, e.g. cysteine, glutathione, 2-mercaptoethanol or dithiothreitol (DTT). Preferred compounds are selected from the group consisting of cysteine and glutathione. Cysteine is most preferred.

Normálisan a merkapto vegyület oldatban van 0,1-5 mM koncentrációban. Előnyösen a koncentráció a 0,5 - 3 mM határok közé esik. A találmány előnyben részesített aspektusa szerint a növekedési hormont 1 - 2 mM koncentrációban levő ciszteinnel kezeljük.Normally, the mercapto compound is in solution at a concentration of 0.1-5 mM. Preferably, the concentration is in the range of 0.5 to 3 mM. In a preferred aspect of the invention, the growth hormone is treated with cysteine in a concentration of 1-2 mM.

A találmány szerinti használatban a növekedési hormon kifejezés olyan növekedési hormont jelent, mely madárból, szarvasmarhából, lóból, emberből, juhból, disznóból, lazacból, pisztrángból vagy tonhalból származó növekedési hormon, előnyösen szarvasmarha, humán, vagy disznó növekedési hormon, leginkább a humán növekedési hormon részesül előnyben. A kezelendő növekedési hormon a jelen találmánnyal összhangban lehet egy természetes forrásból izolált növekedési hormon, pl. egy hagyományos módszerrel a hipofízisből kivont növekedési hormon, vagy egy rekombináns technikával előállított növekedési hormon (pl. E.B. Jensen and S. Carlsen Biotech and Bioeng. 36, 1-11, 1990). Az előnyben részesített növekedési hormon a humán növekedési hormon.As used herein, the term growth hormone is a growth hormone which is a growth hormone derived from a bird, cattle, horse, human, sheep, pig, salmon, trout or tuna, preferably bovine, human or porcine growth hormone, most preferably human growth hormone. is preferred. The growth hormone to be treated in accordance with the present invention may be a growth hormone isolated from a natural source, e.g. growth hormone extracted from the pituitary by a conventional method, or growth hormone produced by recombinant techniques (e.g., E. B. Jensen and S. Carlsen Biotech and Bioeng. 36, 1-11, 1990). The preferred growth hormone is human growth hormone.

A növekedési hormon lehet a növekedési hormon egy csonkított formája, ahol egy vagy több aminosav maradékot vetettünk alá deléciónak; ezek egy analógja, ahol a natív molekulában egy vagy több aminosav maradékot helyettesítettünk más aminosav maradékkal, előnyösen egy természetes aminosav maradékkal, amennyiben a helyettesítés nincs káros hatással, pl. antigenitás, vagy csökkent hatás; vagy ezek egy származéka, pl. rendelkezhet egy N- vagy C-terminális extenzióval mint pl. Met-hGH, Met-Lys-hGH, Ala-Glu-hGH, Thr-Glu-Ala-Glu-hGH, Ala-Glu-Ala-Glu-hGH, Met-Glu- Ala-Glu-hGH, Met-Phe-Glu-Glu-hGH, Met-Asp-Ala-Asp-hGH, vagy Met- Glu-Ala-Asp-hGH.Growth hormone may be a truncated form of growth hormone in which one or more amino acid residues have been deleted; an analogue thereof wherein one or more amino acid residues in the native molecule have been substituted with another amino acid residue, preferably a natural amino acid residue, provided that the substitution has no adverse effect, e.g. antigenicity or reduced activity; or a derivative thereof, e.g. may have an N- or C-terminal extension, e.g. Met-hGH, Met-Lys-hGH, Ala-Glu-hGH, Thr-Glu-Ala-Glu-hGH, Ala-Glu-Ala-Glu-hGH, Met-Glu-Ala-Glu-hGH, Met-Phe- Glu-Glu-hGH, Met-Asp-Ala-Asp-hGH, or Met-Glu-Ala-Asp-hGH.

A kezelendő növekedési hormon származéka oldatának előállításához használt oldószer lehet például egy vizes puffer, mely a pH értéket 5-10 közé pufferolja. A 6-os pH értéknél nagyobbra pufferolt oldatokat részesítjük előnyben. Az oldószert előnyösen a Trist, trietilamint, citromsavat foszfát puffért és hisztidint magába foglaló csoportból szelektáljuk. Tris az előnyben részesített puffer.For example, the solvent used to prepare a solution of the growth hormone derivative to be treated may be an aqueous buffer that buffers the pH to between 5 and 10. Buffer solutions above pH 6 are preferred. Preferably, the solvent is selected from the group consisting of Trist, triethylamine, citric acid phosphate buffer and histidine. Tris is the preferred buffer.

Az előnyben részesített pufferolt oldatot pH 7,5 értékre pufferoljuk 20 mM Trist és 10 mM citromsavat használva.The preferred buffered solution is buffered to pH 7.5 using 20 mM Trist and 10 mM citric acid.

A találmány részletes leírásaDetailed Description of the Invention

A humán növekedési hormon hidrofób variánsa aminosav szekvenciájának a humán növekedési hormon aminosav szekvenciájával való aminosav szekvencia azonosságát az izolált peptid fragmentek triptines peptid térképezésével, aminosav szekvencia analízissel határozzuk meg. Továbbá tömeg spektrometriás vizsgálatot is elvégzünk.The amino acid sequence identity of the hydrophobic variant of human growth hormone to the human growth hormone amino acid sequence was determined by tryptic peptide mapping of the isolated peptide fragments and amino acid sequence analysis. In addition, mass spectrometry is performed.

A tömeg spektrometria a hGH hidrofób származékának 32 daltonos tömeg növekedését mutatta a natív hGH-hoz viszonyítva. Ez az extra kénatom jelenlétének tulajdonítható.Mass spectrometry showed a 32 dalton weight gain of the hydrophobic derivative of hGH compared to native hGH. This is due to the presence of extra sulfur.

A hidrofób növekedési hormon származék jellemzésének eredményeiből azt a következtetést vontuk le, hogy a származék egy olyan humán növekedési hormon, mely egy diszulfid híddal ( Cys 53-Cys 165) és egy triszulfid híddal (Cys 182-S-Cys 189) rendelkezik, valamint aminosav szekvenciája azonos a natív hGH-éval.From the results of the characterization of the hydrophobic growth hormone derivative, it was concluded that the derivative is a human growth hormone having a disulfide bridge (Cys 53-Cys 165) and a trisulfide bridge (Cys 182-S-Cys 189) as well as an amino acid. has the same sequence as native hGH.

KÍSÉRLETI RÉSZEXPERIMENTAL PART

1. példaExample 1

A humán növekedési hormon hidrofób származékának detektálásaDetection of a hydrophobic derivative of human growth hormone

A rekombináns humán növekedési hormon hidrofób származéka - mely egy extra kénatommal rendelkezik a növekedési hormon natív formájához képest - jelenlétét a találmánnyal összhangban detektáljuk úgy, hogy a növekedési hormont HICnek vetjük alá egy FPLC készüléket (Pharmacia) és Fenil Szuperóz HR 5/5 (Pharmacia) készüléket használva.The presence of a hydrophobic derivative of recombinant human growth hormone, which has an extra sulfur atom compared to the native form of growth hormone, is detected in accordance with the invention by subjecting the growth hormone to HIC using an FPLC apparatus (Pharmacia) and Phenyl Superose HR 5/5 (Pharmacia). device.

Az eluáláshoz ammónium szulfát grádiensét használjuk.A gradient of ammonium sulfate was used for elution.

A puffer rendszer a következő:The buffer system is as follows:

A puffer: 1,2 ; ammónium szulfát, 20 mM tris pH=7,4Buffer A: 1.2; ammonium sulfate, 20 mM tris pH 7.4

B puffer: 20 mM Tris pH=7,4Buffer B: 20 mM Tris pH 7.4

Az összes használt vegyszer Merk vegyszer.All chemicals used are Merk chemicals.

Az eluálást a következő grádienseket használva végezzük:Elution is performed using the following gradients:

Idő (perc) Time (minutes) Puffer Buffer 0,0 0.0 Konc. %B Conc. % B 0,0 0.0 1,0 1.0 Konc %B Conc% B 0,0 0.0 10,0 10.0 Konc. %B Conc. % B 100 100 16,0 16.0 Konc. %B Conc. % B 100 100 17,0 17.0 Konc. %B Conc. % B 0 0 22,0 22.0 vége over

A puffért 0,50 ml/perc rátával adjuk és a papír adagolási sebessége 0,50 cm/perc.The buffer was added at a rate of 0.50 ml / min and the feed rate of the paper was 0.50 cm / min.

A hidrofób származékot tartalmazó eluátum frakcióit a fent leírtak szerint peptid térképezésnek vetjük alá.Fractions of the eluate containing the hydrophobic derivative were subjected to peptide mapping as described above.

A humán növekedési hormon hidrofób származékának detektálására szolgáló alternatív módszerAn alternative method for detecting the hydrophobic derivative of human growth hormone

A hGH mintákat egy TSK Éter 5PW (75 x 4,6 mm ID) oszlopon analizáljuk környezeti hőmérsékleten C és D eluenseket használva és a D eluens 40-50 % grádiensét használva 30 percen keresztül.The hGH samples were analyzed on a TSK Ether 5PW (75 x 4.6 mm ID) column at ambient temperature using C and D eluents and a 40-50% gradient of D eluent over 30 minutes.

C eluens: 2 M (NH4)2SO4, 20 mM Na2HPO4 x 2H2O pH=6,0C eluent: 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 mM Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O pH 6.0

D eluens: 20 mMNa2HPO4 x 2H2O, 0,1 % PEG, pH=6,0Eluent D: 20 mM Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O, 0.1% PEG, pH 6.0

A detektálás 280 nm hullámhosszon történik. Az átfolyás 0,5 ml/perc. HPLC készülék: Adat kezelés és szabályozás: Waters 860 Networking számítógép rendszer, Pumpák: Waters pumpák 510-es modell, Minta injektorok: Waters Wisp 712, Detektor: Waters M481 spektrometer.Detection is at 280 nm. The flow rate was 0.5 ml / min. HPLC instrument: Data management and control: Waters 860 Networking computer system, Pumps: Waters pumps Model 510, Sample injectors: Waters Wisp 712, Detector: Waters M481 spectrometer.

A rekombináns humán növekedési hormon (rhGH1) hidrofób származékát a 8as és 9-es csúcsok között megjelenő új csúccsal valamint az ezzel egyidőben észlelhető 7-es csúcs (a 7-es peptid) - mely megfelel a 179-191 aminosav maradékoknak a rekombináns humán növekedési hormon (rhGH) peptid térképében - eltűnésé vei azonosítjuk. A csúcsok számozása megfelel az irodalomban leírtaknak (High Performance Liquid Chromatography Chapter 9, supra).The hydrophobic derivative of recombinant human growth hormone (rhGH 1 ) with the new peak appearing between peaks 8 and 9 and the concurrent peak 7 (peptide 7), corresponding to the 179-191 residues of the recombinant human growth hormone (rhGH) peptide map. The numbering of the peaks corresponds to that described in the literature (High Performance Liquid Chromatography Chapter 9, supra).

A humán növekedési hormon hidrofób származékának izolálásaIsolation of a hydrophobic derivative of human growth hormone

Ha egy hGH mintából a hidrofób származék izolálása kívánatos, az ilyen izolálás végrehajtható a fent leírt eljárás léptéknövelésével, vagy végrehajtható az irodalomban leírt eljárást használva (Bio/Technology 5 161-164 (1987)).If it is desired to isolate the hydrophobic derivative from a sample of hGH, such isolation may be accomplished by scale-up of the procedure described above or may be performed using the procedure described in the literature (Bio / Technology 5: 161-164 (1987)).

A humán növekedési hormon hidrofób származékának tömeg spektroszkópiás jellemzéseMass spectroscopic characterization of the hydrophobic derivative of human growth hormone

A rekombináns humán növekedési hormont sorrendben Plazma Deszopciós Tömeg Spektroszkópiával (PDMS) és Elektro-Spray Tömeg Spektroszkópiával (ESMS) analizáljuk.The recombinant human growth hormone was analyzed by Plasma Desorption Mass Spectroscopy (PDMS) and Electro-Spray Mass Spectroscopy (ESMS), respectively.

Az analízis során sorrendben az intakt rhGH és rhGH' és a megfelelő 7 és 7' triptikus peptidek közötti eltérés detektálására fektetjük a hangsúlyt.The analysis focuses on detecting the difference between the intact rhGH and rhGH 'and the corresponding 7 and 7' tryptic peptides, respectively.

Az intakt rhGH és rhGH' tömeg meghatározásaDetermination of intact rhGH and rhGH 'mass

Az intakt rhGH és rhGH' tömegét ESMS-t használva határozzuk meg API IIIThe weights of intact rhGH and rhGH 'were determined using API III

LC/MS rendszert (Sciex. Thornhill, Ontario, Canada) használva. A hármas quadropople készülék 2400 tömeg-töltés (m/Z) határral rendelkezik és egy pneumatikus meghajtású elektrosprayhez (ionsprayként is utalnak rá) interface-hez illeszkedik (Ρ1, P1). A minta bejuttatását egy injekcióstű infúziós pumpával (Sage Instruments, Cambridge, MA) érjük el egy fúzionált kapillárison keresztül (75 pm i.d.) a folyadék áramlást 0,5 - 1 μΙ/perc értékre állítjuk. A készülék m/z skáláját poli(propilén glikolok)(PPG-k) egyszeres töltésű ammónium addukt ionjaival kalibráljuk egység felbontás mellett. A tömeg meghatározás pontossága általában 0,02 %LC / MS (Sciex. Thornhill, Ontario, Canada). The triple quadropople device has a 2400 mass charge (m / Z) limit and fits into a pneumatic actuated electrospray (also referred to as an ionspray) interface (Ρ1, P1). Sample delivery is accomplished using a needle infusion pump (Sage Instruments, Cambridge, MA) through a fused capillary (75 pm i.d.) to adjust the fluid flow to 0.5-1 μ 1 / min. The instrument's m / z scale is calibrated with single-charge ammonium adduct ions of poly (propylene glycols) (PPGs) at a unit resolution. The accuracy of mass determination is generally 0.02%

- 11 nál jobb, de a kis intenzitású spektrum kevésbé pontos tömeg meghatározást eredményezhet.- Better than 11, but low intensity spectrum may result in less accurate mass determination.

A Plazma Deszoprciós Tömeg Spektrometria (PDMS) analízist egy BIO-ION 20K 252-California time-of-flight készülékkel (ABI Nordic A/s, Uppsala, Sweden) használva végezzük el. A minta adagoláshoz standard eljárást (ideértve az in situ redukciót, DTT-t használva) és analízist hajtunk végre (P3, P4). A tömeg meghatározás pontossága kb. 0,1 %.Plasma Desorption Mass Spectrometry (PDMS) analysis was performed using a BIO-ION 20K 252-California time-of-flight instrument (ABI Nordic A / s, Uppsala, Sweden). Standard sample procedures (including in situ reduction using DTT) and analysis (P3, P4) were performed for sample administration. The accuracy of the mass determination is approx. 0.1%.

Az analízis előtt az rhGH-t és az rhGH'-t is sómentesítjük egy Sep-pak készüléken (Stacioner fázis C-|8 a Waterstői). Az rhGH' 31 ±2 amu tömegnövekedést mutat az rhGH-hoz viszonyítva. A DTT-t használó redukció után az rhGH' tömege megegyezik a redukált rhGH számított tömegével.Prior to analysis, both rhGH and rhGH 'are desalted on a Sep-Pak (Stationary Phase C18 from Water). RhGH 'exhibits a mass gain of 31 ± 2 amu relative to rhGH. After reduction using DTT, the weight of rhGH 'equals the calculated weight of the reduced rhGH.

Az eredményeket az I. táblázat mutatjaThe results are shown in Table I.

I. táblázatTable I

ESMS ESMS Számított calculated rhGH rhGH 22126±2 22 126 ± 2 22125,2 22125.2 rhGH rhGH 22157±2 22 157 ± 2 - - rhGH + DTT rhGH + DTT 22129±2 22 129 ± 2

Az rhGH és rhGH' 7-es számú triptikus fraqmentjének tömeg meghatározásaMass determination of the triple fragment of rhGH and rhGH '7

Az rhGH és rhGH' 7-es számú triptikus fragmentjének, a 7-es és 7' fragmenteknek, a tömegét PDMS-sel határozzuk meg. A 7-es fragment az rhGH triptikus peptid térképezéséből származik.The weight of the tryptic fragment of rhGH and rhGH '7, fragments 7 and 7', was determined by PDMS. Fragment 7 is derived from the mapping of the tryptic peptide rhGH.

mg/ml koncentrációban levő hGH-t dializálunk 50 mM Tris, 2 mM CaCl2, 6H2O (pH=7,8) elegyével szemben 24 óráig 4 °C hőmérsékleten. A hGH-hoz mg • · mennyiségenként 10 μΙ tripszin oldatot (1 mg tripszin/ml feloldásával (szarvasmarha, DPCC kezelt, T-1005 a Sigmától) nyerjük), 1 mM HCI-t, 2 mM CaCl2*6H2O-t adunk hozzá. Az emésztést 6 órán keresztül hajtjuk végre 37 °C hőmérsékleten. Az emésztési terméket (25 μΙ) analizáljuk a következőket használva RP-HPLC: Oszlop: Nucleosil RP C18, 250 x 4 mm, 120 A, 7u (Macherey-Nagel, Art 720042); a hőmérséklet: 45 °C; detektálás: 215 nm hullámhosszon; átfolyás: 1 ml/perc; E eluens: 0,05 % (térf/térf) TFA vízben; F eluens: 0,05 % (térf/térf) TFA 70 %-os vízben levő acetonitrilben; grádiens: 0 - 70 F eluens 60 perc alatt. Ezután a grádienst 100 % F eluensre cseréljük 5 perc alatt, amit 10 percig tartó izokratikus eluálás követ 100 % F- fel. A grádienst visszaállítjuk 0 % F-re 1 perc alatt és az oszlopot 15 percig ekvilibráljuk a következő futtatás előtt.hGH at a concentration of mg / ml is dialyzed against a mixture of 50 mM Tris, 2 mM CaCl2, 6H2O (pH 7.8) for 24 hours at 4 ° C. 10 mg of trypsin solution (obtained by dissolving 1 mg of trypsin / ml (bovine, DPCC treated, T-1005 from Sigma)), 1 mM HCl, 2 mM CaCl2 * 6H2O were added to hGH. Digestion was carried out for 6 hours at 37 ° C. The digestion product (25 μΙ) was analyzed using RP-HPLC: Column: Nucleosil RP C18, 250 x 4 mm, 120 A, 7u (Macherey-Nagel, Art 720042); temperature: 45 ° C; detection: at 215 nm; flow rate: 1 ml / min; Eluent E: 0.05% (v / v) TFA in water; Eluent F: 0.05% (v / v) TFA in 70% acetonitrile in water; gradient: 0 - 70 F in 60 minutes. The gradient is then changed to 100% F in 5 minutes, followed by isocratic elution for 10 minutes with 100% F. The gradient is reset to 0% F in 1 minute and the column equilibrated for 15 minutes before the next run.

