HU221745B1 - Process for microbiological hydroxylation of gonene-dione compounds - Google Patents
Process for microbiological hydroxylation of gonene-dione compounds Download PDFInfo
- Publication number
- HU221745B1 HU221745B1 HU9603191A HUP9603191A HU221745B1 HU 221745 B1 HU221745 B1 HU 221745B1 HU 9603191 A HU9603191 A HU 9603191A HU P9603191 A HUP9603191 A HU P9603191A HU 221745 B1 HU221745 B1 HU 221745B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gonene
- dione
- alkyl
- medium
- bioconversion
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 title claims description 21
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 title claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title abstract description 8
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title description 2
- OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N formestane Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1O OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 14
- -1 17-dione compound Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 241000879295 Fusarium equiseti Species 0.000 claims abstract description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- NANJFPZFEUIDND-MYBOQGECSA-N (8r,9s,10r,13s,14s,15s)-13-ethyl-15-hydroxy-1,2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](CC)(C(C[C@@H]4O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 NANJFPZFEUIDND-MYBOQGECSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 2
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 abstract 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 abstract 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000122824 Aspergillus ochraceus Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- NPAGDVCDWIYMMC-IZPLOLCNSA-N nandrolone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 NPAGDVCDWIYMMC-IZPLOLCNSA-N 0.000 description 3
- 229960004719 nandrolone Drugs 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 3
- WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N (+)-Norgestrel Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000577959 Calonectria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 2
- 241001620302 Glomerella <beetle> Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 241000235546 Rhizopus stolonifer Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 2
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 2
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000003805 gonenes Chemical class 0.000 description 2
- 229960004400 levonorgestrel Drugs 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- NWVGSNAXMMRSHK-FOMBCDKBSA-N (8R,9S,10R,13S,14S)-16-ethyl-2,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound C([C@@H]12)CC3=CC(=O)CC[C@@H]3[C@H]2CC[C@H]2[C@H]1CC(CC)C2=O NWVGSNAXMMRSHK-FOMBCDKBSA-N 0.000 description 1
- JFEPJTGMGDGPHJ-PNKHAZJDSA-N (8r,9s,10r,13s,14s)-13-methyl-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-one Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@@H]2[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CCC[C@@]1(C)CC2 JFEPJTGMGDGPHJ-PNKHAZJDSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 241000235389 Absidia Species 0.000 description 1
- 241000228193 Aspergillus clavatus Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 description 1
- 241001674393 Diplodia mutila Species 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000122692 Fusarium avenaceum Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 1
- 241001623528 Mucor circinelloides f. griseocyanus Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000189150 Nigrospora Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 241000228145 Penicillium brevicompactum Species 0.000 description 1
- 241001025446 Penicillium canescens ATCC 10419 Species 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 241000519895 Penicillium janczewskii Species 0.000 description 1
- 241000985516 Penicillium raistrickii Species 0.000 description 1
- 241000614003 Penicillium raistrickii ATCC 10490 Species 0.000 description 1
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 description 1
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000005899 aromatization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- SNDBGVVLDAPORX-UHFFFAOYSA-N cyclohexane;ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.CCOC(C)=O.C1CCCCC1 SNDBGVVLDAPORX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- SIGSPDASOTUPFS-XUDSTZEESA-N gestodene Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](CC)([C@](C=C4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 SIGSPDASOTUPFS-XUDSTZEESA-N 0.000 description 1
- 229960005352 gestodene Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002899 hydroxyprogesterone Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940053934 norethindrone Drugs 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás a (II) általános képletű 13-alkil-4-gonén-3,17-dion-vegyület – ahol R1 jelentése C1–4 al- kilcsoport –biokonverziós úton végzett hidroxilezésével kapott (I) általánosképletű 13-alkil-4-gonén-3,17-dion-- vegyület-származékokat tartalmazó– ahol R1 jelentése C1–4 alkilcsoport, R2 és R3 jelentése hidrogénatomvagy hid- roxilcsoport, mimellett R2 és R3 nem jelenthet egyidejűleghidroxilcsoportot – fermentlé előállítására, majd a fer- mentléből akívánt végtermék önmagában ismert módon történő izolálására. Azeljárás szerint a biokonverziót az egyidejűleg többfajta szteroid-oxigenáz-aktivitással rendelkező, a Mezőgazdasági és IpariMikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél (Kertészeti és Élelmiszer-ipari Egyetem, Budapest) NCAIM F 001237 azonosítási jel alatt letétbehelyezett Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 mikroorganizmussalvégzik, majd a) 6?,15?-dihidroxi-13?-etil-4-gonén-3,17-dion izolálásaesetén a tenyészetet szűrik, a szűrletből a kívánt terméket önmagábanismert módon izolálják, b) 15?-hidroxi-13?-etil-4-gonén-3,17-dionizolálása esetén a biokonverzió során táptalajcserét és/vagy továbbiszubsz- trátadagolást végeznek, majd a fermentléből a kívánt terméketönmagában ismert módon izolálják. ŕThe subject of the invention is a process obtained by bioconversion of the 13-alkyl-4-gonene-3,17-dione compound of the general formula (II) - where R1 is a C1-4 alkyl group - 13-alkyl-4 of the general formula (I) -gonene-3,17-dione- containing compound derivatives - where R1 is a C1-4 alkyl group, R2 and R3 are a hydrogen atom or a hydroxyl group, and R2 and R3 cannot simultaneously represent a hydroxyl group - for the production of fermented juice, and then the desired final product from the fermented juice for its isolation in a manner known per se. According to the procedure, the bioconversion is carried out by the Fusarium equiseti var., which has multiple steroid-oxygenase activities at the same time, deposited at the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (University of Horticulture and Food Industry, Budapest) under identification number NCAIM F 001237. richter SzB 0456 microorganism, then a) in the case of isolation of 6?,15?-dihydroxy-13?-ethyl-4-gonene-3,17-dione, the culture is filtered, the desired product is isolated from the filtrate in a manner known per se, b) 15?-hydroxy In the case of the isolation of -13?-ethyl-4-gonene-3,17-dione, during the bioconversion, the culture medium is changed and/or additional substrate dosing is carried out, and then the desired product is isolated from the fermentation broth in a known manner. ŕ
Description
A leírás terjedelme 8 oldal (ezen belül 1 lap ábra)
HU 221 745 Bl dasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél (Kertészeti és Élelmiszer-ipari Egyetem, Budapest) NCAIM F 001237 azonosítási jel alatt letétbe helyezett Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 mikroorganizmussal végzik, majd
a) 6β,15a-dihidroxi-l 3p-etil-4-gonén-3,17-dion izolálása esetén a tenyészetet szűrik, a szűrletből a kívánt terméket önmagában ismert módon izolálják,
b) 15a-hidroxi-^-etil-4-gonén-3,17-dion izolálása esetén a biokonverzió során táptalajcserét és/vagy további szubsztrátadagolást végeznek, majd a fermentléből a kívánt terméket önmagában ismert módon izolálják.
A találmány tárgya új eljárás a (Π) általános képletű 13-alkil-4-gonén-3,17-dion-vegyület - ahol Rj jelentése Cj_4 alkilcsoport - biokonverziós úton végzett hidroxilezésével kapott (I) általános képletű 13-alkil-4- 15 gonén-3,17-dion-vegyület-származékokat tartalmazó ahol Rt jelentése Ct_4 alkilcsoport, R2 és R3 jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, mimellett R2 és R3 nem jelenthet egyidejűleg hidroxilcsoportot - fermentlé előállítására, majd a fermentléből a kívánt vég- 20 termék önmagában ismert módon történő izolálására.
A találmány továbbá egy új dihidroxi-gonén-származékra is vonatkozik.
A 19-norszteroidok igen fontos szteroidhormon- és gyógyszeralapanyagok, a hidroxilezett származékok pe- 25 dig fontos kulcsintermedierek a további szintézisekben.
A 19-norszteroidok mikrobiológiai hidroxilezésével az ötvenes évek óta eredményesen foglalkoznak.
A progeszteron lla-hidroxilezéséhez gyakran és sikeresen alkalmazott Rhizopus nigricans törzzsel végeztek 30 biokonverziót 19-norszteroidon, nevezetesen a 19nortesztoszteronon. A ^termékként keletkező όβ-hidroxiszármazék mellett melléktermékként keletkezett a 1 ία-hidroxi-, valamint a ΙΟξ-hidroxiszármazék (J.
Am. Chem. Soc. 781512-1513 [1956]). 35
Természetesen sok kutatót foglalkoztatott az enzimatikus szteroidhidroxilezés reakciómechanizmusa. Korai tapasztalat szerint a különböző helyzetű hidroxilezéseket elkülöníthető oxigenázenzimek végzik. Megállapították például, hogy az Aspergillus ochraceus 6β-1ιίά- 40 roxilázának képződését a lla-hidroxi-progeszteron indukálja (2 802 775 számú és 2 905 593 számú USA szabadalmi leírás); a keletkezett lla-hidroxitermék reakcióelegyből való eltávolításával elérték, hogy a 6β,11αdihidroxiszármazék képződése visszaszorult. 45
A 19-norszteroidok hidroxilezésére viszonylag kevés iparilag megvalósítható szteroidhidroxilező eljárást ismerünk, különösen, ha a C13 atomhoz hosszabb szénláncú alkilcsoport kapcsolódik. Az ösztradiént Fusarium és Absidia torzsáikéi konvertálva, 15a-hidroxiszármazékot 50 kaptak (3 331288 számú NSZK-beli szabadalmi leírás).
A nortesztoszteron lla-hidroxilezését Sehgal és munkatársai írták le Aspergillus ochraceus törzzsel (Can. J. Microbiol. 14 529-532 [1968]). Csak sok évvel később sikerült a 19-nortesztoszteron gazdaságos 1 la-hidroxilezését 55 megoldani Rhizopus nigricans törzzsel, ami Petzoldt nevéhez fűződik (3 248 434 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). A 17-alkinil-4-ösztrének 15a-hidroxilezését Penicillium raistrickii törzzsel oldották meg német kutatók (2 546 062 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). 60
A 19-nor-13-etil-szteroidok hidroxilezésével csak a 70-es évektől kezdtek megbirkózni a kutatók. A 13βetil-l,3,5(10)-gonatrién-3,17fl-diol-szubsztráton Bacillus megaterium baktériumtörzzsel 16a-hidroxilezést tudtak amerikai kutatók megvalósítani (3 733 254 számú USA szabadalmi leírás). A noretiszteront melléktermékként 11 β-helyzetben is hidroxilező Botryodiplodia malorum törzs a norgesztrelt (13p-etil-17a-etinil-17phidroxi-4-gonén-3-on) Cn-atomon nem képes hidroxilezni, a 13-alkilcsoport gátlóhatása miatt (2 546 062 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). A különböző gonénszármazékok Ια-hidroxilezésére sok törzset képesnek találtak: Rhizoctonia, Sclerotium,
Calonectria, Glomerella törzsekkel (2 450 106 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). A norgesztrel la-helyzetű hidroxilezését több kutatócsoport is megoldotta::
Calonectria decora törzzsel (2 450 106 számú NSZK- j beli szabadalmi leírás), Aspergillus clavatus törzzsel i(2 539 261 számú NSZK-beli szabadalmi leírás)., t
A norgesztrel όβ-ΙύίίΓοχίΙεζέβέί Mucor griseocyanus * | törzzsel valósították meg (2 330159 számú NSZK-beli J szabadalmi leírás). Ugyancsak gonénszármazékok 9α- j, hidroxilezését valósították meg Glomerella gomba- i törzzsel (4 397 947 számú USA szabadalmi leírás). |
-fenil-gonén-származékok hidroxilezésével is f foglalkoztak német kutatók: 6a-hidroxiszármazékot f tudtak létrehozni Streptomyces és Nigrospora törzsekkel, 7a-hidroxiterméket konvertált egy Streptomyces törzs, 15β-1ιί<ΐΓθχίΙεΓπ^βΙ pedig egy Neurospora törzs (3 527 517 számú NSZK-beli szabadalmi leírás).
Petzoldt és munkatársai (3 248 434 számú NSZKbeli szabadalmi leírás) a 3-oxo-4-ösztrén-származékokra, illetve azok 18-alkilhomológjaira a térben nem, csak időben elválasztott két biokonverziós reakciót valósítottak meg. Alacsony szubsztrátkoncentrációt (1 g/1) alkalmazva 36 óra alatt Aspergillus ochraceus törzzsel lla-hidroxilezés, majd Arthrobacter simplex, vagy Bacillus sphaericus hozzáadásával, aerob körül- , mények között 63 óra alatt az A gyűrű aromatizációja ment végbe.
A levodion (^-etil-4-gonén-3,17-dion) 15a-hidroxiszármazékát Penicillium,, illetve Fusarium törzsekkel tudta előállítani K. Petzold és R. Wiechert (2 546 068 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). Mind a fent említett NSZK-beli szabadalmi leírásban, mind a Magyarországon 173 395 lajstromszámon kinyomtatott * szabadalmi leírás példáiban kizárólag Penicillium raistrickii ATCC 10490 fonalas gombatörzs szerepel (a gesztodén fontos intermedieijének, a 15a-hidroxi-13fl2
HU 221 745 BI etil-4-gonén-3,17-dionnak az előállítására, 76,5%-os kihozatallal), jóllehet a leíró részben a Fusarium avenaceum CBS 38662, Fusarium oxysporum ATCC 7808, illetve ATCC 9991, Fusarium rosceum ATCC 14714, Penicillium canescens ATCC 10419, Penicillium chrysogenum ATCC 10003, Penicillium nigricans ATCC 9439 és Penicillium stoloniferum ATCC 14586 törzsek is említésre kerülnek.
A találmány célja az (I) általános képletű - ahol a képletben R, jelentése C,_4 alkilcsoport, R2 és R3 jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, mimellett R2 és R3 nem jelenthet egyidejűleg hidroxilcsoportot - hidroxi-gonén-vegyületek előállítása iparilag hasznosítható koncentrációban, és méretnövelésre alkalmas technológiai paraméterek megvalósítása mellett.
A találmány alapja az a felismerés, hogy a többféle szteroid-hidroxiláz enzimaktivitással rendelkező Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 (NCAIM F 001237) fonalasgomba-törzzsel végzett fermentáció során a termékspektrum befolyásolható, a normális esetben feldúsuló dihidroxivegyületek képződése visszaszorítható oly módon, hogy amikor a keletkezett 15a-hidroxi-13-alkil-4-gonén-3,l 7-dion mennyisége már jelentős, és a dihidroxivegyületek képződése még éppen csak megindult, a micéliumtömegről eltávolítjuk a fermentlevet és adott esetben a micéliumtömeget feltöltve folytatjuk a biotranszformációt.
A Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 (NCAIM F 001237) törzs tenyészetében elvétve találhatók sporodochiumok, típusos makrokonídiumokkal. Mikrokonídium nem képződik a szokásos táptalajokon, idősebb tenyészetben megjelennek a sorba fűződő klamidospórák. A törzs növekedése viszonylag gyors, a légmicélium és az agarlemez színe narancssárga.
Megállapítottuk, hogy a micélium feltöltéséhez használhatunk desztillált vizet vagy fiziológiás sóoldatot, vagy pufferoldatot (például pH=6,8 citrátpuffer), vagy az eredeti táptalaj összetételének megfelelő táptalajt, illetve annak különböző mértékben hígított változatát. A micéliumtömeg feltöltéséhez alkalmazott táptalaj lehet szteroidmentes, illetve különböző koncentrációban tartalmazhat szubsztrátot. A feltöltés eredményeképpen a tenyészet térfogata lehet kevesebb, azonos vagy több, mint a konverzió kezdetén.
A találmány továbbá azon a felismerésen alapul, hogy a megfelelő táptalajkomponensek kiválasztásával sikerült elérni, hogy a magasabb konvertált szubsztrátmennyiség mellett a szubsztrát a micéliumhoz kötötten, a vízoldékonyabb hidroxitennék pedig teljes mennyiségében a fermentlében található.
Nehézséget jelentett az igen gyenge vízoldékonyságú szubsztrát bevitele a fermentlébe. Az általánosan használt dimetil-formamidos oldatban történő adagolás kedvező volt, de a kívánt hatást önmagában nem eredményezte. Ezért további, oldódást elősegítő adalékot kerestünk, így egy emulgeálószer; egy poli(oxi-etilén)-szorbiton-monooleát (Tween-80), valamint a β-ciklodextrin bizonyult alkalmasnak.
Felismeréseink alapján kivitelezett eljárással sikerült elérni, hogy az iparilag hasznosítható mennyiségben alkalmazott szubsztrát teljes mennyiségének konvertálása mellett, meglepő módon, az egylépéses folyamatban lejátszódó biokonverzióhoz képest a táptalajcserés eljárásban keletkező dihidroxivegyületek mennyisége a felére csökkent, miközben a 15a-hidroxi fötermék mennyisége hasonló mértékben növekedett.
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás a (Π) általános képletű 13-alkil-4-gonén-3,17-dion-vegyület ahol Rj jelentése C, _4 alkilcsoport - biokonverziós úton végzett hidroxilezésével kapott (I) általános képletű 13-alkil-4-gonén-3,17-dion-vegyület-szánnazékokat tartalmazó - ahol R! jelentése Cj_4 alkilcsoport, R2 és R3 jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, mimellett R2 és R3 nem jelenthet egyidejűleg hidroxilcsoportot - fermentlé előállítására, majd a fermentléből a kívánt végtermék önmagában ismert módon történő izolálására, olyan módon, hogy a biokonverziót az egyidejűleg többfajta szteroid-oxigenáz-aktivitással rendelkező, a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél (Kertészeti és Élelmiszer-ipari Egyetem, Budapest) NCAIM F 001237 azonosítási jel alatt letétbe helyezett Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 mikroorganizmussal végezzük, majd
a) 6β,15a.-dihidroxi-13$-etil-4-gonén-3,17-dión izolálása esetén a tenyészetet szűrjük, a szűrlet- Ί bői a kívánt terméket önmagában ismert módon» izoláljuk,
b) 15a-hidroxi-13fi-etil-4-gonén-3,l 7-dion izolálósa esetén a biokonverzió során táptalajcserét és/vagy további szubsztrátadagolást végzünk, * majd a fermentléből a kívánt terméket önmagá- f bán ismert módon izoláljuk.
A találmány szerinti táptalajcseréhez használt közeget az eredeti táptalaj, hígított táptalaj, desztillált víz, fiziológiás sóoldat és különböző pufferoldat tetszőleges arányú keverékéből választjuk ki. A táptalajcsere során további 0,2-5,0 g/1 szubsztrátot juttatunk a rendszerbe.
A találmány ezenkívül egy új dihidroxiszármazékra; a 6p,15a-dihidroxi-13fl-etil-4-gonén-3,17-dionra vonatkozik.
A találmány szerinti eljárásban a mikroorganizmusok növesztését és a hidroxilezést rázott tenyészetben (240/perc fordulatszámú, 2 cm kitérésű síkrázógépen) végezzük. A tenyésztéshez használt táptalajokban előnyösen alkalmazható nitrogénforrásul szójaliszt, élesztőkivonat, malátakivonat, kukoricalekvár és különféle fehéijehidrolizátumok; szénforrásként pedig mono-, oligo- és poliszaharidok - például glükóz, szacharóz és keményítő - valamint növényi olajok és szerves savak. .
A hidroxilezést végző gombákat célszerűen 24-32 °Con tenyésztjük.
A biokonverziót végző mikroorganizmus előtenyésztését az átalakításra szolgáló rázatott lombikban vagy fermentorban végezzük olyan módon, hogy a tenyészet optimális állapotában adagoljuk a szubsztrátot.
Az optimális állapotot a szénforrás felhasználását jelző pH-csökkenés vége jelenti, ami a mikroorganizmustól t és a táptalajtól függően 16-30 órás korban következik be. A szubsztrátadagolással egyidőben az oldódást és a r biokonverziót elősegítő adalékokat is a fermentlébe jut3
HU 221 745 Bl tatjuk, a Tween-80-at 0,1-2,0 g/1, előnyösen 0,8 g/1; a β-ciklodextrint 5-25 g/1, előnyösen 16 g/1 koncentrációban.
A fermentáció nyomon követésére a szteroid vegyületeket a fermentléből klórozott szénhidrogénekkel, ész- 5 terekkel, vízzel nem elegyedő ketonokkal vagy alkoholokkal végzett extrakcióval különíthetjük el. A fermentlében található szteroidok minél teljesebb kinyerése érdekében célszerű extrakció előtt a tenyészetet homogenizálni. Az egyes komponensek mennyiségi meg- 10 határozása vékonyréteg-kromatográfiás elválasztást követően denzitometrálással történik, Kieselgel 60 F254 (Merck, N°5554) rétegen. Kifejlesztőrendszerként a szóban forgó vegyületek jó elválását biztosító módszert, előnyösen a 216 874 számú magyar szabadalmi 15 leírásban szereplő rendszert alkalmazzuk, melynek összetétele ciklohexán-etil-acetát-etanol (35:56:8).
A mérést Shimadzu CS-9000 denzitométerrel, 242 nm hullámhosszon végezzük
A tenyészetek szűrése után a kivánt szteroidokat ön- 20 magában ismert utódon, például extrakciós vagy abszorpciós eljárással különítjük el a szűrletből.
A fermentléből izolált új vegyület, a 6p,15a-dihidroxi-13p-etil-4-gonén-3,17-dion fontos intermedier lehet gyógyszerhatóanyagok szintézisében. 25
A találmány kivitelezését a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy tárgykörét pusztán ezekre kívánnánk korlátozni.
1. példa 30
Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 (NCAIM F 001237) maláta ferdeagaron növesztett 1-4 hetes tenyészetéről 5 ml steril vízzel készített sejtszuszpenzió teljes mennyiségével 500 ml méretű Erlenmeyerlombikban sterilezett 100 ml térfogatú BK-2 táptalajt 35 oltunk, melynek összetétele a következő:
pepton 30,0 g glükóz 10,0 g
1000 ml csapvízben.
A táptalaj pH-ját 7,3 értékre állítjuk, majd autokláv- 40 bán 121 °C-on 20 percen át sterilezzük.
A tenyészetet 2 napig növesztjük síkrázógépen,
1000 ml csapvízben. 50
A táptalaj pH-ját 6,3-6,5 értékre állítjuk, majd autoklávban 121 °C-on 20 percen át sterilezzük.
A kapott tenyészetet 26 °C-on síkrázógépen 36 órán át rázatjuk, majd 5 ml tenyészettel 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml BKF-K1 táptalajt ol- 55 tünk. A BKF-K1 táptalaj összetétele a következő:
1000 ml csapvízben.
A táptalaj pH-ját 6,3-6,5 közötti értékre állítjuk, majd autoklávban 121 °C-on 20 percen át sterilezzük.
A beoltott rázatott lombikokat 26 °C-on termosztáljuk. 18 óra előtenyésztés után hozzáadunk 2 ml 0,08 g Tween-80 detergenst tartalmazó dimetil-formamidban oldott 0,3 g 13p-etil-4-gonén-3,17-dion-t, ami 3 g/1 koncentrációnak felel meg. A 15a-hidroxi-13P-etil-4gonén-3,17-dion maximális mennyiségét a szubsztrátadagolás után 48 órával mértük, ekkor 0,12 g/1 (4%) szubsztrát maradt, 1,64 g/1 (55%) 15a-hidroxi-13P-etil4-gonén-3,17-dion, 0,50 g/1 (17%) 6p,15a-dihidroxi13p-etil-4-gonén-3,17-dion, 0,46 g/1 (15%) 7β,15αdihidroxi-13p-etil-4-gonén-3,17-dion és 0,28 g/1 (9%) egyéb melléktermék keletkezett
A szubsztrátadagolás után 24 órával a fermentlevet centrifugálással eltávolítjuk, és az eredeti térfogatnak megfelelően desztillált vízzel kiegészítjük a micéliumtömeget. További 24 óra múlva a tenyészet szteroidtartalmát meghatározzuk, amelyet a 24 órás korban eltávolított fermentlé szteroidtartalmával összegezve a bevitt szubsztrát konverziója a következőképpen alakul:
g/1 szubsztrát
2,55 g/1 (85%) 15a-hidroxi-13P-etil-4-gonén-3,17dion,
0,21 g/1 (7%) 6p,15a-dihidroxi-13p-etil-4-gonén3.17- dion,
0,12 g/1 (4%) 7p,15a-dihidroxi-13p-etil-4-gonén3.17- dion és
0,12 g/1 (4%) egyéb melléktermék.
A kapott termékek legfontosabb fizikai-kémiai adatait az alábbiakban foglaljuk össze:
15a.-hidroxi-13$-etil-4-gonén-3,17-dion
Molekulatömeg: 302 •H-NMR (500 Mhz, DMSO-d6[UTMS], 30 °C,
5[ppm]): 0,78 (3H, t, -CH2-C//3), 2,09 & 2,99 (2H, m & m, H-16), 2,33 (1H, br, OH), 4,50 (1H, m, H-15), 5,84 (1H, m, H-4) »C-NMR (125 Mhz, DMSO-d6(39,5 ppm], 30 °C, ő[ppm]:
7.4 (-CHj-C/fj), 19,5 f-C7/2-CH3), 25,3 (C-ll),
26,6 (C-l), 26,8 (C-12), 31,1 (C-7), 35,4 (C-6),
36.4 (C-2), 39,7 (C-8), 42,5 (C-10), 46,5 (C-16),
49.5 (C-9), 54,1 (C-13), 58,0 (C-14), 69,5 (C-15), 124,6 (C-4), 165,9 (C-5), 199,8 (C-3),
214,8 (C-17)
6$,15a-dihidroxi-13fi-etil-4-gonén-3,17-dion
Molekulatömeg: 318 •H-NMR (500 Mhz, DMSO-d6[TMS], 30 °C,
5[ppm]): 0,65 (3H, t, -CH2-C7/j/, 1,28 & 2,36 (2H, m & m, H-7), 1,82 & 2,92 (2H, m & m, H-16), 4,20 (1H, m, H-6), 4,24 (1H, m H-15), 4,82 (1H, d, 15a-OH), 5,14 (1H, d, 6β-ΟΗ), 5,75 (1H, d, H-4) •3C-NMR (125 Mhz, DMSO-dé^O.ő ppm], 30 °C, 8[ppm]): 7,4(-01,-(¾). 18,5 (- CH2-CH3), 24,6
HU 221 745 Bl (C-ll), 25,5 (C-1), 26,4 (C-12), 32,5 (C-8), 35,7 (C-2), 37,4 (C-10), 38,5 (C-7), 46,1 (C-16), 48,7 (C-9), 53,3 (C-13), 573 (C-14), 67,7 (C-15), 69,8 (C-6), 123,6 (C-4), 166,4 (C-5), 199,1 (C-3), 2153 (C-17)
7β, 15a-dihidroxi-l 3$-etil-4-gonén-3,17-dión
Molekulatömeg: 318 ’H-NMR (500 Mhz, DMSO-dJTMS], 30 °C, ö[ppm]): 0,66 (3H, t, -Cl^-CHj), 1,95 & 2,93 (2H, m & m, H-16), 2,29 & 2,69 (2H, m & m, H-6), 3,35 (IH, m, H-7), 4,35 (IH, m, H-15), 5,79 (IH, m, H-4), 6,02 (IH, d, 15a-0H), 6,13 (IH, d, 7β-ΟΗ) ’3C-NMR (125 Mhz, DMSO-d6[39,5 ppm], 30 °C, ö(ppm]): 7,1 (-CHz-Cffj), 18,1 (-CH2-CH3), 24,2 (C-ll),
26.1 (C-1), 26,2 (C-12), 36,0 (C-2), 40,6 (C-10),
43.1 (C-6), 44,3 (C-16), 45,0 (C-9), 46,0 (C-8), 53,4 (C-13), 57,0 (C-14), 67,7 (C-15), 71,3 (C-7), 124,3 (C-4), 163,8 (C-5), 198,2 (C-3), 214,7 (C-17)
2. példa
Fusarium equiseti var. richter SZB 0456 (NCAIM
F 001237) maláta ferdeagaron növesztett 1-4 hetes tenyészetéről 5 ml steril vízzel készített sejtszuszpenzió teljes mennyiségével 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml BK-2 táptalajt oltunk, melynek összetételét az 1. példa tartalmazza.
A tenyészetet 2 napig növesztjük sikrázógépen, °C-on, majd 5-5 ml tenyészettel 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezett 3 x 100 ml NS-táptalajt oltunk. Az NS-táptalaj összetételét az 1. példa tartalmazza. A kapott tenyészetet 26 °C-on sikrázógépen 36 órán át rázatjuk, majd 250 ml tenyészettel laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett 5 liter térfogatú BK-2 táptalajt oltunk. Az előtenyésztést 28 °C-on, 300 rpm keverés és 601/óra levegőátáramoltatás mellett végezzük. 18 órás korban a tenyészethez adunk 50 ml dimetil-formamid és 0,5 g Tween-80 detergens elegyében oldott 15 g ^-etil-4-gonén-3,17-dion-t, ami 3 g/1 koncentrációnak felel meg, majd a hőmérsékletet 24 °Cra mérsékeljük. 40 órás korban a tenyészetet leszűrjük, és a szűrletet 100 g SP-207 típusú adszorpciós gyantával 30 percen át keveijük. Ezután a gyantát szűréssel elválasztjuk, a szteroidmentesített szűrlettel a biomasszát felszuszpendáljuk, és visszajuttatjuk a fermentorba. A fermentációt a korábbi technológiai paraméterek változatlanul hagyásával további 28 órán át folytatjuk.
A fermentáció végén a tenyészetben lévő, illetve a órás korban adszorpciós gyantával kinyert szteroidok együttes mennyisége a fermentlé térfogatára vonatkoztatva a következő:
0,19 g/1 (6%) szubsztrát,
2,24 g/1 (75%) 15α-1ιϊ<ΐΓθχΐ-13β-βΙΐ1-4^οηέη-3,17dion,
0,36 g/1 (12%) 6β,15α-«1ϊ1ιΐ<ΐΓθχϊ-13β-βύ1-4^οηέη3.17- dion,
0,11 g/1 (4%) 7β,15α^Πιϊ(ΐΓθχΐ-13β-βΐΠ-4^οηέη3.17- dion és
0,11 g/1 (4%) egyéb melléktermék.
3. példa
Fusarium equiseti var richter SzB 0456 (NCAIM F 001237) maláta ferdeagaron növesztett 1 -4 hetes tenyészetéről 10 cm3 steril vízzel készített sejtszuszpenzió teljes mennyiségével 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml BK-2 táptalajt oltunk, melynek összetételét az 1. példa tartalmazza.
A tenyészetet 2 napig növesztjük sikrázógépen, 26 °C-on, majd 5-5 cm3 tenyészettel 500 cm3-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 3 χ 100 cm3 NS-táptalajt oltunk. Az NS-táptalaj összetételét az 1. példa tartalmazza. A kapott tenyészetet 26 °C-on sikrázógépen 24 órán át rázatjuk, majd 250 cm3 tenyészettel 5 dm3, laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett, BK-F3 táptalajt oltunk. A BK-F3 táptalaj összetétele a következő:
csapvízben.
A táptalaj pH-ját 6,3-6,5 közötti értékre állítjuk, = majd autoklávban 121 °C-on 20 percen át sterilezzük. tA beoltott fermentort 26 °C-on teimosztáljuk és i flat-blade keverővei 300 fordulat/perc kevertetéssel, valamint 60 dm3/óra levegőátáramoltatással inkubál- | juk. 18 óra előtenyésztés után hozzáadunk 50 cm3 dimetil-formamid és 0,5 g Tween-80 detergens elegyében oldott 15 g 13p-etil-4-gonén-3,17-dion-t, majd a hőmérsékletet 28 °C-ra emeljük, öt nap múlva a tenyészetet szűrjük, és a szűrletből a szteroidokat önmagában ismert módon, például adszorpciós eljárás alkal- f mazásával elkülönítjük. A kapott termékek az aláb- i biak:
5,5 g 7β,15α-0ΐ1ιϊ<ΐΓθχϊ-13β-β01-4^οηέη-3,17-<1ϊοη,
1,8 g 6β,15α-<Β1ιϊ<ΐΓθχϊ-13β-βΰ1-4^οηέη-3,17-<1ΐοη, és
1,0 g 15a-hidroxi-13p-etil-4-gonén-3,17-dion.
The scope of the description is 8 pages (including 1 page figure)
EN 221 745 Fusarium equiseti var. Deposited at the National Collection of Industrial and Industrial Microorganisms (University of Horticulture and Food Industry, Budapest) under the identification mark NCAIM F 001237. richter with SB 0456 microorganism, then
a) In the isolation of 6β, 15α-dihydroxy-3β-ethyl-4-gonene-3,17-dione, the culture is filtered, the desired product is isolated from the filtrate in a manner known per se.
b) In the case of the isolation of 15α-hydroxy-4-ethyl-4-gonene-3,17-dione, medium exchange and / or additional substrate dosing is carried out during the bioconversion and the desired product is isolated from the fermentation broth in a manner known per se.
The present invention relates to (Π) 13-alkyl-4-ene-3,17-dione compound a novel method - resulting hydroxylation conducted bioconversion means (I), 13-alkyl-4 - wherein R 4 is alkyl, Cj_ containing 15 ene-3,17-dione compound derivatives wherein R is t C t _ 4 alkyl group, R 2 and R 3 represents H or OH, whereby R 2 and R 3 are not simultaneously hydroxy - broth preparation and the fermentation to isolate the desired end product in a manner known per se.
The invention further relates to a novel dihydroxyone derivative.
19-norsteroids are very important steroid hormone and drug base materials, while hydroxylated derivatives are important key intermediates in further syntheses.
Microbiological hydroxylation of 19-norsteroids has been successfully dealt with since the fifties.
For the progesterone 11-hydroxylation, 30 bioconversion of 19 norstosterone, 19nortestosterone, was frequently and successfully used with the Rhizopus nigricans strain. In addition to the β-hydroxy derivative of β-product, the ß-hydroxy and β-hydroxy derivative were produced as by-products (J.
Am. Chem. Soc. 781512-1513 [1956]). 35
Of course, many researchers have been involved in the reaction mechanism of enzymatic steroid hydroxylation. Early experience has shown that hydroxylations at different positions are carried out by separable oxygenase enzymes. It has been found, for example, that the formation of Aspergillus ochraceus 6β-1ιί 40-40 roxylase is induced by II-hydroxy-progesterone (U.S. Patent Nos. 2,802,775 and 2,905,593); by removing the resulting hydroxyl product from the reaction mixture, the formation of the 6β, 11αdihydroxy derivative was reduced. 45
The 19-norsteroids hydroxylation szteroidhidroxilező relatively few commercially feasible methods are known, especially if it is longer than the C 13 carbon atom chain linked. The estradiol was converted into Fusarium and Absidia trachea to give 15α-hydroxy derivative 50 (U.S. Patent 3,312,888).
The nortestosterone 11-hydroxylation was described by Sehgal et al., With Aspergillus ochraceus (Can. J. Microbiol. 14: 529-532 [1968]). Only many years later was it possible to solve the economical 1-hydroxylation of 19-nortestosterone with the Rhizopus nigricans strain associated with Petzoldt (U.S. Patent No. 3,248,434). The 15α-hydroxylation of 17-alkynyl-4-esters was solved by the Penicillium raistrickii strain by German researchers (U.S. Patent No. 2,546,062). 60
By the hydroxylation of 19-nor-13-ethyl steroids, researchers began to cope only with the 70s. On the 13β-ethyl-1,3,5 (10) -gonatriene-3,17-di-diol substrate, 16a-hydroxylation could be carried out by US researchers with the Bacillus megaterium bacterial strain (U.S. Patent 3,733,254). The norethindrone hydroxylating is 11 β-position byproduct Botryodiplodia malorum strain of norgestrel (13p-ethyl-17a-ethinyl-17p-4-ene-3-one) C n -atomon not able to hydroxylate, because of the 13-alkyl inhibition (2546 U.S. Patent No. 062). Many strains of αα-hydroxylation of various gonene derivatives have been found to be: Rhizoctonia, Sclerotium,
Calonectria, with Glomerella strains (U.S. Patent No. 2,450,106). A number of research groups have solved the la-hydroxylation of norgestrel by: \ t
With the Calonectria decora strain (U.S. Patent No. 2,450,106), with Aspergillus clavatus (U.S. Patent No. 2,539,261).
The Norwegians elβ-ΙύίίΓοχίΙεζέβέί Mucor griseocyanus * | (Patent No. 2 330159, U.S. Patent Specification, No. 2,30159). Also, the 9α- and hydroxylation of gonene derivatives has been accomplished with the Glomerella fungal strain (U.S. Patent No. 4,397,947). |
German researchers have also studied the hydroxylation of phenylphenone derivatives: they were able to create a 6a-hydroxy derivative with strains of Streptomyces and Nigrospora, and converted a 7a-hydroxy product into a Streptomyces strain, and a 15β-1ιί <ΐΓθχίΙεΓπ ^ βΙ strain of Neurospora ).
Petzoldt et al., U.S. Pat. No. 3,248,434, to the 3-oxo-4-estrene derivatives and their 18-alkyl homologs, did not produce two bioconversion reactions in space, but only in time. Using a low substrate concentration (1 g / l) over 36 hours, the aromatization of ring A was carried out in an aerobic environment by addition of an Aspergillus ochraceus strain, followed by addition of α-hydroxylation followed by Arthrobacter simplex or Bacillus sphaericus.
The 15α-hydroxy derivative of levodion (4-ethyl-4-gonene-3,17-dione) was produced by Penicillium, or Fusarium, by K. Petzold and R. Wiechert (U.S. Patent No. 2,556,068). In both the aforementioned U.S. Patent Specification and in the examples of the patent application * printed in Hungary 173,395, only Penicillium raistrickii ATCC 10490 filamentous fungus is included (important intermediates of gestodene, 15a-hydroxy-13fl2).
For the preparation of ethyl 4-gonene-3,17-dione, with a yield of 76.5%), although the descriptive part is Fusarium avenaceum CBS 38662, Fusarium oxysporum ATCC 7808 and ATCC 9991, Fusarium rosceum ATCC 14714 Penicillium canescens ATCC 10419, Penicillium chrysogenum ATCC 10003, Penicillium nigricans ATCC 9439 and Penicillium stoloniferum ATCC 14586 are also mentioned.
The aim of the invention of formula (I) - wherein R, is C, _ R 2 4 alkyl group, R 2 and R 3 represents H or OH, whereby R 3 are not simultaneously hydroxy - Preparation of Hydroxy-ene compounds industrially it can be used in concentration and by implementing technological parameters suitable for size increase.
The invention is based on the recognition that Fusarium equiseti var. richter PB 0456 (NCAIM F 001237) during fermentation with a filamentous fungus, the product spectrum can be influenced, the formation of normally enriched dihydroxy compounds can be suppressed such that when the resulting 15α-hydroxy-13-alkyl-4-gonene-3, 17-dione and the formation of dihydroxy compounds has just begun, the fermentation broth from the mycelium is removed, and biotransformation is optionally continued when the mycelium is filled.
Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 (NCAIM F 001237) is a sporodochium with a typical macroconidium. Microconidium is not formed on the usual media, but in the older culture, the chlamydial pores appear in the queue. The growth of the strain is relatively fast, the color of the mycelium and the agar plate is orange.
It has been found that distilled water or physiological saline or buffer solution (e.g., pH 6.8 citrate buffer) or medium suitable for the composition of the original medium, or a variety of diluted versions thereof, can be used to top up the mycelium. The medium used to top up the mycelial mass may be steroid-free or may contain substrate at various concentrations. As a result of the filling, the volume of the culture may be less, the same or more than the beginning of the conversion.
The invention is further based on the discovery that the selection of the appropriate media components has resulted in the substrate being attached to the mycelia in addition to the higher amount of the converted substrate and the total amount of water-soluble hydroxytene in the fermentation broth.
It was difficult to introduce a substrate with very low water solubility into the fermentation broth. Dosage in the commonly used dimethylformamide solution was beneficial but did not produce the desired effect by itself. Therefore, a further solubilising additive was sought, such as an emulsifier; a polyoxyethylene sorbiton monooleate (Tween-80) and β-cyclodextrin proved to be suitable.
Based on our inventions, it has been found that, in addition to converting the total amount of substrate used in an industrially useful amount, the amount of dihydroxy compounds produced in the medium exchange process has decreased by half compared to the bioconversion in the one-step process, while the amount of 15α-hydroxy main product has increased at a similar rate.
Based on the above the invention relates to (Π) 13-alkyl-4-ene-3,17-dione compound of formula wherein R is C, _ 4 alkyl - obtained by hydroxylation conducted bioconversion means (I), 13-alkyl formula -4-Gonene-3,17-Dione Compound-Pannicans - where R! is Cj_ 4 alkyl, R 2 and R 3 represents H or OH, whereby R 2 and R 3 are not simultaneously hydroxy - broth preparation and the fermentation broth for the isolation of the final product desired manner known per se, in such a way that the bioconversion of multiple simultaneous kind Fusarium equiseti var. deposited under the identification mark of NCAIM F 001237 of the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Horticulture and Food Industry, Budapest), having steroid oxygenase activity. richter BB 0456, then
a) 6β, 13-dihydroxy-15a. $ ethyl-4-ene-3,17-dione can be isolated by filtration of the culture, the vesicle szűrlet- Ί the desired manner known per se »is isolated,
b) In the case of the isolator of 15α-hydroxy-13-ethyl-4-gonene-3,17-dione, medium exchange and / or additional substrate dosing is carried out during bioconversion, and the desired product is isolated from the fermentation broth in a manner known per se.
The medium used for media exchange according to the invention is selected from any mixture of the original medium, diluted medium, distilled water, physiological saline and various buffer solutions. An additional 0.2-5.0 g / l of substrate was introduced into the system during media exchange.
The invention further provides a novel dihydroxy derivative; 6β, 15α-dihydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3,17-dione.
In the process according to the invention, the growth of microorganisms and the hydroxylation are carried out in shaken culture (240 cm rpm, 2 cm skimmer). Soy flour, yeast extract, malt extract, maize marmalade and various white hydrolysates are preferred for use in culture media; as carbon sources, mono-, oligo- and polysaccharides, such as glucose, sucrose and starch, and vegetable oils and organic acids. .
Preferably, the hydroxylation fungi are cultured at 24-32 ° C.
The pre-culture of the bioconversion microorganism is carried out in a shake flask or fermentor for transformation by administering the substrate in an optimal state of the culture.
The optimum condition is the end of the pH reduction indicating the use of the carbon source, which occurs at 16-30 hours depending on the microorganism and the medium. At the same time as substrate dosing, additives that promote dissolution and bioconversion are added to the fermentation broth3
Tween-80 is 0.1-2.0 g / l, preferably 0.8 g / l; β-cyclodextrin at a concentration of 5-25 g / l, preferably 16 g / l.
To monitor fermentation, the steroid compounds can be isolated from the fermentation broth by extraction with chlorinated hydrocarbons, esters, water-immiscible ketones or alcohols. In order to obtain as much as possible the steroids in the fermentation broth, the culture should be homogenized prior to extraction. The quantitative determination of the individual components is carried out by densitometry after thin-layer chromatography separation on Kieselgel 60 F254 (Merck, N ° 5554). As a development system, a good separation method for the compounds in question is used, preferably the system of U.S. Patent No. 216,874, which consists of cyclohexane-ethyl acetate-ethanol (35: 56: 8).
The measurement was performed with a Shimadzu CS-9000 densitometer at 242 nm
After filtering the cultures, the desired steroids are isolated from the filtrate by a known offspring, such as an extraction or absorption process.
A novel compound isolated from the fermentation broth, 6β, 15α-dihydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3,17-dione, may be an important intermediate in the synthesis of drug substances. 25
The following examples illustrate the practice of the present invention without limiting its scope to these.
Example 1 30
Fusarium equiseti var. richter SzB 0456 (NCAIM F 001237) cultured from 1 to 4 weeks of cultured malt slurry with a total volume of 5 ml sterile water in a 500 ml Erlenmeyer flask sterilized with 100 ml of BK-2 medium containing the following composition:
peptone 30.0 g glucose 10.0 g
1000 ml of tap water.
The pH of the medium was adjusted to 7.3 and then sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes.
The culture was grown on a shaker for 2 days.
1000 ml of tap water. 50
The pH of the medium is adjusted to 6.3-6.5 and then sterilized in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes.
The resulting culture was shaken at 26 ° C on a shaker machine for 36 hours and 100 ml of BKF-K1 medium sterilized in a 500 ml Erlenmeyer flask with 5 ml of culture. The composition of the BKF-K1 medium is as follows:
1000 ml of tap water.
The pH of the medium is adjusted to between 6.3 and 6.5 and then sterilized for 20 minutes in an autoclave at 121 ° C.
The inoculated shake flasks were thermostated at 26 ° C. After 18 hours of pre-culture, 0.3 g of 13p-ethyl-4-gonene-3,17-dione dissolved in dimethylformamide (0.08 g, Tween-80 detergent) was added, corresponding to a concentration of 3 g / l. The maximum amount of 15α-hydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3,17-dione was measured 48 hours after substrate dosing, leaving a substrate of 0.12 g / l (4%) at 1.64 g / l (55%). Hydroxy-13β-ethyl4-gonene-3,17-dione, 0.50 g / l (17%) 6β, 15α-dihydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3,17-dione, 0.46 g / l ( 15%) 7β, 15αdihydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3,17-dione and 0.28 g / l (9%) of other by-products
24 hours after substrate dosing, the fermentation broth was removed by centrifugation and the mycelium was added to the distilled water according to the original volume. After a further 24 hours, the steroid content of the culture, determined by summing up the steroid content of the fermented broth at 24 hours, was converted to the following substrate:
g / 1 substrate
2.55 g / l (85%) of 15α-hydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3,17dione
0.21 g / l (7%) of 6β, 15α-dihydroxy-13β-ethyl-4-gone3.17 dione
0.12 g / l (4%) of 7β, 15α-dihydroxy-13β-ethyl-4-gonone 3.17 dione and
0.12 g / 1 (4%) other by-product.
The most important physico-chemical data of the products obtained are summarized below:
$ 15a.-hydroxy-13-ethyl-4-ene-3,17-dione
Molecular Weight: 302 1 H-NMR (500 Mhz, DMSO-d 6 [UTMS], 30 ° C,
5 [ppm]): 0.78 (3H, t, -CH 2 -C 3 //), 2.09 & 2.99 (2H, m & m, H-16), 2.33 (1H, br , OH), 4.50 (1H, m, H-15), 5.84 (1H, m, H-4) C-NMR (125 MHz, DMSO-d6 (39.5 ppm), 30 ° C) , she [ppm]:
4.7 (-CHj-C / f) f 19.5 C7 / 2 -CH 3), 25.3 (C-II),
26.6 (Cl), 26.8 (C-12), 31.1 (C-7), 35.4 (C-6),
36.4 (C-2), 39.7 (C-8), 42.5 (C-10), 46.5 (C-16),
49.5 (C-9), 54.1 (C-13), 58.0 (C-14), 69.5 (C-15), 124.6 (C-4), 165.9 (C-5) ), 199.8 (C-3),
214.8 (C-17)
6 $, 15a-dihydroxy-13fi-ethyl-4-ene-3,17-dione
Molecular weight: 318 • H NMR (500 MHz, DMSO-d6 [TMS], 30 ° C,
5 [ppm]): 0.65 (3H, t, -CH 2 -C 7 / j /, 1.28 & 2.36 (2H, m & m, H-7), 1.82 & 2.92 ( 2H, m &m; H-16), 4.20 (1H, m, H-6), 4.24 (1H, m-H-15), 4.82 (1H, d, 15a-OH), 5 , 14 (1H, d, 6β-ΟΗ), 5.75 (1H, d, H-4) • 3 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6 ppm), 30 ° C, 8 [ppm] ]): 7.4 (-01, - (¾). 18.5 (- CH 2 -CH 3 ), 24.6
HU 221 745 B1 (C-11), 25.5 (C-1), 26.4 (C-12), 32.5 (C-8), 35.7 (C-2), 37.4 ( C-10), 38.5 (C-7), 46.1 (C-16), 48.7 (C-9), 53.3 (C-13), 573 (C-14), 67, 7 (C-15), 69.8 (C-6), 123.6 (C-4), 166.4 (C-5), 199.1 (C-3), 2153 (C-17)
7β, 15α-Dihydroxy-1,3-ethyl-4-gonene-3,17-diol
Molecular Weight: 318 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-dJTMS), 30 ° C, [ppm]): 0.66 (3H, t, -Cl2 -CH2), 1.95 & 2.93 (2H , m & m, H-16), 2.29 & 2.69 (2H, m &m; H-6), 3.35 (1H, m, H-7), 4.35 (1H, m, H-15), 5.79 (IH, m, H-4), 6.02 (IH, d, 0H-15a), 6.13 (IH, d, 7β-ΟΗ) '3 C NMR (125 MHz, DMSO-d6 [ppm 39.5], 30 ° C,? (ppm]): 7.1 (-CH-Cffj), 18.1 (CH 2 CH 3), 24.2 (C -ll)
26.1 (C-1), 26.2 (C-12), 36.0 (C-2), 40.6 (C-10),
43.1 (C-6), 44.3 (C-16), 45.0 (C-9), 46.0 (C-8), 53.4 (C-13), 57.0 (C-14) ), 67.7 (C-15), 71.3 (C-7), 124.3 (C-4), 163.8 (C-5), 198.2 (C-3), 214.7 (C-17)
Example 2
Fusarium equiseti var. richter SZB 0456 (NCAIM
F 001237) From 1-4 weeks of cultivation of malt slurry agar In a total volume of 5 ml sterile water, 100 ml of BK-2 medium sterilized in a 500 ml Erlenmeyer flask was seeded in Example 1.
The culture was grown on a shaker at 2 ° C for 2 days followed by inoculation of 5 x 100 ml NS medium in 500 ml Erlenmeyer flasks with culture. The composition of the NS medium is shown in Example 1. The resulting culture was shaken for 36 hours on a shaker at 26 ° C, and 5 liters of BK-2 medium was sterilized in 250 ml of culture in a laboratory glass fermenter. Pre-culture is performed at 28 ° C, 300 rpm mixing and 601 hrs airflow. At 18 hours, 15 g of 4-ethyl-4-gon-3,17-dione dissolved in a mixture of 50 ml of dimethylformamide and 0.5 g of Tween-80 detergent were added to the culture, corresponding to a concentration of 3 g / l, then the temperature is reduced to 24 ° C. At 40 hours, the culture was filtered and the filtrate mixed with 100 g of SP-207 type adsorption resin for 30 minutes. The resin was then separated by filtration, the biomass was resuspended in the steroid-depleted filtrate and returned to the fermentor. The fermentation was continued for a further 28 hours, leaving the previous technological parameters unchanged.
At the end of the fermentation, the total amount of steroids present in the culture and obtained with the adsorption resin at hourly time is as follows:
0.19 g / l (6%) of substrate,
2.24 g / 1 (75%) 15α-1ιϊ <ΐΓθχΐ-13β-βΙΐ1-4 ^ οηέη-3,17dion
0.36 g / 1 (12%) 6β, 15α- 1ϊ1ιΐ <ΐΓθχϊ-13β-βύ1-4 ^ οηέη3.17- dione
0.11 g / 1 (4%) 7β, 15α ^ Πιϊ (ΐΓθχΐ-13β-βΐΠ-4 ^ οηέη3.17- dione and
0.11 g / 1 (4%) other by-product.
Example 3
Fusarium equiseti var riCHter OC total volume of cell suspension grown in 0456 (NCAIM 001237 F) malt slant 1 -4 weeks inoculum in 10 cm 3 of sterile water added to sterilized 500-ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of BK-2 medium, having the composition of Example 1 included.
The culture was grown for 2 days on a shaker, at 26 ° C, and then inoculated with 3 x 100 cm 3 NS medium in a 500 cm 3 Erlenmeyer flask with a culture of 5 to 5 cm 3 . The composition of the NS medium is shown in Example 1. The resulting culture was shaken for 24 hours on a shaker at 26 ° C, and 5 µm 3 of BK-F3 medium, sterilized in laboratory glass fermenter, was inoculated with 250 cm 3 of culture. The composition of the BK-F3 medium is as follows:
tap water.
The pH of the medium is adjusted to between 6.3 to 6.5, and sterilized by autoclaving at 121 = C for 20 minutes. The inoculated fermenter is teethostimulated at 26 ° C and with flat blade stirrers incubated at 300 rpm and 60 dm 3 / hr airflow incubation | Juk. After 18 hour pre-culture was added in 50 cm 3 of dimethylformamide and 0.5 g of Tween 80 detergent in a mixture of 15 g of 13p-ethyl-4-ene-3,17-dione, and then the temperature was raised to 28 ° C, after five days, the culture is filtered and the steroids from the filtrate are isolated in a manner known per se, for example using an adsorption process. The resulting products are:
5.5 g 7β, 15α-0ΐ1ιϊ <ΐΓθχϊ-13β-β01-4 ^ οηέη-3,17- <1ϊοη,
1.8 g 6β, 15α- <Β1ιϊ <ΐΓθχϊ-13β-βΰ1-4 ^ οηέη-3,17- <1ΐοη, and
1.0 g of 15α-hydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3,17-dione.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9603191A HU221745B1 (en) | 1996-11-19 | 1996-11-19 | Process for microbiological hydroxylation of gonene-dione compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9603191A HU221745B1 (en) | 1996-11-19 | 1996-11-19 | Process for microbiological hydroxylation of gonene-dione compounds |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9603191D0 HU9603191D0 (en) | 1997-01-28 |
| HUP9603191A2 HUP9603191A2 (en) | 1998-07-28 |
| HUP9603191A3 HUP9603191A3 (en) | 2000-09-28 |
| HU221745B1 true HU221745B1 (en) | 2002-12-28 |
Family
ID=89994465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9603191A HU221745B1 (en) | 1996-11-19 | 1996-11-19 | Process for microbiological hydroxylation of gonene-dione compounds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU221745B1 (en) |
-
1996
- 1996-11-19 HU HU9603191A patent/HU221745B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9603191A3 (en) | 2000-09-28 |
| HU9603191D0 (en) | 1997-01-28 |
| HUP9603191A2 (en) | 1998-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4035236A (en) | Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione | |
| US4293645A (en) | Process for preparing androsta-1,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione | |
| JPH022395A (en) | Microbiological production of 9 alpha-hydroxy- 17-ketosteroid | |
| CA2202016C (en) | Process for the production of lipstatin and of tetrahydrolipstatin | |
| US2802775A (en) | 11 alpha-hydroxylation of steroids by aspergillus ochraceus | |
| US4293644A (en) | Process for preparing androst-4-ene-3,17-dione | |
| HU221745B1 (en) | Process for microbiological hydroxylation of gonene-dione compounds | |
| US4062729A (en) | Microbial transformation of steroids | |
| US4039381A (en) | Composition of matter and process | |
| EP0008214B1 (en) | Microorganisms and their use in producing androst-4-ene-3,17-dione | |
| US4358538A (en) | Mycobacterium fortuitum mutant | |
| US4042459A (en) | Composition of matter and process | |
| JPS6141547B2 (en) | ||
| US4345030A (en) | Microorganism mutant conversion of sterols to androsta-4-ene-3,17-dione | |
| US4097335A (en) | Microbial transformation of steroids | |
| US4618581A (en) | Clavine-producing strain, a process for the preparation thereof as well as a microbiological process for producing clavine alkaloids | |
| US4304860A (en) | Process for the microbial transformation of steroids | |
| US4177106A (en) | Process for preparing 3aα-H-4α-[3'-propanol]-7aβ-methylhexahydro-1,5-indanedione hemiketal | |
| US4211841A (en) | Process for microbial transformation of steroids | |
| JP4439079B2 (en) | Method for producing pravastatin | |
| US4345033A (en) | Mycobacterium fortuitum mutant | |
| US2768928A (en) | Microbiological oxidation to lactones | |
| HU216874B (en) | Method for microbial production of 11alfa-hydroxi-gonan compounds | |
| EP0786011A1 (en) | A microbiological process for the preparation of 17beta-carboxy substituted 3-oxo-4-azasteroids and the use of such products as inhibitors of the enzyme 5alpha-reductase | |
| US4345034A (en) | Mycobacterium fortuitum mutant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC9A | Change of name, address |
Owner name: RICHTER GEDEON NYRT., HU Free format text: FORMER OWNER(S): RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYAR RT., HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |