HU231255B1 - Extracelluláris vezikulák mennyiségének meghatározására kidolgozott új módszer - Google Patents
Extracelluláris vezikulák mennyiségének meghatározására kidolgozott új módszer Download PDFInfo
- Publication number
- HU231255B1 HU231255B1 HU1800247A HUP1800247A HU231255B1 HU 231255 B1 HU231255 B1 HU 231255B1 HU 1800247 A HU1800247 A HU 1800247A HU P1800247 A HUP1800247 A HU P1800247A HU 231255 B1 HU231255 B1 HU 231255B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- suspension
- preparation
- evs
- sample
- absorbance
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 86
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims description 13
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 112
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 76
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 60
- 239000012927 reference suspension Substances 0.000 claims description 49
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 43
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 claims description 40
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 40
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 30
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- GSWZGTLWVRFGIJ-UHFFFAOYSA-N (4-formyl-2-methoxyphenyl) dihydrogen phosphate Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1OP(O)(O)=O GSWZGTLWVRFGIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 22
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000012925 reference material Substances 0.000 claims description 19
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 claims description 14
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 9
- -1 sphingomyelin Chemical compound 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 7
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 58
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical group ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 101150035777 sev gene Proteins 0.000 description 10
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 238000004483 ATR-FTIR spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000013469 resistive pulse sensing Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGVRFARTWVJNQC-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetamide Chemical compound NC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl VGVRFARTWVJNQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 241000273930 Brevoortia tyrannus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- SZFSLWMLMWUDEG-UHFFFAOYSA-N S(=O)(=O)(O)C(=O)C1=CC(OC)=C(OP(=O)=O)C=C1 Chemical compound S(=O)(=O)(O)C(=O)C1=CC(OC)=C(OP(=O)=O)C=C1 SZFSLWMLMWUDEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000001196 cardiac muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000803 cardiac myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000003234 fluorescent labeling method Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000010913 used oil Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
- G01N21/274—Calibration, base line adjustment, drift correction
- G01N21/278—Constitution of standards
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/08—Sphingolipids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
1244ÖS-940Í8 LG
Az extracellulárís vezikulák mennyteégének meghatározására kidolgozott áj módszer
Háttér
Napjainkban az extracellüláris vezikulák (EV-k) kiemelt figyelemben részesülnek az orvosbiológiat kutatások között, hiszen egyre több kulcs fontosságú biológiai folyamatban igazolódik be az EV-k szerepe, illetve potenciálisan betegségek biomarkereíként is felhasználhatónak lehetnek [l. 2, 3j. Mindezek ellenére az EV-k mennyiségi meghatározására szolgáló megbízható és reprodukálható módszerek száma és alkalmazhatósági köre erősen korlátozott [4, 5, 6]. Emiatt az EV-kutatás során olyan új módszerekre van szükség, melyek lehetővé teszik az EV-k mennyiségének meghatározását, és így az EV-Kkel végzett kísérletek standardizálását.
A tudomány jelenlegi állása
Az EV-k mennyiségének meghatározása lényegesen Összetettebb kérdés, mint ahogy azt elsőre gondolnánk. Leggyakrabban a minta teljes fehérjetartalmának meghatározásával történik a kísérletek standardizálása, általában színreakción alapuló eljárások felhasználásával (pf MicroBCA teszt).
.A nagyobb fehérjék és fehérje-aggregátumok az EV-khez számos biofizikai paraméterükben hasonlítanak, így a szeparálás során gyakran fordul elő, hogy együtt izolálódnak [7j. Emiatt az EV minták többnyire tartalmaznak olyan nem EV-eredetú fehérjéketZfehérjé aggyegátutnokaL amik a fehérjetartalom meghatározása során ronthatják a mérések reprodukálhatóságát, illetve a minták EV-k koncentrációjának fel ülbecsülését okozh atj ák,
A fehérjetartalom mérése mellett az EV-k mennyiségi meghatározása történhet olyan módszerekkel is, melyek a mintában található nanorészecskék számáról adnak információt. A módszerek egy része a nanopafikulumok optikai követésén alapul (nanopartide-tracking analysis- NTA), tóig más esetben egy állítható méretű nanopórus felhasználásával, hnpendancia alapon történhet a mérés (tuneable resistive pulse sensing system ~ pl. qNano) (6). Sajnálatos módon ezeknek a módszereknek nagy hátránya, hogy nem képesek megkülönböztetni a vezikalákat és nem vezikulárts természetű részecskéket egymástól.
Az EV-k vezikuláris természetükből adódóan fcszfolipid kettősréteggel körülhatároltak [5, S], ezért a Hpidek (mim például a foszfolipidek és a koleszterin) alapvető Összetevői az EV-knek Az EV-membránból származó lípidek mennyiségi meghatározása segítené a fehérje- aggregátumok elkülönítését az EV-ktÖl, így elkerülhetővé válna a fehérje alapú módszerek okozta EV koncentráció túlbecslés a kísérleti rendszerekben. Az EV-k lipíd tartalom alapján történő mérése - megfelelő módszer hiányában - eddig nem volt széles körben elérhető. A protein/lipid arányt néhány esetben, mint a minta tisztaságát jellemző paramétert javasolták használni.
Mihály és mtsai ismertettek egy módszert, amellyel az EV minták féhérje/lípíd aránya meghatározható infravörös spektroszkópia félhasználásával [9], azonban a módszertani korlátok miatt a mérési módszer széles körű elterjedése korlátokba ütközik.
östeikoetxéa X és mtsai [10] korábban ismertetettek egy egyszerű, látható színreakción alapuló módszert, mely alkalmasnak bizonyult egyes EV preparátumok lipid tartalmának meghatározására. A szerzők azt is kimutatták, hogy az egyes EV altípusok elkülöníthetők a fehérje, lipid arányuk alapján. Ez a teszt a korábban ismert szulfb-foszfo-vanilin reakción ($zFV) alapult. Az állniuk leírt lipid meghatározás hátránya, hogy kis mennyiségek mérése során magasabb az egyes mérések között, illetve a mérések technikai párhuzamosai között tapasztalt variabilitás a fehérje meghatározáshoz viszonyítva, A közölt módszer széleskörű elterjedését korlátozta a viszonylag alacsony érzékenység; egyazon EV preparátum jelentős részét felemésztette a lipid meghatározás, így a további funkcionális vizsgálatokhoz sokszor nem maradt elegendő minta [éj.
SZTNH-100222948
Jelenleg - jobb módszer híján - a fehérjék összmennyísége és a részecske szám együttes meghatározása a legmegbízhatóbb módszer az EV-k standardizálására, még akkor is, ha a fehérje mérés okozta problémák (fehérje aggregátornak és fehérje szennyezők) az ajánlott módszerrel nem kiküszöbölhetők.
Alternatív megközelítés a tömegspeklroszkópía (MS) alapú lipid tartalom meghatározás, azonban a módszer igen drága eszközt és sok mintái igényel, A minták feldolgozása, az eredmények értékelése hosszadalmas, a technika a legtöbb laboratórium számára nehezen hozzáférhető (2J.
A fentieket összefoglalva, nagy az igény egy olyan .lipid tartalom meghatározásán alapuló módszerre, mely alkalmas az EV-k kimutatására és számszerűsítésére, kellően érzékeny a rutinszerű alkalmazásra, és a legtöbb laboratóriumban könnyen hozzáférhető és kivitelezhető.
A találmány rövid ismertetése
I .A találmány tárgya eljárás extracelluláris vezikulumok (EV-k) mennyiségi meghatározására egy mintában, amely eljárás tartalmazza a következőket:
a) EV készítmény elkészítése a mintából, az EV készítmény EV-ket tartalmazó vizes saiszpenzió;
b) az a) lépés szerinti EV készítmény kapcsolatba hozása kénsavval, majd foszfo-vani Ilin-reagenssel és ezután színreakció kialakulásának lehetővé tétele, és így színes oldatot kapunk;
c) a b) lépés szerint kapott oldat abszorbanctájának mérése, és így készítmény abszorbancia értéket kapunk, és referencia szuszpenzióból készíteti egy vagy több referencia oldat abszorbanciájának mérése, és így referencia -abszorbancia értéket kapunk;
d) a c) lépésben mért készítmény abszorbancia érték és egy vagy több referencia abszorbancia érték összehasonlítása és a lipídek mennyiségének meghatározása az EV készítményben az összehasonlítás eredménye alapján;
e) az a) lépés szerinti EV készítményben lévő EV-k mennyiségének meghatározása a d) lépésben meghatározott Iipid mennyiségéből;
azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti EV készítmény szerves oldószerektől alapvetően mentes; a c) lépés szerinti reférencía-sznszpenzió olyan szuszpenzió, amely tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, a referencia-anyag liposzómák kialakítására képes fősz fel ipid, előnyösen 1,2-dioleoil-sn-glicero3-fosz.fokoliu (DOPC), szfingomíelín, foszfatidi'l-szerm vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes.
2. A találmány tárgya továbbá eljárás lipideknek extracelluláris vezikulumokat- (EV-ket) tartalmazó mintában történő mennyiségi meghatározására. amely eljárás tartalmazza a következő lépéseket:
a) EV készítmény elkészítése a mintából az EV készítmény EV-ket tartalmazó vizes szuszpenzió;
b) az a) lépés szerinti EV készítmény kapcsolatba hozása kénsavval, majd foszfo-vanillin-reagenssel és ezután színreakció kialakulásának lehetővé tétele, és így színes oldatot kapunk;
e) a b) lépés szerint kapott oldat abszorbanctájának mérése, és így készítmény abszorbancia értéket kapunk,, és referencia szuszpenzióból készített egy vagy több referencia oldat abszorbauciájának mérése, és így referencia abszorbancia értéket kapunk;
d) a c) lépésben mért készítmény abszorbancia érték és egy vagy több referencia abszorbancia érték összehasonlítása és a lipidek mennyiségének meghatározása az EV készítményben az összehasonlítás eredménye alapján;
azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti EV készítmény szerves oldószerektől alapvetően mentes; a c) lépés szerinti referencia-szuszpenzió olyan szuszpenziö, amely tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, a referencia-anyag liposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen l ,2-dioleoil-sn-glícero
3-íbszíbkolin (DOPC), szftngomielin, tbszfatidif-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencía-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes.
3. A fenti eljárások bármelyikének egy' előnyös megvalósítási módjában a c) lépés szerinti referencia szuszpenzió hígított törzs szuszpenzió, ahol a törzs szuszpenzió tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendáiva, és a törzs szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes.
4. A fenti eljárások bármelyikének egy előnyös megvalósítási módjában az a) lépés szerinti EV készítmény olyan mérettartományba eső EV-ket tartalmaz, amely tartomány alsó határa és felső határa közötti különbség kisebb, mint 600 nm, előnyösen kisebb, mint 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm vagy 100 nm.
5. Az 1-3. pontok szerinti eljárások bármelyikének egy előnyös megvalósítási módjában az a) lépés szerinti EV készítmény a 200 nm-né! kisebb mérettartományba eső EV-ket tartalmaz, vagy kb. 100-800 nm közötti mérettartományba eső EV-ket tartalmaz, vagy kb. 800-5000 nm közötti mérettartományba eső EV-ket tartalmaz.
6. .Az 1-5. pontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a vizes szuszpenzió oldószere egy vizes puffér, például PBS, NaCl-HEPES, MES, TRIS, fiziológiás nátrium-klorid-oldat, vagy Duibecco PBS (DPBS), előnyösen PBS vagy NaCl-HEPES.
7. Az 1-6. pontok bármelyike szerinti eljárás, ahol referencia szuszpenzió és a törzs szuszpenzió oldószere vizes puffer, például PBS, NaCl-HEPES, MES, TR1S, fiziológiás nátrium-klorid-oldat, vagy Duibecco PBS (DPBS), előnyösen PBS vagy NaCl-HEPES.
8. Az 1-7. pontok bármelyike szerinti eljárás, ahol minta testfolyadék minta vagy sejtkultúra minta.
9. Az 1-8. pontok bármelyike szerinti eljárás, ahol ab) lépés tartalmazza b 1) az a) lépés szerinti oldat kapcsolatba hozását kénsavval és vortexel történő keverését b2) a b Ϊ) lépés keverékét 90 ° C-on 20 percig inkubáljuk, majd szobahőmérsékletűre hütjük b3) a b2) lépés lehűtött keverékéhez foszfo-vandlin reagenst adunk és vortexel elkeverjük b4) inkubáljuk a b3) lépésben kapott keveréket 1 órán át 37 ° C-on, lehetővé téve a színreakció kifejeződését.
10. Az 1-9. pontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az abszorbanciáí 540 nm-en mérjük.
11. Az 1-10. pontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az eljárást az SzFV reakció kivitelezéséhez alkalmas edényben végezzük.
12. A jelen találmány tárgya továbbá eljárás biológiai membránok mennyiségi meghatározására egy mintában, amely eljárás tartalmazza a következőket:
a) készítményt biztosítunk a mintából, a készítmény biológiai membránokat tartalmaz vizes szuszpenzióban;
b) az a) lépés szerinti készítmény kapcsolatba hozása kénsavval, majd foszfo-vaníllin-reagenssel és ezután szinreakció kialakulásának lehetővé tétele, és így színes oldatot kapunk;
c) a b) lépés szerint kapott oldat abszorbanciájának mérése, és így készítmény abszorbancia értéket kapunk, és referencia szuszpenzióból készített egy vagy több referencia oldat abszorbanciájának mérése, és így referencia abszorbancia értéket kapunk;
d) a c) lépésben mért készítmény abszorbancia érték és egy vagy több referencia abszorbancia érték összehasonlítása és a lipidek mennyiségének meghatározása a készítményben az összehasonlítás eredménye alapján;
e) az a) lépés szerinti készítményben lévő membránok mennyiségének meghatározása a d) lépésben meghatározott lipid mennyiségéből;
azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti készítmény szerves oldószerektől alapvetően mentes; a c) lépés szerinti referencía-szuszpenzió olyan szuszpenzió, amely tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendáiva, a. referencia-anyag liposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen 1,2-dioleoil-sn-gliéero
3-fosztokolm (DOPC), szfingomielin, fbszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes.
13.A jelen találmány tárgya továbbá eljárás lipideknek biológiai membránokat tartalmazó mintában történő mennyiségi meghatározására, amely eljárás tartalmazza a következőket:
a) készítményt biztosítunk a mintából, a készítmény biológiai membránokat tartalmaz vizes szuszpenzióban;
bi az a) lépés szerinti készítmény kapcsolatba hozása kénsavval, majd foszfo-vanillin-reagenssel és ezután színreakció kialakulásának lehetővé tétele, és így színes oldatot kapunk;
c) a b) lépés szerint kapott oldat abszorbanciájának mérése, és így készítmény abszorbancia értéket kapunk, és referencia szuszpenzióból készített egy vagy több referencia oldat abszorbanciájának mérése, és így referencia abszorbancia értéket kapunk;
d) a c) lépésben mért készítmény abszorbancia érték és egy vagy több referencia abszorbancia érték összehasonlítása és a lipidek mennyiségének meghatározása a készítményben az összehasonlítás eredménye alapján;
azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti készítmény szerves oldószerektől alapvetően mentes: a c) lépés szerinti referencia-szuszpenzió olyan szuszpenzió, amely tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, a referencia-anyag Hposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen 1,2-dioleoil-sn-glicero3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes.
14. A 12, vagy 13. pont szerinti eljárások egy előnyös megvalósítási módjában a c) lépés szerinti referencia szuszpenzió hígított törzs szuszpenzió, ahol a törzs szuszpenzió tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, és a törzs szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes.
15. A találmány tárgya továbbá olyan referencia-szuszpenzió alkalmazása, amely egy vizes oldószerben szuszpendáit referenciaanyagot tartalmazó szuszpenzió, a referenciaanyag Hposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen l,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes; extracelluláris vezikulumok (EV-k) mennyiségi meghatározására egy mintában vagy készítményben,
16. A találmány tárgya továbbá olyan referencia-szuszpenzió alkalmazása, amely egy vizes oldószerben szuszpendáit referenciaanyagot tartalmazó szuszpenzió, a referenciaanyag Hposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen l,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes; lipidek mennyiségi meghatározására extracelluláris vezikulumokat (EV-k) tartalmazó mintában vagy készítményben.
17. A találmány tárgya továbbá olyan referencia-szuszpenzió alkalmazása, amely egy vizes oldószerben szuszpendáit referenciaanyagot tartalmazó szuszpenzió, a referenciaanyag Hposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen l,.2-díoleoil-sn«glicero-3-foszfokoHn (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes; lipidek mennyiségi meghatározására biológiai membránokat tartalmazó mintában vagy készítményben.
18. A találmány tárgya továbbá készlet, amely tartalmaz referencia-szuszpenziót, amely egy vizes oldószerben szuszpendáit referenciaanyagot tartalmazó szuszpenzió, a referenciaanyag Hposzómák. kialakítására képes foszfolipid, előnyösen !,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a: referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes. A készlet tartalmaz továbbá legalább egy kézikönyvet (használati útmutató) az utasításokkal, A készlet felhasználható a fenti pontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtásához, A készlet tartalmazhat olyan edényt vagy edényeket, amelyek alkalmasak az SzFV reakcióhoz.
Az. ábrák rövid leírása
l. ábra: szulfo-foszfo-vanilin (SzFV) reakció standard görbéje: a háttérintenzítás DMSO nélkül a foszfovanília reagens hozzáadása előtt, illetve a háttérintenzitás DMSO jelenlétében a foszfo-vanílin reagens hozzáadása előtt. Sárga szín megjelenése látható szerves oldószert tartalmazó reakcióelegyben (DMSO jelenlétében: 20 pL DMSO * 20 pL (16 g.g) DOPC PBS-ben + 200 μΕ 96%-os kénsav), a szerves oldószert nem tartalmazó mintához viszonyítva (40 μΕ (16 pg) DOPC PBS-ben + 200 μΕ 96%-os kénsav) 20 perc WC-on történd inkubációt követben.
2. ábra. A továbbfejlesztett lipid esszé standard görbéié ábra. H9c2 differenciált kardiomioblasztok felülúszójából izolált, CD63 pozitív, közepes méretű EV-k méret- és koncentráció eloszlása
4. ábra. EPIC optikai bioszenzoron mért EV-jelek összefüggése a minták fehérje- és íipidtartalmával.
5. ábra. Variabilitás (RSD%) a kereskedelmi forgalomban kapható lipid esszé és az általunk továbbfejlesztett mérési módszer esetében
6. ábra. A kereskedelmi forgalomban kapható lipid esszé referencia anyaga és a DOPC referencia szuszpenzió összehasonlítása
A találmány részletes leírása
Az extracelluíáris vezíkulák (EV-k) foszfölipid membrán kettösréteg által határolt részecskék, amelyeket mind az eukarióta, mind a prokarióta sejtek képesek termelni. Az EV-k közé tartoznak az (0 exoszómák vagy más néven kis EV-k (small EV; sEV), melyek általában 20ömmnél kisebb átmérőjűnk; (ii) a mikrovezikulák vagy közepes méretű EV-k (medium. EV; m£V), melyek közvetlenül a plazmamembránról (űződnek le és átmérőjük kb. 100 és 800 nm közé esik; és (ni) az apoptotikus testek mérettartományába eső nagy EV-k (large EV; IEV) melyek 800 és 5000 nm közötti átmérővel jellemczhetöek. Nagy általánosságban az EV-k mérete- nem haladja meg az 5 pm-t.
Az'EV-k származhatnak valamilyen testfoíyadékból vagy /» w/ro sejttenyészetböl is. Ilyen testfolyadék lehet például a vizelet, a nyál, a nyálka, a könny, a vérplazma, a vérszérum, a köpet, a spinális folyadék, a mellüri folyadék gyű lem. a mellbimbó aspirátum, a nyirok, a tracheoláris folyadék, a bélfolyadék, a húgyúti hógyfolyadék, az anyatej, nyirok folyadék, sperma, cerebrospináíis folyadék, légzőrendszeri folyadék, ascites, tumor eredetű váladék, magzatvíz vagy a fentiek bármely kombinációja. A sejttenyészet eredetű minta lehet bármilyen sejttenyészet kondicionált médiuma. Előnyös, ha a médium nem tartalmaz szérumot (FCS vagy FBS), vagy más állati termékekeket, hogy a szérum eredetű EV-k ko-izolációja elkerülhető legyen.
Az EV izolálása/tisztítása kifejezés magában foglalja az EV-tartalmú folyadék kinyerését, előkészítését a szövettenyésztési mintából vagy egy testfolyadék mintából, illetve az EV-knak a minta más, nem EV komponenseitől történő (például sejtjeitől, fehérjéitől) történő elválasztását így tisztított EV preparátum készül, vagyis a nem EV komponensek mennyisége csökken, vagy ideális esetben ezek eltűnhetnek az EV készítményből. Az angol „harvest (magyarul leginkább EV-termeltetés) kifejezés azt jelenti, hogy az EVtartalmó folyadékot elválasztjuk a sejttenyészet eredetű minta esetén a sejtektől vagy testfolyadékminta, sejtjeitől és további feldolgozásra készítjük elő. Az EV tartalmú folyadékot centrifugálhatjuk, hogy eltávolítsák a sejtes, vagy egyéb nem EV természetű alkotóelemeket, majd nagyobb fordulatszámon kiülepithetjük az EV-ket is. Az igy nyert EV tartalmú mintából előállított üledékek moshatóak, például PBS-ben, vagy bármely más vizes pufferben. A mintákat méret alapú szeparálás céljából gravitációs szűrésnek is alávethetjük, összefoglalva, az
EV készítmény előállítása kifejezés magában foglalhatja a sejtek eltávolítását, ezzel együtt lehetőleg a nem EV eredetű lipidekét is, és így séjtmentes EV szuszpenzió előállítását.
A minta további feldolgozása során a különböző típusú EV-k egymástól való elválasztása történhet (sEV, mEV és IEV). Összességében EV készítménynek nevezhető az a minta, ami szuszpenzióban tartalmaz a kiindulási mintához képest feldúsított EV-ket; lehetőleg úgy, hogy azok hasonló mérettartományba esnek (lásd alább); előfordulhatnak benne oldható fehérjék és fehérje aggregátumok, és kisebb mennyiségben egyéb típusú EV-k is, azonban a nem EV komponensek vagy sejtek lényegében eltávolításra kerülnek.
Az EV-k elválasztása a minta egyéb nem EV természetű komponenseitől, illetve az egyes EV altípusok egymástól való elválasztása leggyakrabban uítracentrifúgálással és/vagy differenciál centrifugálással történik. Mindazonáltal, más különféle izolálás! módszerek, mint például a sűrűség gradiens centrifugálás, kicsapás, szűrés, kromatográfta, (méretkizárásos kromatográfiai, és immun-affinitás alapon működő szeparációs eljárások is rendelkezésre állnak.
A találmány felhasználása során a fent említettektől eltérő mérettartományokba eső, méret alapján szeparált EV-k is vizsgálhatóak. A fentebb említett módszerekkel tetszőleges méretű EV-k szeparálhatónk a mintából. A találmány felhasználása során azonban előnyös, ha az izoláh/szeparált EV minta lehetőleg egy szűk mérettartományba esik, melynek alsó és felső határa között a különbség kisebb, mint 600 nm (lehetőleg legyen kisebb, mint 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm vagy 100 nm), így például vizsgálhatjuk a 700-900 nm közé eső EV-ket.
A kivitelezés b) lépését in vitro körülmények között célszerű végrehajtani. A b) és c) lépéseket nevezzük együttesen szulfb-íbszfo-vanilíin (SzFV) esszének. A mérés alapjául szolgáló reakció leírása megtalálható Frings és Dunn „Színváltozást mérő módszer a teljes szérum lipídek meghatározására az SZFV reakció alapján” című, 1970-ben az AJCP folyóiratban megjelent közleményében.
Jelen találmány esetében a mintát tartalmazó tesztcsöhöz tömény kénsavat (H2SO4) adunk, majd alapos elkeverés (pl. vortexelés) után a reakcióelegyet 80-100 °C-on melegítjük 10-30 percen keresztül. A savas kezelés hatására a szuszpenzióban lévő lipídek oldott fázisba kerülnek. A következő lépésben a reakcióelegyet szobahőmérsékletűre hűtjük (pl. 5 perc 4°C-on történő inkubációval). A lehűtött elegyhez adjuk a foszfo-vaníllm reagenst, majd az így kapott oldatot alaposan elkeverjük (pl, vortexeléssel). Utolsó lépésben a mintát átvihetjük egy 96 mérőhelyes lemezre, ahol további 15-90 percig l5-50°C-on inkubáljuk az elegyet, a szinreakció kifejeződéséig. Az elegy abszorbanc iáját abszorbancia mérésére alkalmas készülékkel mérjük, lehetőleg olyannal, ami a 96 méröhelyes lemezt képes a megfelelő hullámhosszon leolvasni, ez a mérési hullámhossz pedig lehetőleg 540 nm legyen.
Az SzFV reakció során a mérést zavaró vegyületek keletkezhetnek a tesztcsövek műanyag alkotóiból, az esetleges bevonatokból vagy a csövekben maradó esetleges műanyag maradványokból a savas kezelés hatására. A méröedény (tesztcsö) gondos megválasztása ezért fontos az SzFV reakció kivitelezése során. Akkor nevezhető egy tesztcsö SzFV mérésre alkalmasnak, ha egy, a találmány leírásának megfelelően elvégzett SzFV reakció során egy EV mintát nem tartalmazó tesztcsöben a számított lipid mennyiség a mérési küszöb alá, előnyös esetben a kimutatási küszöb alá esik. Az E V mintát ebben az esetben a minta hígítására is használt vizes pufferei helyettesítjük, a mintával megegyező térfogatban. Egy példa tesztcsö, amely nem alkalmas az SzFV mérés kivitelezésére lehet a LoBind T330 7LST Simport Kanadából. A cső belső felszínének bevonata reakcióba lép a méréshez használt vegyületekkel, így műtermékként zavarja a mérést.
A „törzs szuszpenzió” kifejezés alatt egy olyan szuszpenziót értünk, mely esetében pontosan ismert mennyiségű tiszta vegyületet (referencia anyagot) szuszpendálunk ismert térfogatú oldószerben, a jelen esetben vizes pufferben, ami lehet például PBS, általában 0,1-10 mg/ml koncentrációjú szuszpenziót eredményezve, A törzs szuszpenzió stabil, ami azt jelenti, hogy a szerves és vizes fázisok legalább 24 órán keresztül, de lehetőleg 7 napon keresztül sem válnak szét, újabb keverési lépés beiktatása nélkül sem. A jelen találmányban használt törzs szuszpenzió vizes oldatban / pufferben szuszpendált referencia anyagból készült.
A referencia anyag lehet bármilyen olyan foszfolipid, mely stabil Hposzómák képzésére alkalmas; például l,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokölin (DOPC), szfingomielin, vagy bármely más foszfolipid, például foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanoi-amin. Előnyben részesítendőek azok a föszfolipidek, melyek stabil liposzómákat képeznek, és kettős kötést tartalmaznak egy vagy több alkil-láncban. A referencia anyagot szuszpendáló vizes oldat vagy puffér lehet például PBS, NaCl- HEPES, DPBS, MES, TR1S és fiziológiás NaCIoldat, lehetőleg PBS vagy NaCI-HEPES. A törzs szuszpenzió legyen mentes a szerves oldószerektől.
A „referencia szuszpenzió kifejezésen a törzs szuszpenzió egy olyan hígított változatát értjük, ahol a referencia anyag pontos koncentrációja ismert. A referencia szuszpenzió elkészíthető a törzs szuszpenzió és vizes bázisú oldószer pontos térfogatainak összemérésével. A referencia szuszpenzió az SzFV reakció során pontosan ugyanazokon a lépéseken megy keresztül, mint az. EV készítmény, tehát kénsavai, majd foszfo-vanillin reagenst adunk hozzá, megvárjuk a színreakció kifejeződését, végül a kapott oldat abszorbanciája kerül lemérésre. Röviden, a referencia szuszpenzióból a b) lépés során képződik a referencia oldat. A referencia szuszpenzió szerves oldószer mentes kell, hogy legyen. A referencia szuszpenzió készülhet közvetlenül a mérés előtt, vagy használhatunk kereskedelmi forgalomban kapható, használatra kész szuszpenziót is.
A „szerves oldószertől alapvetően mentes” kifejezés alatt azt értjük, hogy az oldat olyan kis mennyiségben tartalmaz szerves oldószert, mely nem okoz az SzFV reakció során sárga elszíneződést a foszfovanillin reagens hozzáadása előtt. Pontosabban, a „sárga elszíneződés hiánya (tehát a szerves oldószertől való mentesség) kifejezés alatt azt értjük, hogy ha a találmány leírásának megfelelő tesztedényben,, kénsav hozzáadása után, de a foszfo-vanillin reagens nélkül elvégezzük a referencia anyagon vagy az EV mintán az SzFV mérést, akkor a kapott abszorbancia érték nem haladhatja meg a foszfo-vanillin reagens jelenlétében a legalacsonyabb referencia szuszpenzió koncentráció értékénél mért abszorbancia 20%-át.
A leírás értelmében a „számszerűsítés” kifejezés az EV készítményben lévő EV-k mennyiségének meghatározására vonatkozik. A (relatív) számszerűsítéshez szükségesek referencia szuszpenziók különböző ismert koncentrációkban, melyekkel a b) lépésben készített minta oldatok abszorbanciája összevethető, miután az SzFV reakció azonos lépéseinek lettek alávetve. Ha több, mint egy referencia szuszpenziót használunk a mérés során, akkor a referencia anyag koncentráció adatai és a mért abszorbanciák felhasználásával lineráris regressziós analízist követően egy egyenes vonal (kalibrációs görbe) nyerhető. A minta koncentrációja (az EV készítményben lévő lipidek mennyisége) ezután a regressziós képlet segítségével kiszámítható.
Az EV mintában mért lipidek mennyisége összefügg a minta EV tartalmával, hiszen a lipidek mennyisége összefüggésbe hozható az EV-k felszínének nagyságával, ami egy ismert mérettartományon belül értelmezve korrelákatható az EV-k mennyiségével is. Kellően keskeny mérettartományban vizsgálva az EV-ket az egyes EV-k felszínének nagysága ismert, vagy kiszámítható. Szélesebb méreteioszlást vizsgálva, néhány esetben a méret eloszlás ismeretében szintén kiszámítható az EV-k mennyisége. A méreteloszlás lehet ismert, vagy mérési ötös meghatározott. Szakember számára a lipid adatok ismeretében az EV-k mennyisége meghatározható. A „meghatározás kifejezés helyett használható a „kiszámítás” kifejezés is,
A biológiai minták Hpid komponenseit általában szerves oldószerekkel, például metanollal kloroformmal vagy metanol-kloroform elegyekkel izolálják. Általában kromatográfiás módszerekkel, például vékonyréteg-kromatográfiával (TLC), nagynyomás ú foly adékkromatógráfiáva I (HPLC) és lömegspektroszkópiával (MS), illetve fluoreszcens jelölési módszerekkel és kolorlmetriás detektálással is jeilémezhetöek. Kémiai szempontból, lipidek erősen «poláros molekulák, és főleg szerves oldószerben oldódnak.
A foszfolipidek (pl. fosziatidifkolin, foszfatidil-szerin), amelyek a biológiai membránok fö komponensei, tartalmaznak egy poláris téjesoportot, emiatt amfipatíkus molekulák. Ezek az amfipatikus foszfolipidek micelíákat és stabil kolloidokat képezhetnek.
Λ klasszikus lípíd jellemzési technikák során a kolloid részecskéket, mint pl. a liposzómákat, ajánlatos kerülni, mivel ezek mérési műtermékekhez és a berendezés eltömődéséhez vezethetnek.
Az SzFV-hez hasonló színreakción alapuló vizsgáltai módszerek esetében a lipidek és a standardok egyaránt szerves oldószerben oldottak. A legelterjedtebb oldószer a kloroform, míg más laboratóriumok más oldószereket, például abszolút etanolt, klotoform-metanol keverékeket, szénteirakloridot, hexánt, DMSO-t alkalmaznak.
A reakció standardjaiként általában különböző olajokat használnak, mint pl. olívaolaj. Schizochytrium olaj, kukoricaolaj, menhaden halolaj és koleszterin, vagy palmitinsav és olajsav keveréke fl: 1 j. Ezek az olajok nem képeznek stabil kolloidokat, ellentétben a foszfolipldekkel (pl. DOPC). Emiatt ezeknek az anyagoknak a sorozatos hígítása nem végezhető el vizes oldatokban, a szerves oldószerek alkalmazása elkerülhetetlen.
A kezdeti célunk az SzFV reakcióval az EV-k mérése volt, melyek természetükből adódóan kolloidként, viselkednek. Először halolaj és koleszterin kloroformban oldott formáit használtuk referencia anyagként [ lö], A vizes fázisban lévő EV mintákhoz szintén kloroformot adtunk, igy biztosítva a minták és a standardok egyenlő kezelését. Ezen korábbi vizsgálatok során megfigyeltük, hogy a maradék szerves oldószerek műtermékhez, a reakció sárgás elszíneződéséhez vezettek. A referencia anyag intenzív elpárologtaíása a pipettázás pontatlanságát, illetve az oldószer mennyiségi csökkenése következtében megnövekedett koncentrációt okozhat.
Ezek a hatások együttesen az SzFV reakció alacsony érzékenységét eredményezték, és szinte lehetetlennek bizonyult az EV mintákban található 2-5 pg, vagy annál is kevesebb mennyiségű lipid kimutatása. Általában az egy·' izolálás során kinyerhető EV-k lipid mennyisége összességében nem haladja meg a 2-5 pg-ot, ami azt Jelenti, hogy az EV minták legalább felél fel kellett használni a lipidek mennyiségi meghatározására. A szerves oldószerek használata egészségügyi kockázatot is jelent, Fontos megjegyezni, bogy ha a lipid minták szerves oldószereket is tartalmaznak, mint példáid a kloroformot, dimetil-szulföxidot (DMSO) vagy acetont, akkor sárgás szín képződik. A sárga szín befolyásolja a mért abszorbandát, különösen az alacsonyabb koncentrációíartotnányban. Annak ellenére, hogy bár összefüggés mutatható ki a minták lipid tartalmával, a reakció speciflcuása és érzékenysége nem tette lehetővé az olyan alacsony lipid koncentrációk meghatározását, amelyek jellemzők az EV-készítményekre (1, ábra). A fenti jelenség szerepel kereskedelmi forgalomban kapható, SzFV reakción alapuló lipid mennyiség meghatározására szolgáló készlet műszaki leiratában is. A készlet gyártója a sárgás háttér színből adódód abszorbaneia levonását javasolja $40 nm hullámhosszon az SzFV reakciói követően (Lípid Quanntificatíon Kit, STA-613 Cell Bioiabs, Inc.). A probléma ismeri a területen, de igazán hatékony megoldás ezidáig nem állt rendelkezésre.
A jelen találmány feltalálói, ahelyett, hogy a klasszikusan használt olaj alapú referenciákat használták volna, készítettek és a mérések során használtak egy (X>PC liposzóma referencia anyagot, amely lehetővé tette a reakció kivitelezését vizes fázisban. Módosított lipid vizsgálatunkban így kiiktattuk a szerves oldószereket a mérési módszerből, és mind a standardok, mind a minták vizes fázisban vannak. Ezeknek a liposzómáknak a fizikai-kémiai tulajdonságai nagyon közei állnak az EV-kéthez,.emiatt a mérések pontosak. A DOPC liposzóma szuszpenzió referencia anyagként való alkalmazása kiküszöbölte mind a műtermékként megjelenő sárga szín, mind a pipettázási nehézségek okozta problémákat, hiszen szerves oldószer nélkül nem jelenik meg a sárga háttérszín sem. Bár a korai kísérleteinkben DOPC-t használtunk, egyértelmű, hogy bármely liposzóma képzésre alkamas Ibsztolipid használható referencia anyagként, pl. szfíngonüeh'm fosziatidiVszerin é foszfatidilelhanonamin is.
A hpkl mérés érzékenységének növelésére egy optimalizált foszfo-vanillin reagens is bevezetésre került. A végső vanillin-koncentráció S-szeresére nőtt ahhoz képest, mint amit Osteikoetxea és mtsai leírtak [10], A töményebb foszfo-vanillin reagens 4t:C-on, fénytől védve 3 hónapig stabil maradt.
A fent leírt találmány alkalmazható bármely biológiai membrán mennyiségi meghatározására, pl. plazmamembrán, sejtmagmembrán, ER membrán, intracellulárís vezíkulnmok membránjai, mitokondriális membránok, különböző kloroplaszt membránok, mikroszómáíis membránok stb. A mintáknak azonban meg kell fejelniük a fentebb említett kritériumoknak, úgy mint nem tartalmazhatnak a kénsavval reakcióba lépő egyéb komponenseket, illetve vizes pufferben kell legyenek szuszpendálva. lodixanol maradványok a bennük található a hensíl-gyúni miatt szintén növelhetik a reakció során mért hátteret. A biológiai membránokat tartalmazó készítmény előállítására szolgáló módszerek jói ismertek a témában jártas szakemberek számáré, éppúgy, mint az, hogy a készítménynek hasonló méret tartományba eső membrán darabokat kell tartalmaznia az EV-khez hasonlóan. A számszerűsítés további lépései megegyeznek az EV-k esetében leírásra körűitekkel, a szükséges változtatásokkal
Annak, bizonyítására, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmas az EV minták lipid tartalmának mérésére, kereskedelmi forgalomban kapható, 5 mgfml-es fehérje koncentrációjú LDL lipid tartalmát is megmértük. Az LDL egy jó és elfogadott EV-modell, amelynek jól ismert és dokumentált lipid tartalma van. A mért fehérje / lipid (P / L) százalékos aránya 24,89 A 1,8% volt, ami jól illeszkedik az Irodalmi adatokhoz, ahol a P / L arány 23 és 26% között van [291.
Ax EV-k lipid tartalmát megmértük az új liposzóma alapú kolorimetriás lípíd vizsgálattal, illetve a korábban leírt ATR-FTIR spektroszkópiával is [9]. Az mEV-kben detektált lipid mennyiséget a két független módszerrel azonosnak találtuk, míg a kolorimetriás vizsgálat szórása tizedtésze volt az ATR-FTIR alapú módszerének.
A vizes fázisban is alkalmazható DOPC liposzóma standard használatával a korábban használt szerves oldószer alapú mérésekhez képest [10, 15, 16, 18. 19] egy nagyságrenddel sikerült megnöveljük a reakció érzékenységét. A megnövekedőit érzékenység lehetővé teszi az EV és más kolloid Hpídek mérését LoD - (1,2 pg és LoQ - ü,4 pg paraméterekkel. így az új mérési módszer érzékenysége összemérhető a gyakran használt fehérje meghatározó reakcióéval, a Micro BCA reakcióval. A találmány szerinti számszerűsítést limit 20%-os hibahatár mellett kb. 0,5 pg össz lipid mennyiség, a detektálási küszöbérték pedig 0,2 gg (5. ábra), ami alkalmassá teszi a módszert EV minták rutin vizsgálatára. A tapasztalataink szerint a kibocsájtó sejttípustól és EV típusiéi függőért átlagosan az egy izolálást procedúra során nyerhető EV minta kb. 2- 15%-a elegendő volt a lipidek mennyiségi meghatározásához,
A találmány leírásában ismertetett mérési módszert olyan általános EV komponensek jelenléte, mint a nukleinsavak és fehérjék nem befolyásolják.
Az EV-k sejtköltúra telülüszóból (ínég ha EV-mentesített szérummal vart is kiegészítve) gravitációs szűréssel és differenciál cemrifugálással történő izolálása során a keletkező EV-kben feldúsított mintákban mindig kimutatható valamennyi szennyező fehérje jelenléte (lásd. 5. Táblázat). A minták fehérje tartalmának mérése során kiugróan magas értékeket kapunk, még akkor is, ha sejtmentes körülmények között, csupán médiumból történik az „izolálás’', A jelen találmány leírásában ismertetett módszer képes különbséget tenni a valód, EV-ket tartalmazó minták és a sejtmentes környezetben izoláltkontroll minták közölt.
Az EPIC™ rendszerrel történt mérések igazolták (lásd. ki. példa), hogy a mintában található Hpidek mérése lényegesen megbízhatóbb viszonyítási alapot szolgáltat a mérések során, mint a fehérje tartalom meghatározása (4. ábra). Ezen felöl összehasonlítottuk a kereskedelmi forgalomban kapható lipid meghatározó készlet tisztított ílpid referencia anyagait a DOPC referencia anyaggal. A DÖPC és a tisztított lipidek érdemben nem tértek el egymástól (a 0,25 - ló pg lipídet tartalmazó mérési tartományban) a találmányban ismertetett módszer alkalmazása során. A további mérésekkel együttesen értékelve a fenti adatok igazolják a találmányban leírásra került módszer használhatóságát.
Módszerünk előnye, hogy bármely olyan laboratóriumban alkalmazható, ahol rendelkezésre áll elszívó fülke, ítüd blokk termosztát és spektrofotométer. Mivel a módszer során nincs szükség nagy értékű felszerelésre (ellentétben az IR spektroszkópiával és a tömegspektrometriávál), így egy egyszerű, megbízható és gyors módszerként alkalmazható a minták EV tartalmának meghatározására és a kísérletek összehasonlítására.
A következő példák célja csupán néhány előnyős kísérleti elrendezés bemutatása, a további felhasználási módok korlátozása nélkül.
Példák
I pétta: Se/ivomM
Az AC 16 humán cardiomyocyla sejtvonalat (SCC1Ö9) a Merck cégtől szereztük be, és a gyártó utasításainak megfelelően ifi viiro tenyésztettük. Az EV izolálás előtt az ACI6 sejteket a Davidson által leírt módon difíérertciáhattukf í Íj. A sejteket 0,02% zselatin (EMD Mlllipore) és 5 gg /ml fibronektin (Gibco) bevonattal ellátott szövettenyésztó lombikokban' tenyésztettük a kontinens állapot eléréséig. Miután a fenti állapotot elértük, további két héten át tenyésztettük őket DMEM / F12 médiumban, amely 2% lószérummal és Ix inzulin-uanszferrin-szelénnei (Gibco) volt kiegészítve, Az EV-eket szétummentes sejtkultúra felülószóbó! izoláltuk.
A H9c2 (2-1) BD1X patkány szív myoblast sejtvonalat az ECACC-tól a Sígma-Merck-en keresztül rendeltük. A sejteket DMEM tápközegben (Sigma) tenyésztettük 10% FBS (Gibco), 1% MÉM nem esszenciális aminosavoldal (Sigma), amibiotikum-antimikotikum (Gibco), 2 mM L-glutamm (EMD Millipore) és 3,51 g / 1 D'glükóz (Sigma) hozzáadása mellett.
EV izolálás előtt a H9c2 sejteket dílTerenciáltattuk a Ménard és mtsai által leírt módon [ 12], A sejteket a kontinens állapot eléréséig tenyésztettük, majd egy héten keresztül napontó friss 1% FBS-sel (Gibco) kiegészített DMEM médiumot kaptak, ezt követően egy további héten át 1% FBS-sel (Gibco) és 10 nmei retinomsawal kiegészített DMEM-ben tartottuk őket.Az EV-eket szérummentes kondicionált sejtfelülüszóból izoláltuk.
A HL l immortalizált egér cardiomyocyta séjtvonalat (SCC065) a Merck cégtől elrendeltük, és a gyártó utasításai szerint tenyésztettük. Miután a sejtek elérték a konfluens állapotot, további egy napig tenyésztésztettük őket (ebben az állapotban a sejtek spontán összehúzódásai kimutathatók voltak). Az EV-eket szérummentes kondicionált seitfölülúszöból izoláltuk.
A THP-l humán leukémiás monocita sejtvonalat az ECACC-töl a Sigma-Merck-en keresztül rendetek. A sejteket Osteikoetxea és mtsai által korábban leírtaknak megfelelően tenyésztettük (I3j A sejtvonalat 10%
FBS-t (Gibco), 2 m.M glutamínt (EMD MiHipore) és 1% antibiotikum-antimikotikus oldatot (Gibco) tartalmazó RPMl tápközegben tenyésztettük. Az EV-eket szérummentes kondicionált sej tiéi ül úszóból izoláltuk.
2. példa: £Wzotó/ó$ ~ feoWds kandicianáit seiikuitúrafeldlús^óból
Az EV-eket az Osteikoetxea és mtsai által leírt módon izoláltuk, [lOj kisebb változtatásokkal. Az izolálást megelőzően a sejteket háromszor megmostuk PBS-sel, és az EV-termeltetést 24 órán át hagytuk szérummentes tápközegben, vagy némely esetben 12.5%-os EV-mentes FBS (Gibco) jelenlétében végeztük.
Három különböző méretű EV alpopulációt izoláltunk, beleértve a nagy EV-ket (IEV, jelen esetben apoptotikus. testnek is nevezhetjük őket), közepes méretű EV-ket (mEV, vagy mikrovezíkula) és a kis EVket (sEV, exoszóma); nehézségi erő által hajtott .szűrés és differenciál centrifugál ás kombinációjával.
Röviden, először szobahőmérsékleten 300 g-vel történő cemrifugálással 10 perc alatt eltávolítottuk a sejteket, majd a felűlűszót átszűrtük külső nyomás alkalmazása, nélkül egy 5 pm átmérőjű szőrön (Miilipore, Billerica, MA). Ezt követően 49O<m 2.000 g centrifugális erővel 30 perc alatt kiűlepítettíík az IEV-ket (Avanti JXP26 centrifuga, J.A. 25. 15 rotor. Beckman Coulter Inc.). A telülúszót átszűrtük külső nyomás alkalmazása nélkül egy 0.8 um átmérőjű szűrőn (Miilipore), majd 12.500 g-vel 4-’C-on 40 pere alatt kiülepítettük az mEV-kel (Avanti J -ΧΡ2δ centrifuga, JA 25.15 rotor, Beckman Coulter Inc.). Végül a felüiűszót külső nyomóerő nélkül átszűrtük egy 0,22 pm-es szűrőn (Miilipore), majd ultracentriíugáltuk égy Optima MAX-XP asztali ultracentrifugával
MLA-5S szögrotorban (Beckman Coulter. Inc,) 100.000 g-vel 70 percig 4 ® C-on, így kiülepítva az sEV-ket.
Mindegyik EV üledéket egyszer újra felvettük sótartalmú pufferben (PBS) és a kiindulásinak megfelelő körülmények között újra kiülepítettük (mosási lépés).
3. példa: A. iipid standard elkészítése- törzs szuszpenzió
Lipid referencia anyagként !,2-dioleoil-sn-glicerO’3-foszfokoHn (DOPC) liposzómákat alkalmaztunk 1 mg. í ml koncentrációban. A DOPC-t Sigma-Aldrich-tól vásároltuk liofllizált formában. I mg DöPC-t feloldottunk I ml kloroformban (Reanal)egy 2 ml térfogatú csőben. Ezután a kloroformot elpárologtattuk 60 A~on egy thermoblokk (Eabnet) felhasználásával elszívó fülke alatt. Ezután a bepótolt DOPC-hoz PBS-t adtunk, és a csövet intenziven 2 percen át maximális sebességgel vortexetek (Fishefbrand). A kapott nyers liposzotnaszuszpenziót ezután ultrahanggal kezeltük 35 kHz-en (Emmi '20. EMAG) 45 X-on 10 percen keresztül, majd további 2 percig tartó intenzív vortexelés következett. A kapott liposzóma törzs szuszpenzió 4üC-on legalább 3 hónapig stabil, azonban közvetlenül a használatot megelőzően a törzs, szuszpenzió intenzív újra vortexelése szükséges.
4. példa: A foszfo-vaniilin reagens elkészítése
A lipid mérés érzékenységének növelése érdekében egy optimalizált foszfo-vaniHin reagenst vezettünk be. Ehhez 50 mg vanillint (Sigma) feloldunk 50 ml 17% -os foszförsavban (Sigma). így a végső vanillin koncentrációt ötszörösére növeltük ahhoz a korábbihoz képest, amit Osteikoetxea és mtsai használtak [10], A foszfo-vaniilin reagens 4 ’C-on, fénytől védve legalább 3 hónapig stabil.
5. példa: Kalibrálás és lineáris regresszió
A standard görbét 0,25-16 pg DOPC-böl 40 μΐ-ben (6,25-400 ng / mi, n = 3) állítottuk be az új liposzóma standard és a találmány szerinti eljárással növelt vanillin koncentráció alkalmazásával. Amint az a 2. ábrán látható, az 540 nm-es abszorbancta és a lipid koncentráció közötti koσeláció (Pearson r érték) megközelítőleg 1, ezért a módosított teszt alkalmas lipidek és liposzómák detektálására vizes fázisban.
6. példa: A lipid tartalom meghatározása egy EV készítményből
Kétszáz μΐ 96%-os kénsavat (Molar Chemicals) adtunk vagy 40 μΐ referencia szuszpenzióhoz vagy 40 μ| EV mintához, ami vagy PBS-ben volt szuszpendáiva, vagy ionmentesített vízben vagy nátrium-klorid HEPES pufiérben, 1,5 ml csövekben(Safe-Loek csövek, 1,5 ml, 0030 120-086, Eppendorf AG. Németország). Egy rövid vortexefést követően a csöveket nyitott tetővel 90°C-on inkubáltuk termoblokkban (AccuBlock, labnet), elszívó fülke alatt 20 percig. A csövek lehűtésére a mintákat legalább 5 percre 4°C-ra helyeztük, majd 120 pl foszfovanillin reagenst adtunk minden csőhöz és alaposan vortexeltük őket. Ezután minden mintából 280 pL-t átvittünk egy 96 lyukú lemez különböző lyukaiba (Thermo) és vártuk a színreakció kifejeződését a lemezt 1 órán át 37°C-on inkubálva. Az 540 nm-en mért abszorbanciát lemezt olvasni képes spektrofotométerrel határoztuk meg (Multiskan MS, Labsystems).
7. példa: A reakció mintaigénye
A következő kulcsfontosságú kérdés az volt, hogy a módosított lipídvizsgálat alkalmas-e az EVkészítmények lipidtartalmának mérésére. Ahogy az 1. táblázat mutatja, az EV minták 15%-a elegendő volt ahhoz, hogy könnyen kimutatható lípid adatokat biztosítson a találmány szerinti eljárással.
Az AC16 és HL 1 sejtek kondicionált tápfolyadékából sejtenként két db T175 konfluens szövettenyésztő Aaskából (24h szérummentes inkubációt követően) EV-ket izoláltunk, A kondicionált felülúszó térfogata 24 mi (kétszer 12 ml) volt. Minden méretfrakeióban 30pl EV készítményt kaptunk. Az EV-k 16%-át (5 pl-t a 30 plböl) használtuk fel a lípid mérésekhez.
1. T áb lázat
| Sejttípus | EV típus | EV méret (kb.) | Az EV-k összes lipid tartalma |
| AC 16 | Nagyméretű EV | 800-1500 nm | 37,84 pg |
| AC 16 | Közepes méretű EV | 200-800 nm | 21,60 ug |
| AC 16 | Kisméretű EV | <200 nm | 9,74 pg |
| HL I | Nagyméretű EV | 800-1500 nm | 36,34 pg |
| HIM | Közepes méretű EV | 200-800 nm | 57,29 pg |
HL 1
Kisméretű EV <200 nm
16,63 pg
8. példa: Az EV-k lípld koncentrációjának közvetett meghatározása ATR-FTIR spektroszkópiával
Az infravörös spektrumokat egy Varian 2000 FTÍR spektrométerrel (Varian Inc., USA) vettük fel, amely MCT (Mercury-Cadmium-TeHuride) detektorral és egy reflexiós gyémánt ATR tartozékkal (Specac Ltd, 'UK) volt félszerve. 3 ul mintát helyeztünk a gyémánt ATR kristályra, és a szárazfílm-spektrumokat rögzítettük (64 scan, 2 cm'1 spektrális felbontás) az oldószer elpárologtatósa után. Legalább 3 párhuzamos mérést végeztünk. A spektroszkópiai protein-Hpid arány (P l L speUrum) meghatározását a [9] pontban leírt: eljárás felhasználásával határoztuk meg. Röviden, a PBS háttér spektrális kivonása után a fehérje relatív mennyiségét a fehérje Amid I sáv (körülbelül 1650 cm'1) integrált intenzitása alapján becsültük meg, a lipid tartalmat pedig a CH 3020-2800 cm'1 huílámszámú régióban. A spektroszkópiai fehérje / lipid arány (P / Lspefctnmi) és a névleges fehérje / lipid arány (P / L™™) konverziója megfelelő kalibrációs görbét igényel. Ebből a célból a BSA - Agyi Teljes Lipid Kivonat keverékeket készítettünk PBS pufferben, különböző fehérje-lipid arányokkal (0,2-4 mg l mg).
9. példa: Az EV-k fehérjetartalmának meghatározása BCA alkalmazásával
Az EV-ek fehérjetartalmát Micro BCA Protein Assay kit (Thermo) segítségével határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. Röviden, az EV-ket 5-10-szer hígítottuk, és 0,5% Triton ΧΊΌ0 (Sigma) és 0,05% SDS (Sigma) felhasználásával lizákuk. A színreakció kifejlődésére 1 órán át 60 cC-on inkubáhuk, majd az abszorbanciát 562 nm-en mértük (NanoDrop NP-1000 ThermoFisher).
10. példa: A találmány szerinti eljárás és az ATR-FTIR módszer összehasonlítása
A módszert a H9c2 és AC16 sejívonalak differenciált sejtjeinek szérummentes kondicionált tápfolyadékából származó mEV-k (100-800 nm átmérő) felhasználásával validáltuk. Az mEV-k lipid tartalmát megmértük (a 6. példa szerint), és összehasonlítottuk az ATR-FTIR spektroszkópián alapuló módszer eredményével (8-as példa). A 2, Táblázatban bemutatott összes lipid mennyiség a spektroszkópiai és a névleges lipid arány felhasználásával, a Micro BCA méréssel meghatározott fehérjekoncentráció ismeretében került kiszámításra (9. példa). Az általunk kifejlesztett új lipid mérés és az ATR-FTIR mérés eredményeinek összehasonlítását a 3. Táblázatban foglaltuk össze. Az mEV-k detektált lipid mennyiségét a két független módszerre) azonosnak találtuk, azonban a színreakción alapuló új mérés szórása tizedrésze volt az ATR-FTIR módszerének.
2. Táblázat
| P / L spektr | P / L nőin | Protein konc, ng / ml | Számított lípid konc, ng / ml | |
| AC16 mEV | 0,3587 ±0,0716 | 0,8178 ± 0,2524 | 86,6 | 113,9 ±39.47 |
| H9c2 mEV | 0,3516 ± 0,1068 | 0,7928 ± 0,3761 | 101,7 | 144,5 ±68,57 |
3. táblázat
Mima
A fehérje koncentrációja (ng / pL)
Lipid koncentráció a találmány szerinti eljárással mérve (ng / pL) mEV H9c2 mEV AC 16
101,7 ± 2,9
86,6 ±2,58
114,5 ±3.1
105,1 ± 1,5
Lipid koncentráció az IR-módszer alapján számítva (ng / pL) 144,5 ± 68,6 í 13,9 ± 39,4
11. példa: Ez EV~a$sz.oclált felszíni adhéziós jel meghatározása
Az EV-k felszíni adhéziós jeleit a Németh és mtsai által leírt módon határoztuk meg [17], THP-1 sejtekből származó sEV-k esetében. A mérésekhez az EPJC!M asztali mérőállomást használtuk (Corning Inc.) a hozzá való Corning EPIC 384 lyukú mikrolemezekkel együtt. A mérés során az EV-k felülethez való kitapadása során bekövetkező törésmutató változást detektáltuk. A bevonat nélküli lemezre kitapadó EV-k jel intenzitása arányosnak bizonyult az EV-k mennyiségével.
A. mérés során az adhéziós szignálból következtetett EV mennyiség összefüggését vizsgáltuk a minták fehérje és lipid koncentrációjával. Kisméretű EV-ket izoláltunk THP-1 sejtek szérummentes kondicionált felüiúszójából. A bevonat nélküli EP1C,M felületi jelet összehasonlítottuk a Micro BCA módszerrel meghatározott fehérje koncentrációval és a találmány leírásának megfelelően mért lipid tartalommal. A 4/A ábrán látható az összefüggés a mért lipid tartalom és az EPIC™ segítségével meghatározott adhéziós szignál között. A 4/B ábrán pedig ugyanennek a jelnek a fehérje koncentrációval mutatott összefüggése látható. Jól látható, hogy a minta vezikula tartalma (EPIC1M csupasz felületi jel nagysága) erősen korrelál a minta lipid tartalmával, míg a fehérje mérés esetében ez az összefüggés nem igazolható.
12. példa: Az EV-k méreteloszlásának és koncentrációjának meghatározása
A H9c2 sejt eredetű mEV-k méretelosziását és koncentrációját egy állítható méretű nanopórus segítségével „tunable resistive pulse sensing módszerrel (qNaNo, IZON Science Ltd.) a korábban leírtaknak megfelelően határoztuk meg [17]. A PBS-ben kétszeresen hígított mintát (összesen 24 ml sejtfelülúszóból származó EV) 0,2 pm pórusátméröjü szűrön átszűrtük, majd qNaNo készülékkel a mértük. Legalább 700 részecskét számoltunk le, 10 mbar nyomás alkalmazása mellett egy NP400-as nanopórus membrán felhasználásával. A kalibrációhoz ElOOO-szer 0,2 μιη-es szűrőn átszűrt PBS-ben hígított CPC400G ismert koncentrációjú kalibrációs gyöngyöket használtunk (IZON Sciences; átlagos átmérő: 340 nm). Az adatok kiértékelése az IZON Control Suite 3.2 programmal történt.
A CD63-at hordozó H9c2 eredetű EV-k méret és koncentráció meghatározása qNaNo-val a 3. ábrán látható. A 3/A ábrán a H9c2 sejtek kondicionált felüiúszójából származó EV minta méreteloszlása és koncentrációja látható. A 3/B ábrán ugyanezen minta közepes méretű EV-inek elektronmikroszkópos képe látható. A CD63 fehérje jelenlété a mintában 10 nm-es aranyrészecskével konjugált antitesttel, immunológiai jelöléssel mutattuk ki (lásd. 13. példa).
A teljes membránfelszín / ml mennyiséget a részecskék átmérőjéből és koncentrációjukból számítottuk ki. A minták lipíd tartalmát a találmány szerint optimalizált lipid méréssel határoztuk meg. Azt találtuk, hogy az EV minta találmány szerinti eljárással kapott lipid mennyisége 2,66 x 10 g lipid / m2, míg a qNaNo-val megbatározott részecskeméret és koncentráció alapján 3,59 χ 10 g lipid / m2 a várható számított mennyiség, ha minden részecskét észlelt a qNaNo, és az EV-membránok fehérjetartalmát nem vettük számításba [21],
13. példa: A CD63 pozitív H9c2 mEV-k transzmissziós elektronmikroszkópiával történő kimutatása
A transzmissziós elektronmikroszkópiás eljáráshoz 2 μ| 0,22 μπι-en szűrt PBS-ben felvett mintát vittünk fel 300-as hálós, formwar-ral bevont nikkel gridekre, majd 10 percen át inkubáituk szobahőmérsékleten. Ezután a maradék folyadékot leitattuk, és a mintákat 10 percen keresztül szobahőn fixáltuk 0,22 pm-en szűrt PBS-ben oldott 4%-os parafonnáldehid oldatban, majd háromszor mostuk szűrt PBS-ben egyenként 5 percen keresztül. A blokkoláshoz l órán keresztül szobabőn inkubáituk a mintákat 5% BSA-t (Sigma) tartalmazó 0,22 pm-en szűrt PBS-ben. Az elsődleges antitestettek amely monoklonális, nyálban termelt anti-CD63 IgG volt (H-193, cs15363, Santa Cruz Biotechnology) egy éjszakán keresztül inkubáituk a mintát, 1:50-es hígításban (a hígítás 5% BSA-t tartalmazó szűrt PBS-ben történt), 4cC-on.
Másnap háromszor 5 perc mosási lépést követően (5% BSA 0,22 pm-en szűrt PBS-ben) egy kecskében termelt, 10 nm-es aranyrészecskével konjugált, poliklonális anti-nyúl IgG-t használtunk 3 órán át, szobahön inkubálva. Újabb három mosási lépés után (5% BSA 0,22 pm-en szűrt PBS-ben), háromszor 5 percig mostuk a mintákat 0,22 pm-en szűrt PBS-ben, végül háromszor 5 percig tisztított vízben. Ezután a minták végleges fixálása történt 2%-os glutáraídehíd oklattal 10 percen keresztül szobahőmérsékleten, amit három ötperces mosás követett tisztított vízzel. A háttér kontrasztozása 2%-os foszfo-wolfrámsav oldattal történt 10 percen keresztül szobahön. Végül háromszor egy perc gyors mosással fejeztük be a minták előkészítését. A gridek analízise JEOL 1011 (Japán) transzmissziós elektronmikroszkóppal történt.
14. példa: Zavaró tényezők vizsgálata
Annak a kérdésnek az eldöntésére, hogy az EV készítmények potenciális egyéb komponensei zavarhatják-e az optimalizált lipid mérési módszert, növekvő koncentrációban fehérjéket és nukleinsavakat (DNS) adtunk a 2,5 pg DOPC liposzómát tartalmazó mintához, és vizsgáltuk az 540 nm-en mért abszorbancia értékeket.
Szarvasmarha-szérttmalbumint (BSA) alkalmaztunk tesztfehérjékként, illetve Saccharomyces cerevisiae sejtekből kivont genomiális DNS-tmint teszt nukleinsavat. A 4. Táblázatban összefoglalva látható, hogy sem a fehérjék, sem a nukleinsavak nem interferálnak érdemben az optimalizált lipid mérési módszerrel.
4. táblázat
| A fehérje koncentrációja W | Abszorbancia (arb) | isatétlésszám a | t-próba p: | Egyatas ANOVA | |
| átlagos | SD | ||||
| 0,0 | 0,1839 | 0,0213 | 6 | 6' (0,2894) | |
| 0.63 | 0, i 830 | 0,0076 | 3 | 0,9463 | <F 42.6143) |
| 1,25 | 0,1830 | 0,0176 | 3 | 0,9512 | |
| 2,50 | 0,1953 | 0,0068 | 3 | 0,4076 | A fehérje (BSA) |
| 5.00 | 0,1917 | 0,0184 | 3 | 0.6642 | koncentrációja |
| 10,00 | 0.1867 | 0.0101 | 3 | 0,8414 | lényegesen nem |
| változtatja meg az | |||||
| 20,00 | 0,1933 | 0.0105 | 3 | Ut5vzu | átlagos abszorbanciát |
| 40,00 | 0,1842 | 0,0262 | 3 | 0,989! | 540 nm-en |
| DNS- | Abszorbancia (arb) | ismétléssszám | t-próba | Egymás ANOVA | |
| koncentráció (ag) | li | p- | n | p: | |
| 0.0 | 0,1355 | 0,0178 | 6 | ||
| 15.6 | 0,1270 | 0,0066 | 3 | 0,4629 | F (0,3354) |
| 31.3 | 0,1273 | 0,0176 | 3 | 0,3366 | <F 423435) |
| 62,5 | 0,1323 | 0,0074 | 3 | 0,7822 | |
| 125,0 | 0,1410 | 0,0174 | 3 | 0,6740 | A DNS-koncentrácíó |
| 250,0 | 0,1310 | 0,0017 | 3 | 0,6862 | szignifikánsan nem |
| 500,0 | OJ3Í3 | 0,0157 | 3 | 0,7428 | változtatja meg az átlagos abszorbandát |
| 1000.0 | 0,1300 | 0,012! | 3 | 0,6>00 | 540 nm-en |
Ezen léiül bemutatunk egy olyan példái is, amelyben 12,5%-os EV-deplelált szérummal (Gibco) kiegészített kondicionált sejtfelülúszóból EV-ket izoláltunk. A közepes (mEV) és kisméretű (sEV) vezikulák fehérje koncentrációját Micro BCA kit (Thermo) felhasználásával határoztuk meg. A lipid koncentrációt a találmány szerinti eljárással határoztuk meg. Az EV-ket 24 ml kondicionált sejtfelhlászóhól (AC 16 sEV és AC ló mEV) izoláltuk 24 óra inkubációt követően két kcnfluens ΤΓ75 tenyésztő fiaskóból. A szövettenyésztő közeg 12,5% EV-smentesített szérumot (Gibco) tartalmazott. Az „mEV médium” és az „sEV médium” 24 mLsejtekkel nem kondicionált tápfolyadék technikai kontrollja, amely 12,5% EV-mentes szérumot (Gibco) tartalmaz. Az EV készítmények fehérje és hpíd tartalmát összehasonlítottuk az azonos módon kezelt, nem kondicionált médium mintákból kapott értékekkel (5. táblázat). Amint a táblázatban látható, az összes minta jelentős és viszonylag hasonló mennyiségű fehérjét tartalmazott. A lipid tartalom azonban csak a kondicionált médiumokból származó EV-k cselében volt mérhető.
5. táblázat
| A fehérje koncentrációja ag / mi | Lipid koncentráció ng / ml | Protein / lipid arány (közepes háftéikvonás utá») | |
| mEV AC 16 | 205,00 | 21,83 | 2,52 |
| sEV AC 16 | 206,67 | 17,16 | 2,04 |
| mEV médium | 150,00 | ND | N A |
sEV médium ND N/A
1$. pé/W Ar opttmo/izd/t lipio' mérés összehasonfftósa σ kereskedelmi forgalomban kapható iipid meghatározó készlettel
Először összehasonlítottuk a kereskedelmi készlet standard görbéit (a gyártó utasításainak megfelelően) és az optimalizált lipid vizsgálatunk görbéit. Meghatároztuk a relatív standard deviációd értékeket (RSD%), melyek a 5. ábrán láthatóak. Amint az az ábrán látható, az általánosan elfogadott maximális 20%-os ESD értéket (melyet az ábrán pontozott vonallal jelöltünk) [32], az optimalizált lipid mérés esetében 0,4 pg teljes lipid tartalomnál értük el 40 pl térfogatban (10 ng / pl-es koncentráció), míg a kereskedelmi lípíd készlet esetében ez az érték 1.6 pg lipid volt, 20 pl térfogatban (80 ng / pL- es koncentráció). Ez azt jelenti, hogy az optimalizált lípíd vizsgálat érzékenysége körülbelül egy nagyságrenddel nagyobb, mint a kereskedelmi forgalomban kapható készleté.
Ezenfelül valídáliuk az újonnan bevezetett DOPC liposzóma standardot is. Ennek érdekében a kereskedelmi készlet tisztított lipid standardját a mi DOPC standardunkkal együtt az új, optimalizált vizsgálattal mértük le. A kereskedelmi készlet referencia anyaga DMSO-ban van oldva. Hogy a minták egyenlő kezelését biztosítjuk, a 40 pl minta térfogata mindkét lípíd standard esetében 10 pl DMSO-t és 30 pl PBS~t tartalmazott. A DMSO jelenléte ebben az esetben magyarázza a vizsgálat alacsonyabb érzékenységét (6. ábra), A DOPC és a tisztított lípíd standardok (a 0,25-16 pg lipid tartományban) nem különböztek szignifikánsan egymástól a vizsgálatban.
Hivatkozások
I, Consortium E-T, Van Deun J, Mestdagh P, et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 2017 02/28/online;l4:228, dot: lCM(D8/nmeth,4185
2. Pocsfalvi G, Stanly C, Vilasi A, et al. Mass spectrometry of extracellular vesicles. Mass Spectrometry Reviews. 2016:35( 1):3-21. dm: lO.IOO2/mas,21457.
3. ¥áóez-Mö M, Siljander PRM, Andreu Z, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 2015 05/14 !2/22/received 02/24/revised 03/l0/aecepted;4:l0,3402/jev.v4.27066. doí: 10,3402/jev.v4.27066. PubMed PM1D: PMC4433489,
4, Maas SEN, de Vrij J, van der Vlist EJ, et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 20! 5 2015/02/28/:200:87-96.
$. Lötvall J, Hill AF, Hochberg F, et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 2014 12/22:3:l0.3402.jev,v3.26913. doit 10.3402 jev,v3.269l3. PubMed PMID: PMC4275645.
6. Tkach M, Kowal J, Théry C. Why the need and how to approach the functional diversity of extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2018 2018-01-05 OO:(8):OO;373.
7. György B. Módos K, Páll inger É, el al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters [10.1182 bk>od-2(H 0-09307595]. Blood. 201 l;l 17(4):e39.
8. Melo SA, Luecke LB, Kohlért C, et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer [Article]. Nature, 2015 06/24/online;523:177. dot: IO.I038/naturel458l
9. Mihály .1, Deák R. Szigyártó IC, et al. Characterization of extracellular vesicles by IR spectroscopy: Fast and simple classification based on amide and CH stretching vibrations. Biochimica et Biophysics Acta (BBA.) Biomembrancs. 2017 2017.-03/0
10. Osteikoetxea X. Balogh A, Szabó-Taylor K. et al. Improved Characterization of EV Preparations Based on Protein to Lipid Ratio and Lipid Properties, PLOS ONE. 2015;10(3):e012 I 184. dot: 10.1371 (journal .txme.O121184.
II. Davidson MM, Nesti C, Palenzuela L, et al. Novel cell lines derived from adult human ventricular cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2005 2005/07/01/:39(1 ):133-147.
12. Ménard C, Pupier S, Momet D, et al. Modulation of 1..-type Calcium Channel Expression during Retinoic Acid-induced Differentiation of H9C2 Cardiac Cells. Journal of Biological Chemistry. 1999 October 8. 1999,274(41 ):29003-29070. doi: 10.W74/jbc.274,41..29063,
13. Gsteikoetxea X, Sodar B, Nemeth A, et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Org Biomol Chern. 2015 Oct 14:13(38):9775-82. doi: 10.I039/c5ob0145Id. FubMed EMID: 26264754; eng.
14. Akbarzadeh A, Rezaei-Sadabady R, Davaran S, et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 2013 02/22 01/05/received 01/22/accepted;8( I ):102-102< doi: 10.1186/1556-276X-8-102. PubMed EMID: FMC3599573.
15. Frings CS, Fendley TW, Dunn RT, et al. Improved Determination of Total Serum Lipids by the Sulfo-Phospho-Vanillin Reaction, Clinical Chemistry. 1972; 18(7):673.
16. Frings CS, Dunn RT, A -Colorimetric Method for Determination of Total Serum Lipids Based on the Sulfb-phospho-vanillm Reaction. American Journal of Clinical Pathology, 1970;53(I):89-91. doi: 10, IO93/ajcp/53.1.89,
17. Németh A, Orgovan N, Sodor BW, et al. Antibiotic-induced release of small extracellular vesicles (exosomes) with surface-associated DNA. Scientific Reports. 2017 2017/08-15:7(:):8202. doi: 10.1Q38/S41598-017-08392-1.
18. Cheng Y-S, Zheng Y, VanderGheynst JS, Rapid Quantitative Analysis of Lipids Using a Colorimetric Method in a Microplate Format. Lipids. 2011 201 I/O 1/01:46( I) 95-103. dot: I0.1007/s 11745-0103494-0.
Johnson KR, Ellis G, Tbothili C. The sulfophosphovanillin reaction for serum lipids: a reappraisal. Clinical Chemistry. 1977;23(9): 1669.
20. Kuchinskiene Z, Carlson LA, Composition, concentration, and size of low density lipoproteins and of subfractions of very low density lipoproteins from serum of normal men and women. Journal of Lipid Research. 1982 July L 1982,23(5):762-9.
21. Reddy AS, Warshaviak DT. Chachisvilis M. Effect of membrane tension on the physical properties of DOPC lipid bilayer membrane. Biochimtca et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 2012 2012/09/01/: 1818(9):2271 -2281.
22. 1CH Quality Guidelines: An Implementation Guide. Teasdale A, Elder D, Nims RW, editors,: Wiley; 2017.
23. Sódar BW, Kittel Á, Pálóczi K, et al Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and mic-rovesicles during isolation and detection. Scientific Reports, 2016 04/18 01/14/received 03/2l/accepted;6:24316. doi: 10.103S/srep24316. PubMed PMID: PMC4834552.
Claims (10)
- Igénypontok1. Eljárás extracelluláris vezikulák (EV) mennyiségi meghatározására egy mintából, amely eljárás tartalmazza a következőket:a) EV készítmény biztosítása a mintából, az EV készítmény EV-ket tartalmazó vizes szuszpenzió;b) az a) lépés szerinti EV készítmény kapcsolatba hozása kénsawal, majd foszfo-vanillin-reagenssel és ezután színreakció kialakulásának lehetővé tétele, és így színes oldatot kapunk;c) a b) lépés szerint kapott oldat abszorbanciájának mérése;d) a c) lépésben mért abszorbancia érték összehasonlítása egy vagy több referencia szuszpenzió abszorbancia értékével, és az EV készítményben lévő lipidek mennyiségének számítása az összehasonlítás eredményéből;e) az a) lépés szerinti EV készítményben lévő EV-k mennyiségének számítása a d) lépésben számított lipid mennyiségéből azzal jellemezve, hogy- az a) lépés szerinti EV készítmény szerves oldószerektől alapvetően mentes;- a d) lépés szerinti referencia-szuszpenzió olyan szuszpenzió, amely tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, a referencia-anyag liposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen 1,2dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és- a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes, azaz az eljárást a referencia anyagon vagy az EV mintán elvégezve kénsav hozzáadása után, de a foszfo-vanillin reagens nélkül, a kapott abszorbancia érték nem haladja meg a foszfo-vanillin reagens jelenlétében a legalacsonyabb referencia szuszpenzió koncentráció értékénél mért abszorbancia 20%-át.
- 2. Eljárás lipideknek extracelluláris vezikulumokat (EV-ket) tartalmazó mintában történő mennyiségi meghatározására, amely eljárás tartalmazza a következőket:a) EV készítmény biztosítása a mintából, az EV készítmény EV-ket tartalmazó vizes szuszpenzió;b) az a) lépés szerinti EV készítmény kapcsolatba hozása kénsawal, majd foszfo-vanillin-reagenssel és ezután színreakció kialakulásának lehetővé tétele, és így színes oldatot kapunk;c) a b) lépés szerint kapott oldat abszorbanciájának mérése;d) a c) lépésben mért abszorbancia érték összehasonlítása egy vagy több referencia szuszpenzió abszorbancia értékével, és az EV készítményben lévő lipidek mennyiségének számítása az összehasonlítás eredményéből;azzal jellemezve, hogy- az a) lépés szerinti EV készítmény szerves oldószerektől alapvetően mentes;- a d) lépés szerinti referencia-szuszpenzió olyan szuszpenzió, amely tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, a referencia-anyag liposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen 1,2dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és- a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes, azaz az eljárást a referencia anyagon vagy az EV mintán elvégezve kénsav hozzáadása után, de a foszfo-vanillin reagens nélkül, a kapott abszorbancia érték nem haladja meg a foszfo-vanillin reagens jelenlétében a legalacsonyabb referencia szuszpenzió koncentráció értékénél mért abszorbancia 20%-át.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a d) lépés szerinti referencia szuszpenzió hígított törzs szuszpenzió, ahol a törzs szuszpenzió tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, és a törzs szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti EV készítmény olyan mérettartományba eső EV-ket tartalmaz, amely tartomány alsó határa és felső határa közötti különbség kisebb, mint 600 nm, előnyösen kisebb, mint 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm vagy 100 nm2134®
- 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti EV készítmény a 200 nm-nél kisebb mérettartományba eső EV-ket tartalmaz, vagy kb. 100-800 nm közötti mérettartományba eső EV-ket tartalmaz, vagy kb. 800-5000 nm közötti mérettartományba eső EV-ket tartalmaz..
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a vizes szuszpenzió oldószere egy vizes puffer, például PBS, NaCl-HEPES, MES, TRIS, fiziológiás nátrium-klorid-oldat, vagy DPBS, előnyösen PBS vagy NaCl-HEPES, és a referencia-szuszpenzió és a törzs szuszpenzió vizes pufferben szuszpendált, például PBS-ben, NaCl-HEPES-ben, MES-ben, TRIS-ben, fiziológiás NaCl-oldatban vagy DPBS-ben, előnyösen PBS-ben vagy NaCl-HEPES-ben.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol ab) lépés tartalmazza bl) az a) lépés szerinti oldat kapcsolatba hozását kénsavval és vortexel történő keverését;b2) a bl) szerinti keverék 90 °C-on 20 percig inkubálását, majd szobahőmérsékletűre hűtését;b3) foszfo-vanillin reagens hozzáadását és vortexel történő keverését;b4) a b3) szerinti keverék inkubálását 1 órán át 37 ° C-on, lehetővé téve a színreakció kifejeződését.
- 8. Eljárás biológiai membránok mennyiségi meghatározására egy mintából, amely eljárás tartalmazza a következőket:a) készítmény biztosítása a mintából, a készítmény biológiai membránokat tartalmazó vizes szuszpenzió;b) az a) lépés szerinti készítmény kapcsolatba hozása kénsavval, majd foszfo-vanillin-reagenssel és ezután színreakció kialakulásának lehetővé tétele, és így színes oldatot kapunk;c) a b) lépés szerint kapott oldat abszorbanciájának mérése, és így készítmény abszorbancia értéket kapunk, és referencia szuszpenzióból készített egy vagy több referencia oldat abszorbanciájának mérése, és így referencia abszorbancia értéket kapunk;d) a c) lépésben mért készítmény abszorbancia érték és egy vagy több referencia abszorbancia érték összehasonlítása és a lipidek mennyiségének számítása a készítményben az összehasonlítás eredménye alapján;e) az a) lépés szerinti készítményben lévő membránok mennyiségének számítása a d) lépésben számított lipid mennyiségéből azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti készítmény szerves oldószerektől alapvetően mentes;a c) lépés szerinti referencia-szuszpenzió olyan szuszpenzió, amely tartalmaz referencia-anyagot vizes oldószerben szuszpendálva, a referencia-anyag liposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen l,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanolamín; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes, azaz az eljárást a referencia anyagon vagy a mintán elvégezve kénsav hozzáadása után, de a foszfo-vanillin reagens nélkül, a kapott abszorbancia érték nem haladja meg a foszfo-vanillin reagens jelenlétében a legalacsonyabb referencia szuszpenzió koncentráció értékénél mért abszorbancia 20%-át.
- 9. Referencia-szuszpenzió alkalmazása, amely egy vizes oldószerben szuszpendált referenciaanyagot tartalmazó szuszpenzió, a referenciaanyag liposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen 1,2-dioleoil-snglicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referenciaszuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes; extracelluláris vezikulumok (EV-k) mennyiségi meghatározására egy mintában vagy készítményben, ahol a mennyiségi meghatározás az 1. igénypont szerint történik.
- 10. EV mennyiségi meghatározásra szolgáló készlet amely alkalmas az 1. és 3-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kivitelezésére, amely készlet tartalmaz referencia-szuszpenziót, amely egy vizes oldószerben szuszpendált referenciaanyagot tartalmazó szuszpenzió, a referenciaanyag liposzómák kialakítására képes foszfolipid, előnyösen l,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DOPC), szfingomielin, foszfatidil-szerin ‘-a213418^ vagy foszfatidil-etanol-amin; és a referencia-szuszpenzió szerves oldószerektől alapvetően mentes, továbbá tartalmaz foszfo-vanillin-reagenst és legalább egy használati utasítást.213418^
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU1800247A HU231255B1 (hu) | 2018-07-13 | 2018-07-13 | Extracelluláris vezikulák mennyiségének meghatározására kidolgozott új módszer |
| EP19761937.2A EP3821248A1 (en) | 2018-07-13 | 2019-07-12 | Method for determining the lipid content of extracellular vesicles |
| US17/259,625 US20210293834A1 (en) | 2018-07-13 | 2019-07-12 | Method for determining the lipid content of extracellular vesicles |
| PCT/HU2019/050033 WO2020012205A1 (en) | 2018-07-13 | 2019-07-12 | Method for determining the lipid content of extracellular vesicles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU1800247A HU231255B1 (hu) | 2018-07-13 | 2018-07-13 | Extracelluláris vezikulák mennyiségének meghatározására kidolgozott új módszer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP1800247A1 HUP1800247A1 (hu) | 2020-01-28 |
| HU231255B1 true HU231255B1 (hu) | 2022-07-28 |
Family
ID=89992724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU1800247A HU231255B1 (hu) | 2018-07-13 | 2018-07-13 | Extracelluláris vezikulák mennyiségének meghatározására kidolgozott új módszer |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210293834A1 (hu) |
| EP (1) | EP3821248A1 (hu) |
| HU (1) | HU231255B1 (hu) |
| WO (1) | WO2020012205A1 (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111781128B (zh) * | 2020-06-15 | 2023-07-07 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种尿分析仪用鞘液及其制备方法 |
| CN114606133B (zh) * | 2022-04-13 | 2024-04-26 | 厦门大学 | 一种从裂壶藻废渣中提取外泌体的方法 |
-
2018
- 2018-07-13 HU HU1800247A patent/HU231255B1/hu unknown
-
2019
- 2019-07-12 EP EP19761937.2A patent/EP3821248A1/en active Pending
- 2019-07-12 US US17/259,625 patent/US20210293834A1/en active Pending
- 2019-07-12 WO PCT/HU2019/050033 patent/WO2020012205A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP1800247A1 (hu) | 2020-01-28 |
| EP3821248A1 (en) | 2021-05-19 |
| WO2020012205A1 (en) | 2020-01-16 |
| US20210293834A1 (en) | 2021-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Visnovitz et al. | An improved 96 well plate format lipid quantification assay for standardisation of experiments with extracellular vesicles | |
| Lim et al. | Subtyping of circulating exosome-bound amyloid β reflects brain plaque deposition | |
| Paolini et al. | Residual matrix from different separation techniques impacts exosome biological activity | |
| Morasso et al. | Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis patients | |
| EP3335028A1 (en) | Optical analyses of particles and vesicles | |
| US10113968B2 (en) | Specific detection and quantification of cardiolipin and isolated mitochondria by positively charged AIE fluorogens and method of manufacturing thereof | |
| De Cecco et al. | Nuclear protein accumulation in cellular senescence and organismal aging revealed with a novel single-cell resolution fluorescence microscopy assay | |
| HU231255B1 (hu) | Extracelluláris vezikulák mennyiségének meghatározására kidolgozott új módszer | |
| Koster et al. | Surface enhanced Raman scattering of extracellular vesicles for cancer diagnostics despite isolation dependent lipoprotein contamination | |
| Moura et al. | Multiplex detection and characterization of breast cancer exosomes by magneto-actuated immunoassay | |
| Shahrouei et al. | Highly sensitive detection of Ceftriaxone in water, food, pharmaceutical and biological samples based on gold nanoparticles in aqueous and micellar media | |
| US20180252725A1 (en) | Microparticle fractionation | |
| Matencio et al. | Ellagic acid–borax fluorescence interaction: application for novel cyclodextrin-borax nanosensors for analyzing ellagic acid in food samples | |
| Ceccato et al. | PLIF: A rapid, accurate method to detect and quantitatively assess protein-lipid interactions | |
| Li et al. | Gold nanoparticle aggregation-based colorimetric assay for β-casein detection in bovine milk samples | |
| Bakker et al. | Preparing ductal epithelial organoids for high-spatial-resolution molecular profiling using mass spectrometry imaging | |
| Ramm Sander et al. | NMR spectroscopy of macrophages loaded with native, oxidized or enzymatically degraded lipoproteins | |
| Brombacher et al. | Characterization of Dendritic Cell Metabolism by Flow Cytometry | |
| Gao et al. | Simple method for O-GlcNAc sensitive detection based on graphene quantum dots | |
| Li et al. | Resonance Rayleigh scattering detection of the epidermal growth factor receptor based on an aptamer-functionalized gold-nanoparticle probe | |
| Liu et al. | Cancer diagnosis using label-free SERS-based exosome analysis | |
| Sarrasague et al. | Effect of serum proteins on an exogenous pulmonary surfactant: ESR analysis of structural changes and their relation with surfactant activity | |
| US20190369022A1 (en) | Method for evaluating surface state of particles, and evaluation system | |
| Eichmann et al. | α-Synuclein plasma membrane localization correlates with cellular phosphatidylinositol polyphosphate levels | |
| Bleicken et al. | New biophysical methods to study the membrane activity of Bcl-2 proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: TERMESZETTUDOMANYI KUTATOKOEZPONT, HU Free format text: FORMER OWNER(S): SEMMELWEIS EGYETEM, HU Owner name: SEMMELWEIS EGYETEM, HU Free format text: FORMER OWNER(S): SEMMELWEIS EGYETEM, HU |