A triptikus hasítással létrehozott rhGH 7-es fragmentjének számított tömege 1401 és az l-es szerkezeti képlettel rendelkezik: l-es szerkezeti képlet lle-Val-GIn-Cys-ArgThe calculated fragment 7 of the rhGH generated by tryptic cleavage is 1401 and has the structural formula I: Formula lle-Val-GIn-Cys-Arg

SS

SS

Ser-Val-Glu-Ser-Cys-Gly-Phe Mr: 1401Ser-Val-Glu-Ser-Cys-Gly-Phe Mr: 1401

Egy 32 amu különbséget észlelünk a 7-es és 7’ peptidek tömege között. DTT-t használó redukció után azonos tömegeket kapunk a 7-es és a 7' peptidek esetében, melyek megfelelnek a redukált peptid számított tömegének. Az eredményeket a II. táblázat mutatja:A difference of 32 amu was observed between the weight of peptides 7 and 7 '. Reduction using DTT gives identical weights for peptides 7 and 7 ', which correspond to the calculated weight of the reduced peptide. The results are shown in Table II. table shows:

- 13 II. táblázat- 13 II. spreadsheet

PDSM PDSM Számított calculated 7 fragment Fragment 7 1401 1401 1401 1401 7 fragment + DTT 7 fragment + DTT 617 + 785 617 + 785 618 + 785 618 + 785 7 fragment Fragment 7 1433 1433 7 fragment + DTT 7 fragment + DTT 617 + 785 617 + 785

A 7' fragmentet a fent leírt tripszin emésztés RP-HPLC-vel kapott új csúcsának megfelelő frakció összegyűjtésével izoláljuk.Fragment 7 'was isolated by collecting the fraction corresponding to the new peak of trypsin digestion obtained by RP-HPLC as described above.

A részleges Edman Degradációt, a PDMS analízissel valamint az ESMS analízissel együtt a 7' fragmenten közvetlenül hajtjuk végre. Négy lépésen keresztül nyomon lehet követni a manuális degradációt (lebomlás) a csonkított peptid analizálásával. Az egyes lépésekben két aminosav maradékot hasítunk le (egyet az egyes N-terminálisokról). A 7-es és 7' peptidek közötti 32 amu tömeg eltérés nem változik a négy hasítási lépés során.Partial Edman degradation, together with PDMS analysis and ESMS analysis, is performed directly on the 7 'fragment. There are four steps to tracking manual degradation (degradation) by analyzing the truncated peptide. In each step, two amino acid residues (one for each N-terminus) are cleaved. The 32 amu weight difference between peptides 7 and 7 'does not change during the four cleavage steps.

Az ESMS-sel végzett MS/MS analízis egy sor ionizált szekvenciát eredményez, melyek a peptid N-terminális részével kapcsolatosak. Az MS/MS-t a 7' peptid - mely 717 amu tömegű és egy kettős töltéssel rendelkezik - molekuláris ionját használva hajtjuk végre. A felső lánc fragmentálása a következő értékeknél ad csúcsokat: m/z: 1320, 1221 és 1094, míg az alsó lánc fragmentálása a következő értékeknél ad csúcsokat: m/z: 1247, 1118, 1061 és 974. A következtetés szerint az első négy aminosav maradék az egyes láncokban - legalábbis a cisztein maradékot tekintve - normál tömeget mutat így az rhGH és az rhGH' közötti 32 amu tömeg eltérés úgy tűnik egy triszulfid jelenlétének tulajdonítható a normál diszulfiddal szembeállítva.MS / MS analysis by ESMS yields a series of ionized sequences that relate to the N-terminal portion of the peptide. MS / MS is performed using the molecular ion of peptide 7 ', which has a mass of 717 amu and has a double charge. Fragmentation of the upper chain yields peaks at m / z 1320, 1221, and 1094, while fragmentation of the lower chain yields peaks at m / z 1247, 1118, 1061, and 974. It concludes that the first four amino acids are the residues in each chain show a normal mass, at least for the cysteine residue, so the 32 amu weight difference between rhGH and rhGH 'appears to be due to the presence of a trisulfide as opposed to the normal disulfide.

- 14 - ·:· ···· -:· '·'- 14 - ·: · ···· -: · '·'

A hGH'-ban levő extra kénatom jelenlétének bemutatásaDemonstration of the presence of extra sulfur atoms in hGH '

A triszulfid híd jelenlétét ólom acetátot használva mutatjuk ki az alábbiakban leírtak szerint.The presence of the trisulfide bridge is detected using lead acetate as described below.

Az alábbiakban leírtak szerint ciszteinnel való rhGH' kezelés azt mutatja, hogy az rhGH' natív rhGH-ná transzformálódik, melynek során hidrogén szulfid képződést detektálunk.Treatment of rhGH 'with cysteine as described below shows that rhGH' is transformed into native rhGH, whereby formation of hydrogen sulfide is detected.

