HU226918B1 - Microbiological method for preparation of hydroxy derivatives of 4-androsten-3,17-dione - Google Patents
Microbiological method for preparation of hydroxy derivatives of 4-androsten-3,17-dione Download PDFInfo
- Publication number
- HU226918B1 HU226918B1 HU0501157A HUP0501157A HU226918B1 HU 226918 B1 HU226918 B1 HU 226918B1 HU 0501157 A HU0501157 A HU 0501157A HU P0501157 A HUP0501157 A HU P0501157A HU 226918 B1 HU226918 B1 HU 226918B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dione
- androstene
- hours
- ncaim
- hydroxy
- Prior art date
Links
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 title 1
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 claims abstract description 23
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 claims abstract description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 241000879295 Fusarium equiseti Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000228129 Penicillium janthinellum Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 150000001443 androstenes Chemical class 0.000 abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 7
- MYKMKUGZFQKMOZ-CKDIOHLVSA-N (8r,9s,10r,13s,14s,15s)-15-hydroxy-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(C[C@@H]4O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MYKMKUGZFQKMOZ-CKDIOHLVSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 5
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000007436 thin-layer chromatography-densitometry Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- MYKMKUGZFQKMOZ-HYNIEHHYSA-N (8r,9s,10r,13s,14s)-15-hydroxy-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MYKMKUGZFQKMOZ-HYNIEHHYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000235575 Mortierella Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 2
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- WVAMBAWFDOYFOD-BMSLSITRSA-N (6s,8r,9s,10r,13s,14s)-6-hydroxy-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3C[C@H](O)C2=C1 WVAMBAWFDOYFOD-BMSLSITRSA-N 0.000 description 1
- WVAMBAWFDOYFOD-DQXCSHPPSA-N 6beta-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3C[C@@H](O)C2=C1 WVAMBAWFDOYFOD-DQXCSHPPSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000010953 Ames test Methods 0.000 description 1
- 231100000039 Ames test Toxicity 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- RWKXIKGJGJYBJK-UHFFFAOYSA-N C(C)(=O)OCC.C(C)O.C1CCCCC1.C(Cl)(Cl)Cl Chemical compound C(C)(=O)OCC.C(C)O.C1CCCCC1.C(Cl)(Cl)Cl RWKXIKGJGJYBJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N Dehydroepiandrosterone Natural products C1C(O)CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241001149959 Fusarium sp. Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000228145 Penicillium brevicompactum Species 0.000 description 1
- 241000985513 Penicillium oxalicum Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940083712 aldosterone antagonist Drugs 0.000 description 1
- 150000001440 androstane derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001327 anti-mineralocorticoid effect Effects 0.000 description 1
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-AKLPVKDBSA-N carbane Chemical compound [15CH4] VNWKTOKETHGBQD-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- METQSPRSQINEEU-UHFFFAOYSA-N dihydrospirorenone Natural products CC12CCC(C3(CCC(=O)C=C3C3CC33)C)C3C1C1CC1C21CCC(=O)O1 METQSPRSQINEEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- METQSPRSQINEEU-HXCATZOESA-N drospirenone Chemical compound C([C@]12[C@H]3C[C@H]3[C@H]3[C@H]4[C@@H]([C@]5(CCC(=O)C=C5[C@@H]5C[C@@H]54)C)CC[C@@]31C)CC(=O)O2 METQSPRSQINEEU-HXCATZOESA-N 0.000 description 1
- 229960004845 drospirenone Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N formestane Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1O OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002394 mineralocorticoid antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002847 prasterone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical group O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- -1 steroid compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű vegyületekThis invention relates to compounds of formula (I)
- ahol a képletben R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport - előállítására, 4-androsztén-3,17-dion fermentáció útján történő szelektív hidroxilezésével.wherein R is hydrogen or hydroxy by selective hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione by fermentation.
Biológiailag aktív szteroidok kutatása során igényként és újabb fiziológiai hatást kiváltó vegyületek előállításának lehetőségeként merült fel e vegyületek különböző pozíciókban történő hidroxilezése, ami szintetikus módszerek alkalmazásával lehetséges ugyan, de rendkívül költséges.In the course of researching biologically active steroids, there has been a demand and potential for the preparation of compounds with novel physiological effects at various positions, which, although possible by synthetic methods, is extremely costly.
Ma már tudjuk, hogy a szteránváz szénatomjaira a 4-es és a 13-as kivételével - biokonverzióval, többnyire fonalasgombák alkalmazásával hidroxilcsoport vihető be. A reakciókért felelős enzimek a mikroorganizmusok sejtjein belül, proteázoktól védve, vezikulumokban, mikroszómákban rendeződve, membránhoz kötötten fordulnak elő.It is now known that, with the exception of 4 and 13, the hydroxy group can be introduced into the carbon atoms of the sterane backbone, most commonly by the use of filamentous fungi. The enzymes responsible for the reactions occur inside the cells of microorganisms, protected from proteases, organized in vesicles, microsomes, bound to membranes.
Ismert az is, hogy a 6,15-helyzetben szubsztituált androsztánszármazékok fontos szteroidhormonok és egyéb gyógyszerek értékes intermedierjei.It is also known that the 6.15-substituted androstane derivatives are important intermediates for steroid hormones and other drugs.
A 4-androsztén-3,17-dion és a dehidroepiandroszteron mellett a 3-azo-androsztán-vegyületek 6,15-helyzetben szubsztituált származékai periferikus szelektivitással rendelkező antiandrogének, amelyeket prosztatahiperplazia és -karcinóma kezelésére használnak (lásd: 4 021 433 és 4 143 142 számú német szabadalmi leírásokat).In addition to 4-androstene-3,17-dione and dehydroepiandrosterone, the 6,15-substituted derivatives of the 3-azo-androstane compounds are peripherally selective antiandrogens used for the treatment of prostate hyperplasia and carcinoma (see 4,021,433 and 4,143). 142).
Az antimineralokortikoid és antiandrogén hatással rendelkező drospirenon előállítása során szükséges a 6p,7p-metiléncsoport és a 15p,16p-metiléncsoport kialakítása, amely lényegesen megkönnyíthető mikrobiológiai lépésekkel. Az adott pozíciókban metiléncsoport beépítéséhez kettős kötést alakítanak ki, melynek egyik lehetséges útja mikrobiológiai hidroxilezésen keresztül vezet. Ugyanezen vegyületek szintetikus reakciókkal is kialakíthatóak bonyolult reakcióutakon, kevésbé szelektíven, s ezért lényegesen drágábban.The preparation of the antimineralocorticoid and the anti-androgen drospirenone requires the formation of the 6β, 7β-methylene group and the 15β, 16β-methylene group, which can be greatly facilitated by microbiological steps. A double bond is formed at these positions to incorporate a methylene group, one of which is via microbiological hydroxylation. The same compounds can also be formed by synthetic reactions on complex reaction pathways, less selectively and therefore substantially more expensive.
A 4-androsztén-3,17-dion hidroxilezésével több publikáció foglalkozik, amelyek szerint főleg monohidroxiszármazékokat sikerült előállítani és azonosítani.The hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione has been the subject of several publications, which have mainly produced and identified monohydroxy derivatives.
így, a 4-androsztén-3,17-dion 6β- és 15a-hidroxiszármazékát számos mikroorganizmustörzs fermentációjánál kimutatták, elsők között Hanc és munkatársai, akik közel 100 Aspergillus, Penicillium és Fusarium törzzsel hidroxilezték a 4-androsztén-3,17-diont a kérdéses pozíciókban [Pharmacotherapeutica 1950-1959 (1963)].Thus, the 6β and 15α-hydroxy derivatives of 4-androstene-3,17-dione have been detected in the fermentation of several strains of microorganisms, including Hanc et al., which hydroxylated 4-androstene-3,17-dione with nearly 100 strains of Aspergillus, Penicillium and Fusarium. at positions in question (Pharmacotherapeutica 1950-1959 (1963)).
Mineki és munkatársai a 4-androsztén-3,17-dion monohidroxiszármazékait előállították biokonverziós úton; Penicillium oxalicum törzzsel 6β- és 15a-hidroxi4-androsztén-3,17-diont, Fusarium sp. törzzsel 15ahidroxi-4-androsztén-3,17-diont és Aspergillus niger törzzsel 6a-hidroxi-4-androsztén-3,17-diont, 1 g/dm3 szubsztrátbevitellel [J. Ferm. Bioeng. 80 (3), 223-228, (1995)].Mineki et al., The monohydroxy derivatives of 4-androstene-3,17-dione were prepared by bioconversion; Strain Penicillium oxalicum 6β- and 15α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, Fusarium sp. strain 15ahydroxy-4-androstene-3,17-dione and Aspergillus niger strain 6a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione with a 1 g / dm 3 substrate intake [J. Ferm. Bioengineering. 80 (3): 223-228 (1995)].
A 15a-hidroxi-4-androsztén-3,17-diont már az 1980-as évek elején előállítottak, Penicillium és Fusarium törzsekkel 1,6 g/dm3 4-androsztén-3,17-dionszubsztrátból kiindulva; Penicillium stoloniferum törzzsel 60 óra alatt 82%-os konverzióval, Fusarium oxysporum törzzsel 24 óra alatt 86%-os konverzióval (lásd 3 403 862 számú német szabadalmi leírást).15α-Hydroxy-4-androstene-3,17-dione was already produced in the early 1980s starting with 1.6 g / dm 3 of 4-androstene-3,17-dione substrate with Penicillium and Fusarium strains; Penicillium stoloniferum strain with 82% conversion in 60 hours, Fusarium oxysporum strain with 86% conversion in 24 hours (see German Patent 3,403,862).
A 4-androsztén-3,17-dion-szubsztrát dihidroxilezett származékainak ismertetése és felhasználása szűk körű. így, a 6β,15α-όίΝ0ΓθχΙ-4-3η0Γθ3ζΙέη-3,17-όίοη mikrobiológiai képződését csak egyszer említik, nevezetesen a 6β,15α-dihidroxi-4-androsztén-3,17-diont Colonectria decora törzs biokonverziós termékei között azonosították Evans és munkatársai [J. Chem. Soc. 14, 1356-9 (1975)].Dihydroxylated derivatives of 4-androstene-3,17-dione substrate have been reported and used in a narrow manner. Thus, the microbiological formation of 6β, 15α-όίΝ0ΓθχΙ-4-3η0Γθ3ζΙέη-3,17-όίοη is only mentioned once, namely 6β, 15α-dihydroxy-4-androstene-3,17-dione has been identified in the bioconversion products of Evans strain Colonectria decora and et al., J. Chem. Soc. 14, 1356-9 (1975)].
A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amellyel 15a-hidroxi-4-androsztén-3,17-diont, illetve annak δβ-helyzetben tovább hidroxilezett származékát iparilag hasznosítható tisztaságban és magas kitermeléssel nyerhetjük.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a process for the preparation of 15α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, or a further hydroxylated derivative thereof at the δβ position, in commercially useful purity and in high yield.
Kísérleteink során abból indultunk ki, hogy a szteroidvegyületek mikrobiológiai hidroxilezésével kapcsolatban két olyan probléma merül fel, amely veszélyeztetheti az eljárás gazdaságos megvalósítását.Our experiments were based on the assumption that there are two problems associated with the microbiological hydroxylation of steroid compounds that could jeopardize the economical implementation of the process.
Az egyik probléma a szteroidmolekulák szerkezete, amely planárisan elhelyezkedő szén és hidrogén, valamint a 3-as és a 17-es pozícióban, a síkba beleolvadó oxigénatomokból épül fel. Igya hidroxilezhető szénatomok azonos térállásban vannak - ennek következménye viszont az, hogy az enzimek tevékenységének eredményeként egy időben több, különböző helyen hidroxilezett származék jelenik meg biokonverziós termékként.One problem is the structure of steroid molecules, which are formed of planar carbon and hydrogen, and at the 3 and 17 positions, the oxygen atoms melting in the plane. Thus, the hydroxylizable carbon atoms are in the same spatial position, which in turn results in the enzymatic activity of several hydroxylated derivatives at different sites appearing as bioconversion products.
A 15-ös helyzetben hidroxilezésre hajlamos törzsek esetén ezek a származékok általában a következők lehetnek: 11a-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion, δβ-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion, 11a,15a-dihidroxi-4-androsztén-3,17-dion. Annak ellenére, hogy a szennyezések mennyiségi aránya az alkalmazott mikroorganizmustól függ, továbbá, hogy arányuk bizonyos mértékben a fermentáció körülményeinek megválasztásával befolyásolható, jelenlétük olyan elválasztástechnikai problémákat vet fel, amelyek költség- és idővonzatai csökkentik az eljárás gazdaságos ipari alkalmazhatóságát, továbbá az értéktelen melléktermékek képződése erőteljesen rontja a főtermék elérhető hozamát.In the case of strains prone to hydroxylation at position 15, these derivatives may generally be: 11α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, δβ-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, 11α, 15α-dihydroxy 4-androstene-3,17-dione. Although the amount of impurities depends on the microorganism used and their proportion can be controlled to some extent by the choice of fermentation conditions, their presence raises separation problems, the cost and time of which reduce the economic viability of the process and the formation of worthless by-products. it reduces the yield of the main product.
A másik fontos szempont a megfelelő tenyésztési tulajdonságokkal rendelkező törzs kiválasztása. Ennek az a jelentősége, hogy a kísérleti eredmények szórása megnő, ha az egyébként jó biokonverziós képesség mellett, például a sejtek összetapadása miatt nehezen nyerhető homogén minta; az oltásra szánt térfogatokban a sejtek száma eltérő, valamint a később bevitt szubsztrát eloszlása nem egyenletes. Az összetapadt sejtek oldószer-átjárhatósága csökken, a végtermék izolálása nehézkes, és csak veszteséggel valósítható meg.Another important consideration is the selection of a strain with appropriate breeding characteristics. The significance of this is that the standard deviation of experimental results is increased when a homogeneous sample is difficult to obtain with otherwise good bioconversion capability, for example due to cell adhesion; the number of cells in the inoculated volumes and the distribution of the substrate administered later are not uniform. Solvent permeability of the adherent cells is reduced, isolation of the final product is difficult and can only be achieved at a loss.
HU 226 918 Β1HU 226 918 Β1
Kísérleteink során sikerült olyan mikroorganizmust izolálnunk, amelynek fermentorban mutatott szaporodási paraméterei megfelelnek a gazdaságossági követelményeknek, és olyan enzimekkel rendelkezik, amelyek a 4-androsztén-3,17-diont - mint szubsztrátot - a 15a-pozícióban hidroxilezi, de számottevő mértékű melléktermék-képződés nélkül.In our experiments we succeeded in isolating a microorganism whose growth parameters in the fermenter meet the economic requirements and possess enzymes that hydroxylate 4-androstene-3,17-dione at the 15a position without significant byproduct formation. .
Célunk volt továbbá, hogy olyan mikroorganizmust is izoláljunk, amely a 15a-pozíció mellett δβ-pozícióban is hidroxilezi a 4-androsztén-3,17-diont, ugyancsak minimális melléktermék-képződés mellett.It was also our aim to isolate a microorganism which, at position 15a, also hydroxylates 4-androstene-3,17-dione at a δβ position, with minimal by-product formation.
Figyelmünk az Aspergillus, Penicillium, Fusarium és Mortierella fajok felé fordult, mert tudtuk, hogy egyrészt a 4-androsztén-3,17-diont képesek különböző pozícióban hidroxilezni, másrészt tenyészeteik könnyen kezelhetőek, és számunkra előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek. Lombikban rázatott vagy fermentorban levegőztetett tenyészeteikben a fonálszerű micéliumok nem tapadnak össze, ideális esetben sűrű, de laza micéliumtömeget formálnak, amelyek nagy felületet biztosítanak a szubsztráttal való érintkezésre, így relatíve magas szubsztrátkoncentráció alkalmazása is lehetséges. Ugyanakkor a tenyészet homogén szuszpenzióként viselkedik, lehetővé téve a korrekt mintavételt, ami egyaránt feltétele a reprodukálható oltási műveleteknek, és az analitikai méréseknek. Emellett a termék a feldolgozás során oldószerrel, nagy hatékonysággal extrahálható, és a micéliumtömeg szűréssel könnyen eltávolítható.Our attention turned to the species Aspergillus, Penicillium, Fusarium and Mortierella, because we knew that on the one hand, 4-androstene-3,17-dione could be hydroxylated at different positions, on the other hand, their cultures were easy to handle and had beneficial properties. In their shake flasks or fermenter-aerated cultures, the filamentous mycelia do not adhere, ideally forming a dense but loose mycelial mass, which provides a large surface for contact with the substrate, so that relatively high substrate concentrations can be used. At the same time, the culture behaves as a homogeneous suspension, allowing correct sampling, which is a prerequisite for both reproducible inoculation procedures and analytical measurements. In addition, the product can be extracted with a solvent with high efficiency during processing and easily removed by mycelial mass filtration.
A hidroxilezési kísérletekhez a gombafonalak szaporítását rázatott tenyészetben (240 fordulat/perc, 2 cm kitérésű síkrázógép) végeztük, majd 18 óra múlva adtuk a tenyészethez az etanolban oldott 4-androsztén-3,17diont. A 48 óra múlva vett mintákat vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháltuk, és Kieselgel 60 F254 (Merck, N° 5554) vékony rétegen, ciklohexán - etil-acetát - etanol - kloroform (50:60:5:0,3) kifejlesztő rendszerben futtattuk (lásd: 216.874 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás). A kromatogramot UV fényben, 254 nm hullámhosszon, megfelelő standardokhoz viszonyítva értékeltük ki, illetve 242 nm hullámhosszon mértük intenzitásukat Shimadzu CS-9000 denzitométerrel.For the hydroxylation experiments, the fungal filaments were propagated in shake culture (240 rpm, 2 cm flat plate shaker) and after 18 hours, 4-androstene-3,17-dione dissolved in ethanol was added to the culture. Samples taken after 48 hours were extracted with a water-immiscible organic solvent and developed in a thin layer of Kieselgel 60 F 25 4 (Merck, N ° 5554) to afford cyclohexane-ethyl acetate-ethanol-chloroform (50: 60: 5: 0.3). system (see Hungarian Patent Application No. 216,874). The chromatogram was evaluated under UV light at 254 nm against appropriate standards and measured at 242 nm with a Shimadzu CS-9000 densitometer.
A több mint 2000 izolált fonalas gomba közül számos, Penicillium, Fusarium és Mortierella törzset izoláltunk és vizsgáltuk felhasználhatóságukat. Ezek a mikroorganizmusok jó hatásfokkal alakították át a szubsztrátot 15a-hidroxi-4-androsztén-3,17-dionná, de - sajnos - a szennyezési profiljuk nem volt megfelelő: egyéb mono- és dihidroxiszármazékok keletkeztek, amelyeknek elválasztási költségei nem termék lehetővé az ipari alkalmazást.Of the more than 2000 isolated filamentous fungi, several strains of Penicillium, Fusarium and Mortierella were isolated and tested for their utility. These microorganisms efficiently converted the substrate to 15a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione, but unfortunately their contamination profile was inadequate: other mono- and dihydroxy derivatives were obtained, the cost of separation of which did not allow industrial application. .
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy meglepő módon egyetlenegy olyan mikroorganizmust sikerült izolálnunk, amely a hidroxilcsoportot 90% feletti hatékonysággal a 15-ös szénatomra kapcsolja, anélkül, hogy számottevő mennyiségben keletkeznének mono-, illetve dihidroxi-melléktermékek; valamint egy további olyan törzset találtunk, amely a 15-ös szénatom mellett a 6-os szénatomot is hidroxilezi, ugyancsak melléktermék-képződés nélkül. Az ipari megvalósítás tekintetében fontos szempont, hogy ez a két törzs, egy Penicillium és egy Fusarium fonalas gomba nem patogén, és az Ames-teszt szerint mutagén vegyületeket nem termel. A törzsek egyéb fermentációs tulajdonságai, valamint az átalakítható szubsztrátkoncentráció megfelelnek azoknak a paramétereknek, amelyek eleget tesznek a gazdaságos ipari hasznosítás elvárásainak.The invention is based on the discovery that, surprisingly, a single microorganism has been isolated which binds the hydroxyl group to C15 at an efficiency of over 90% without producing significant amounts of mono- or dihydroxy by-products; and another strain has been found which also hydroxylates carbon 6 in addition to carbon 15, without the formation of by-products. An important aspect of the industrial implementation is that these two strains, one Penicillium and one Fusarium filamentous fungus, are non-pathogenic and do not produce mutagenic compounds according to the Ames test. Other fermentation properties of the strains, as well as convertible substrate concentrations, are parameters that meet the requirements of economical industrial utilization.
A találmány szerinti Fusarium törzs a már általunk korábban NCAIM F 001237 azonosítóval letétbe helyezett Fusarium equiseti.The Fusarium strain of the present invention is Fusarium equiseti, previously deposited with us under NCAIM F 001237.
A találmány szerinti Penicillium izolátum taxonómiai besorolása a Pitt [Pitt, J. I., The Genus Penicillium, Academic Press, London (1979)] és Ramirez [Ramirez, C., Manual and Atlas of the Penicillia, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam (1982)] által leírtaknak megfelelően történt. MEA és CYA táptalajokon a telepek átmérője 4-5 cm, színe kezdetben szürkészöld, majd fakózöld két hét után 25 °C-on. Tiszta exudátum figyelhető meg a telepen. Elektronmikroszkóppal vizsgálva a konídiumok felszíne durva mintázatú, agyvelőre emlékeztet. A telepek viszonylag gyors növekedése, az elágazó konídiumtartók és a konídiumok durva felülete alapján az izolátum a Furcatum subgenusba, a Furcatum szekcióba az Oxalica sensu Pitt (1979) sorozatba tartozó Penicillium simplicissimum (Oudemans) fajnak bizonyult. Rendelkezésünkre áll továbbá több olyan molekuláris marker, illetve DNS-szekvencia (ITS régió analízise, RFLP, Gdp gén és RAPD amplikonok szekvenciája), amelyek alkalmasak a törzs egyértelmű azonosítására. A törzset a nemzetközi egyezmények és előírások betartásával letétbe helyeztük, a deponálási szám: NCAIM F 001327.The taxonomic classification of the Penicillium isolate of the invention is Pitt (Pitt, J.I., Genus Penicillium, Academic Press, London, 1979) and Ramirez (Ramirez, C., Manual and Atlas of the Penicillia, Elsevier Biomedical Press, 1982). . On MEA and CYA media, colonies are 4-5 cm in diameter, first gray-green, then charcoal after two weeks at 25 ° C. Pure exudate was observed at the colony. When examined by electron microscopy, the surface of conidia is rough in appearance and resembles a brain. Based on the relatively rapid growth of colonies, the branched conidium supports and the rough surface of the conidia, the isolate was Penicillium simplicissimum (Oudemans) belonging to the Oxalica sensu Pitt (1979) series in the Furcatum subgenus and Furcatum section. We also have several molecular markers and DNA sequences (ITS region analysis, RFLP, Gdp gene and RAPD amplicon sequences) that are capable of unambiguously identifying the strain. The strain has been deposited in accordance with international conventions and regulations, deposit number NCAIM F 001327.
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű vegyületekSUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a process for the preparation of compounds of formula (I)
- ahol a képletben R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport - előállítására, 4-androsztén-3,17-dion fermentáció útján történő szelektív hidroxilezésével, olyan módon, hogywherein R is hydrogen or hydroxy by selective hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione by fermentation such that
a) az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, ahol R jelentése hidrogénatom, hidroxilezőmikroorganizmusként Penicillium simplicissimum (NCAIM F 001327) fonalas gombatörzset vagy Fusarium equiseti (NCAIM F 001237) fonalas gombatörzset alkalmazunk, azzal a megkötéssel, hogy utóbbi esetben a fermentációt legfeljebb 45 óra időtartam után állítjuk le,(a) in the preparation of compounds of formula I wherein R is hydrogen, the filamentous fungal strain Penicillium simplicissimum (NCAIM F 001327) or the filamentous fungal strain Fusarium equiseti (NCAIM F 001237) is used as the hydroxylating microorganism, provided that Shut down after 45 hours,
b) az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, ahol R jelentése hidroxilcsoport, hidroxilezömikroorganizmusként Fusarium equiseti (NCAIM F 001237) fonalas gombatörzset, legalább 48 órai fermentációs technológiai időtartam alkalmazása mellett, használunk.b) for the preparation of compounds of formula I wherein R is hydroxy, the filamentous fungal strain of Fusarium equiseti (NCAIM F 001237) is used as the hydroxyl-microorganism using a fermentation time of at least 48 hours.
HU 226 918 Β1HU 226 918 Β1
A biokonverzió kivitelezéséhez a NCAIM F 001327 jelű Penicillium és a NCAIM F 001237 jelű Fusarium törzset szerves nitrogén- és szénforrásokat, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon, 24-30 °C közötti hőmérsékleten tenyésztjük. A megfelelő állapotú tenyészethez hozzáadjuk az átalakítandó vegyület (1-3 g/l) felületaktív anyagokat tartalmazó, vízzel elegyedő szerves oldószerrel készített oldatát. A biokonverzió előrehaladtát az időközönként vett aliquot minták vékonyréteg-kromatográfiás, denzitometriás analízisével követjük nyomon. Amikor a szubsztrátum mennyisége a detektálási határ alá csökken, a biokonverziót leállítjuk, és kívánt esetben a terméket önmagában ismert módon, például extrakcióval kinyerjük.For bioconversion, Penicillium strain NCAIM F 001327 and Fusarium strain NCAIM F 001237 are cultured on media containing organic nitrogen and carbon sources and mineral salts at a temperature of 24-30 ° C. A solution of the compound to be converted (1-3 g / l) in a water-miscible organic solvent is added to the culture in the appropriate condition. Progress of bioconversion is monitored by periodic analysis of aliquot samples by thin layer chromatography, densitometry. When the amount of substrate falls below the limit of detection, the bioconversion is stopped and, if desired, the product is recovered in a manner known per se, for example by extraction.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon mutatjuk be.The invention is illustrated by the following examples.
1. példaExample 1
15u-Hidroxi-4-androsztén-3,17-dion előállítása15u-Hydroxy-4-androstene-3,17-dione
Penicillium simplicissimum NCAEM F 001327 törzs rizs oltókonzervére 50 cm3 maláta tápoldatot mérünk, majd 30 percen át, 26 °C-os termosztátszobában 240 l/perc löketszámú rázóasztalon rázatjuk. A spóraszuszpenzió 1 cm3-ével 500 cm3 térfogatú rázólombikban levő 100 cm3 maláta tápoldatot oltunk. Az oltóspóra-koncentráció a táptalaj térfogatára számolva: 1x106-5*106 spóra/cm3. Az inokulum I. tenyésztést 26 °C-os termosztátszobában 240 l/perc löketszámú rázóasztalon rázatva végezzük. Továbboltás 46-50 órás korban történik.Penicillium simplicissimum NCAEM F 001327 strain inoculum rice was weighed with 50 cm 3 of malt medium and shaken for 30 minutes at 240 L / min on a shaking table in a thermostat room at 26 ° C. The spore suspension was added to 100 cm 3 malt medium in a 500 cm 3 volume of 1 cm 3 -ével shake flask. Concentration of inoculum spores based on volume of culture medium: 1x10 6 -5 * 10 6 spores / cm 3 . Inoculum I was cultured on a shaking table at 240 L / min in a thermostat room at 26 ° C. The booster is given at 46-50 hours.
cm3 tenyészettel 500 cm3 térfogatú rázólombikban levő 100 cm3 maláta táptalajt oltunk, majd 46-50 órán át 26 °C-os termosztátszobában 240 l/perc löketszámú rázóasztalon rázatjuk. 250 cm tenyészettel oltjuk a laboratóriumi üvegfermentorban készített 5000 cm térfogatú maláta táptalajt. A tenyésztést 26 °C hőmérsékleten, 300 l/perc keveréssel és 60 dm3/óra levegőztetéssel végezzük, 46-52 órán keresztül. cm-3 is used to inoculate 100 cm 3 malt medium in a 500 cm 3 volume shaking flask and shaken at 26 ° C termosztátszobában 240 l / min stroke on a rotary shaker for 46-50 hours. Inoculate a 5000 cm volume malt medium in a laboratory glass fermenter with 250 cm culture. Cultivation was carried out at 26 ° C with 300 L / min stirring and 60 dm 3 / hr aeration for 46-52 hours.
3,5 dm3 tenyészettel oltjuk a félüzemi fermentorban készített 70 dm3 térfogatú maláta táptalajt. A tenyésztést 26 °C hőmérsékleten, 200 l/perc keveréssel és 900 dm3/óra levegőztetéssel végezzük, 46-52 órán keresztül.A 3.5 dm 3 culture was inoculated into a 70 dm 3 malt medium in a semi-industrial fermenter. Cultivation was carried out at 26 ° C with 200 L / min stirring and 900 dm 3 / hr aeration for 46-52 hours.
A főfázis oltása 5 térfogat% oltótenyészettel történik, ehhez 75 dm3 GQ105 jelű táptalajt sterilezünk félüzemi 130 dm3-es fermentorban.The main phase is inoculated with 5% (v / v) seed culture by sterilizing 75 dm 3 GQ105 in a semi-industrial 130 dm 3 fermenter.
A GQ105 jelű táptalaj összetétele a következő:The composition of GQ105 medium is as follows:
Glükóz 750 gGlucose 750 g
Élesztőkivonat 375 gYeast extract 375 g
KH2PO4 75 gKH 2 PO 4 75 g
MgSO4.7H2O 37,5 gMgSO 4 .7H 2 O 37.5 g
NaCI 37,5 gNaCl 37.5 g
Vas(ll)-szulfát ,7H2O 0,75 gIron (II) sulfate, 7H 2 O 0.75 g
Struktol J633 15 cm3 dm3-re kiegészítés csapvízzel, pH-állítás: 6,4-6,5 értékre 20%-os nátrium-hidroxid-oldattal.Structol J633 15 cm 3 dm 3 supplemented with tap water, pH adjustment: 6.4-6.5 with 20% sodium hydroxide solution.
Oltás után a fermentort 200 l/perc keveréssel és 900 dm3/óra levegőztetéssel üzemeltetjük. 22 órás korra a fermentlé szárazanyag-tartalma eléri a 3-4 g/dm3 értéket és alkalmassá válik a szubsztrát beadására. Az átalakítandó 150 g 4-androsztén-3,17-dion-szubsztrátot 21-23 órás korban juttatjuk a fermentorba.After inoculation, the fermenter was operated at 200 L / min and aeration of 900 dm 3 / h. By 22 hours, the dry matter content of the fermentation broth reaches 3-4 g / dm 3 and is suitable for administration of the substrate. The 150 g of 4-androstene-3,17-dione substrate to be converted is introduced into the fermentor at 21-23 hours.
Az adagolás során az átalakítandó 4-androsztén3.17- dion-szubsztrátot keverés közben 640 cm3, 60-65 °C hőmérsékletű 90%-os etanolban oldjuk. A szubsztrátoldathoz 0,5 cm3 Tween-80 detergenst keverünk, majd az elegyet perisztaltikus pumpa segítségével, 2-3 perc alatt a tenyészethez adagoljuk. Az adagolás folyamán a fordulatszámot 250 l/percen tartjuk. Az adagolás befejezése után 10 cm3 Struktol J633 habgátlót adagolunk a fermentorba, a levegőztetést 300 dm3/óra értékre csökkentjük. Ezután a levegőztetést fokozatosan, a habzás függvényében 4-6 óra alatt 900 dm3/óra értékre emeljük. A kisebb fokú habzás megfékezésére az első 4 órában néhányszor habgátlót adagolunk.During the addition, the 4-androstene-3,17-dione substrate to be converted was dissolved under stirring in 640 cm 3 of 90% ethanol at 60-65 ° C. 0.5 cm 3 of Tween-80 detergent was added to the substrate solution and the mixture was added to the culture using a peristaltic pump for 2-3 minutes. The rpm is maintained at 250 L / min during the addition. After the addition was complete, 10 cm 3 of Struktol J633 antifoam agent was added to the fermenter and the aeration was reduced to 300 dm 3 / h. The aeration is then gradually increased to 900 dm 3 / hour, depending on the foaming, over a period of 4-6 hours. To control less foaming, antifoam was added several times during the first 4 hours.
Az átalakítást VRK-denzitometriás méréssel követjük nyomon. A fermentáció 50-55 órás korban leállítható, ekkorra a termékkoncentráció általában eléri maximális értékét, a tenyészetben a maradék 4-androsztén3.17- dion 8-10% között van.The conversion was monitored by TLC densitometry. Fermentation can be stopped at the age of 50-55 hours, at which time the product concentration usually reaches its maximum, with the remaining 4-androstene-31.17-dione in the culture being between 8-10%.
A fermentlé 5 dm3 aliquot részét szűrjük, 2x2 dm3 etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot 3 g aktív szénnel derítjük, majd csökkentett nyomáson vízig bepároljuk. A kivált kristályokat szűrjük, és vákuum-szárítószekrényben 60 °C-on megszárítjuk.An aliquot of 5 dm 3 of the fermentation broth was filtered and extracted with 2 x 2 dm 3 ethyl acetate. The extract was clarified with 3 g of activated carbon and then concentrated under reduced pressure to water. The precipitated crystals are filtered off and dried in a vacuum oven at 60 ° C.
Az így kapott termék tömege 7,5 g (amely 71,1%-os hozamot jelent), olvadáspontja: 198,8-200,3 °C, 15ahidroxi-4-androsztén-3,17-dion-tartalma pedig VRKdenzitometriás mérés alapján 94,8%.The product thus obtained weighs 7.5 g (71.1% yield), m.p. 198.8-200.3 ° C and has a 15-hydroxy-4-androstene-3,17-dione content by TLC densitometry. 94.8%.
2. példaExample 2
6β, 15a-Hidroxi-4-androsztén-3,17-dion előállításaPreparation of 6β, 15α-Hydroxy-4-androstene-3,17-dione
Fusarium equiseti NCAIM F 001237 burgonya ferde agaron fenntartott felületi tenyészetét 0,01% Tween-80tartalmú steril vízzel lemossuk. 4,5 cm3 spóraszuszpenzióval BK-2SQ jelű táptalajt oltunk.The surface culture of Fusarium equiseti NCAIM F 001237 potato on sloped agar was washed with sterile water containing 0.01% Tween-80. A 4.5 cm 3 spore suspension was inoculated with BK-2SQ.
A BK-2SQ jelű táptalaj összetétele a következő: Pepton 8,0 gThe composition of BK-2SQ is as follows: Pepton 8.0 g
Glükóz 10,0 gGlucose 10.0 g
Élesztőkivonat 4,0 gYeast extract 4.0 g
1000 cm3-re kiegészítés csapvízzel, pH-állítás: 6,4-6,5 értékre 20%-os nátrium-hidroxid-oldattal.Make up to 1000 cm 3 with tap water, adjust pH to 6.4-6.5 with 20% sodium hydroxide solution.
A vegetatív tenyésztést 100 cm3 táptalajt tartalmazó 500 cm3 térfogatú rázólombikokban végezzük, 26 °C-os termosztátszobában 240 l/perc löketszámú rázóasztalon rázatva.Vegetative cultivation was performed in 500 cm 3 shake flasks containing 100 cm 3 of medium, shaking on a shaking table at 240 L / min in a thermostat room at 26 ° C.
cm3 kétnapos tenyészettel 100 cm3 BK-2SQ jelű táptalajt tartalmazó 500 cm3 térfogatú rázólombikokat oltunk, és 26 °C-os termosztátszobában 240 l/perc löketszámú rázóasztalon rázatunk.added 500 cm 3 shaker flasks containing medium was 100 cm 3 BK 2 SO 3 cm marked two-day culture, and shaken at 26 ° C 240 l / min on a rotary shaker termosztátszobában stroke.
250 cm3 kétnapos vegetatív tenyészettel laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett, 5 dm3 NSH táptalajt oltunk.Two days in 250 cm 3 sterilized vegetative culture laboratory jar fermentors were added 5 dm 3 NSH medium.
Az NSH jelű táptalaj összetétele a következő: Pepton 73,0 gThe composition of NSH medium is as follows: Pepton 73.0 g
Szacharóz 50,0 gSucrose 50.0 g
KH2PO4 5,0 gKH 2 PO 4 5.0 g
HU 226 918 Β1HU 226 918 Β1
MgSO4.7H2O 2,5 gMgSO 4 .7H 2 O 2.5 g
Struktol J633 3 cm3 Structol J633 3 cm 3
5000 cm3-re kiegészítés csapvízzel, pH-állítás: 6,4 értékre 20%-os nátrium-hidroxid-oldattal.Make up to 5000 cm 3 with tap water, adjust pH to 6.4 with 20% sodium hydroxide solution.
A tenyésztés 300 l/perc keverő fordulatszám és 60 dm3/óra levegőátbuborékoltatás mellett 26 °C-on történik. A továbboltásra 48 órás korban kerül sor.The cultivation was carried out at a mixing speed of 300 l / min and an air bubbling of 60 dm 3 / h at 26 ° C. The booster will be given at 48 hours.
dm3 oltótenyészettel 80 dm3 félüzemi fermentorban sterilezett NSH táptalajt oltunk. A tenyésztés 28 °C-on, 200 l/perc keverő fordulatszám és 960 dm3/óra levegő átbuborékoltatás mellett történik.Sterilized NSH medium was inoculated with dm 3 seed culture in 80 dm 3 semi-industrial fermenter. The cultivation was carried out at 28 ° C with a stirring speed of 200 l / min and air bubbling at 960 dm 3 / h.
dm3 22-30 órás tenyészettel 1000 dm3 GSQ táptalajt oltunk.dm 3 In a culture for 22-30 hours, 1000 dm 3 of GSQ medium was inoculated.
A GSQ jelű táptalaj összetétele a következő:The composition of the GSQ medium is as follows:
Pepton 8 kgPepton 8 kg
Glükóz 20 kgGlucose 20 kg
Élesztőkivonat 4 kgYeast extract 4 kg
KH2PO4 1 kgKH 2 PO 4 1 kg
MgSO4.7H2O 1 kgMgSO 4 .7H 2 O 1 kg
Struktol J633 200 cm3 Structol J633 200 cm 3
1000 dm3-re kiegészítés csapvízzel, pH-állítás: 6,4-6,5 értékre 20%-os nátrium-hidroxid-oldattal.Addition to 1000 dm 3 of tap water, pH adjustment: 6.4-6.5 with 20% sodium hydroxide solution.
Az átalakítandó 2 kg 4-androsztén-3,17-dionszubsztrátot keverés közben 20 dm3 etanolban feloldjuk. A szubsztrátoldathoz szolubilizálóanyagokként 100 cm3 Tween-80 detergenst és 1 dm3 Struktol J633 habgátlót keverünk, majd a tenyésztés 18. órájában az elegyet a fermentorba juttatjuk. Ha a fermentációt körülbelül 40-45 órás korban leállítjuk, ekkorra a szubsztrát szinte teljes mennyisége átalakul, a fermentlében mérhető 15ahidroxi-4-androsztén-3,17-dion-koncentráció 1,82 g/dm3. Amennyiben a fermentációt folytatjuk és körülbelül 48-52 órás korban leállítjuk, ekkorra a szubsztrát szinte teljes mennyisége átalakul dihidroxiszármazékká.The 2 kg of 4-androstene-3,17-dione substrate to be converted is dissolved in 20 dm 3 of ethanol with stirring. The substrate solution was mixed with 100 cm 3 of Tween-80 detergent and 1 dm 3 of Struktol J633 antifoam as solubilizers and transferred to the fermentor at 18 hours of culture. When fermentation is stopped at about 40-45 hours, almost all of the substrate is converted to a concentration of 15-hydroxy-4-androstene-3,17-dione in the fermentation broth of 1.82 g / dm 3 . If fermentation is continued and stopped at about 48-52 hours, almost all of the substrate is converted to the dihydroxy derivative.
A fermentlében VRK-denzitometriás mérés alapján a 6p,15a-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion-koncentráció 1,64 g/dm3.The concentration of 6β, 15α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione in the fermentation broth was 1.64 g / dm 3 as determined by TLC densitometry.
A fermentlé 5 dm3 aliquot részét szűrjük, 2^2 dm3 etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot 3 g aktív szénnel derítjük, majd csökkentett nyomáson vízig bepároljuk. A kivált kristályokat szűrjük, és vákuum-szárítószekrényben 60 °C-on megszárítjuk. Az így kapott termék tömege 6,6 g (amely 54,1%-os kihozatali jelent), olvadáspontja: 90-95,4 °C, 6p,15a-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion-tartalma pedig VRK-denzitometriás mérés alapján 82%.An aliquot of 5 dm 3 of the fermentation broth was filtered and extracted with 2 x 2 dm 3 of ethyl acetate. The extract was clarified with 3 g of activated carbon and then concentrated under reduced pressure to water. The precipitated crystals are filtered off and dried in a vacuum oven at 60 ° C. The product thus obtained weighed 6.6 g (yield: 54.1%), m.p. 90-95.4 ° C, with a 6β, 15α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione content of TLC. 82% by densitometry.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0501157A HU226918B1 (en) | 2005-12-16 | 2005-12-16 | Microbiological method for preparation of hydroxy derivatives of 4-androsten-3,17-dione |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0501157A HU226918B1 (en) | 2005-12-16 | 2005-12-16 | Microbiological method for preparation of hydroxy derivatives of 4-androsten-3,17-dione |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0501157D0 HU0501157D0 (en) | 2006-02-28 |
| HUP0501157A2 HUP0501157A2 (en) | 2007-09-28 |
| HU226918B1 true HU226918B1 (en) | 2010-03-01 |
Family
ID=89986455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0501157A HU226918B1 (en) | 2005-12-16 | 2005-12-16 | Microbiological method for preparation of hydroxy derivatives of 4-androsten-3,17-dione |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU226918B1 (en) |
-
2005
- 2005-12-16 HU HU0501157A patent/HU226918B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU0501157D0 (en) | 2006-02-28 |
| HUP0501157A2 (en) | 2007-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0322081B1 (en) | Microbiological preparation of 9-alpha-hydroxy-17-keto steroids | |
| US20070212751A1 (en) | Microbial method for the 11beta hydroxylation of 9beta, 10alpha-steriods | |
| CN105779555B (en) | Preparation of 11 beta-hydroxy-1, 4-diene-3, 20-diketone steroid compound by combined fermentation of Absidia and arthrobacter | |
| CZ183498A3 (en) | Microbial method of steroid transformation | |
| US8367394B2 (en) | Process for the synthesis of 9α-hydroxy-steroids | |
| CN109251870B (en) | New mycobacterium aureofaciens mutant strain and application thereof in preparation of HIP (HIP) | |
| US7002028B2 (en) | 5-androsten-3β-ol steroid intermediates and processes for their preparation | |
| HU226918B1 (en) | Microbiological method for preparation of hydroxy derivatives of 4-androsten-3,17-dione | |
| RU2426792C2 (en) | Method of preparing 11-beta-hydroxy-9-beta, 10-alpha steroids with using amycolatopsis mediterranei cells | |
| GB1570621A (en) | Degradation of steroids by microorganisms | |
| GB1571143A (en) | Degradation of steroids by microorganims | |
| CN105779553B (en) | Preparation of 11 beta-hydroxy-1, 4-diene-3, 20-diketone steroid compound by combined fermentation of curvularia lunata and arthrobacter | |
| HU227262B1 (en) | Process for production of 15alpha-hydroxy-4-androstene-3,17 dione by high concentrated bioconversion | |
| US20040265948A1 (en) | Microbial method for hydrolysis and oxidation of androst-5-ene and pregn-5-ene steroid esters | |
| KR20010030710A (en) | A process for the biotransformation of colchicone compounds into the corresponding 3-glycosyl derivatives | |
| JP4439079B2 (en) | Method for producing pravastatin | |
| Yaderets et al. | A study of steroid hydroxylation activity of Curvularia lunata mycelium | |
| US11254924B2 (en) | Method for biocatalysis using filamentous fungi | |
| CN108277170B (en) | New mycobacterium aureofaciens and application thereof in preparation of 9-hydroxyprogesterone | |
| HU227435B1 (en) | Process for the production of 15-alpha-hydroxylevodion by bioconversion | |
| KR0169498B1 (en) | Novel microorganisms and a process for preparing 3-alpha, 7-alpha-dihydroxy-12-keto-5-beta-cholanic acid | |
| US5298398A (en) | Preparation of 9-α-hydroxy-17-keto steroids using Mycobacterium species CBS 482.86 | |
| HU216874B (en) | Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds | |
| US20060100185A1 (en) | 5-Androsten-3beta-ol steroid intermediates and processes for their preparation | |
| HU221745B1 (en) | Process for microbiological hydroxylation of gonene-dione compounds |