HUP0103414A2

HUP0103414A2 - Nucleic acid molecules encoding an amylosucrase

Info

Publication number: HUP0103414A2
Application number: HU0103414A
Authority: HU
Inventors: Nicholas Provart; Martin Quanz
Original assignee: Planttec Biotechnologie Gmbh
Priority date: 1998-09-02
Filing date: 1998-09-02
Publication date: 2002-01-28
Also published as: JP2002524080A; EP1109916A1; CA2342124A1; HUP0103414A3; AU9535798A; WO2000014249A1

Abstract

A jelen találmány olyan nukleinsav molekulákat ír le, melyek egyamiloszacharázt kódolnak, valamint az a-1,4 glükánok és fruktóztermelésére szolgáló eljárást mutat be, ilyen nukleinsav molekulákatvagy kódolt proteineket használva. Ezenkívül leírásra kerülnek a leírtnukleinsav molekulákkal transzformált gazdasejtek is. ÓThe present invention describes nucleic acid molecules that encode an amylosucrase and provides a process for the production of α-1,4 glucans and fructose using such nucleic acid molecules or encoded proteins. In addition, the host cells transformed with the described nucleic acid molecules are also described. HE

Description

S.B.G. & Κ.S.B.G. & K.

NemzetköziInternational

Szabadalmi IrodaPatent Office

H-1062 Budapest, Andrássy út 113.H-1062 Budapest, Andrássy Street 113.

71.985/SZE Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-32371.985/SZE Phone: 34-24-950, Fax: 34-24-323

AMILOSZACHARÁZT KÓDOLÓ NUKLEINSAV MOLEKULÁKNUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING AMYLOSUCRACASE

A jelen találmány amiloszacharáz aktivitással rendelkező nukleinsav molekulákkal, valamint ilyen molekulákat tartalmazó vektorokkal kapcsolatos. Ezenkívül, a jelen találmány a leírt nukleinsav molekulákkal vagy a kódolt proteinekkel történő a-1,4 glükánok és fruktóz termelésével is kapcsolatos.The present invention relates to nucleic acid molecules having amylosucrase activity, and to vectors containing such molecules. In addition, the present invention relates to the production of α-1,4 glucans and fructose by the nucleic acid molecules described or the encoded proteins.

A lineáris a-1,4 glükánok glükóz monomerekből álló poliszacharidok, ez utóbbiak egymáshoz kizárólag a-1,4 glikozidos kötésekkel kapcsolódnak. A leggyakrabban előforduló természetes a-1,4 glükán az amilóz, a növényi keményítő alkotórésze. Mostanában egyre nagyobb jelentőséget tulajdonítanak a lineáris a-1,4 glükánok kereskedelmi alkalmazásának. Fizikokémiai tulajdonságainak köszönhetően az amilóz felhasználható színtelen, szagtalan, íztelen, nem toxikus és biológiailag lebontható filmek előállítására. Már ma különböző alkalmazási lehetőségek állnak rendelkezésünkre, például az élelmiszeriparban, a textiliparban, az üvegszál iparban és a papírgyártásban.Linear α-1,4 glucans are polysaccharides composed of glucose monomers, the latter linked to each other exclusively by α-1,4 glycosidic bonds. The most common natural α-1,4 glucan is amylose, a component of plant starch. Recently, the commercial application of linear α-1,4 glucans has gained increasing importance. Due to its physicochemical properties, amylose can be used to produce colorless, odorless, tasteless, non-toxic and biodegradable films. Various applications are already available today, for example in the food industry, textile industry, glass fiber industry and paper production.

Sikerült az amilózból olyan rostokat előállítani, melyek tulajdonságai hasonlóak a természetes cellulóz tulajdonságaihoz és melyek lehetővé teszik a cellulóz részleges vagy teljes helyettesítését a papír előállításában. Az a1,4 glükánok legfontosabb képviselőiként az amilózt felhasználják a tablettagyártásban kötőanyagként, pudingok és krémek sűrítőiként, a zselatin helyettesítőjeként, hangszigetelő fal elemek előállításában kötőanyagként és viaszos olajok áramlási tulajdonságainak javítójaként. Az a-1,4 glükánok további, mostanában figyelemfelkeltő tulajdonsága az, hogy ezen molekulák képesek inklúziós vegyületeket létrehozni szerves komplexképző anyagokkal helikális szerkezetüknek köszönhetően. Ez a tulajdonság lehetővé teszi, hogy az a-1,4 glükánokat széleskörűen alkalmazzák. A jelen megfontolás vitaminok, gyógyszerészeti vegyületek és aromás anyagok molekuláris kapszulázására, valamint anyagok keverékeinek immobilizált, lineáris a-1,4 glükánok feletti kromatográfiás elválasztására vonatkozik. Az amilóz az úgynevezett ciklodextrinek (cikloamilózokként, ciklomaltózokként is utalnak rájuk) előállítására szolgáló kiindulási anyagként is szolgálhat, ami viszont széleskörűen alkalmazható a gyógyszeriparban, az élelmiszer-feldolgozó technológiákban, a kozmetikai iparban és az analitikai szeparációs technológiában. Ezek a ciklodextrinek 6-8 monoszacharid egységből álló ciklikus malto-oligoszacharidok, melyek szabadon oldódnak vízben, azonban olyan hidrofób üreggel rendelkeznek, ami inklúziós vegyületek létrehozására használható.It has been possible to produce fibers from amylose that have properties similar to those of natural cellulose and that allow for partial or complete replacement of cellulose in paper production. As the most important representative of α1,4 glucans, amylose is used as a binder in tablet production, as a thickener for puddings and creams, as a substitute for gelatin, as a binder in the production of soundproof wall elements, and as an improver of the flow properties of waxy oils. Another recently attracting attention property of α-1,4 glucans is that these molecules are able to form inclusion compounds with organic complexing agents due to their helical structure. This property allows α-1,4 glucans to be widely used. The present consideration concerns the molecular encapsulation of vitamins, pharmaceutical compounds and aromatic substances, as well as the chromatographic separation of mixtures of substances over immobilized, linear α-1,4 glucans. Amylose can also serve as a starting material for the production of so-called cyclodextrins (also referred to as cycloamyloses, cyclomaltoses), which in turn have a wide range of applications in the pharmaceutical industry, food processing technologies, the cosmetic industry and analytical separation technology. These cyclodextrins are cyclic malto-oligosaccharides consisting of 6-8 monosaccharide units, which are freely soluble in water, but have a hydrophobic cavity that can be used to form inclusion compounds.

Jelenleg az a-1,4 glükánok, különösen a lineáris a-1,4 glükánok, amilóz formájában állíthatók elő keményítőből. Maga a keményítő két alkotórészből áll. Az egyik alkotórész az amilózt alkotja, a-1,4 kötésű glükóz egységek elágazás nélküli láncaként. A másik alkotórész az amilopektint alkotja, mely glükóz egységek erősen elágazó polimere, ahol, az a-1,4 kötéseken túl a glükóz lánc elágazhat az a-1,6 kötéseknél is. Eltérő szerkezetük és a megvalósuló fiziko-kémiai tulajdonságok következtében a két alkotórész különböző alkalmazási területeken használható. Az egyes alkotórészek tulajdonságainak közvetlen hasznosításához ezeket az alkotórészeket tiszta formában kell kinyerni. Mindkét alkotórész előállítható keményítőből, az eljárás azonban több tisztítási lépést tesz szükségessé és jelentős az anyagi és időráfordítása. Ezért, szükség van az alkotórészek egységes módon keménvítőből történő kinverésére. Ismeretes, hoov bizonvos baktériumok.Currently, α-1,4 glucans, especially linear α-1,4 glucans, can be produced from starch in the form of amylose. Starch itself consists of two components. One component is amylose, an unbranched chain of α-1,4-linked glucose units. The other component is amylopectin, a highly branched polymer of glucose units, where, in addition to α-1,4 bonds, the glucose chain can also branch at α-1,6 bonds. Due to their different structures and the resulting physicochemical properties, the two components can be used in different areas of application. In order to directly utilize the properties of the individual components, these components must be extracted in pure form. Both components can be produced from starch, but the process requires several purification steps and is time-consuming and expensive. Therefore, it is necessary to extract the components from the starch in a uniform manner. It is known that certain bacteria.

különösen a Neisseria nemzetségbe tartozók, olyan enzimeket termelnek, melyek képesek lineáris a-1,4 glükánokat szintetizálni szacharózból. Ahhoz, hogy az ilyen enzimeket fel tudjuk használni az a-1,4 glükánok hatékony termeléséhez szükség van a megfelelő DNS szekvenciák izolálására és jellemzésére.particularly those of the genus Neisseria, produce enzymes that are capable of synthesizing linear α-1,4 glucans from sucrose. To utilize such enzymes for the efficient production of α-1,4 glucans, the isolation and characterization of the appropriate DNA sequences is required.

A jelen találmány alapjául szolgáló technikai probléma így az, hogy olyan nukleinsav molekulákat és eljárásokat biztosítsunk, melyek lehetővé teszik az a-1,4 glükánok termelését.The technical problem underlying the present invention is therefore to provide nucleic acid molecules and methods that enable the production of α-1,4 glucans.

Ezen technikai probléma megoldását a jelen találmány, az igénypontokban jellemzett kiviteli alakok biztosításával éri el.The solution to this technical problem is achieved by the present invention by providing the embodiments characterized in the claims.

Ezért a jelen találmány egy amiloszacharáz enzimatikus aktivitásával rendelkező proteint kódoló nukleinsav molekulákkal kapcsolatos, melyek (a) a 2. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező proteint kódoló nukleinsav molekulákat;Therefore, the present invention relates to nucleic acid molecules encoding a protein having an amylosucrase enzymatic activity, which comprise (a) nucleic acid molecules encoding a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2;

(b) az 1. számú szekvenciában bemutatott kódoló régió nukleotid szekvenciáit tartalmazó nukleinsav molekulákat;(b) nucleic acid molecules comprising the nucleotide sequences of the coding region set forth in SEQ ID NO: 1;

(c) a 2. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező polipeptid egy analógját kódoló nukleinsav molekulákat; és (d) a genetikai kód degeneráltsága következtében a (c) pontban meghatározott nukleinsav molekula szekvenciájától eltérő szekvenciájú nukleinsav molekulákat jelent.(c) nucleic acid molecules encoding an analogue of a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; and (d) nucleic acid molecules having a sequence different from the sequence of the nucleic acid molecule defined in (c) due to the degeneracy of the genetic code.

Az 1. számú szekvenciában bemutatott kódoló régió nukleinsav szekvenciája a Neisseria polysaccharea egy amiloszacharáz enzimatikus aktivitásával rendelkező proteinjét kódolja. A jelen találmány nukleinsav molekulájának segítségével lehetővé válik olyan mikroorganizmusok és gombák, különösen élesztőgombák termelése, melyek képesek az a-1,4 glükánok szacharózból történő szintézisét katalizáló enzimet termelni.The nucleic acid sequence of the coding region shown in SEQ ID NO: 1 encodes a protein of Neisseria polysaccharea having an amylosucrase enzymatic activity. The nucleic acid molecule of the present invention enables the production of microorganisms and fungi, in particular yeasts, capable of producing an enzyme catalyzing the synthesis of α-1,4 glucans from sucrose.

A továbbiakban arra is lehetőség nyílik, hogy az a-1,4 glükánokat, különösen a lineáris a-1,4-glükánokat, valamint a tiszta fruktóz szirupot .L. .:.··.··-’··· alacsony termelési költséggel állítsuk elő a jelen találmány DNS szekvenciáinak vagy az ezek által kódolt proteinek segítségével.Furthermore, it is also possible to produce α-1,4 glucans, especially linear α-1,4-glucans, as well as pure fructose syrup at low production costs using the DNA sequences of the present invention or the proteins encoded by them.

A 2. számú szekvenciában bemutatott polipeptid egy analógját kódoló nukleotid szekvenciákat a jelen találmány körén belül olyan nukleotid szekvenciáknak tekintjük, melyek a következő jellemzőkkel rendelkező polipeptideket kódolnak:Nucleotide sequences encoding an analog of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2 are considered within the scope of the present invention to be nucleotide sequences encoding polypeptides having the following characteristics:

(a) amiloszacharáz aktivitással rendelkeznek, és előnyösen (b) a továbbiakban aminosav szekvencia szinten legalább 80 %-os, még előnyösebben legalább 85 %-os, és még előnyösebben legalább 90 %-os és különösen előnyösen legalább 95 %-os azonosságot mutatnak a 2. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciával annak teljes hosszában.(a) have amylosucrase activity, and preferably (b) further show at least 80%, more preferably at least 85%, and even more preferably at least 90% and particularly preferably at least 95% identity at the amino acid sequence level to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 over its entire length.

így a jelen találmány olyan nukleinsav molekulákra is vonatkozik, melyek egy olyan polipeptidet kódolnak, melynek szekvenciája egy vagy több pozícióban eltér a 2. számú szekvenciában bemutatott aminosav szekvenciától, de mely még mindig rendelkezik amiloszacharáz aktivitással. Az aminosav szekvencia eltérések az aminosav maradékok más aminosav maradékokkal való helyettesítéséből származnak, az aminosav maradékok előnyösen a polipeptid N- vagy C-terminusán való hozzáadásából, vagy egy vagy több aminosav maradék, előnyösen a protein N- vagy C-terminusán való deléciójából adódhatnak. A leírt protein ilyen analógjait kódoló nukleinsav molekulák létrehozását a tudomány e területén átlagosan képzett szakember ismeri.Thus, the present invention also relates to nucleic acid molecules encoding a polypeptide whose sequence differs at one or more positions from the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, but which still possesses amylosucrase activity. The amino acid sequence differences result from the substitution of amino acid residues with other amino acid residues, preferably by the addition of amino acid residues at the N- or C-terminus of the polypeptide, or by the deletion of one or more amino acid residues, preferably at the N- or C-terminus of the protein. The generation of nucleic acid molecules encoding such analogs of the described protein is within the skill of the art.

A jelen találmány olyan nukleinsav molekulákkal is kapcsolatos, melyek komplementer szálai szigorú körülmények között a fentiekben meghatározott nukleinsav molekulákkal hibridizálódnak, és melyek egy amiloszacharáz enzimatikus aktivitásával rendelkező polipeptidet kódolnak.The present invention also relates to nucleic acid molecules whose complementary strands hybridize under stringent conditions to the nucleic acid molecules defined above and which encode a polypeptide having amylosucrase enzymatic activity.

A jelen találmányban a hibridizáció kifejezés a Sambrook és munkatársai által leírt (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) szigorú körülmények közötti hibridizációt jelentik. A szigorú körülmények azt jelentik, hogy a teljes kódoló szekvencia legalább 80 %-os, előnyösen legalább 90 %os, még előnyösebben legalább 95 %-os, és előnyösen legalább 99 %-os szekvencia azonosságot mutat.In the present invention, the term hybridization refers to hybridization under stringent conditions as described by Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ^2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Stringent conditions mean that the entire coding sequence exhibits at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 99% sequence identity.

A jelen találmány szerinti molekulákhoz hibridizálódó nukleinsav molekulák izolálhatok például egy amiloszacharázt expresszáló organizmusból, például mikroorganizmusokból, különösen a Neisseria nemzetségbe tartozó baktériumokból létrehozott genom vagy cDNS könyvtárakból. Az ilyen nukleinsav molekulák azonosítása és izolálása a jelen találmány molekuláinak, ezen molekulák részeinek, vagy adott esetben ezen molekulák reverz komplementer szálainak alkalmazásával végezhető el, például standard módszerekkel végzett hibridizációval (lásd például Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).Nucleic acid molecules that hybridize to the molecules of the present invention can be isolated, for example, from genomic or cDNA libraries generated from an organism expressing amylosucrase, such as microorganisms, particularly bacteria of the genus Neisseria. The identification and isolation of such nucleic acid molecules can be accomplished using the molecules of the present invention, portions of these molecules, or optionally the reverse complementary strands of these molecules, for example by hybridization using standard methods (see, for example, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

A hibridizációhoz való próbaként, például olyan nukleinsav molekulák használhatók, melyek pontosan, vagy többé kevésbé az 1. számú szekvenciában bemutatott kódoló régió nukleotid szekvenciáját, vagy ennek részeit tartalmazzák. A hibridizációs próbaként használt fragmentek lehetnek olyan szintetikus fragmentek is, melyeket hagyományos szintetizálási módszerekkel hoztunk létre, és melyek szekvenciája lényegében azonos a jelen találmány szerinti nukleinsav molekula szekvenciájával. Miután a jelen találmány szerinti nukleinsav szekvenciákkal hibridizálódó géneket azonosítottuk és izoláltuk, a szekvenciát meg kell határozni és az ezen szekvencia által kódolt proteinek tulajdonságait elemezni kell.As probes for hybridization, for example, nucleic acid molecules can be used which contain exactly, or more or less, the nucleotide sequence of the coding region shown in SEQ ID NO: 1, or parts thereof. The fragments used as hybridization probes can also be synthetic fragments which have been produced by conventional synthesis methods and whose sequence is substantially identical to the sequence of the nucleic acid molecule of the present invention. After the genes which hybridize with the nucleic acid sequences of the present invention have been identified and isolated, the sequence must be determined and the properties of the proteins encoded by this sequence must be analyzed.

A jelen találmány nukleinsav molekuláihoz hibridizáló molekulák szintén tartalmazzák azon fent leírt nukleinsav molekulák fragmentjeit, származékait és alléi variánsait, melyek egy amiloszacharáz enzimatikus aktivitásával rendelkező proteint kódolnak. Ezért a fragmenteket a nukleinsav molekulák olyan részeiként definiáljuk, melyek elég hosszúak ahhoz, hogy egy olyan proteint kódoljanak, mely még rendelkezik az enzimatikus aktivitással. Ez magába foglalja a jelen találmány szerinti nukleinsav molekulák olyan részeit .r.. ·:· ·· * ” is, melyekből hiányzik a protein szekréciójáért felelős jelpeptidet kódoló nukleotid szekvencia. A származék kifejezés azt jelenti, hogy ezen molekulák szekvenciája egy vagy több pozícióban eltér a fent említett nukleinsav molekulák szekvenciájától, valamint azt, hogy ezek nagyfokú homológiát mutatnak ezekkel a szekvenciákkal. A homológia kifejezés legalább 80 %-os, részletesen legalább 90 %-os, előnyösen több, mint 95 %-os és még előnyösebben több, mint 98 %-os szekvencia azonosságot jelent. A fent leírt nukleinsav molekulákkal való összehasonlítás során előforduló eltéréseket okozhatja a deléció, a szubsztitúció, az inzertáció vagy a rekombináció.Molecules hybridizing to the nucleic acid molecules of the present invention also include fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules described above that encode a protein having amylosucrase enzymatic activity. Therefore, fragments are defined as portions of nucleic acid molecules that are long enough to encode a protein that still has enzymatic activity. This also includes those parts of the nucleic acid molecules of the present invention .r.. ·:· ·· * ” which lack the nucleotide sequence encoding the signal peptide responsible for the secretion of the protein. The term derivative means that the sequence of these molecules differs at one or more positions from the sequence of the above-mentioned nucleic acid molecules, and that they show a high degree of homology to these sequences. The term homology means at least 80%, in particular at least 90%, preferably more than 95% and more preferably more than 98% sequence identity. Differences occurring in comparison with the nucleic acid molecules described above may be caused by deletion, substitution, insertion or recombination.

Ezenkívül, a homológia azt jelenti, hogy funkcionális és/vagy szerkezeti egyenlőség áll fenn a megfelelő nukleinsav molekulák vagy az általuk kódolt proteinek között. A fent leírt molekulákkal homológ, és az ezen molekulák származékait képviselő nukleinsav molekulák általában azon molekulák variációi, melyek azokat módosításokat alakítják, melyek azonos biológiai funkciót biztosítanak. Ezek a variációk lehetnek természetesen előforduló variációk, például más szervezetekből származó szekvenciák, vagy mutációk; ezek a mutációk előfordulhatnak természetesen, vagy bejuttathatok a specifikus mutagenezis eszközeivel is. Ezenkívül, a variációk lehetnek szintetikusan létrehozott szekvenciák is. Az alléi variánsok lehetnek természetesen előforduló variánsok, valamint szintetikusan létrehozott variánsok, vagy rekombináns DNS technikákkal létrehozott variánsok.Furthermore, homology means that there is functional and/or structural equivalence between the corresponding nucleic acid molecules or the proteins encoded by them. Nucleic acid molecules homologous to the molecules described above and representing derivatives of these molecules are generally variations of those molecules that incorporate modifications that confer the same biological function. These variations may be naturally occurring variations, such as sequences from other organisms, or mutations; these mutations may occur naturally or may be introduced by means of specific mutagenesis. In addition, the variations may be synthetically generated sequences. Allelic variants may be naturally occurring variants, as well as synthetically generated variants, or variants generated by recombinant DNA techniques.

A jelen találmány szerinti nukleinsav molekulák különböző variánsai által kódolt proteinek bizonyos közös tulajdonságokkal rendelkeznek. Az enzim aktivitás, a molekulatömeg, az immunológiai reakcióképesség, a konformáció, stb. ezen tulajdonságok közé tartozhat, akárcsak a fizikai tulajdonságok, mint például a gélelektroforézis során mutatott mobilitás, a kromatográfiás jellemzők, a szedimentációs koefficiens, az oldékonyság, a spektroszkópiás tulajdonságok, a stabilitás, a pH optimum, a hőmérséklet optimum, stb.The proteins encoded by the various variants of the nucleic acid molecules of the present invention have certain common properties. Enzyme activity, molecular weight, immunological reactivity, conformation, etc. may be among these properties, as may physical properties such as mobility in gel electrophoresis, chromatographic characteristics, sedimentation coefficient, solubility, spectroscopic properties, stability, pH optimum, temperature optimum, etc.

.!·· ··· ·* **.!·· ··· ·* **

Egy amiloszacharáz (szacharázként: 1,4-α glükán 4-a-glikoziltranszferáz, E.C. 2.4.1.4. is utalnak rá) olyan enzim, mellyel kapcsolatban az alábbi reakcióvázlatot fogadják el:An amylosucrase (also referred to as sucrase: 1,4-α glucan 4-α-glycosyltransferase, E.C. 2.4.1.4.) is an enzyme for which the following reaction scheme is accepted:

szacharóz + (a-1,4-D-glikozil)_n ->D-fruktóz+ (a-1,4-D-glikozil)_n+1 sucrose + (α-1,4-D-glycosyl) _n ->D-fructose+ (α-1,4-D-glycosyl) _n+1

Ez a reakció egy transzglikoziláció. A transzglikoziláció akceptor molekulák jelenlétében vagy hiányában is végbe mehet. Az ilyen akceptor molekulák lehetnek poliszacharidok, például malto-oligoszacharidok, dextrin, glikogén, stb. Amikor egy ilyen akceptor molekula egy lineáris a-1,4 glükán molekulát jelent, a kapott termék egy polimer, lineáris a-1,4-glükán. Amikor az amiloszacharázzal katalizált transzglikoziláció megy végbe, ilyen akceptor molekulák hiányában, egy olyan glükánt kapunk, mely egy terminális fruktóz molekulával rendelkezik. A jelen találmány körében a-1,4-glükánként hivatkozunk az összes olyan termékre, melyet egy akceptor molekula jelenlétében vagy hiányában egy amiloszacharáz segítségével transzglikozilációval nyerhetünk.This reaction is a transglycosylation. Transglycosylation can occur in the presence or absence of acceptor molecules. Such acceptor molecules can be polysaccharides, such as malto-oligosaccharides, dextrin, glycogen, etc. When such an acceptor molecule is a linear α-1,4 glucan molecule, the resulting product is a polymeric, linear α-1,4-glucan. When amylosucrase-catalyzed transglycosylation occurs in the absence of such acceptor molecules, a glucan having a terminal fructose molecule is obtained. In the context of the present invention, all products that can be obtained by transglycosylation with an amylosucrase in the presence or absence of an acceptor molecule are referred to as α-1,4-glucan.

Egy akceptor molekula hiányában egy amiloszacharázzal végzett transzglikoziláció reakció mechanizmusát az alábbiak szerint írhatjuk le:In the absence of an acceptor molecule, the reaction mechanism of a transglycosylation carried out by amylosucrase can be described as follows:

GH-F+n(G-F) -> G_n-G-F+nF, ahol G-F szacharózt, G glükózt, F fruktózt és G_n-G-F egy a-1,4-glükánt jelent.GH-F+n(GF) -> G _n -G-F+nF, where GF represents sucrose, G glucose, F fructose and G _n -GF represents an α-1,4-glucan.

Egy akceptor molekula jelenlétében végzett reakció mechanizmust az alábbiak szerint írhatunk le:The reaction mechanism in the presence of an acceptor molecule can be described as follows:

mG-F+Gn G_n+m+mF, ahol G_n egy poliszacharid akceptor molekulát, G_n+m a poliszacharidot + az amiloszacharázzal ehhez hozzáadott a-1,4-glükán láncokat, G-F szacharózt, F fruktózt és G alükózt jelent. Az amiloszacharázzal katalizált reakciótermékei .:.. ··· ·· ” a fent leírt α-1,4 glükánok és a fruktóz. Kofaktorokra nincs szükség. Az amiloszacharáz aktivitást ezideig csupán néhány baktérium fajban találták meg, ezek közé tartoznak a Neisseria fajok (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357-362), és az enzimet csupán enzimatikus aktivitásáért vizsgálták. Okada és munkatársai szerint a Neisseria parflava-bó\ származó részlegesen tisztított enzim szacharóz hozzáadás hatására olyan glikogén-szerű poliszacharidok szintézisét eredményezi, melyek kis mértékben elágaznak (Okada et al., J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135). Hasonlóképpen, a Neisseria perflava és a Neisseria polysaccharea intravagy extracellulárisan szintetizált glükánjai bizonyos fokú elágazást mutat (Riou et al., Can. J. Microbiol. 32 (1986), 909-911). Még nem tisztázták, hogy vajon ezeket az elágazásokat az amiloszacharáz juttatja be, vagy a tisztított amiloszacharáz készítményben szennyeződésként jelen levő más enzimek. Miután ezideig nem találtak olyan enzimet, mely elágazást juttat be, úgy vélik, hogy a polimerizációt és az elágazási reakciót is az amiloszacharáz katalizálja (Okada et al., loc. cit.).mG-F+Gn G _n+m +mF, where G _n represents a polysaccharide acceptor molecule, G _n+ represents the polysaccharide + the α-1,4-glucan chains added to it by amylosucrase, GF represents sucrose, F represents fructose, and G represents allicose. The products of the amylosucrase-catalyzed reaction are the α-1,4 glucans described above and fructose. No cofactors are required. Amylosucrase activity has so far been found in only a few bacterial species, including Neisseria species (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357-362), and the enzyme has been studied only for its enzymatic activity. According to Okada et al., a partially purified enzyme from Neisseria parflava, upon the addition of sucrose, results in the synthesis of glycogen-like polysaccharides that are slightly branched (Okada et al., J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135). Similarly, the glucans synthesized intracellularly or extracellularly by Neisseria perflava and Neisseria polysaccharea show some degree of branching. (Riou et al., Can. J. Microbiol. 32 (1986), 909-911). It has not yet been clarified whether these branches are introduced by amylosucrase or by other enzymes present as impurities in the purified amylosucrase preparation. Since no enzyme has been found to introduce branches, it is believed that both the polymerization and the branching reaction are catalyzed by amylosucrase (Okada et al., loc. cit.).

A Neisseria-ban konstitutív módon expresszált enzim rendkívüli módon stabil, nagyon erősen kötődik a polimerizációs termékekhez és kompetitív módon gátolja a fruktóz (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 13031307). Egy Neisseria faj, a Neisseria polysaccharea, szekretálja az amiloszacharázt (Riou et al., loc. cit.), míg más Neisseria fajokban ez a sejtben marad. Az amiloszacharáz aktivitással rendelkező enzimek csak mikroorganizmusokban detektálhatok. Növényekben az amiloszacharázok előfordulását nem ismerjük.The constitutively expressed enzyme in Neisseria is extremely stable, binds very strongly to polymerization products, and is competitively inhibited by fructose (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 13031307). One Neisseria species, Neisseria polysaccharea, secretes amylosucrase (Riou et al., loc. cit.), while in other Neisseria species it remains intracellular. Enzymes with amylosucrase activity are only detectable in microorganisms. Amylosucrase is not known to occur in plants.

Az amiloszacharáz enzimatikus aktivitásának detektálása elérhető a szintetizált glükánok detektálásával, ahogy azt az alábbi, 3. példában leírjuk. A detektálást általában jódos festéssel végezzük. Az amiloszacharázt expresszáló bakteriális telepek például jód párával való kezeléssel azonosíthatók. Az oc-1,4 glükánokat szintetizáló telepek kékre színeződnek.Detection of the enzymatic activity of amylosucrase can be achieved by detecting the synthesized glucans, as described in Example 3 below. Detection is generally performed by iodine staining. Bacterial colonies expressing amylosucrase can be identified, for example, by treatment with iodine vapor. Colonies synthesizing α-1,4 glucans are stained blue.

A tisztított enzim enzimatikus aktivitása detektálható például szacharózt tartalmazó agaróz lemezeken. Ha a proteint hozzáadjuk egy ilyen lemezhez és 1 vagy több órán keresztül 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, az az agarózba diffundál és katalizálja a glükánok szintézisét. Ez utóbbi jód párával való kezeléssel detektálható. Ezenkívül, a protein detektálható natív poliakrilamid gélekben is. Egy natív poliakrilamid gélelektroforézis után a gélt nátrium-citrát pufferben (50 mM, pH 6.5) ekvilibráljuk és egy éjszakán keresztül szacharóz oldatban (nátrium-citrát pufferben, 5%) inkubáljuk. Ha ezt követően a gélt Lugol oldattal megfestjük, az amiloszacharáz aktivitással rendelkező proteineket tartalmazó területek kékre festődnek az a-1,4 glükánok szintézisének következtében.The enzymatic activity of the purified enzyme can be detected, for example, on agarose plates containing sucrose. When the protein is added to such a plate and incubated for 1 hour or more at 37°C, it diffuses into the agarose and catalyzes the synthesis of glucans. The latter can be detected by treatment with iodine vapor. In addition, the protein can be detected in native polyacrylamide gels. After a native polyacrylamide gel electrophoresis, the gel is equilibrated in sodium citrate buffer (50 mM, pH 6.5) and incubated overnight in a sucrose solution (sodium citrate buffer, 5%). When the gel is subsequently stained with Lugol's solution, the areas containing proteins with amylosucrase activity are stained blue due to the synthesis of α-1,4 glucans.

Egy a jelen találmánynak megfelelő nukleinsav molekula által kódolt protein molekulatömege előnyösen 63 ± 20 kDa, még előnyösebben 63 ± 15 kDa és még előnyösebben 63 ± 10 kDa, SDS-PAGE meghatározás alapján.The molecular weight of a protein encoded by a nucleic acid molecule according to the present invention is preferably 63 ± 20 kDa, more preferably 63 ± 15 kDa and even more preferably 63 ± 10 kDa, as determined by SDS-PAGE.

Egy előnyös kiviteli alakban, a jelen találmány olyan nukleinsav molekulákkal kapcsolatos, melyek egy mikroorganizmusból, különösen egy gram-negatív mikroorganizmusból, előnyösen egy Neisseria nemzetségbe tartozó baktériumból, és különösen előnyösen a Neisseria polysaccharea-bő\ származó amiloszacharázt kódolnak.In a preferred embodiment, the present invention relates to nucleic acid molecules encoding an amylosucrase derived from a microorganism, in particular a gram-negative microorganism, preferably a bacterium of the genus Neisseria, and particularly preferably Neisseria polysaccharea.

A jelen találmány szerinti nukleinsav molekulák bármilyen nukleinsav molekulák lehetnek, például RNS, vagy DNS molekulák, különösen cDNS vagy genom DNS molekulák. Lehetnek szintetikusak, részlegesen szintetikusak, vagy természetes forrásból izolált molekulák.The nucleic acid molecules of the present invention may be any nucleic acid molecules, for example RNA or DNA molecules, in particular cDNA or genomic DNA molecules. They may be synthetic, partially synthetic, or molecules isolated from natural sources.

Ezenkívül, a jelen találmány olyan vektorokkal, például plazmidokkal, fágokkal, kozmidokkal, fágmidokkal vagy mesterséges kromoszómákkal is kapcsolatos, melyek a jelen találmány szerinti nukleinsav molekulát tartalmaznak. A jelen találmány részletesen olyan vektorokkal kapcsolatos, melyekben a jelen találmány nukleinsav molekulái olyan szekvenciákhoz kötődnek, melyek biztosítják a nukleinsav molekula prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben való expresszióját. Az expresszió ebben a tekintetben transzkripciót, előnyösen transzkripciót és transzlációt jelent. Az expressziós vektorokat részletesen leírták a tudomány e területén. Egy szelekciós marker génen és a kiválasztott gazdában a replikálódást lehetővé tevő replikációs .u. .:. ·- - ·** origón túl ezek normális esetben tartalmaznak még egy a gazdasejtben aktív promótert, valamint egy transzkripciós terminációs jelet. A promoter és a terminációs hely között normális esetben legalább egy restrikciós hely vagy egy polikötő hely van, ami lehetővé teszi a kódoló DNS szekvencia inzertálását. Promoter szekvenciaként a megfelelő gén transzkripcióját normál esetben szabályozó DNS szekvencia használható, feltéve, ha az a kiválasztott szervezetben aktív. Ez a szekvencia más promoter szekvenciákkal is helyettesíthető. Olyan promóterek használhatók, melyek hatással vannak a gén vagy az indukálható promóterek konstitutív expressziójára, ami lehetővé teszi az ettől downstream irányban levő gén expressziójának szelektív szabályozását. A prokarióta gazdasejtekben történő expresszióhoz való bakteriális és virális promoter szekvenciák részletesen leírásra kerültek a tudomány e területén. A tőle downstream irányban levő gén különösen erős expresszióját lehetővé tevő promóterek közé tartoznak például a T7 promoter (Studier et al., in Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), a Iacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez, R.L. and Chamberlin, M.J., (Eds.), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, pp. 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25), az Ipi, a rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100) vagy az ompF promoter. A heterológ gének élesztőgombában való expressziójához való vektorok szintén leírásra kerültek (például Bitter et al., Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544). Ezek a vektorok a szelekciós marker génen és a baktériumokban való szaporodáshoz való replikációs origón túl tartalmaznak legalább egy további szelekciós marker gént, mely lehetővé teszi a transzformált élesztőgomba sejtek azonosítását, egy DNS szekvenciát, ami lehetővé teszi az élesztőgombában való replikációt és egy polikötőt a kívánt expressziós kazetta inzertálásához. Az expressziós kazettát promóterből, az expresszálandó DNS szekvenciából és egy a transzkript transzkripciós terminációját és poliadenilációját lehetővé tevő DNS szekvenciából szerkesztjük meg. A Saccharomyces-bö\ származó promóterek és transzkripciós terminációs jelek szintén leírásra kerültek és rendelkezésre • f « · · · ♦ · állnak. Egy expressziós vektor az élesztőgomba sejtekbe standard technikák szerinti transzformációval juttatható be (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). A vektort tartalmazó sejteket szelektáljuk és megfelelő szelekciós tápközegen szaporítjuk. Az élesztőgombák azt is lehetővé teszik, hogy az expressziós kazettát homológ rekombinációval integráljuk egy a megfelelő vektort használó sejt genomjába, ami a tulajdonság stabil öröklődéséhez vezet.Furthermore, the present invention also relates to vectors, such as plasmids, phages, cosmids, phagemids or artificial chromosomes, which contain a nucleic acid molecule according to the present invention. The present invention relates in particular to vectors in which the nucleic acid molecules of the present invention are linked to sequences which ensure the expression of the nucleic acid molecule in prokaryotic or eukaryotic host cells. Expression in this respect means transcription, preferably transcription and translation. Expression vectors have been described in detail in the art. In addition to a selectable marker gene and an origin of replication enabling replication in the selected host, they normally also contain a promoter active in the host cell and a transcription termination signal. Between the promoter and the termination site there is normally at least one restriction site or a polynucleotide site, which allows the insertion of the coding DNA sequence. As a promoter sequence, a DNA sequence that normally controls the transcription of the corresponding gene can be used, provided that it is active in the selected organism. This sequence can also be replaced by other promoter sequences. Promoters that affect the constitutive expression of the gene or inducible promoters can be used, which allows the selective control of the expression of the gene downstream thereof. Bacterial and viral promoter sequences for expression in prokaryotic host cells have been described in detail in the art. Promoters that allow particularly strong expression of the gene downstream thereof include, for example, the T7 promoter (Studier et al., in Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), the Iacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez, R.L. and Chamberlin, M.J., (Eds.), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, pp. 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25), the Ipi, the rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100) or the ompF promoter. Vectors for the expression of heterologous genes in yeast have also been described (e.g. Bitter et al., Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544). These vectors contain, in addition to a selectable marker gene and an origin of replication for propagation in bacteria, at least one additional selectable marker gene that allows the identification of transformed yeast cells, a DNA sequence that allows replication in yeast, and a polylinker for insertion of the desired expression cassette. The expression cassette is constructed from a promoter, the DNA sequence to be expressed, and a DNA sequence that allows transcriptional termination and polyadenylation of the transcript. Promoters and transcriptional termination signals from Saccharomyces have also been described and are available. An expression vector can be introduced into yeast cells by transformation using standard techniques (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Cells containing the vector are selected and propagated on appropriate selection media. Yeast also allows the expression cassette to be integrated into the genome of a cell using the appropriate vector by homologous recombination, leading to stable inheritance of the trait.

Ezenkívül, a jelen találmány egy a jelen találmány szerinti nukleinsav molekulával vagy vektorral transzformált gazdasejtekkel is kapcsolatos. Megfelelő gazdasejtek a prokarióta sejtek, mint például a mikroorganizmusok, például a baktériumok, például az E. coli , a Bacillus, a Streptococcus, stb. vagy az eukarióta sejtek, mint például a gomba sejtek, mint például a Saccharomyces cerevisiae·, növényi sejtek vagy állati sejtek, például rovar sejtek, CHO sejtek stb.In addition, the present invention also relates to host cells transformed with a nucleic acid molecule or vector of the present invention. Suitable host cells are prokaryotic cells, such as microorganisms, such as bacteria, such as E. coli, Bacillus, Streptococcus, etc. or eukaryotic cells, such as fungal cells, such as Saccharomyces cerevisiae, plant cells or animal cells, such as insect cells, CHO cells, etc.

Ezenkívül, a jelen találmány egy amiloszacharáz aktivitással rendelkező protein termelésére szolgáló eljárással is kapcsolatos, mely eljárás abból áll, hogy a gazdasejtet a jelen találmány szerint szaporítjuk olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik a protein expresszióját, majd a proteint a sejtekből és/vagy a szaporító tápközegből kinyerjük.Furthermore, the present invention also relates to a method for producing a protein having amylosucrase activity, which method comprises growing the host cell according to the present invention under conditions that allow expression of the protein, and then recovering the protein from the cells and/or the growth medium.

A jelen találmány kapcsolatos egy amiloszacharáz enzimatikus aktivitásával rendelkező proteinnel is, melyet a jelen találmány szerinti nukleinsav molekula kódol, vagy melyet a jelen találmány szerinti eljárással nyerünk.The present invention also relates to a protein having amylosucrase enzymatic activity, which is encoded by the nucleic acid molecule of the present invention or which is obtained by the method of the present invention.

Egy másik aspektusban a jelen találmány az a-1,4 glükánok és/vagy fruktóz termelésére szolgáló eljárással kapcsolatos, mely eljárás a következő lépésekből áll:In another aspect, the present invention relates to a process for producing α-1,4 glucans and/or fructose, which process comprises the following steps:

(a) az amiloszacharázt a tenyésztápközegbe szekretáló, találmány szerinti gazdasejtet szacharózt tartalmazó tápközegben szaporítjuk olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik az amiloszacharáz expresszióját és szekrécióját; és(a) the host cell of the invention secreting amylosucrase into the culture medium is grown in a medium containing sucrose under conditions that allow for the expression and secretion of the amylosucrase; and

(b) a termelt α-1,4 glükánokat és/vagy fruktózt a tenyésztápközegből kinyerjük.(b) recovering the produced α-1,4 glucans and/or fructose from the culture medium.

A fent leírt eljárás lehetővé teszi a tiszta a-1,4 glükánok in vitro ellőállítását. A Neisseria polysaccharea által expresszált amiloszacharáz egy olyan extracelluláris enzim, ami lineáris a-1,4 glükánokat szintetizál a sejten kívül a szacharózt használva kiindulási alapként. A sejtben zajló poliszacharid szintézis legtöbb reakcióútjától eltérően, sem aktivált glükóz származékokra, sem kofaktorokra nincs szükség. A kondenzált glükóz maradékok közötti α1,4 glükozidos kötések létrehozásához szükséges energia közvetlenül a szacharóz molekulában levő glükóz és fruktóz egységek közötti kötés hidrolíziséből származik.The above-described procedure allows the in vitro production of pure α-1,4 glucans. Amylosucrase expressed by Neisseria polysaccharea is an extracellular enzyme that synthesizes linear α-1,4 glucans outside the cell using sucrose as a starting material. Unlike most intracellular polysaccharide synthesis pathways, neither activated glucose derivatives nor cofactors are required. The energy required to form α1,4 glucosidic bonds between condensed glucose residues comes directly from the hydrolysis of the bond between the glucose and fructose units in the sucrose molecule.

Ezért van lehetőség az amiloszacharázt szekretáló gazdasejtek szacharózt tartalmazó tenyésztápközegben való tenyésztésére; a szekretált amiloszacharáz a tápközegben levő szacharózból a-1,4 glükánok szintéziséhez vezet. Ezek a glükánok a tenyésztápközegből izolálhatok.Therefore, it is possible to culture host cells secreting amylosucrase in a culture medium containing sucrose; the secreted amylosucrase leads to the synthesis of α-1,4 glucans from sucrose in the culture medium. These glucans can be isolated from the culture medium.

Ezenkívül, a jelen találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy nem költséges módon tiszta fruktóz szirupot állítsunk elő. A fruktóz előállítás hagyományos módszerei vagy a szacharóz enzimatikus hidrolízisével foglalkoznak egy invertáz alkalmazásával vagy a glükóz egységekben levő keményítő lebontásával, gyakran acidolízissel és ezt követően a glükóz fruktózzá történő enzimatikus konverziójával glükóz izomeráz használatával. Mindkét módszer a glükóz és fruktóz keverékét eredményezi. A két alkotórészt szeparálni kell egymástól kromatográfiás eljárással, mely időigényes és drága.Furthermore, the process of the present invention allows for the inexpensive production of pure fructose syrup. Conventional methods of fructose production involve either enzymatic hydrolysis of sucrose using an invertase or the breakdown of starch into glucose units, often by acidolysis, followed by enzymatic conversion of glucose to fructose using glucose isomerase. Both methods result in a mixture of glucose and fructose. The two components must be separated by chromatography, which is time-consuming and expensive.

A jelen találmány szerinti eljárásban a szubsztrát - azaz a szacharóz - a két reakcióterméktől - a fruktóztól és az a-1,4 glükánoktól - szeparálása, vagy a két reakciótermék elválasztása elérhető például olyan membránok alkalmazásával, melyek a fruktózt átengedik, a szacharózt vagy glükánokat azonban nem. Ha a fruktózt folyamatosan eltávolítjuk egy ilyen membránnal,In the process of the present invention, the separation of the substrate, i.e. sucrose, from the two reaction products, fructose and α-1,4 glucans, or the separation of the two reaction products, can be achieved, for example, by using membranes that allow fructose to pass through but not sucrose or glucans. If fructose is continuously removed by such a membrane,

a szacharóz többé-kevésbé teljes mértékben fruktózzá és lineáris glükánokká konvertálódik.sucrose is more or less completely converted to fructose and linear glucans.

Az amiloszacharázt termelő sejtek előnyösen a két membrán közé helyezett hordozó anyagon immobilizálhatók, mely membránok közül az egyik lehetővé teszi a fruktóz áthatolását, a szacharózét vagy a glükánokét viszont nem és a másik lehetővé teszi a szacharóz áthaladását, azonban a glükánokét nem. A szubsztrátot azon a membránon keresztül biztosítjuk, mely a szacharózt átengedi. A szintetizált glükánok a két membrán közötti térben maradnak és a fruktózt folyamatosan eltávolítjuk az egyensúlyban levő reakcióelegyből azon a membránon keresztül, amelyik csak a fruktóz áthaladását teszi lehetővé. Egy ilyen elrendezés a reakciótermékek hatékony szeparálását teszi lehetővé és így, inter alia a tiszta fruktóz termelését.Amylosucrase-producing cells are preferably immobilized on a support material placed between two membranes, one of which allows the passage of fructose but not sucrose or glucans, and the other allows the passage of sucrose but not glucans. The substrate is provided through the membrane that allows the passage of sucrose. The synthesized glucans remain in the space between the two membranes and fructose is continuously removed from the equilibrium reaction mixture through the membrane that only allows the passage of fructose. Such an arrangement allows for efficient separation of the reaction products and thus, inter alia, the production of pure fructose.

Az amiloszacharáz tiszta fruktóz termelésében való alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy az összehasonlíthatóan olcsóbb szacharóz szubsztrát használható kiindulási anyagként, valamint a fruktóz egyszerű módon izolálható a reakcióelegyből kromatográfiás eljárások nélkül.The use of amylosucrase in the production of pure fructose has the advantage that the comparatively cheaper sucrose substrate can be used as a starting material, and that fructose can be isolated from the reaction mixture in a simple manner without chromatographic procedures.

Egy előnyös kiviteli alakban az eljárásban használt gazdasejt egy mikroorganizmus, például a Saccharomyces cerevisiae vagy az E. coli és még előnyösebben a gazdasejtet immobilizáljuk. Az immobilizálást általában a sejtek megfelelő anyagba, például alginátba, poliakrilamidba, zselatinba, cellulózba vagy kitozánba való inklúziójával érjük el. Ezenkívül lehetőség van a sejtek hordozó anyagra való adszorbeálására vagy ahhoz való kovalens kötésére (Brodelius and Mosbach, in Methods in Enzymology, Vol. 135:173175) is. A sejtek immobilizálásának az az előnye, hogy jelentősen nagyobb sejtsűrűség érhető el, mint a folyékony tenyészetben való szaporításánál, ami nagyobb produktivitást eredményez. A tenyészet kevertetése és levegőztetése, valamint a sterilitás fenntartásának költségei csökkennek. Lényeges szempont, hogy az immobilizáció folyamatos termelést tesz lehetővé, így a fermentációs eljárások során rendszeresen előforduló hosszú improduktív fázisok elkerülhetők, vagy legalábbis lényegesen csökkenthetők. Ahogy korábban említettük, mikroorganizmusként az amiloszacharázt expresszáló élesztőgomba sejtek használhatók a folyamatban. Az élesztőgombákhoz való tenyésztési módszerek részletesen leírásra kerültek (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Lehetőség van az élesztőgombák immobilizálására is, és ezt az eljárást az etanol kereskedelmi célú termelésében már használják is (Nagashima et al., in Methods in Enzymology 136, 394-405; Nojima and Yamada, in Methods in Enzymology 136, 380-394).In a preferred embodiment, the host cell used in the method is a microorganism, such as Saccharomyces cerevisiae or E. coli, and more preferably the host cell is immobilized. Immobilization is generally achieved by inclusion of the cells in a suitable material, such as alginate, polyacrylamide, gelatin, cellulose or chitosan. It is also possible to adsorb or covalently bind the cells to a carrier material (Brodelius and Mosbach, in Methods in Enzymology, Vol. 135:173175). The advantage of immobilizing cells is that significantly higher cell densities can be achieved than when growing them in liquid culture, resulting in higher productivity. The costs of stirring and aerating the culture and maintaining sterility are reduced. An important aspect is that immobilization allows continuous production, so that the long unproductive phases that regularly occur during fermentation processes can be avoided or at least significantly reduced. As mentioned earlier, yeast cells expressing amylosucrase can be used as microorganisms in the process. Culture methods for yeasts have been described in detail (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). It is also possible to immobilize yeasts, and this method is already used in the commercial production of ethanol (Nagashima et al., in Methods in Enzymology 136, 394-405; Nojima and Yamada, in Methods in Enzymology 136, 380-394).

Azonban szacharózt tartalmazó tenyésztápközegben az amiloszacharázt szekretáló élesztőgombák alkalmazása az a-1,4 glükánok szintézisére még nem teljesen használható, mivel az élesztőgombák egy olyan inzvertázt szekretálnak, ami hidrolizálja az extracelluláris szacharózt. Az élesztőgomba a kapott hexózokat egy hexóz transzporteren keresztül importálja. Gozalbo és Hohmann (Current Genetics 17 (1990), 77-79), azonban leírtak egy olyan élesztőgomba törzset, amely egy hibás suc2 gént hordoz és ami éppen ezért nem képes invertázt szekretálni. Ezek az élesztőgomba sejtek nem tartalmaznak transzport rendszert sem a szacharóz sejtekbe való importálásához. Ha egy ilyen törzset módosítunk a jelen találmány nukleinsav molekulájával oly módon, hogy az egy amiloszacharázt szekretál a tenyésztápközegbe, az amiloszacharáz a-1,4 glükánokat szintetizál, ha a tenyésztápközeg szacharózt tartalmaz. A reakciótermékként keletkező fruktózt az élesztőgomba ezt követően importálhatja.However, the use of yeasts secreting amylosucrase in sucrose-containing culture media for the synthesis of α-1,4 glucans is not yet fully feasible, since yeasts secrete an invertase that hydrolyzes extracellular sucrose. The yeast imports the resulting hexoses via a hexose transporter. Gozalbo and Hohmann (Current Genetics 17 (1990), 77-79), however, described a yeast strain that carries a defective suc2 gene and is therefore unable to secrete invertase. These yeast cells also do not contain a transport system for the import of sucrose into the cells. If such a strain is modified with the nucleic acid molecule of the present invention so that it secretes an amylosucrase into the culture medium, the amylosucrase will synthesize α-1,4 glucans when the culture medium contains sucrose. The fructose produced as a reaction product can then be imported by the yeast.

Ezenkívül a jelen találmány kapcsolatos egy az a-1,4 glükánok és/vagy fruktóz in vitro termelésére szolgáló eljárással is, mely eljárás magába foglalja azt a lépést, amikor a jelen találmány szerinti proteint érintkezésbe hozzuk egy szacharózt tartalmazó oldattal olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik a szacharóz a-1,4 glükánokká és fruktózzá való konverzióját, majd a termelt a-1,4 glükánokat és a fruktózt kinyerjük az oldatból.Furthermore, the present invention relates to a method for the in vitro production of α-1,4 glucans and/or fructose, which method comprises the step of contacting the protein of the present invention with a sucrose-containing solution under conditions that allow the conversion of sucrose to α-1,4 glucans and fructose, and then recovering the α-1,4 glucans and fructose produced from the solution.

Részletesen, az a-1,4 glükánokat egy sejt-mentes enzim készítmény segítségével is szintetizálni lehet in vitro. Ez úgy valósítható meg, hogy például egy szacharóz mentes tenyésztápközegben szaporítjuk az amiloszacharázt szekretáló gazdasejteket, lehetővé téve az amiloszacharázIn detail, α-1,4 glucans can also be synthesized in vitro using a cell-free enzyme preparation. This can be achieved, for example, by growing host cells secreting amylosucrase in a sucrose-free culture medium, allowing the amylosucrase to be produced.

expresszióját, amíg a sejtek elérik a stacioner szaporodási fázist. A sejtek tenyésztápközegből való eltávolítása után a szekretált enzimet centrifugálással kinyerhetjük a felülúszóból. Ezután az enzim hozzáadható a szacharózt tartalmazó oldatokhoz az a-1,4 glükánok és a fruktóz szintetizálása céljából. Az a-1,4 glükánok közvetlenül a szacharózt tartalmazó tenyésztápközegben való szintéziséhez képest ez a módszer azért előnyös, mert a reakció körülmények jobban ellenőrizhetők és a reakciótermékek lényegében tisztábbak és a továbbiakban könnyebben tisztíthatok.expression until the cells reach stationary phase of growth. After removal of the cells from the culture medium, the secreted enzyme can be recovered from the supernatant by centrifugation. The enzyme can then be added to sucrose-containing solutions to synthesize α-1,4 glucans and fructose. Compared to the synthesis of α-1,4 glucans directly in sucrose-containing culture medium, this method has the advantage that the reaction conditions can be more controlled and the reaction products are substantially purer and easier to purify.

Az enzim a tenyésztápközegből hagyományos tisztítási technikákkal tisztítható, például precipitációval, ioncserés kromatog ráfiéval, affinitás kromatográfiával, gélszűréssel, HPLC reverz fázisú kromatográfiával, és más hasonló eljárásokkal.The enzyme can be purified from the culture medium by conventional purification techniques, such as precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration, HPLC reverse phase chromatography, and other similar methods.

A továbbiakban arra is lehetőség van, hogy egy polipeptidet expresszáljunk az expressziós vektorba inzertált DNS szekvencia módosításával, ami egy olyan polipeptidet eredményez, amely könnyebben izolálható a tenyésztápközegből bizonyos tulajdonságoknak köszönhetően. Az enzim fúziós proteinként is expresszálható egy másik polipeptid szekvenciával együtt, melynek specifikus kötési tulajdonságai lehetővé teszik a fúziós protein affinitás kromatográfiával történő izolálását.It is also possible to express a polypeptide by modifying the DNA sequence inserted into the expression vector, resulting in a polypeptide that is more easily isolated from the culture medium due to certain properties. The enzyme can also be expressed as a fusion protein together with another polypeptide sequence whose specific binding properties allow the fusion protein to be isolated by affinity chromatography.

Az ismert technikák közé tartoznak például a fúziós proteinként való expresszió a glutation S transzferázzal együtt, majd az ezt követő tisztítás affinitás kromatográfiával glutation oszlopon, a glutation S transzferáz glutationhoz való affinitásának felhasználásával (Smith and Johnson, Gene 67 (1988), 31-40). Egy másik ismert technika a fúziós proteinként való expresszió a maltóz kötő proteinnel (MBP) együtt, és az ezt követő tisztítás amilóz oszlopon (Guan et al., Gene 67 (1988), 21-30; Maina et al., Gene 74 (1988), 365-373).Known techniques include, for example, expression as a fusion protein with glutathione S transferase followed by purification by affinity chromatography on a glutathione column, utilizing the affinity of glutathione S transferase for glutathione (Smith and Johnson, Gene 67 (1988), 31-40). Another known technique is expression as a fusion protein with maltose binding protein (MBP) followed by purification on an amylose column (Guan et al., Gene 67 (1988), 21-30; Maina et al., Gene 74 (1988), 365-373).

Egy előnyös kiviteli alakban az amiloszacharázt egy ilyen eljárásban immobilizáljuk.In a preferred embodiment, amylosucrase is immobilized in such a process.

Az a-1,4 glükánok szintéziséhez a tisztított enzim szacharóz tartalmú oldathoz való közvetlen hozzáadásának lehetőségén túl létezik egy olyan alternatíva is, melynek során az enzimet egy hordozó anyagon immobilizáljuk. Az ilyen immobilizálás azt az előnyt nyújtja, hogy az enzim, mint szintézis katalizátor könnyen visszanyerhető és többször is felhasználható. Miután az enzimek tisztítása általában nagyon időigényes és költséges, az enzimek immobilizálása és újrahasznosítása jelentős költségcsökkentést jelent. Másik előny, a reakciótermékek nagy fokú tisztasága, ami többek között annak a ténynek köszönhető, hogy a reakció körülmények jobban szabályozhatók, ha immobilizált enzimek kerülnek felhasználásra. Az reakciótermékként nyert oldhatatlan lineáris glükánok ezután könnyen tovább tisztíthatok.In addition to the possibility of directly adding the purified enzyme to a sucrose-containing solution for the synthesis of α-1,4 glucans, there is also an alternative in which the enzyme is immobilized on a support material. Such immobilization offers the advantage that the enzyme as a synthesis catalyst can be easily recovered and reused. Since the purification of enzymes is usually very time-consuming and expensive, the immobilization and recycling of enzymes represents a significant cost reduction. Another advantage is the high purity of the reaction products, which is due, among other things, to the fact that the reaction conditions can be better controlled when immobilized enzymes are used. The insoluble linear glucans obtained as reaction products can then be easily purified further.

Számos hordozó anyag áll rendelkezésre az olyan proteinek immobilizálásához, melyek hordozó anyagokhoz kapcsolhatók kovalens vagy nem kovalens kötésekkel (áttekintéshez lásd a: Methods in Enzymology Vol. 135, 136 and 137). A széleskörűen alkalmazott hordozó anyagok például az agaróz, a cellulóz, a poliakrilamid, a kovaföld és a nylon.A variety of support materials are available for immobilizing proteins that can be linked to support materials by covalent or non-covalent bonds (for a review, see Methods in Enzymology Vol. 135, 136 and 137). Examples of widely used support materials include agarose, cellulose, polyacrylamide, diatomaceous earth, and nylon.

Az amiloszacharáz aktivitással rendelkező proteinek alkalmazásának további lehetősége az, hogy ezeket a proteineket ciklodextrinek termelésére használjuk. A ciklodextrineket a keményítő lebontásával állítják elő a ciklodextrin transzglikoziláz segítségével (EC 2.4.1.19), melyet a Bacillus macerans-bó\ állítanak elő. A keményítő elágazása miatt a glükóz egységek csupán 40 %-át lehet ciklodextrinekké konvertálni ezzel a rendszerrel. Az amiloszacharáz aktivitással rendelkező, lényegében tiszta proteinek biztosításával lehetőség van a ciklodextrinek szacharóz alapú szintetizálására az amiloszacharáz és a ciklodextrin transzglikoziláz egyidejű aktivitásával, az amiloszacharáz a szacharózból történő lineáris glükánok szintézisét katalizálja és a ciklodextrin transzglikoziláz ezen glükánok ciklodextrinekké történő konverzióját.A further potential application of proteins with amylosucrase activity is to use these proteins for the production of cyclodextrins. Cyclodextrins are produced by the degradation of starch using cyclodextrin transglycosylase (EC 2.4.1.19), which is produced from Bacillus macerans. Due to the branching of starch, only 40% of the glucose units can be converted to cyclodextrins by this system. By providing substantially pure proteins with amylosucrase activity, it is possible to synthesize cyclodextrins from sucrose by the simultaneous activity of amylosucrase and cyclodextrin transglycosylase, with amylosucrase catalyzing the synthesis of linear glucans from sucrose and cyclodextrin transglycosylase catalyzing the conversion of these glucans to cyclodextrins.

A találmányban a következő rövidítéseket használjuk:The following abbreviations are used in the invention:

IPTG izopropil-p-D-tiogalakto-piranozidIPTG isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside

A találmányban a következő tápközegeket és oldatokat használjuk:The following media and solutions are used in the invention:

YT tápközeg YT medium 8 g bacto-tripton 5 g élesztőkivonat 5 g NaCI 1000 ml ddH₂O hozzáadással 8 g bacto-tryptone 5 g yeast extract 5 g NaCl 1000 ml ddH ₂ O added YT lemezek YT records YT tápközeg 15 g bacto-agarral/1000 ml YT nutrient medium with 15 g bacto-agar/1000 ml Lugol-oldat Lugol's solution 12 g KI 6 g l₂ 1,8 I ddH₂O víz hozzáadással 12 g KI 6 gl ₂ 1.8 I ddH ₂ O with the addition of water

A következőkben bemutatott példák csak a találmány illusztrálására szolgálnak.The examples presented below are intended to illustrate the invention only.

1. példaExample 1

Egy amiloszacharáz aktivitást kódoló genom DNS szekvencia izolálása Neisseria polysaccharea-bő\Isolation of a genomic DNA sequence encoding amylosucrase activity from Neisseria polysaccharea

Egy amiloszacharáz aktivitást kódoló, Neisseria polysaccharea-bó\ származó DNS szekvencia izolálásához először egy genom DNS könyvtárat hozunk létre. A Neisseria polysaccharea sejteket Columbia véragaron (Difco) szaporítjuk 2 napig, 37°C hőmérsékleten. A kapott telepeket összegyűjtjük a lemezekről. Genom DNS-t izolálunk Ausubel és munkatársai módszerét használva (Current Protocols in Molecular Biology (1987), J. Wiley & Sons, NY), majd felhasználjuk. Az így nyert DNS-t részlegesen emésztetjük Sau3A restrikciós endonukleázzal. A kapott DNS fragmenteket a BamHI-gyel emésztett pBluescript SK(-) vektorba ligáljuk. A ligálási termékeket E. coli XL1-Blue sejtekbe transzformáljuk. Szelekciójukhoz a sejteket szelekciós markerként ampicillint tartalmazó YT lemezekre szélesztjük. A szelekciós tápközeg még 5 % szacharózt és 1 mM IPTG-t is tartalmaz. Egy éjszakán át tartó, 37°C hőmérsékleten végzett inkubálás után a létrejött bakteriális telepeket jóddal megfestjük oly módon, hogy jód kristályokat helyezünk a petri-csészék fedelébe és a bakteriális telepeket tartalmazó tenyész lemezeket fordítva a petri csészékre helyezzük 10 percre. A szobahőmérsékleten elpárolgó jód kékre festi a tenyész lemezek azon régióit, melyek amilóz-szerű glükánokat tartalmaznak. A kék udvarral rendelkező baktérium telepekből plazmid DNS-t izolálunk Bimbóim & Doly módszerét használva (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523). Az említett DNS-t E. coli SURE sejtekbe transzformáljuk. A transzformált sejteket szelekciós markerként ampicillint tartalmazó YT lemezekre transzformáljuk. A pozitív kiónokat izoláljuk.To isolate a DNA sequence encoding amylosucrase activity from Neisseria polysaccharea, a genomic DNA library was first constructed. Neisseria polysaccharea cells were grown on Columbia blood agar (Difco) for 2 days at 37°C. The resulting colonies were collected from the plates. Genomic DNA was isolated using the method of Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (1987), J. Wiley & Sons, NY) and used. The DNA thus obtained was partially digested with Sau3A restriction endonuclease. The resulting DNA fragments were ligated into the BamHI-digested pBluescript SK(-) vector. The ligation products were transformed into E. coli XL1-Blue cells. For their selection, the cells were plated on YT plates containing ampicillin as a selection marker. The selection medium also contains 5% sucrose and 1 mM IPTG. After overnight incubation at 37°C, the resulting bacterial colonies are stained with iodine by placing iodine crystals in the lids of the Petri dishes and inverting the culture plates containing the bacterial colonies onto the Petri dishes for 10 minutes. The iodine, which evaporates at room temperature, stains the regions of the culture plates containing amylose-like glucans blue. Plasmid DNA is isolated from the bacterial colonies with a blue halo using the method of Bimbóim & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523). The DNA is transformed into E. coli SURE cells. The transformed cells are transformed onto YT plates containing ampicillin as a selection marker. The positive clones are isolated.

2. példaExample 2

A pNB2 plazmid genom DNS inzertjének szekvencia analíziseSequence analysis of the genomic DNA insert of plasmid pNB2

Az 1. példa szerint nyert E. coli kiónból egy rekombináns plazmidot izolálunk. A restrikciós analízis azt mutatja, hogy az említett plazmid egy olyan ligálási termék, ami két vektor molekulát és egy megközelítően 4,2 kb hosszúságú genom fragmentet tartalmaz. A plazmidot a Pstl restrikciós endonukleázzal emésztetjük és a genom fragmentet izoláljuk (GeneClean, Bio101). Az így nyert fragmentet a pBluescript II SK vektorba ligáljuk, Pstlgyel linearizáljuk, ami a Pstl és Smal restrikciós helyek duplikálását eredményezi. A ligálási terméket E. coli sejtekbe transzformáljuk és ez utóbbiakat ampicillint tartalmazó lemezekre helyezzük a szelektáláshoz. A pozitív kiónokat izoláljuk. Ezen telepek egyikéből egy plazmidot izolálunk és genom DNS-e szekvenciájának egy részét standard technikákat használva meghatározzuk a didezoxi módszert használva (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). A teljes inzert megközelítően 4,2 kb hosszúságú. A nukleotid szekvenciát meghatároztuk és az 1. számú szekvenciában mutatjuk be.A recombinant plasmid is isolated from the E. coli clone obtained according to Example 1. Restriction analysis shows that said plasmid is a ligation product containing two vector molecules and a genome fragment of approximately 4.2 kb in length. The plasmid is digested with the restriction endonuclease PstI and the genome fragment is isolated (GeneClean, Bio101). The fragment thus obtained is ligated into the pBluescript II SK vector, linearized with PstI, resulting in duplication of the PstI and SmaI restriction sites. The ligation product is transformed into E. coli cells and the latter are plated on ampicillin-containing plates for selection. Positive clones are isolated. A plasmid was isolated from one of these colonies and a portion of its genomic DNA sequence was determined using standard techniques using the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). The entire insert is approximately 4.2 kb in length. The nucleotide sequence was determined and is shown in SEQ ID NO:1.

3. példaExample 3

Az extracelluláris amiloszacharáz aktivitás expressziója transzformált E. coli sejtekben (a) Amiloszacharáz aktivitás detektálása az YT lemezeken való növekedés alattExpression of extracellular amylosucrase activity in transformed E. coli cells (a) Detection of amylosucrase activity during growth on YT plates

Az extracelluláris amiloszacharáz aktivitás expressziójához E. coli sejteket transzformálunk az izolált plazmid vektorral standard technikákat használva. A transzformált törzs egy telepét YT lemezeken (1,5 % agar, 100 pg/ml ampicillin, 5 % szacharóz, 0,2 mM IPTG) inkubáljuk egy éjszakán keresztül, 37°C hőmérsékleten. Az amiloszacharáz aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a telepeket jód párába helyezzük. Az amiloszacharázt expresszáló telepek kék koronával rendelkeznek. Az amiloszacharáz aktivitás megfigyelhető akkor is, ha IPTG nincs jelen, feltételezhetően az endogén amiloszacharáz promóterek aktivitásának köszönhetően.For the expression of extracellular amylosucrase activity, E. coli cells were transformed with the isolated plasmid vector using standard techniques. A colony of the transformed strain was incubated overnight on YT plates (1.5% agar, 100 pg/ml ampicillin, 5% sucrose, 0.2 mM IPTG) at 37°C. Amylosucrase activity was determined by placing the colonies in iodine vapor. Colonies expressing amylosucrase had a blue crown. Amylosucrase activity was observed even in the absence of IPTG, presumably due to the activity of endogenous amylosucrase promoters.

(b) Az amiloszacharáz aktivitás detektálása YT tápközegben való szaporodás alatt(b) Detection of amylosucrase activity during growth in YT medium

Az extracelluláris amiloszacharáz aktivitás expressziójához E. coli sejteket transzformálunk izolált plazmid vektorral standard technikáknak megfelelően. Az YT tápközeget (100 pg/ml ampicillin, 5 % szacharóz) a transzformált törzs egy telepével beoltjuk. A sejteket egy éjszakán keresztül 37°C hőmérsékleten inkubáljuk folyamatos rázatás mellett (rotációs keverőben, 150-200 percenkénti fordulatszámon). Az amiloszacharáz által katalizált reakcióterméket úgy detektáljuk, hogy Lugol oldatot adunk a tenyészet felülúszóhoz, ami kék elszíneződést eredményez.For the expression of extracellular amylosucrase activity, E. coli cells were transformed with the isolated plasmid vector according to standard techniques. YT medium (100 pg/ml ampicillin, 5% sucrose) was inoculated with a single colony of the transformed strain. The cells were incubated overnight at 37°C with continuous shaking (rotary shaker, 150-200 rpm). The reaction product catalyzed by amylosucrase was detected by adding Lugol's solution to the culture supernatant, which resulted in a blue coloration.

(c) Az amiloszacharáz aktivitás detektálása szacharóz jelenlétében tenyésztett, transzformált E. coli sejtek tenyészet felülúszójában(c) Detection of amylosucrase activity in the culture supernatant of transformed E. coli cells grown in the presence of sucrose

Az extracelluláris amiloszacharáz aktivitás expressziójához, E. coli sejteket transzformálunk az izolált plazmid vektorral, standard technikákat használva. YT tápközeget (100 pg/ml ampicillin) inokulálunk a transzformált törzs egy telepével. A sejteket egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37°C hőmérsékleten folyamatos rázatás mellett (rotációs keverő, 150-200 percenkénti fordulatszám). A sejteket ezután centrifugálással (30 perc, 4°C hőmérséklet, 5500 rpm, JA10 Beckmann rotor) eltávolítjuk. A felülúszót egy 0,2 pm-es szűrőn (Schleicher & Schuell) átszűrjük steril körülmények között.For the expression of extracellular amylosucrase activity, E. coli cells were transformed with the isolated plasmid vector using standard techniques. YT medium (100 pg/ml ampicillin) was inoculated with a single colony of the transformed strain. The cells were incubated overnight at 37°C with continuous shaking (rotary shaker, 150-200 rpm). The cells were then removed by centrifugation (30 min, 4°C, 5500 rpm, JA10 Beckmann rotor). The supernatant was filtered through a 0.2 µm filter (Schleicher & Schuell) under sterile conditions.

Az amiloszacharáz aktivitást a következők szerint detektáljuk:Amylosucrase activity is detected as follows:

(i) a felülúszót szacharózt tartalmazó agar lemezen inkubáljuk. 40 pl felülúszót helyezünk az agar lemezre (5 % szacharóz 50 mM nátrium citrát pufferben, pH 6,5) vágott üregbe és legalább 1 órán keresztül inkubáljuk 37°C hőmérsékleten. Az amiloszacharáz által katalizált reakciótermékeit jód párával való festéssel detektáljuk. A reakciótermékek jelenlétét a kékes festődés mutatja.(i) Incubate the supernatant on a sucrose agar plate. 40 µl of supernatant is placed in a well cut on the agar plate (5% sucrose in 50 mM sodium citrate buffer, pH 6.5) and incubated for at least 1 hour at 37°C. The reaction products catalyzed by amylosucrase are detected by staining with iodine vapor. The presence of the reaction products is indicated by a bluish coloration.

(ii ) vagy a felülúszó proteinjeinek gél elektroforetikus szeparálásával végezzük egy natív gélben majd a reakciótermékeket gélen detektáljuk szacharózzal való inkubálás után. 40-80 μΙ felülúszót szeparálunk gél elektroforézissel 80 %-os natív poliakrilamid gélen (0,375 M Tris pH 8,8) 100 V feszültségen. Ezután a gélt kétszer ekvilibráljuk 15 percig megközelítően 100 ml 50 mM nátrium-citrát pufferben (pH 6,5) és egy éjszakán át inkubáljuk pH 6,5 értékű nátrium-citrát puffer/5 % szacharózban. Az amiloszacharáz által katalizált reakciótermékének láthatóvá tételéhez a gélt Lugol oldatban mossuk. Az amiloszacharáz aktivitással rendelkező sávok kékre festődnek.(ii) or by gel electrophoretic separation of the supernatant proteins in a native gel and detection of the reaction products on the gel after incubation with sucrose. 40-80 μΙ of supernatant is separated by gel electrophoresis on an 80% native polyacrylamide gel (0.375 M Tris pH 8.8) at 100 V. The gel is then equilibrated twice for 15 minutes in approximately 100 ml of 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.5) and incubated overnight in sodium citrate buffer/5% sucrose at pH 6.5. To visualize the reaction product catalyzed by amylosucrase, the gel is washed in Lugol's solution. Bands with amylosucrase activity are stained blue.

4. példaExample 4

A glükánok in vitro termelése részlegesen tisztított amiloszacharázzalIn vitro production of glucans with partially purified amylosucrase

Az extracelluláris amiloszacharáz aktivitás expressziójához E. coli sejteket transzformálunk az izolált plazmid vektorral standard technikákat használva. YT tápközeget (100 μg/ml ampicillin) inokulálunk a transzformált törzs egy telepével. A sejteket egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37°C hőmérsékleten folyamatos rázatás mellett (rotációs keverő, 150-200 percenkénti fordulatszám). A sejteket ezután centrifugálással (30 perc, 4°C hőmérséklet, 5500 rpm, JA10 Beckmann rotor) eltávolítjuk. A felülúszót egy 0,2 pm-es szűrőn (Schleicher & Schuell) átszűrjük steril körülmények között. A felülúszót ezután 200-szor koncentráljuk egy Amicon kamrát (YM30 membrán, melynek kizáró mérete 30 kDa, Amicon) használva nyomás alatt (p=3 bar). A koncentrált felülúszót hozzáadjuk 50 ml szacharóz oldathoz (5 % szacharóz 50 mM nátrium-citrát pufferben, pH 6,5). A teljes oldatot 37°C hőmérsékleten inkubáliuk. Fehéres oldhatatlan poliszacharidok képződnek.For the expression of extracellular amylosucrase activity, E. coli cells were transformed with the isolated plasmid vector using standard techniques. YT medium (100 μg/ml ampicillin) was inoculated with a colony of the transformed strain. The cells were incubated overnight at 37°C with continuous shaking (rotary shaker, 150-200 rpm). The cells were then removed by centrifugation (30 min, 4°C, 5500 rpm, JA10 Beckmann rotor). The supernatant was filtered through a 0.2 µm filter (Schleicher & Schuell) under sterile conditions. The supernatant was then concentrated 200-fold using an Amicon chamber (YM30 membrane, cut-off size 30 kDa, Amicon) under pressure (p=3 bar). The concentrated supernatant is added to 50 ml of sucrose solution (5% sucrose in 50 mM sodium citrate buffer, pH 6.5). The entire solution is incubated at 37°C. Whitish insoluble polysaccharides are formed.

5. példaExample 5

A 4. példából származó, amiloszacharázzal szintetizált reakciótermékek jellemzéseCharacterization of reaction products synthesized with amylosucrase from Example 4

A 4. példában leírt oldhatatlan reakciótermékek 1 M NaOH-ban oldódnak. A reakciótermékeket úgy jellemezzük, hogy mérjük az abszorpciós maximumot. Megközelítően 100 mg izolált reakcióterméket (nedves tömeg) feloldunk 200 μΙ 1 M NaOH-ban és H₂O-val hígítjuk 1:10 arányban. A 0,1 M NaOH 900 μΙ mennyiségét és 1 ml Lugol oldatot adunk ezen oldat 100 μΙ mennyiségéhez. Az abszorpciós spektrumot 400 és 700 nm között mérjük. A maximum 605 nm (az amilóz abszorpciós maximuma 614 nm).The insoluble reaction products described in Example 4 are soluble in 1 M NaOH. The reaction products are characterized by measuring the absorption maximum. Approximately 100 mg of isolated reaction product (wet weight) is dissolved in 200 μΙ of 1 M NaOH and diluted 1:10 with H ₂ O. 900 μΙ of 0.1 M NaOH and 1 ml of Lugol's solution are added to 100 μΙ of this solution. The absorption spectrum is measured between 400 and 700 nm. The maximum is 605 nm (the absorption maximum of amylose is 614 nm).

A 4. példa reakció keverékének HPLC analízise CARBOPAC PA1 oszlopon (DIONEX) azt mutatja, hogy az oldhatatlan termékeken kívül oldható termékek is létrejönnek. Ezek az oldható termékek rövid-láncú poliszacharidok. A lánc hosszúság megközelítően 5 és megközelítően 60 glükóz egység közötti. Kisebb mértékben azonban akár rövidebb vagy hosszabb molekulák is detektálhatok.HPLC analysis of the reaction mixture of Example 4 on a CARBOPAC PA1 column (DIONEX) shows that in addition to the insoluble products, soluble products are also formed. These soluble products are short-chain polysaccharides. The chain length is between approximately 5 and approximately 60 glucose units. However, shorter or longer molecules can also be detected to a lesser extent.

A rendelkezésre álló analitikai módszerekkel nem lehetett elágazást detektálni a szintézises termékekben.No branching could be detected in the synthesized products using the available analytical methods.

6. példaExample 6

Az intracelluláris amiloszacharáz aktivitás expressziója transzformált E. coli sejtekbenExpression of intracellular amylosucrase activity in transformed E. coli cells

Polimeráz láncreakciót (PCR) használva egy fragmentet amplifikálunk az izolált plazmid vektorból, mely az 1. számú szekvenciában bemutatott szekvencia 981 - 2871 nukleotidjait tartalmazza. A következő oligonukleotidokat használjuk primerekként:Using polymerase chain reaction (PCR), a fragment is amplified from the isolated plasmid vector, which contains nucleotides 981 to 2871 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1. The following oligonucleotides are used as primers:

TPN2TPN2

5' - CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC - 3' (3. számú szekvencia)5' - CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC - 3' (sequence number 3)

TPC1 5' - CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G - 3' (4. számú szekvencia)TPC1 5' - CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G - 3' (sequence number 4)

A kapott fragment tartalmazza az amiloszacharáz kódoló régiót, azzal az eltéréssel, hogy hiányoznak a 16 N-terminális aminosavakat kódoló nukleotidok. Ezek az aminosavak tartalmazzák azt a szekvenciát, mely szükségesnek látszik az enzim sejtekből történő szekréciójához. Ezenkívül, ez a PCR termék tartalmazza a nem transziáit régió 88 bázispárját. A használt primerekkel Ncol restrikciós helyeket juttatunk be a fragment mindkét végére.The resulting fragment contains the amylosucrase coding region, except that the nucleotides encoding the 16 N-terminal amino acids are missing. These amino acids contain the sequence that appears to be necessary for secretion of the enzyme from cells. In addition, this PCR product contains the 88 base pairs of the untranslated region. The primers used introduce NcoI restriction sites at both ends of the fragment.

Az Ncol restrikciós endonukleázzal való emésztés után a kapott fragmentet ligáljuk az Ncol-gyel emésztett pMex7 expressziós vektorral. A ligálási termékeket E. coli sejtekbe transzformáljuk és a transzformált kiónokat szelektáljuk. A pozitív kiónokat egy éjszakán keresztül inkubáljuk 37°C hőmérsékleten YT lemezeken (1,5 % agar, 100 pg/ml ampicillin, 5 % szacharóz, 0,2 mM IPTG). A lemezek jód párának való kitevése után nem lehetett kék festődést megfigyelni a baktérium telepeket körülvevő területen, azonban a glikogén intracelluláris termelése detektálható volt (a transzformált sejtek barnára színeződtek a nem transzformált XL1-Blue sejtekben mutatkozó nem festődő telepekhez képest). A protein funkcionalitásának vizsgálatához, az YT tápközegen tenyésztett transzformált sejteket feltárjuk ultrahangos kezeléssel és a nyert nyers extraktumot szacharózt tartalmazó agar lemezekre pipettázzuk. A lemezek jód párának való kitevése után kék festődést lehetett megfigyelni.After digestion with NcoI restriction endonuclease, the resulting fragment was ligated with the NcoI-digested pMex7 expression vector. The ligation products were transformed into E. coli cells and the transformed clones were selected. Positive clones were incubated overnight at 37°C on YT plates (1.5% agar, 100 pg/ml ampicillin, 5% sucrose, 0.2 mM IPTG). After exposure of the plates to iodine vapor, no blue staining could be observed in the area surrounding the bacterial colonies, however, intracellular glycogen production was detectable (transformed cells stained brown compared to the non-staining colonies in untransformed XL1-Blue cells). To test the functionality of the protein, transformed cells grown on YT medium were disrupted by sonication and the crude extract was pipetted onto sucrose agar plates. After exposure to iodine vapor, blue staining was observed.

SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓK:SEQUENCE LIST (1) GENERAL INFORMATION:

(i) FELTALÁLÓ:(i) INVENTOR:

(A) NÉV: PlantTec Biotechnologie GmbH Forschung & Entwicklung (B) UTCA: Hermannswerder 14 (C) VÁROS: Potsdam (E) ORSZÁG: Germany (F) IRÁNYÍTÓSZÁM (ZIP): 14473 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Amiloszacharázt kódoló nukleinsav molekulák (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4 (ív) SZÁMÍTÓGÉPES LEOLVASÁSI FORMA:(A) NAME: PlantTec Biotechnologie GmbH Forschung & Entwicklung (B) STREET: Hermannswerder 14 (C) CITY: Potsdam (E) COUNTRY: Germany (F) ZIP CODE: 14473 (ii) TITLE OF THE INVENTION: Nucleic acid molecules encoding amylosucrase (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4 (sheet) COMPUTER READING FORMAT:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:(A) MEDIA TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) SEQUENCE 1 DATA:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) HOSSZÚSÁG: 4173 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genom) (iii) HIPOTETIKUS: NINCS (iv) ANTI-SENSE: NINCS (vi) EREDETI FORRÁS:(A) LENGTH: 4173 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRAND TYPE: double-stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genome) (iii) HYPOTHETICAL: NONE (iv) ANTI-SENSE: NONE (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANIZMUS: Neisseria polysaccharea (ix) JELLEMZŐK:(A) ORGANISM: Neisseria polysaccharea (ix) CHARACTERISTICS:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS:!971..3878 (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION:!971..3878 (xi) DESCRIPTION OF SEQUENCE 1:

GATCGCCTTC GCCCAATTGC GACCAAAGTT TTTTGGTAAA CAGCTTGGGG TTGTTCTCGA 60GATCGCCTTC GCCCAATTGC GACCAAAGTT TTTTGGTAAA CAGCTTGGGG TTGTTCTCGA 60

TGACTTTGTT GGCGATTTTG AGAATCCGCG CGGTGGAGCG GTAGTTTTGC TCCAGTTTGA 120TGACTTTGTT GGCGATTTTG AGAATCCGCG CGGTGGAGCG GTAGTTTTGC TCCAGTTTGA 120

TGACCTTCAT CTGCGGATAG TTTTCCTGCA TTTTGCGCAG GTTTTCCATG TTCGCGCCGCTGACCTTCAT CTGCGGATAG TTTTCCTGCA TTTTGCGCAG GTTTTCCATG TTCGCGCCG

180180

GCCATGCGTA GATGGACTGG TCGTCGTCGC CGACGGCGGT AAACATCCCT TCCGCGCCGG240GCCATGCGTA GATGGACTGG TCGTCGTCGC CGACGGCGGT AAACATCCCT TCCGCGCCGG240

TCAGAAGTTT CATCAACGTA AATTGGCAGG TATTCGTATC TTGGCATTCG TCAACCAGCA300TCAGAAGTTT CATCAACGTA AATTGGCAGG TATTCGTATC TTGGCATTCG TCAACCAGCA300

GATAACGCAG CCGCCGCTGC CATTTGTTGC GCACTTCGCT GTTTTGCTGC AACAGCACGG360GATAACGCAG CCGCCGCTGC CATTTGTTGC GCACTTCGCT GTTTTGCTGC AACAGCACGG360

CAGGCAGGCG GATTAAGTCA TCGAAGTCCA CTGCCTGATA GCTTTGTAAG GTTTCCTGAT420CAGGCAGGCG GATTAAGTCA TCGAAGTCCA CTGCCTGATA GCTTTGTAAG GTTTCCTGAT420

AGCTCGCATA CACGCGTGCG GTTTGTTGTT CCCAAATGTT CGATGCCGTC TGAACGACAT480AGCTCGCATA CACGCGTGCG GTTTGTTGTT CCCAAATGTT CGATGCCGTC TGAACGACAT480

CTTCAGGCGT TTTTAAATCG TTTTTCCAAA GGGAAATTTG ATGTTGCGCT TTGAATGTGG540CTTCAGGCGT TTTTAAATCG TTTTTCCAAA GGGAAATTTG ATGTTGCGCT TTGAATGTGG540

CTTCTTTGCC CGTACCGCCT AAGAGTTCGC CGATGATTTT CGCGCTGTCG GTAGAGTCGA600CTTCTTTGCC CGTACCGCCT AAGAGTTCGC CGATGATTTT CGCGCTGTCG GTAGAGTCGA600

GGATGGAGAA GTTTTTTTTG TAACCGATAT GGTTCGCCTC TTCGCGCAAA ATCTTCATGC660GGATGGAGAA GTTTTTTTTG TAACCGATAT GGTTCGCCTC TTCGCGCAAA ATCTTCATGC660

CCAAAGAATG GAACGTGCAA ATTGTCAGCC CGCGCGTTTG CGATTTGGGC AGCATTTTGG720CCAAAGAATG GAACGTGCAA ATTGCAGCC CGCGCGTTTG CGATTTGGGC AGCATTTTGG720

CGACGCGCTC CTGCATTTCC GCAGCGGCTT TGTTGGTAAA GGTAATCGCG GCGACGGTAT780CGACGCGCTC CTGCATTTCC GCAGCGGCTT TGTTGGTAAA GGTAATCGCG GCGACGGTAT780

GCGGCAGATA GCCGACATTG ACAATCAAAT GCTTGATTTT TTGAGTAATC ACGCCGGTTT840GCGGCAGATA GCCGACATTG ACAATCAAAT GCTTGATTTT TTGAGTAATC ACGCCGGTTT840

TTCCGCTGCC CGCGCCTGCA AGGACGAGCA GGGGGCCGCC GAGGTAGCGG ACGGCTTCGA900TTCCGCTGCC CGCGCCTGCA AGGACGAGCA GGGGGCCGCC GAGGTAGCGG ACGGCTTCGA900

GCTGTTGGGG ATTGAGTTTC ATCATGTTTT GATGCCGTCT GAAATCAGTC TGCGCCGCTT960GCTGTTGGGG ATTGAGTTTC ATCATGTTTT GATGCCGTCT GAAATCAGTC TGCGCCGCTT960

TCGAGGCAGT CGAGTGCCGC ACGGAGGGCG GATACGCCGA TTTGCCCCGG CGCGGAGTTT1020TCGAGGCAGT CGAGTGCCGC ACGGAGGGCG GATACGCCGA TTTGCCCCGG CGCGGAGTTT1020

TGCGTTCCCG AACCGAACGT GATGCTTGAG CCGAACACCT GTCCGGCAAG GCGGCTGACC1080TGCGTTCCCG AACCGAACGT GATGCTTGAG CCGAACACCT GTCCGGCAAG GCGGCTGACC1080

GCCCCCTTTT GCCCCATCGA CATCGTAACA ATCGGTTTGG TGGCAAGCTC TTTCGCTTTG1140GCCCCCTTTT GCCCCATCGA CATCGTAACA ATCGGTTTGG TGGCAAGCTC TTTCGCTTTG1140

AGCGTGGCAG AAAGCAAAGT CAGCACGTCT TCCGCGCTTT GCGGCATCAC CGCAATTTTG1200AGCGTGGCAG AAAGCAAAGT CAGCACGTCT TCCGCGCTTT GCGGCATCAC CGCAATTTTG1200

CAGATGTCCG CGCCGCAGTC CTCCATCTGT TTCAGACGGC ATACGATTTC TTCTTGCGGC1260CAGATGTCCG CGCCGCAGTC CTCCATCTGT TTCAGACGGC ATACGATTTC TTCTTGCGGC1260

GGCGTGCGGT GAAACTCATG ATTGCAGAGC AGGGCGGCGA TGCCGTTTTT TTGAGCATGC1320GGCGTGCGGT GAAACTCATG ATTGCAGAGC AGGGCGGCGA TGCCGTTTTT TTGAGCATGC1320

GCCACGGCGC GCCGGACGGC GGTTTCGCCG GAAAAAAGCT CGATATCGAT AATGTCGGGC1380GCCACGGCGC GCCGGACGGC GGTTTCGCCG GAAAAAAGCT CGATATCGAT AATGTCGGGC1380

AGGCGGCTTT CAATCAGCGA GTCGAGCAGT TCAAAATAAT AATCGTCCGA ACACGGGAAC1440AGGCGGCTTT CAATCAGCGA GTCGAGCAGT TCAAAATAAT AATCGTCCGA ACACGGGAAC1440

GAGCCGCCTT CGCCATGCCG TCTGAACGTA AACAGCAGCG GCTTGTCGGG CAGCGCGTCG1500GAGCCGCCTT CGCCATGCCG TCTGAACGTA AACAGCAGCG GCTTGTCGGG CAGCGCGTCG1500

CGGACGGTCT GCGTGTGGCG CAATACTTCG CCGATGCTGC CCGCGCATTC CAAAAAATCG1560CGGACGGTCT GCGTGTGGCG CAATACTTCG CCGATGCTGC CCGCGCATTC CAAAAAATCG1560

GCGCGGAACT CGACGATATC GAAGGGCAGG TTTTTGATTT GGTCAAGTAC GGCGGAAAGT1620GCGCGGAACT CGACGATATC GAAGGGCAGG TTTTTGATTT GGTCAAGTAC GGCGGAAAGT1620

ACGGCGGCAT CGCGGGCGAC AAGCGGCACG GCGATTTTGG TGCGTCCGCT TCCGATAACG1680ACGGCGGCAT CGCGGGCGAC AAGCGGCACG GCGATTTTGG TGCGTCCGCT TCCGATAACG1680

GTGTTTTTGA CGGTCAGGCT GGTGTGCATG GCGGTTGTTG CGGCTGAAAG GAACGGTAAA1740GTGTTTTTGA CGGTCAGGCT GGTGTGCATG GCGGTTGTTG CGGCTGAAAG GAACGGTAAA1740

GACGCAATTA TAGCAAAGGC ACAGGCAATG TTTCAGACGG CATTTCTGTG CGGCCGGCTT1800GACGCAATTA TAGCAAAGGC ACAGGCAATG TTTCAGACGG CATTTCTGTG CGGCCGGCTT1800

GATATGAATC AAGCAGCATC CGCATATCGG AATGCAGACT TGGCACAAGC CCTGTCTTTT1860GATATGAATC AAGCAGCATC CGCATATCGG AATGCAGACT TGGCACAAGC CCTGTCTTTT1860

CTAGTCAGTC CGCAGTTCTT GCAGTATGAT TGCACGACAC GCCCTACACG GCATTTGCAG1920CTAGTCAGTC CGCAGTTCTT GCAGTATGAT TGCACGACAC GCCCTACACG GCATTTGCAG1920

GATACGGCGG CAGACCGCCG GTCGGAAACT TCAGAATCGG AGCAGGCATC ATG TTG1976GATACGGCGG CAGACCGCCG GTCGGAAACT TCAGAATCGG AGCAGGCATC ATG TTG1976

Met Leu 1Met Leu 1

ACC CCC ACG CAG CAA GTC GGT TTG ATT TTA CAG TAG CTC AAA ACA CGC2024ACC CCC ACG CAG CAA GTC GGT TTG ATT TTA CAG TAG CTC AAA ACA CGC2024

Thr Pro Thr Gin Gin Vai Gly Leu lie Leu Gin Tyr Leu Lys Thr ArgThr Pro Thr Gin Gin Vai Gly Leu lie Leu Gin Tyr Leu Lys Thr Arg

10151015

ATC TTG GAC ATC TAC ACG CCC GAA CAG CGC GCC GGC ATC GAA AAA TCC2072ATC TTG GAC ATC TAC ACG CCC GAA CAG CGC GCC GGC ATC GAA AAA TCC2072

Lie Leu Asp Lie Tyr Thr Pro Glu Gin Arg Ala Gly lie Glu LysSerLie Leu Asp Lie Tyr Thr Pro Glu Gin Arg Ala Gly lie Glu LysSer

25302530

GAA GAC TGG CGG CAG TTT TCG CGC CGC ATG GAT ACG CAT TTC CCC AAA2120GAA GAC TGG CGG CAG TTT TCG CGC CGC ATG GAT ACG CAT TTC CCC AAA2120

Glu Asp Trp Arg Gin Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe ProLysGlu Asp Trp Arg Gin Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe ProLys

40 455040 4550

CTG ATG AAC GAA CTC GAC AGC GTG TAC GGC AAC AAC GAA GCC CTG CTG2168CTG ATG AAC GAA CTC GAC AGC GTG TAC GGC AAC AAC GAA GCC CTG CTG2168

Leu Met Asn Glu Leu Asp Ser Vai Tyr Gly Asn Asn Glu Ala LeuLeuLeu Met Asn Glu Leu Asp Ser Vai Tyr Gly Asn Asn Glu Ala LeuLeu

60656065

CCT ATG CTG GAA ATG CTG CTG GCG CAG GCA TGG CAA AGC TAT TCC CAA2216CCT ATG CTG GAA ATG CTG CTG GCG CAG GCA TGG CAA AGC TAT TCC CAA2216

Pro Met Leu Glu Met Leu Leu Ala Gin Ala Trp Gin Ser Tyr SerGinPro Met Leu Glu Met Leu Leu Ala Gin Ala Trp Gin Ser Tyr SerGin

75807580

CGC AAC TCA TCC TTA AAA GAT ATC GAT ATC GCG CGC GAA AAC AAC CCC2264CGC AAC TCA TCC TTA AAA GAT ATC GAT ATC GCG CGC GAA AAC AAC CCC2264

Arg Asn Ser Ser Leu Lys Asp lie Asp Tie Ala Arg Glu Asn AsnProArg Asn Ser Ser Leu Lys Asp lie Asp Tie Ala Arg Glu Asn AsnPro

90959095

GAT TGG ATT TTG TCC AAC AAA CAA GTC GGC GGC GTG TGC TAC GTT GAT2312GAT TGG ATT TTG TCC AAC AAA CAA GTC GGC GGC GTG TGC TAC GTT GAT2312

Asp Trp He Leu Ser Asn Lys Gin Vai Gly Gly Vai Cys Tyr VaiAspAsp Trp He Leu Ser Asn Lys Gin Vai Gly Gly Vai Cys Tyr VaiAsp

100 105110100 105110

TTG TTT GCC GGC GAT TTG AAG GGC TTG AAA GAT AAA ATT CCT TAT TTT2360TTG TTT GCC GGC GAT TTG AAG GGC TTG AAA GAT AAA ATT CCT TAT TTT2360

Leu Phe Ala Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Asp Lys He Pro TyrPheLeu Phe Ala Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Asp Lys He Pro TyrPhe

115 120 125130115 120 125130

CAA GAG CTT GGT TTG ACT TAT CTG CAC CTG ATG CCG CTG TTT AAA TGC2408CAA GAG CTT GGT TTG ACT TAT CTG CAC CTG ATG CCG CTG TTT AAA TGC2408

Gin Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe LysCysGin Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe LysCys

135 140145135 140145

CCT GAA GGC AAA AGC GAC GGC GGC TAT GCG GTC AGC AGC TAC CGC GAT2456CCT GAA GGC AAA AGC GAC GGC GGC TAT GCG GTC AGC AGC TAC CGC GAT2456

Pro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Vai Ser Ser Tyr ArgAspPro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Vai Ser Ser Tyr ArgAsp

150 155160150 155160

GTC AAT CCG GCA CTG GGC ACA ATA GGC GAC TTG CGC GAA GTC ATT GCT2504GTC AAT CCG GCA CTG GGC ACA ATA GGC GAC TTG CGC GAA GTC ATT GCT2504

Vai Asn Pro Ala Leu Gly Thr He Gly Asp Leu Arg Glu Vai lieAlaVai Asn Pro Ala Leu Gly Thr He Gly Asp Leu Arg Glu Vai lieAla

165 170175165 170175

GCG CTG CAC GAA GCC GGC ATT TCC GCC GTC GTC GAT TTT ATC TTC AAC2552GCG CTG CAC GAA GCC GGC ATT TCC GCC GTC GTC GAT TTT ATC TTC AAC2552

Ala Leu His Glu Ala Gly He Ser Ala Vai Vai Asp Phe He PheAsnAla Leu His Glu Ala Gly He Ser Ala Vai Vai Asp Phe He PheAsn

180 185190180 185190

CAC ACC TCC AAC GAA CAC GAA TGG GCG CAA CGC TGC GCC GCC GGC GAC2600CAC ACC TCC AAC GAA CAC GAA TGG GCG CAA CGC TGC GCC GCC GGC GAC2600

His Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Ala Gin Arg Cys Ala Ala GlyAspHis Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Ala Gin Arg Cys Ala Ala GlyAsp

195 200 205210195 200 205210

CCG CTT TTC GAC AAT TTC TAC TAT ATT TTC CCC GAC CGC CGG ATG CCC2648CCG CTT TTC GAC AAT TTC TAC TAT ATT TTC CCC GAC CGC CGG ATG CCC2648

Pro Leu Phe Asp Asn Phe Tyr Tyr He Phe Pro Asp Arg Arg MetProPro Leu Phe Asp Asn Phe Tyr Tyr He Phe Pro Asp Arg Arg MetPro

215 220225215 220225

GAC CAA TAC GAC CGC ACC CTG CGC GAA ATC TTC CCC GAC CAG CAC CCG2696GAC CAA TAC GAC CGC ACC CTG CGC GAA ATC TTC CCC GAC CAG CAC CCG2696

Asp Gin Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Glu He Phe Pro Asp Gin HisProAsp Gin Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Glu He Phe Pro Asp Gin HisPro

230 235240230 235240

GGC GGC TTC TCG C7XA CTG GAA GAC GGA CGC TGG GTG TGG ACG ACC TTC 27 4 4GGC GGC TTC TCG C7XA CTG GAA GAC GGA CGC TGG GTG TGG ACG ACC TTC 27 4 4

Gly Gly Phe Ser Gin Leu Glu Asp Gly Arg Trp Vai Trp Thr ThrPheGly Gly Phe Ser Gin Leu Glu Asp Gly Arg Trp Vai Trp Thr ThrPhe

245 250255 aa? Tm ttc nas tcc nz\r ttc mt τάο acr aac rrc tcc ctb ttc rcr?7Q9245 250255 aa? Tm ttc nas tcc nz\r ttc mt τάο acr aac rrc tcc ctb ttc rcr?7Q9

Asn Ser Phe Gin Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Vai Phe Arg 260 265270Asn Ser Phe Gin Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Vai Phe Arg 260 265270

GCA ATG GCG GGC GAA ATG CTG TTC CTT GCC AAC TTG GGC GTT GAC ATC2840GCA ATG GCG GGC GAA ATG CTG TTC CTT GCC AAC TTG GGC GTT GAC ATC2840

Ala Met Ala Gly Glu Met Leu Phe Leu Ala Asn Leu Gly Vai AsplieAla Met Ala Gly Glu Met Leu Phe Leu Ala Asn Leu Gly Vai Asplie

275 280 285290275 280 285290

CTG CGT ATG GAT GCG GTT GCC TTT ATT TGG AAA CAA ATG GGG ACA AGC2888CTG CGT ATG GAT GCG GTT GCC TTT ATT TGG AAA CAA ATG GGG ACA AGC2888

Leu Arg Met Asp Ala Vai Ala Phe lie Trp Lys Gin Met Gly ThrSerLeu Arg Met Asp Ala Vai Ala Phe lie Trp Lys Gin Met Gly ThrSer

295 300305295 300305

TGC GAA AAC CTG CCG CAG GCG CAC GCC CTC ATC CGC GCG TTC AAT GCC2936TGC GAA AAC CTG CCG CAG GCG CAC GCC CTC ATC CGC GCG TTC AAT GCC2936

Cys Glu Asn Leu Pro Gin Ala His Ala Leu He Arg Ala Phe AsnAlaCys Glu Asn Leu Pro Gin Ala His Ala Leu He Arg Ala Phe AsnAla

310 315320310 315320

GTT ATG CGT ATT GCC GCG CCC GCC GTG TTC TTC AAA TCC GAA GCC ATC2984GTT ATG CGT ATT GCC GCG CCC GCC GTG TTC TTC AAA TCC GAA GCC ATC2984

Vai Met Arg He Ala Ala Pro Ala Vai Phe Phe Lys Ser Glu AlaHeVai Met Arg He Ala Ala Pro Ala Vai Phe Phe Lys Ser Glu AlaHe

325 330335325 330335

GTC CAC CCC GAC CAA GTC GTC CAA TAC ATC GGG CAG GAC GAA TGC CAA3032GTC CAC CCC GAC CAA GTC GTC CAA TAC ATC GGG CAG GAC GAA TGC CAA3032

Vai His Pro Asp Gin Vai Vai Gin Tyr He Gly Gin Asp Glu CysGinVai His Pro Asp Gin Vai Vai Gin Tyr He Gly Gin Asp Glu CysGin

340 345350340 345350

ATC GGT TAC AAC CCC CTG CAA ATG GCA TTG TTG TGG AAC ACC CTT GCC3080 lie Gly Tyr Asn Pro Leu Gin Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr LeuAlaATC GGT TAC AAC CCC CTG CAA ATG GCA TTG TTG TGG AAC ACC CTT GCC3080 lie Gly Tyr Asn Pro Leu Gin Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr LeuAla

355 360 365370355 360 365370

ACG CGC GAA GTC AAC CTG CTC CAT CAG GCG CTG ACC TAC CGC CAC AAC3128ACG CGC GAA GTC AAC CTG CTC CAT CAG GCG CTG ACC TAC CGC CAC AAC3128

Thr Arg Glu Vai Asn Leu Leu His Gin Ala Leu Thr Tyr Arg HisAsnThr Arg Glu Vai Asn Leu Leu His Gin Ala Leu Thr Tyr Arg HisAsn

375 380385375 380385

CTG CCC GAG CAT ACC GCC TGG GTC AAC TAC GTC CGC AGC CAC GAC GAC3176CTG CCC GAG CAT ACC GCC TGG GTC AAC TAC GTC CGC AGC CAC GAC GAC3176

Leu Pro Glu His Thr Ala Trp Vai Asn Tyr Vai Arg Ser His AspAspLeu Pro Glu His Thr Ala Trp Vai Asn Tyr Vai Arg Ser His AspAsp

390 395400390 395400

ATC GGC TGG ACG TTT GCC GAT GAA GAC GCG GCA TAT CTG GGC ATA AGC3224ATC GGC TGG ACG TTT GCC GAT GAA GAC GCG GCA TAT CTG GGC ATA AGC3224

He Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly HeSerHe Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly HeSer

405 410415405 410415

GGC TAC GAC CAC CGC CAA TTC CTC AAC CGC TTC TTC GTC AAC CGT TTC3272GGC TAC GAC CAC CGC CAA TTC CTC AAC CGC TTC TTC GTC AAC CGT TTC3272

Gly Tyr Asp His Arg Gin Phe Leu Asn Arg Phe Phe Vai Asn ArgPheGly Tyr Asp His Arg Gin Phe Leu Asn Arg Phe Phe Vai Asn ArgPhe

420 425430420 425430

GAC GGC AGC TTC GCT CGT GGC GTA CCG TTC CAA TAC AAC CCA AGC ACA3320GAC GGC AGC TTC GCT CGT GGC GTA CCG TTC CAA TAC AAC CCA AGC ACA3320

Asp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Vai Pro Phe Gin Tyr Asn Pro SerThrAsp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Vai Pro Phe Gin Tyr Asn Pro SerThr

435 440 445450435 440 445450

GGC GAC TGC CGT GTC AGT GGT ACA GCC GCG GCA TTG GTC GGC TTG GCG3368GGC GAC TGC CGT GTC AGT GGT ACA GCC GCG GCA TTG GTC GGC TTG GCG3368

Gly Asp Cys Arg Vai Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Vai Gly LeuAlaGly Asp Cys Arg Vai Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Vai Gly LeuAla

455 460465455 460465

CAA GAC GAT CCC CAC GCC GTT GAC CGC ATC AAA CTC TTG TAC AGC ATT3416CAA GAC GAT CCC CAC GCC GTT GAC CGC ATC AAA CTC TTG TAC AGC ATT3416

Gin Asp Asp Pro His Ala Vai Asp Arg He Lys Leu Leu Tyr SerlieGin Asp Asp Pro His Ala Vai Asp Arg He Lys Leu Leu Tyr Serlie

470 475480470 475480

GCT TTG AGT ACC GGC GGT CTG CCG CTG ATT TAC CTA GGC GAC GAA GTG3464GCT TTG AGT ACC GGC GGT CTG CCG CTG ATT TAC CTA GGC GAC GAA GTG3464

Ala Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu lie Tyr Leu Gly Asp GluVaiAla Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu lie Tyr Leu Gly Asp GluVai

485 490495485 490495

GGT ACG CTC AAT GAC GAC GAC TGG TCG CAA GAC AGC AAT AAG AGC GAC3512GGT ACG CTC AAT GAC GAC GAC TGG TCG CAA GAC AGC AAT AAG AGC GAC3512

Gly Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Ser Gin Asp Ser Asn Lys SerAspGly Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Ser Gin Asp Ser Asn Lys SerAsp

500 505510500 505510

GAC AGC CGT TGG GCG CAC CGT CCG CGC TAC AAC GAA GCC CTG TAC GCG3560GAC AGC CGT TGG GCG CAC CGT CCG CGC TAC AAC GAA GCC CTG TAC GCG3560

Λαη Qov Arrr Trn Sin Una Arrt Pre Z\rrr Twr úcn C Ί i ί Δ1 = T.on Tvr QlaΛαη Qov Arrr Trn Sin Una Arrt Pre Z\rrr Twr úcn C Ί i ί Δ1 = T.on Tvr Qla

515 515 520 525 520 525 530 530 CAA CGC AAC CAA CGC AAC GAT CCG TCG ACC GCA GCC GGG CAA GAT CCG TCG ACC GCA GCC GGG CAA ATC TAT CAG GGC TTG ATC TAT CAG GGC TTG 3608 3608 Gin Arg Asn Gin Arg Asn Asp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gin 535 540 Asp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gin 535,540 He Tyr Gin Gly Leu 545 He Tyr Gin Gly Leu 545 CGC CAT ATG CGC CAT ATG ATT GCC GTC CGC CAA AGG AAT CCG ATT GCC GTC CGC CAA AGG AAT CCG CGC TTC GAC GGC GGC CGC TTC GAC GGC GGC 3656 3656 Arg His Met Arg His Met He Ala Vai Arg Gin Ser Asn Pro 550 555 He Ala Vai Arg Gin Ser Asn Pro 550 555 Arg Phe Asp Gly Gly 560 Arg Phe Asp Gly Gly 560 AGG CTG GTT AGG CTG GTT ACA TTC AAC ACC AAC AAC AAG CAC ACA TTC AAC ACC AAC AAC AAG CAC ATC ATC GGC TAC ATC ATC ATC GGC TAC ATC 3704 3704 Arg Leu Vai 565 Arg Leu Vai 565 Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His 570 Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His 570 He He Gly Tyr He 575 He He Gly Tyr He 575 CGC AAC AAT CGC AAC AAT GCG CTT TTG GCA TTC GGT 7XAC TTC GCG CTT TTG GCA TTC GGT 7XAC TTC AGC GAA TAT CCG CAA AGC GAA TAT CCG CAA 3752 3752 Arg Asn Asn 580 Arg Asn Asn 580 Ala Leu Leu Ala Phe Gly Asn Phe 585 Ala Leu Leu Ala Phe Gly Asn Phe 585 Ser Glu Tyr Pro Gin 590 Ser Glu Tyr Pro Gin 590 ACC GTT ACC ACC GTT ACC GCG CAT ACC CTG CAA GCC ATG CCC GCG CAT ACC CTG CAA GCC ATG CCC TTC AAG GCG CAC GAC TTC AAG GCG CAC GAC 3800 3800 Thr Vai Thr 595 Thr Vai Thr 595 Ala His Thr Leu Gin Ala Met Pro 600 605 Ala His Thr Leu Gin Ala Met Pro 600 605 Phe Lys Ala His Asp 610 Phe Lys Ala His Asp 610 CTC ATC GGT CTC ATC GGT GGC AAA ACT GTC AGC CTG AAT CAG GGC AAA ACT GTC AGC CTG AAT CAG GAT TTG ACG CTT CAG GAT TTG ACG CTT CAG 3848 3848 Leu He Gly Leu He Gly Gly Lys Thr Vai Ser Leu Asn Gin 615 620 Gly Lys Thr Vai Ser Leu Asn Gin 615,620 Asp Leu Thr Leu Gin 625 Asp Leu Thr Leu Gin 625 CCC TAT CAG Pro Tyr Gin CCC TAT CAG Pro Tyr Gin GTC ATG TGG CTC GAA ATC GCC TGACGCACGC TTCCCAAATG Vai Met Trp Leu Glu He Ala 630 635 GTC ATG TGG CTC GAA ATC GCC TGACGCACGC TTCCCAAATG Vai Met Trp Leu Glu He Ala 630 635 3898 3898 CCGTCTGAAC CCGTCTGAAC CGTTTCAGAC GGCATTTGCG CCGAAGCGGA CGTTTCAGAC GGCATTTGCG CCGAAGCGGA CGGTAGTCCC CAAAAGGGAA CGGTAGTCCC CAAAAGGGAA 3958 3958 ACATGCGATA ACATGCGATA ATAGCCGCCC ATCACATCCC GCGCCGCAGC ATAGCCGCCC ATCACATCCC GCGCCGCAGC CCGTGTTGCG CCGCATCCCA CCGTGTTGCG CCGCATCCCA 4018 4018 CATACCGCAT CATACCGCAT TTGTTCCGGA GTAACCCCAA TGTCAGACGA TTGTTCCGGA GTAACCCCAA TGTCAGACGA CAAAAGCAAA GCCCTTGCCG CAAAAGCAAA GCCCTTGCCG 4078 4078 CCGCACTGGC GCCAGCAGGA CCGCACTGGC GCCAGCAGGA GCAAATCGAA AAAAGTTTCG GCAAAGGCGC AGAAAACCTC G7XAGTCATTT CCACC GCAAATCGAA AAAAGTTTCG GCAAAGGCGC AGAAAACCTC G7XAGTCATTT CCACC CATCATG7XAA ATGGACGGCA CATCATG7XAA ATGGACGGCA 4138 4173 4138 4173

(2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:(2) DATA FOR SEQUENCE 2:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) HOSSZÚSÁG: 636 nukleinsav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:(A) LENGTH: 636 nucleic acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: protein (xi) DESCRIPTION OF SEQUENCE NO. 2:

Met Leu Thr Pro Thr Gin Gin Vai Gly Leu lie Leu Gin Tyr Leu Lys 15 1015Met Leu Thr Pro Thr Gin Gin Vai Gly Leu lie Leu Gin Tyr Leu Lys 15 1015

Thr Arg He Leu Asp He Tyr Thr Pro Glu Gin Arg Ala Gly He Glu 20 2530Thr Arg He Leu Asp He Tyr Thr Pro Glu Gin Arg Ala Gly He Glu 20 2530

Lys Ser Glu Asp Trp Arg Gin Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe 35 4045Lys Ser Glu Asp Trp Arg Gin Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe 35 4045

Pro Lys Leu Met Asn Glu Leu Asp Ser Vai Tyr Gly Asn Asn Glu Ala 50 5560Pro Lys Leu Met Asn Glu Leu Asp Ser Vai Tyr Gly Asn Asn Glu Ala 50 5560

Leu 65 Leu 65 Leu Leu Pro Pro Met Meth Leu Leu Glu 70 Glu 70 Met Meth Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gin 75 Gin 75 Ala Ala Trp Trp Gin Gin Ser Ser Tyr 80 Tyr 80 Ser Ser Gin Gin Arg Arg Asn Asn Ser 85 Ser 85 Ser Ser Leu Leu Lys Lys Asp Asp He 90 He 90 Asp Asp He Hey Ala Ala Arg Arg Glu 95 Glu 95 Asn Asn Asn Asn Pro Pro Asp Asp Trp 100 Trp 100 He Hey Leu Leu Ser Ser Asn Asn Lys 105 Lys 105 Gin Gin Vai Yes Gly Gly Gly Gly Vai 110 Or 110 Cys Cys Tyr Tyr Vai Yes Asp Asp Leu 115 Leu 115 Phe Phe Ala Ala Gly Gly Asp Asp Leu 120 Leu 120 Lys Lys Gly Gly Leu Leu Lys Lys Asp 125 Asp 125 Lys Lys He Hey Pro Pro Tyr Tyr Phe 130 Phe 130 Gin Gin Glu Glu Leu Leu Gly Gly Leu 135 Leu 135 Thr Thr Tyr Tyr Leu Leu His His Leu 140 Leu 140 Met Meth Pro Pro Leu Leu Phe Phe Lys 145 Lys 145 Cys Cys Pro Pro Glu Glu Gly Gly Lys 150 Lys 150 Ser Ser Asp Asp Gly Gly Gly Gly Tyr 155 Tyr 155 Ala Ala Vai Yes Ser Ser Ser Ser Tyr 160 Tyr 160 Arg Arg Asp Asp Vai Yes Asn Asn Pro 165 Pro 165 Ala Ala Leu Leu Gly Gly Thr Thr He 170 He 170 Gly Gly Asp Asp Leu Leu Arg Arg Glu 175 Glu 175 Vai Yes He Hey Ala Ala Ala Ala Leu 180 Leu 180 His His Glu Glu Ala Ala Gly Gly He 185 He 185 Ser Ser Ala Ala Vai Yes Vai Yes Asp 190 Asp 190 Phe Phe He Hey Phe Phe Asn Asn His 195 History 195 Thr Thr Ser Ser Asn Asn Glu Glu His 200 His 200 Glu Glu Trp Trp Ala Ala Gin Gin Arg 205 Arg 205 Cys Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asp 210 Asp 210 Pro Pro Leu Leu Phe Phe Asp Asp Asn 215 Asn 215 Phe Phe Tyr Tyr Tyr Tyr He Hey Phe 220 Phe 220 Pro Pro Asp Asp Arg Arg Arg Arg Met 225 Meth 225 Pro Pro Asp Asp Gin Gin Tyr Tyr Asp 230 Asp 230 Arg Arg Thr Thr Leu Leu Arg Arg Glu 235 Glu 235 He Hey Phe Phe Pro Pro Asp Asp Gin 240 Gin 240 His His Pro Pro Gly Gly Gly Gly Phe 245 Phe 245 Ser Ser Gin Gin Leu Leu Glu Glu Asp 250 Asp 250 Gly Gly Arg Arg Trp Trp Vai Yes Trp 255 Trp 255 Thr Thr Thr Thr Phe Phe Asn Asn Ser 260 Ser 260 Phe Phe Gin Gin Trp Trp Asp Asp Leu 265 Leu 265 Asn Asn Tyr Tyr Ser Ser Asn Asn Pro 270 Pro 270 Trp Trp Vai Yes Phe Phe Arg Arg Ala 275 Ala 275 Met Meth Ala Ala Gly Gly Glu Glu Met 280 Meth 280 Leu Leu Phe Phe Leu Leu Ala Ala Asn 285 Asn 285 Leu Leu Gly Gly Vai Yes Asp Asp He 290 He 290 Leu Leu Arg Arg Met Meth Asp Asp Ala 295 Ala 295 Vai Yes Ala Ala Phe Phe He Hey Trp 300 Trp 300 Lys Lys Gin Gin Met Meth Gly Gly Thr 305 Thr 305 Ser Ser Cys Cys Glu Glu Asn Asn Leu 310 Leu 310 Pro Pro Gin Gin Ala Ala His His Ala 315 Ala 315 Leu Leu He Hey Arg Arg Ala Ala Phe 320 Phe 320 Asn Asn Ala Ala Vai Yes Met Meth Arg 325 Arg 325 He Hey Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala 330 Ala 330 Vai Yes Phe Phe Phe Phe Lys Lys Ser 335 Ser 335 Glu Glu Ala Ala He Hey Vai Yes His 340 History 340 Pro Pro Asp Asp Gin Gin Vai Yes Vai 345 Or 345 Gin Gin Tyr Tyr He Hey Gly Gly Gin 350 Gin 350 Asp Asp Glu Glu Cys Cys Gin Gin He 355 He 355 Gly Gly Tyr Tyr Asn Asn Pro Pro Leu 360 Leu 360 Gin Gin Met Meth Ala Ala Leu Leu Leu 365 Leu 365 Trp Trp Asn Asn Thr Thr Leu Leu Ala 370 Ala 370 Thr Thr Arg Arg Glu Glu Vai Yes Asn 375 Asn 375 Leu Leu Leu Leu His His Gin Gin Ala 380 Ala 380 Leu Leu Thr Thr Tyr Tyr Arg Arg His 385 History 385 Asn Asn Leu Leu Pro Pro Glu Glu His 390 History 390 Thr Thr Ala Ala Trp Trp Vai Yes Asn 395 Asn 395 Tyr Tyr Vai Yes Arg Arg Ser Ser His 400 His 400 Asn Asn T 1 o T 1 o Cl w Cl w T-rr-. T-rr-. Thr Thr Ph o Ph o ai = ai = Zion Zion Δ1 a Δ1 a ZX 1 a ZX 1 a Twr Twr Τ.ΩΠ Τ.ΩΠ

405 410415 lie Ser Gly Tyr Asp His Arg Gin Phe Leu Asn Arg Phe Phe Vai Asn 420 425430405 410415 lie Ser Gly Tyr Asp His Arg Gin Phe Leu Asn Arg Phe Phe Vai Asn 420 425430

Arg Phe Asp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Vai Pro Phe Gin Tyr Asn Pro 435 440445Arg Phe Asp Gly Ser Phe Ala Arg Gly Vai Pro Phe Gin Tyr Asn Pro 435 440445

Ser Thr Gly Asp Cys Arg Vai Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Vai Gly 450 455460Ser Thr Gly Asp Cys Arg Vai Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Vai Gly 450 455460

Leu Ala Gin Asp Asp Pro His Ala Vai Asp Arg lie Lys Leu LeuTyrLeu Ala Gin Asp Asp Pro His Ala Vai Asp Arg lie Lys Leu LeuTyr

465 470 475480465 470 475480

Ser He Ala Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu lie Tyr Leu GlyAspSer He Ala Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu lie Tyr Leu GlyAsp

485 490495485 490495

Glu Vai Gly Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Ser Gin Asp Ser Asn Lys 500 505510Glu Vai Gly Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Ser Gin Asp Ser Asn Lys 500 505510

Ser Asp Asp Ser Arg Trp Ala His Arg Pro Arg Tyr Asn Glu Ala Leu 515 520525Ser Asp Asp Ser Arg Trp Ala His Arg Pro Arg Tyr Asn Glu Ala Leu 515 520525

Tyr Ala Gin Arg Asn Asp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gin He Tyr Gin 530 535540Tyr Ala Gin Arg Asn Asp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gin He Tyr Gin 530 535540

Gly Leu Arg His Met He Ala Vai Arg Gin Ser Asn Pro Arg PheAspGly Leu Arg His Met He Ala Vai Arg Gin Ser Asn Pro Arg PheAsp

545 550 555560545 550 555560

Gly Gly Arg Leu Vai Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His He HeGlyGly Gly Arg Leu Vai Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His He HeGly

565 570575565 570575

Tyr He Arg Asn Asn Ala Leu Leu Ala Phe Gly Asn Phe Ser Glu Tyr 580 585590Tyr He Arg Asn Asn Ala Leu Leu Ala Phe Gly Asn Phe Ser Glu Tyr 580 585590

Pro Gin Thr Vai Thr Ala His Thr Leu Gin Ala Met Pro Phe Lys Ala 595 600605Pro Gin Thr Vai Thr Ala His Thr Leu Gin Ala Met Pro Phe Lys Ala 595 600605

His Asp Leu lie Gly Gly Lys Thr Vai Ser Leu Asn Gin Asp Leu Thr 610 615620His Asp Leu lie Gly Gly Lys Thr Vai Ser Leu Asn Gin Asp Leu Thr 610 615620

Leu Gin Pro Tyr Gin Vai Met Trp Leu Glu lie AlaLeu Gin Pro Tyr Gin Vai Met Trp Leu Glu lie Ala

625 630635 (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:625 630635 (2) DATA OF SEQUENCE NUMBER 3:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /leír. = oligonucleotid (iii) HIPOTETIKUS: NINCS (iv) ANTI-SENSE: NINCS (vi) EREDETI FORRÁS:(A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRAND TYPE: single-stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: /descript. = oligonucleotide (iii) HYPOTHETICAL: NONE (iv) ANTI-SENSE: NONE (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A)ORGANIZMUS : Neisseria polysaccharea (xi) A3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:(A)ORGANISM: Neisseria polysaccharea (xi) SEQUENCE DESCRIPTION A3:

CTCACCATGG GCATCTTGGA CATC (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:CTCACCATGG GCATCTTGGA CATC (2) SEQUENCE 4 DATA:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) HOSSZÚSÁG: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (A) LEÍRÁS: /leír. = oligonucleotid (iii) HIPITETIKUS: NINCS (ív) ANTI-SENSE: NINCS (vi) EREDETI FORRÁS:(A) LENGTH: 25 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRAND TYPE: single-stranded (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: /describe = oligonucleotide (iii) HYPOTHETICAL: NONE (arch) ANTI-SENSE: NONE (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANIZMUS: Neisseria polysaccharea (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:(A) ORGANISM: Neisseria polysaccharea (xi) DESCRIPTION OF SEQUENCE NO. 4:

CTGCCATGGT TCAGACGGCA TTTGGCTGCCATGGT TCAGACGGCA TTTGG

Claims

PATENT CLAIMS

1. A nucleic acid molecule encoding a protein having an amylosucrase enzymatic activity, characterized in that (a) nucleic acid molecules encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;

(b) nucleic acid molecules comprising the coding region set forth in SEQ ID NO: 1;

(c) nucleic acid molecules encoding an analogue of a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; and (d) nucleic acid molecules having a sequence different from the sequence of the nucleic acid molecule defined in (c) due to the degeneracy of the genetic code.

2. The nucleic acid molecule of claim 1, characterized in that it is genomic DNA.

3. A vector characterized in that it comprises a nucleic acid molecule according to claim 1 or 2.

4. The vector according to claim 3, characterized in that the nucleic acid molecule encoding a protein having amylosucrase enzymatic activity is operably linked to sequences enabling expression in prokaryotic or eukaryotic host cells.

5. A host cell characterized in that it is transformed with a nucleic acid molecule according to claim 1 or 2, or with a vector according to claim 3 or 4.

6. A method for producing a protein having an amylosucrase enzymatic activity, characterized in that the host cell according to claim 5 is cultured under conditions that allow the expression of amylosucrase, and then the protein is recovered from the cells and/or the culture medium.

7. A protein characterized in that it has the enzymatic activity of an amylosucrase encoded by the nucleic acid molecule according to claim 1 or 2 or obtained according to the method according to claim 6.

8. A method for producing α-1,4 glucans and/or fructose, characterized in that (a) the host cell of claim 5, which secretes amylosucrase into the culture medium, is grown in a culture medium containing sucrose under conditions that allow the expression and secretion of amylosucrase; and (b) the produced α-1,4 glucans and/or fructose are recovered from the culture medium.

9. The method according to claim 8, characterized in that the host cell is a microorganism.

10. The method according to claim 9 or 10, characterized in that the host cell is immobilized.

11. An in vitro process for the production of α-1,4 glucans and/or fructose, comprising (a) reacting a sucrose-containing solution with the protein of claim 7 under conditions that allow the sucrose to be converted to α-1,4 glucans and fructose by amylosucrase; and (b) recovering the α-1,4 glucans and/or fructose produced from the solution.

12. The method according to claim 11, characterized in that the protein is immobilized.

13. α-1,4-glucan obtainable by the process according to claim 11 or 12.

The authorized person