Szűrőpapírt (Watman üveg mikrorostú szűrők) merítünk 0,1 M ólom acetát desztillált vizes oldatába majd levegőn megszáritjuk.Filter paper (Watman glass microfibre filters) was immersed in distilled aqueous solution of 0.1 M lead acetate and air dried.

Hat kémcsövet készítünk, melyek tartalma a III. táblázatban leírtak szerinti.Six test tubes are prepared containing the contents of Table III. Table.

III. táblázat db 10 ml vizet db 10 ml tiszta hGH-t db 10 ml 7-es csúcs nélküli hGHIII. 10 ml of water 10 ml of pure hGH 10 ml of hGH without peak 7

A teszt kémcsöveket két sorozatra osztjuk a IV. táblázatban megadottak szerint.The test tubes are divided into two sets of IV. Table.

IV. táblázatARC. spreadsheet

l-es sorozat l series ll-es sorozat II series kémcső test tube tartalma contents kémcső test tube tartalma contents 1 1 víz water 4 4 víz water 2 2 tiszta hGH pure hGH 5 5 tiszta hGH pure hGH 3 3 hGH hGH 6 6 hGH hGH (7 csúcs nélkül) (Without 7 vertices) 7 7 csúcs nélül) without peak)

Az l-es sorozat minden kémcsövéhez 2,5 ml desztillált vizet adunk.To each Series I tube is added 2.5 mL of distilled water.

A ll-es sorozat minden kémcsövéhez 2,5 ml 2,5 mM desztillált vízben levő ciszteint adunk.To each Series II tube is added 2.5 ml of cysteine in 2.5 mM distilled water.

A szűrőpapírt hat részre vágjuk (3,5 cm átmérőjű rondók) és a nyolc teszt kémcső tetejére helyezzük. A rondeleket 3-4 csepp desztillált vízzel megnedvesítjük és a teszt kémcsöveket a 40 °C hőmérsékletű vízfürdőben hagyjuk 24 órán keresztül.The filter paper was cut into six sections (3.5 cm diameters) and placed on top of the eight test tubes. The rondels are moistened with 3-4 drops of distilled water and the test tubes are left in the water bath at 40 ° C for 24 hours.

A 24 óra elteltével a papír rondeleket megvizsgáljuk. A hozzáadott vizet tartalmazó teszt kémcső esetében nem észlelünk változást.After 24 hours, the paper rondels are examined. No change is observed in the test tube containing added water.

A 4 és 6 teszt kémcsövek (melyekhez ciszteint adtunk) tetején levő papírok nagyon gyenge barnás elszíneződést mutatnak. Az 5. tesztkémcsövön levő papíron egy tömött fekete pont látható mely az ólom szulfid képződésnek tuladonítható. A fekete folt 10-15 perc elteltével jelenik meg.Papers on top of test tubes 4 and 6 (to which cysteine was added) show very slight brown discoloration. The paper on test tube 5 shows a dense black dot, which is attributed to the formation of lead sulfide. The black spot appears after 10-15 minutes.

2. példaExample 2

A humán növekedési hormon hidrofób származékának natív humán növekedési hormonná való konverziója rhGH'-t tartalmazó mintából liofilizált rhGH-t kezelünk a következők szerint, a hGH hidrofób származékának natív hGH-vá való konvertálása céljából.Conversion of the hydrophobic derivative of human growth hormone to native human growth hormone from lyophilized rhGH was treated as follows to convert the hydrophobic derivative of hGH to native hGH.

A: 4 IU hGH-t oldunk fel 2,5 ml desztillált vízben.A: 4 IU of hGH are dissolved in 2.5 ml of distilled water.

B: 4 IU hGH-t oldunk fel 2,5 ml desztillált vízben, melyet 10 percig tartó szobahőmérsékleten 100 pl merkapto etanollal végzett redukció követ. Ezután a kapott elegyet sómentesítjük PD10-et (Pharmacia, Sephadex G 25) használva 20 mM Trisbe (pH=8,6). Az oldatot 2 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten hagyjuk és hidrofób interakciós kromatográfiával analizáljuk az 1. példában leírtak szerint.B: 4 IU of hGH is dissolved in 2.5 ml of distilled water followed by reduction with 100 µl of mercapto ethanol at room temperature for 10 minutes. The resulting mixture was then desalted using 20 mM Tris pH 8.6 using PD10 (Pharmacia, Sephadex G 25). The solution was left for 2 hours at 4 ° C and analyzed by hydrophobic interaction chromatography as described in Example 1.

C: 4 IU hGH-t oldunk fel 2,5 ml 20 mM Trisben (pH=8,6). Az oldatot 2 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten hagyjuk és az 1. példában leírtak szerint hidrofób interakciós kromatográfiával analizáljuk.C: 4 IU of hGH is dissolved in 2.5 mL of 20 mM Tris pH 8.6. The solution was left for 2 hours at 4 ° C and analyzed by hydrophobic interaction chromatography as described in Example 1.

D: 12 IU hGH-t oldunk fel 7,5 ml újra hajtogatási pufferben a WO 92/03477 szabadalomban leírtak szerint: 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM Cisztein. Az oldatot 2 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten hagyjuk és az 1. példában leírtak szerint hidrofob interakciós kromatográfiával analizáljuk. A mintát ezután sómentesítjük 2 mM His-szé (pH=6,5) az 1. példában leírtak szerint hidrofob interakciós kromatográfiával analizáljuk.D: 12 IU of hGH is dissolved in 7.5 ml of refolding buffer as described in WO 92/03477: 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM Cysteine. The solution was left for 2 hours at 4 ° C and analyzed by hydrophobic interaction chromatography as described in Example 1. The sample is then desalted with 2 mM His (pH 6.5) and analyzed by hydrophobic interaction chromatography as described in Example 1.

Az eredmények azt mutatják, hogy a hajtogatási pufferben (D minta) - mely gyengén redukáló, azonban hatékony diszulfid képződést biztosít - való újra feloldás az rhGH' natív rhGH-ná való transzformációját okozza.The results show that redissolution in the folding buffer (sample D), which is a weak reducing but efficient disulfide, results in the transformation of rhGH 'to native rhGH.

A vízben vagy Trisben (pH=8,5) történő újra feloldás nem okoz konverziót (A és C minta). Ha az rhGH'-t merkapto etanollal teljesen redukáljuk az E. coli sejtekben található formával azonos hGH formát kapva ( de hidrogén diszulfid jelenléte nélkül a tápközegben) a homogenizálás előtt, helyes hajtogatás kaphatunk Trisben (pH= 8,5) a cisztein hozzáadása (B minta) nélkül. Ahogy azt fenn bemutattuk, az rhGH' 2 mM cisztein jelenlétében natív hGH-vá transzformálható. Ha az rhGH-t egy DAP1-gyel hasítandó amino terminális extenzióval rendelkező prekurzorként expresszáljuk a hasítás elvégezhető ciszteint tartalmazó tápközegben, mely elősegíti a helyes diszulfid hidakkal rendelkező natív termék képződését.Reconstitution in water or Tris (pH 8.5) does not cause conversion (samples A and C). If rhGH 'is completely reduced with mercapto ethanol to give the same form of hGH in E. coli cells (but in the absence of hydrogen disulfide in the medium) prior to homogenization, correct folding in Tris, pH 8.5, can be achieved by the addition of cysteine (B). sample). As shown above, rhGH 'can be transformed into native hGH in the presence of 2 mM cysteine. When rhGH is expressed as a precursor with an amino terminal extension to be cleaved by DAP1, the cleavage can be performed in a cysteine-containing medium, which promotes the formation of a native product having the correct disulfide bridges.

Ebben az esetben a konverzió és a hasítás megfelelően két lépésben megy végbe, először magas pH értéken a hidrofob származék konvertálásához, mely után a pH értéket lecsökkentjük az amino terminális extenzió hasításának megvalósításához. A klór ionokat tartalmazó 20 mM Trisben (pH=7,5) levő rhGH normális tisztításában az első tisztítási lépésből származó eluátum 4,5 ml mennyiségéhez 10 mM citromsavat adunk 4 °C hőmérsékleten és 0,5 ml 20 mM desztillált vízben levő ciszte in oldatot.In this case, the conversion and cleavage are suitably carried out in two steps, first at high pH to convert the hydrophobic derivative, after which the pH is lowered to effect cleavage of the amino terminal extension. In normal purification of rhGH in 20 mM Tris pH 7.5 containing chlorine ions, 4.5 ml of eluate from the first purification step are added with 10 mM citric acid at 4 ° C and 0.5 ml of cysteine in 20 mM distilled water. .

• ·• ·

- 17 • ··· · · • « · · • · · · 4 · • * ·»·»· · · ♦ ··· ·« 9 · · · · » Ezután 1,2,4,8,16,32 és 64 perc elteltével a gyártók utasításának megfelelően NAP-5 oszlopon (Pharmacia) sómentesített mintákat 25 mM Trissel eluálva kinyerjük. Az eluálás után a pH értéket 7,5-re állítjuk és a 7' peptid tartalmat az 1. példában leírtak szerint hidrofób interakciós kromatográfiával analizáljuk. Egy perc után a 7' proteinnek megfelelő csúcs kb. 75 %-kal csökkent és 4 perc után a csúcs teljesen el is tűnt. így a 7' protein valószínűleg natív proteinné konvertálódik a 2 mM ciszteinnel 4 percig tartó kezelés hatására (4 °C hőmérsékleten).- 17 • · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · After 32 and 64 minutes, the desalted samples were eluted on the NAP-5 column (Pharmacia) as eluted with 25 mM Tris. After elution, the pH is adjusted to 7.5 and the 7 'peptide content is analyzed by hydrophobic interaction chromatography as described in Example 1. After one minute, the peak corresponding to the 7 'protein was approx. It decreased by 75% and after 4 minutes the peak completely disappeared. Thus, the 7 'protein is likely to be converted to native protein upon treatment with 2 mM cysteine for 4 minutes (at 4 ° C).

Ezután a pH értéket 4-4,5-re állítjuk az esetleg jelenlevő extenzió lehasítása céljából.The pH is then adjusted to 4-4.5 to cleave any extensions that may be present.

3, példaExample 3

A humán növekedési hormon hidrofób származékának natív humán növekedési hormonná történő konverziójaConversion of a hydrophobic derivative of human growth hormone to native human growth hormone

A hajtogatási kísérleteket 2 mM cisztein koncentrációval végezzük el különböző pH értékek mellett (4,3, 6,0, 7,5). Kiindulási anyagként hGH'-t tartalmazó hGH-t használunk. A kiindulási anyag (0,7 mg/ml koncentráció) 1 ml mennyiségét a kiválasztott pH értékre állítjuk, majd 1 ml 4 mM-os EDTA-val, 4 mM Cys-nel, 40 mM Trissel, 20 mM citrosavval keverjük össze. Különböző intervallumokban a mintákat leengedjük és azonnal sómentesítjük NAP-5 oszlopon (Pharmacia) 20 mM Trissel szemben, 10 mM citromsavval állítjuk a pH értéket a fenti válsztott értékre. A HIC analízist az 1. példában leírt első említett rendszert használva végezzük el.Folding experiments were performed with 2 mM cysteine at various pHs (4.3, 6.0, 7.5). The starting material is hGH containing hGH '. 1 ml of the starting material (0.7 mg / ml) was adjusted to the selected pH and then mixed with 1 ml of 4 mM EDTA, 4 mM Cys, 40 mM Tris, 20 mM citric acid. At various intervals, the samples were drained and desalted immediately on a NAP-5 column (Pharmacia) against 20 mM Tris, adjusted to pH above with 10 mM citric acid. HIC analysis was performed using the first mentioned system described in Example 1.

A környezeti hőmérsékleten elvégzett kísérletek eredményei a következők:The results of experiments at ambient temperature are as follows:

A kiindulási anyag hGH' tartalma 8%. 4,3 pH értéken a hGH' tartalom 4 perc után 7,7 %-ra csökken, és az egy éjszakán át állni hagyott minta hGH' tartalma még mindig 6 %.The starting material had a hGH 'content of 8%. At pH 4.3, the hGH 'content decreases to 7.7% after 4 minutes and the hGH' content of the sample left overnight is still 6%.

- 18 »· 9- 18 »· 9

6,0 pH értéken a hGH' tartalom 4 perc elteltével 6,0 %-ra csökken, és 64 perc után 1,7 %-ra. 20 óra elteltével nem észlelünk hGH'-t.At pH 6.0, the hGH 'content decreases to 6.0% after 4 minutes and to 1.7% after 64 minutes. After 20 hours, no hGH 'was detected.

7,5 pH értéken a hGH' tartalom nagyon gyorsan csökken. 1 perc után 2,6 %ra, 2 perc után 1,6 %-ra csökken és 4 perc után már nem lehet hGH'-t detektálni.At pH 7.5, the hGH 'content decreases very rapidly. After 1 minute, it declines to 2.6%, after 2 minutes to 1.6%, and after 4 minutes, hGH 'is no longer detectable.

A 4 °C hőmérsékleten és 7,3 pH értéken végrehajtott konverzió eredménye a következő:The conversion at 4 ° C and pH 7.3 results in:

perc után a hGH' tartalom 2,5 %-ra csökken, 4 perc után 1 %-ra és 8 perc után nem lehet hGH'-t detektálni.After 1 min, the hGH 'content decreases to 2.5%, after 4 min to 1% and after 8 min, no hGH' is detected.

Ez azt mutatja, hogy a konverzió gyorsan és mennyiségi szempontból detektálhatóan megy végbe pH=7,5 értéken, alcsonyabb pH értéken sokkal lassabban és nem is teljes a konverzió.This shows that the conversion is detectable rapidly and quantitatively at pH 7.5, much slower at lower pH and incomplete conversion.

A hőmérséklet hatása elhanyagolható.The effect of temperature is negligible.

SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ (i) FELTALÁLÓ:SEQUENCE LIST (1) GENERAL INFORMATION (i) INVENTOR:

(A) NÉV: Novo Nordisk A/S (B) UTCA: Novo Allé (C) VÁROS: DK-2880 Bagsvaerd (E) ORSZÁG: Dánia (G) TELEFON: +45 44448888 (H) TELEFAX: +45 44490555 (I) TELEX: 37173 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME:(A) NAME: Novo Nordisk A / S (B) STREET: Novo Allé (C) CITY: DK-2880 Bagsvaerd (E) COUNTRY: Denmark (G) PHONE: +45 44448888 (H) PHONE: +45 44490555 (I) ) TELEX: 37173 (ii) TITLE OF THE INVENTION:

Eljárás polipeptid jelenlétének kimutatására és átalakítására (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 2 (iv) SZÁMÍTÓGÉPES OLVASÁSI FORMA:Procedure for Detecting and Transforming the Presence of a Polypeptide (iii) SEQ ID NO: 2 (iv) COMPUTER READING FORM:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, 1,25 # verzió (EPO) (v) JELEN ALKALMAZÁS ADATAI:(A) MEDIA TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Version 1.25 (EPO) (v) ) DETAILS OF THIS APPLICATION:

ALKALMAZÁSI SZÁM:APPLICATION NUMBER:

(vi) ELSŐBBSÉGI ADATOK:(vi) PRIORITY DATA:

(A) ALKALMAZÁSI SZÁM: DK 0445/93 (B) IKTATÁSI DÁTUM: 1993. április 20.(A) APPLICATION NUMBER: DK 0445/93 REVISION DATE: B April 20, 1993

(2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:(2) DETAILS OF SEQ ID NO: 1 SEQUENCE FEATURES:

(A) HOSSZÚSÁG: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (ív) ANTI-SENSE: nincs (v) FRAGMENT TÍPUS: belső (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:(A) LENGTH: 5 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) TYPE: single-stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (iii) HYPOTHETICAL: none (arc) ANTI-SENSE: none (v) FRAGMENT TYPE: Internal (xi) DESCRIPTION OF SEQ ID NO: 1:

Ile Val Gin Cys Arg • · 4 ·« 4Ile Val Gin Cys Arg • · 4 · «4

- 21 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:- 21 (2) SEQUENCE DETAILS OF SEQ ID NO: 2 SEQUENCE FEATURES:

(A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:(A) LENGTH: 7 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) TYPE: single-stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQ ID NO: 2

Ser Val Glu Ser Cys Gly PheSer Val Glu Ser Cys Gly Phe

Claims (7)

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATIENT INDIVIDUAL POINTS 1. Eljárás egy növekedési hormon hidrofób származékának a növekedési hormon natív formájává való konvertálására, azzal jellemezve, hogy a növekedési hormon származékát egy merkapto vegyülettel kezeljük.A method for converting a growth hormone hydrophobic derivative into a native form of a growth hormone comprising treating a growth hormone derivative with a mercapto compound. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merkapto vegyületet a ciszteint és glutationt, 2-merkapto etanolt és ditiotreitolt tartalmazó csoportból szelektáljuk.The method of claim 1, wherein the mercapto compound is selected from the group consisting of cysteine and glutathione, 2-mercapto ethanol and dithiothreitol. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merkapto vegyületet a cisztein jelenti.3. The method of claim 2, wherein the mercapto compound is cysteine. 4. Az 1-3. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merkapto vegyület koncentrációja 5 mM értékig terjed.4. Referring to 1-3. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the concentration of the mercapto compound is up to 5 mM. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a merkapto vegyület cisztein és koncentrációja 1 - 2 mM értékek közé esik.5. The method of claim 4, wherein the mercapto compound has a cysteine and a concentration of from 1 to 2 mM. 6. Az 1-5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növekedési hormont a humán növekedési hormon képviseli.6. A method according to claim 1, wherein the growth hormone is represented by human growth hormone. 7. Egy növekedési hormon hidrofób származéka jelenlétének detektálására szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy a növekedési hormon származéka egy extra kénatomot tartalmaz a natív növekedési hormonhoz viszonyítva, és a növekedési hormont egy hidrofób interakciós kromatográfiának vetjük alá és az oszlopot egy só grádiensével eluáljuk és a hidrofób származék jelenlétét detektáljuk.7. A method for detecting the presence of a hydrophobic derivative of a growth hormone, wherein the growth hormone derivative comprises an extra sulfur atom relative to the native growth hormone, and the growth hormone is subjected to hydrophobic interaction chromatography and the column is eluted with a gradient of salt and the hydrophobic compound. the presence of a derivative is detected.
HU9503020A 1993-04-20 1994-04-19 A method of detecting the presence of and converting of a polypeptide HUT73320A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK93445A DK44593D0 (en) 1993-04-20 1993-04-20 PROCEDURE FOR PREPARING A POLYPEPTIDE

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9503020D0 HU9503020D0 (en) 1995-12-28
HUT73320A true HUT73320A (en) 1996-07-29

Family

ID=8093625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9503020A HUT73320A (en) 1993-04-20 1994-04-19 A method of detecting the presence of and converting of a polypeptide

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0695310A1 (en)
JP (1) JPH08508735A (en)
KR (1) KR960701891A (en)
AU (1) AU6535594A (en)
BG (1) BG100068A (en)
CA (1) CA2160663A1 (en)
CZ (1) CZ272895A3 (en)
DK (1) DK44593D0 (en)
FI (1) FI955000A0 (en)
HU (1) HUT73320A (en)
IL (1) IL109347A0 (en)
NO (1) NO954181D0 (en)
PL (1) PL311198A1 (en)
WO (1) WO1994024157A1 (en)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9802454D0 (en) * 1998-07-08 1998-07-08 Pharmacia & Upjohn Ab Production of peptides
ZA200501841B (en) * 2002-08-28 2007-06-27 Pharmacia Corp Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof
US20040048315A1 (en) 2002-08-28 2004-03-11 Pharmacia Corporation Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof
WO2004026251A2 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Pharmacia Corporation Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein
ZA200502320B (en) * 2002-09-20 2006-10-25 Pharmacia Corp Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein
US20090131311A1 (en) 2004-12-29 2009-05-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for Preventing Formation of Trisulfide Derivatives of Polypeptides
US9005926B2 (en) 2009-10-02 2015-04-14 Biogen Idec Ma Inc. Methods of preventing and removing trisulfide bonds
DK2707383T3 (en) 2011-05-13 2018-07-23 Biogen Ma Inc PROCEDURES FOR PREVENTION AND REMOVAL OF TRISULPHIDE BINDINGS

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4985544A (en) * 1987-08-04 1991-01-15 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for renaturing fish growth hormone
US5079230A (en) * 1988-09-12 1992-01-07 Pitman-Moore, Inc. Stable bioactive somatotropins
ES2119779T3 (en) * 1990-09-05 1998-10-16 Southern Cross Biotech Pty Ltd SOLUBILIZATION OF PROTEINS IN ACTIVE FORMS.
US5151501A (en) * 1991-12-20 1992-09-29 American Cyanamid Company Method for solubilization and naturation of somatotropins utilizing sulfolane

Also Published As

Publication number Publication date
WO1994024157A1 (en) 1994-10-27
EP0695310A1 (en) 1996-02-07
IL109347A0 (en) 1994-07-31
FI955000A (en) 1995-10-19
NO954181L (en) 1995-10-19
PL311198A1 (en) 1996-02-05
KR960701891A (en) 1996-03-28
CZ272895A3 (en) 1996-03-13
NO954181D0 (en) 1995-10-19
FI955000A0 (en) 1995-10-19
BG100068A (en) 1996-12-31
HU9503020D0 (en) 1995-12-28
JPH08508735A (en) 1996-09-17
AU6535594A (en) 1994-11-08
DK44593D0 (en) 1993-04-20
CA2160663A1 (en) 1994-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chrétien et al. Isolation, purification, and characterization of γ-lipotropic hormone from sheep pituitary glands
VAN WYK et al. Evidence from radioligand assays that somatomedin-C and insulin-like growth factor-I are similar to each other and different from other somatomedins
Clark-Lewis et al. Chemical synthesis, purification, and characterization of two inflammatory proteins, neutrophil activating peptide 1 (interleukin-8) and neutrophil activating peptide 2
Jackson et al. A comparison of the major apolipoprotein from pig and human high density lipoproteins
Ramachandran et al. Selective cleavage of C-tryptophyl peptide bonds in proteins and peptides
Botes Snake Venom Toxins: THE AMINO ACID SEQUENCES OF TOXINS α AND β FROM NAJA NIVEA VENOM AND THE DISULFIDE BONDS OF TOXIN α
JPH0720993B2 (en) Growth factor
Maghuin‐Rogister et al. Luteinizing Hormone: The Primary Structures of the β‐Subunit from Bovine and Porcine Species
Kohmoto et al. Complete amino acid sequence of mouse prolactin
Forsberg et al. Separation and characterization of modified variants of recombinant human insulin-like growth factor I derived from a fusion protein secreted from Escherichia coli
ZA200102780B (en) Method for obtaining active β-NGF.
Scheffer et al. Horse pancreatic ribonuclease
Grunina et al. Recombinant human erythropoietin with additional processable protein domains: purification of protein synthesized in Escherichia coli heterologous expression system
HUT73320A (en) A method of detecting the presence of and converting of a polypeptide
BAHL Chemistry of human chorionic gonadotropin
IL91457A (en) Variant somatotropins and compositions containing them for growth enhancement and for increasing milk production in mammals
Canova-Davis et al. Transpeptidation during the analytical proteolysis of proteins
WO1996002570A1 (en) A method of converting a hydrophobic derivative of a polypeptide into the native form
Minuth et al. The phenoloxidases of the ascomycete Podospora anserina: structural differences between laccases of high and low molecular weight
EP0482124B1 (en) Somatotropin analogs
Jollès et al. Differences between the chemical structures of duck and hen egg-white lysozymes
Manson et al. Formation of lysinoalanine from individual bovine caseins
Nakagawa et al. Production of human PTH (1-34) via a recombinant DNA technique
Dopheide et al. The amino acid sequence of a protein (apovitellenin I) from the low-density lipoprotein of emu egg yolk
US5663305A (en) Somatotropin analogs

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal