HU226319B1 - Anticancer medicinal composition comprising nigella sativa extract and use of the active component of said extract in the manufacture of a medicament - Google Patents

Description

(54) Nigella sativa kivonatot tartalmazó rákellenes gyógyszerkészítmény és a kivonat aktív komponensének alkalmazása gyógyszer előállítására (57) Kivonat

A találmány tárgya humán rákbetegség gyógyítására alkalmas gyógyszerkészítmény és annak alkalmazása.

A gyógyszer a Nigella sativa magvak kivonatából áll, mely kivonat a magvak tömegének mintegy 2,2%-át kitevő aktív komponens. A kivonat a beteg testtömegével arányos egységadag tonnájában juttatható a szervezetbe, nevezetesen egy 70 kg testtömegű betegnek 20-40 grammot - előnyösen 30 grammot - adva.

HU 226 319 Β1

A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 2 lap ábra)

HU 226 319 Β1

Az orvostudomány és farmakológia területére tartozó jelen találmány a Nigella sativa Linn (N. sativa) növény magvának extraktumával foglalkozik, mely alkalmas a rák, a vírusos betegségek kezelésére, a kemoterápia mellékhatásainak kivédésére és növekedési faktorként hat a vérképzésben szereplő csontvelőre.

Az emberi szervezet számos betegségének kezelésére ma különféle növényi extraktumok és készítmények állnak rendelkezésünkre. Közöttük vannak olyanok, melyeket már évezredek óta ismerünk és leírtak, míg mások gyógyító hatását csak most ismerjük fel. A hatásos növényi kivonatok igen igényeltek, minthogy a betegségek kezelésének „természetes módját jelentik. Az a felfogás, hogy a természetes készítményeknek nincs olyan hátrányos hatásuk a szervezetre, mint a szintetikus anyagoknak.

A kezelések egyik elsődleges célja a rák gyógyítása. Ma már vannak olyan rákellenes gyógymódok, melyek hatásosan elölik a ráksejteket, azonban sok, ezeknél használt gyógyszer az egészséges sejteket is károsítja vagy elöli, illetve más súlyos mellékhatásokat okoz. Ezért életbevágóan fontos olyan rákellenes eljárásokat kidolgozni, melyek fajlagosan hatnak a szervezet rákos burjánzására, de nem toxikusak a többi részeit illetően. Ideális esetben a kezelés természetes növényi kivonatokat alkalmaz. A leírásban szereplő „szervezet” vagy „beteg kifejezés bármilyen meleg vérű emlősre vonatkozhat, szándékunk szerint azonban elsősorban az emberre.

A különféle fűszer- és gyógynövények gyógyhatású tulajdonságai általánosságban ismertek (Strivastava, 1989). (A szövegben szereplő irodalmi idézetek teljes jegyzéke a szabadalmi igénypontok előtti fejezetben található). Grossman és munkatársai 4 986 895 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalma olyan vízoldható növényi kivonatokkal foglalkozik, melyek alkalmasak a vírusos bőrfertőzések kezelésére. Ho és munkatársai 5 178 865 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalma kínai gyógynövénykivonatok in vitro hatását írja le HIV-vel kapcsolatos betegségre, összesen 56 olyan gyógynövénykivonatot szűrtek ki, melyek az in vitro technika alkalmazásánál anti-HIV-aktivitást mutattak.

Aruna (1990) ugyancsak különféle gyógyító tulajdonságokkal rendelkező fűszer-, aromanövényeket és leveles zöldségféléket ír le. 20 fűszernövény és zöldség antikarcinogén-aktivitású termékét szűrték ki, felhasználva a glutation-S-transzferáz indukciót. Az alkalmazott növények egyike a köményként ismert Cuminum cyminum Linn (C. cyminum). Valamennyi fűszernövényt és zöldséget a szervezet jól fogadja, és nem jelentkeznek mellékhatások.

Bitterman és munkatársai (1991) közölnek egy tanulmányt, amit 964 felnőtt betegen végeztek. A betegek 28%-a rosszindulatú daganatos betegségben, 72%-a kilenc különféle idegbetegség valamelyikében szenvedett. A C. cyminum étrendben való alkalmazása közrejátszott a lipidperoxidációval kapcsolatos betegségek megelőzésében.

Aruna és Sivaramakrishman (1992) beszámolnak néhány fűszernövény antikarcigén tulajdonságáról. Tanulmányozták a köménymagot (C. cyminum Linn) is. A köménymagok szignifikánsan gátoltak néhány karcinogenezist.

A N. sativa növény kivonata széles körű gyógyászati felhasználást nyert. A Ranunculaceae családba tartozó N. sativa egynyári növény. A Nigella más fajai: N. arvensis és N. damascena. Az egyes Nigella fajok kallusz szövettenyészetei lényeges kromoszomális eltéréseket mutatnak (Datta és munkatársai, 1983).

A N. sativát felállóan elágazó szár és váltakozóan osztott, vékony szálas, szürkészöld levelek jellemzik. A kékesfehér, csillag alakú virágok végállásúak és egyedülállóak. A sziromlevelek hiányoznak. A termés gömbölyded toktermés kis, fekete, érdes magvakkal. A növényt Indiában, Bangladesben, Törökországban, Közép-Keleten és a Földközi-tengeri medencében termesztik főleg magváért, vagyis a „fekete köményért”, amit étkezési és gyógyítási célra használnak fel, azaz fűszerként és különféle betegségek gyógyítására.

A N. sativa érett magvainak - hívják Kalajira vagy Kalaonji néven is - széles körű gyógyászati felhasználása ismert (Kirtikar és munkatársai, 1982; Chopra és munkatársai, 1982). A magvak szaponint, illóolajat, keserűanyagot (nigellon) és csereanyagokat tartalmaznak. Ezekről az anyagokról kimutatták, hogy vizelethajtó (Nadkami, 1976), epehajtó és görcsoldó (Tennokon és munkatársai, 1991), szélhajtó (Shayeb és Mabrouk, 1984), tejelválasztást fokozó (Vihan, 1987), antibakteriális (Hassan és munkatársai, 1989), antifungális (Agarwal és munkatársai, 1979), féreghajtó (Akhtar, 1991) és menstruációt elősegítő (Siddiqui és munkatársai, 1988) hatásuk van. al-Awadi és munkatársai (1985) az N. sativa kivonat antidiabetikus hatását bizonyította.

Az N. sativa az egyiptomi népi gyógyászatban, mint diuretikumot és szélhajtót alkalmazzák (Sayed, 1980). Az olaját használják asztma, nehézlégzés és köhögés kezelésére. Az illóolaj frakcióból izolálták a nigellon hatóanyagot, és leírták róla, hogy a hörgőasztma kezelésére alkalmas.

A magvak petroléteres kivonata 1000-62,5 ppm koncentrációban ugyanolyan aktivitást mutatott a Dysdercus similis 5. állapotú lárváján végzett vizsgálatoknál, mint a növekedést szabályozó juvenilis hormon (Kumarés munkatársai, 1987).

al-Awadi és munkatársai (1981) az N. sativa kivonatot tartalmazó keveréknek a máj glikoneogenezisére gyakorolt hatását vizsgálták. A kutatók beszámolnak róla, hogy Kuwaitban a nem inzulinfüggő cukorbajt N. sativa kivonatot tartalmazó növényi extraktum keverékkel kezelik. A vizsgálatnál alkalmazott keverék egyenlő arányban tartalmazott elporított N. sativa Linn; Commiphora myrrh. Eng; Ferula Asafoetida, Linn; Aloe vera, Linn növényeket és olibánumot, mely keveréket desztillált vízben forraltak 10 percen át. A diabetikus állatok gyomorinkubációval kapták meg a napi dózisukat. Az eredmények azt mutatják, hogy a növényi kivonat antidiabetikus hatása legalább részben, a máj glukoneogenezisének csökkentésén keresztül nyilvánult meg.

HU 226 319 Β1

Elkadi és Kandil (1987) az N. sativa T-sejtekre gyakorolt hatását vizsgálták. A vizsgálatokat olyan önkénteseken végezték, akiknél alacsony volt a helper T-sejt/szuppresszor T-sejt arány. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a kezelt személyeknél növekedett a helper T-sejtek populációja. A helper T-sejt/szuppresszor T-sejt arány növekedett, mig a kontrollcsoportnál változatlan maradt.

Nair és munkatársai (1991) az N. sativa ciszplatin indukálta toxicitást kivédő lehetséges aktivitását vizsgálták egereken. N. sativa kivonatot használva megfigyeltek bizonyos védőhatást.

Salomi, N. J. és munkatársai (1992) bizonyos zsírsavakat tartalmazó N. sativa magvak antitumorális aktivitását vizsgálták Ehrlich ascites carcinoma (EAC), Dalton lymphonia ascites (DLA) és Sarcoma-180 (S—180) sejteken. Munkájukban in vitro és in vivő antitumorális kísérletek eredményeit mutatják be. A tumorellenes hatóanyagokat kinyerték. Úgy találták, hogy a hatóanyag citotoxikus aktivitással rendelkezik az EAC, KB és a limfocita sejtekkel szemben.

Salomi és munkatársai (1991) beszámolnak arról, hogy az N. sativából olyan hatóanyagot izoláltak, mely gátolta a kémiailag kiváltott bőrrák keletkezését. A N. sativa kivonat intraperitoneális bevitelével megakadályozták a lágyszöveti szarkómák kialakulását, és a kezelt csoportnál csökkenteni tudták vele a tumor átmérőjét.

Metcalf (1984,1985) a kémiai karcinogenezis gátlásáról számol be egereknél.

Ezekben a munkákban viszont nem történik említés humán tumorsejteket elpusztító hatásról.

A jelen találmány tárgya rákellenes gyógyszer, ahol a hatóanyag az N. sativa növény kivonata. A jelen találmány szerinti gyógyszer helyes használatával kezelhetjük a rákbetegséget, megakadályozhatjuk a rákellenes hatóanyagok toxicitását az ember szervezetében és fokozhatjuk az immunműködést.

A jelen találmány további tárgya a rák kezelésére használható gyógyszerkészítmény, mely lényegében a Nigella sativa kivonatát tartalmazza olyan koncentrációban, mely képes a beteg rákos sejtjeit elpusztítani.

A találmány további tárgya olyan gyógyszerkészítmény, mely képes a rákellenes terápia mellékhatásainak kezelésére, és lényegében a Nigella sativa kivonatát tartalmazza olyan koncentrációban, mely csökkenti a rákellenes terápia mellékhatásait.

A jelen találmány további tárgya a rákellenes kezelés mellékhatásaitól szenvedő beteg Nigella sativa kivonatával történő kezelési eljárása, ami abból áll, hogy a betegnek a fenti készítmények hatásos dózisát adjuk be.

A jelen találmány további tárgya az ember immunműködését fokozó eljárás, ami abból áll, hogy a szervezetbe a Nigella sativa kivonatát olyan koncentrációban juttatjuk be, ami képes fokozni az immunműködést.

A jelen találmány további tárgya olyan módszer, mellyel meg tudjuk védeni az egészséges sejteket a vírusok citopatikus hatásaitól, mely eljárás abból áll, hogy az emberi szervezetbe a Nigella sativa extraktumát olyan koncentrációban juttatjuk be, mely védőhatással van a vírusok citopatikus behatásaival szemben.

Továbbá a jelen találmány tárgya módszer az antitesttermelő B-sejtek számának növelésére, mely eljárás abból áll, hogy az emberi szervezetbe a Nigella sativa kivonatát juttatjuk, olyan koncentrációban, ami hatásos az antitestet termelő B-sejtek számának növelésére.

A jelen találmány további tárgya módszer, amivel gátolhatjuk a tumoros sejteket anélkül, hogy az egészséges és nem tumoros sejteket is befolyásolnánk. Az eljárás azt jelenti, hogy a beteg szervezetébe a Nigella sativa kivonatát juttatjuk be, olyan koncentrációban, ami a nem tumoros sejtek befolyásolása nélkül gátolja a tumoros sejteket.

A jelen találmány további tárgya az emberi csontvelő keletkezését stimuláló módszer, ami abból áll, hogy a szervezetbe a Nigella sativa kivonatát juttatjuk be olyan koncentrációban, ami stimulálja a csontvelőképződést.

Összefoglalva, az N. sativa kivonat segít stimulálni a csontvelősejteket, védi az egészséges sejteket a vírusok citopatikus hatásaitól, elpusztítja a tumorsejteket és fokozza az antitestet termelő B-sejtek számát. Mindezek a tényezők az N. sativa magvának kivonatát egy olyan ideális jelöltté teszik, ami felhasználható a rákbetegség megelőzésére és gyógyítására.

A N. sativa növényi kivonat hatásosabb, mint a szokásos rákellenes kemoterápiás hatóanyagok. Az N. sativa kivonat stimulálja a csontvelősejteket, megvédi a normális sejteket a citopatikus vírushatásoktól, elpusztítja a ráksejteket és növeli az antitesttermelő B-sejtek számát. Továbbá védi a csontvelőt a kemoterápia hatásaitól és rákellenes hatóanyagként is működhet.

Az N. sativa kivonatról kimutattuk, hogy segít helyreállítani az immunszuppresszált rákos betegek immunkompetens sejtjeit és túlstimulálni a csontvelő keletkezését az egészséges egyedeknél.

Az N. sativa kivonat segíti működésükben a B-sejteken lévő szabad tumorantigén kötőhelyeket. Úgy találtuk, az N. sativa kivonat bevitele a B-sejtek szabad tumorantigén kötőhelyeket inkább segíti, mint az immunkompetens sejtek számának növekedése, ezáltal megemeli a C19 és az azzal kapcsolatos sejtpopulációt. Ha a B-sejtek felületén lévő immunglobulinmolekula antigén-kötőhelye az N. sativa kivonat hatására szabad, hozzákötődik a tumorral kapcsolatos antigén, immunreakciót kiváltva az antigénnel szemben.

A humán amnion „WISH” sejteknek a vezikuláris sztomatítisz vírus (VSV) citopatikus hatásával szembeni védelme szintén megfigyelhető az N. sativa extraktum bevitelekor. A szérum interferonszintje nő, ezért az N. sativa növényi kivonatnak interferonszerű antivirális hatása van. Ez a vérkeringés interferonszintjének a növekedésére példa, ami véd a vírusos betegségek ellen, amellett feltehetően a vírusos megbetegedéseket gyógyítja is.

A N. sativa serkenti az antitumor aktivitást. A farmakoszenzitív szűrővizsgálatok azt mutatják, hogy az N.

HU 226 319 Β1 sativa növényi kivonat főként a melanoma és a vastagbél-karcinóma típusú tumorokkal szemben hatásos. Az N. sativa extraktum elpusztítja a tumorsejteket, és sértetlenül hagyja az egészséges sejteket, bizonyára azért, mert képes a beteg sejtek felszínén lévő azialofentinhez (lektin) kapcsolódni, ami a tumorsejtek aggregálódását, összetapadását eredményezi. Ezenkívül enzimeket, a nukleinsavszintézisben és a metabolizmusban részt vevő, nem kívánt géntermékeket is gátol.

A találmány további tárgyai, sajátságosságai és előnyei az alábbi részletes leírásból még kiderül.

Az ábrák leírása

Az 1. ábrán azt mutatjuk be, miként növekszik az N. sativa kivonattal 18 órán át kezelt, 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂ légterű inkubátorban tartott, rákos betegekből származó perifériás vérsejtek CD19, HLADR, NK CD3-/CD56+ és CD38 populációja. Az adatok a 2. kísérletből származnak;

a 2. ábrán grafikusan szemléltetjük, milyen százalékos védelmet nyújt 3,5* 10⁴ WISH sejtnek az N. sativa kivonat hígítási sorozata a vezikuláris sztomatitisz vírus (VSH) citopatikus hatásával (CPE) szemben. A vizsgálatokat a 3. kísérlet írja le.

A találmányban használt kifejezések B-sejtek: a B-sejtek vagy B-limfociták olyan fehérjéket/antitesteket választanak ki, amik védik az emberi szervezetet a fertőzésekkel szemben,

CD3: [Cluster Differentiation 3) ezek azok az antitestek, melyek az aktivált T-limfocitákat jelzik, mely limfocitákat a szervezet a káros idegen mikrobák ellen használ,

CD19: ezek az antitestek segítenek a B-limfocitákat kimutatni. A CD19 növekedése a B-limfociták számának növekedését jelzi és viszont,

CD56: ezek az antitestek gátolják bizonyos rendszerekben a természetes killersejtek és célsejtek közötti kölcsönhatást,

G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Faktor): granulocitatelepet stimuláló faktor,

GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor): granulocita/makrofág telepet stimuláló faktor,

HLADR (Humán Leukocyte antigén DR): humán leukocita antigén DR. A DR egy genetikai lokuszt vagy a lokusznak megfelelő fő hisztokompatibilitási komplexnek az antigénjét jelenti. A HLADR növekedése a betegséggel szembeni immunológiai paraméterek emelkedését jelzi.

NK: (Natural Killer Cells): természetes killersejtek. Az NK a természetes killersejtek indikációja. NKCD3-/CD56+: Natural Killer Cluster Differentiation 3-/Cluster Differentation 56+.

N. sativa kivonat elkészítése: Az N. sativa kivonat elkészítésekor először megőröljük a magvakat, megfelelő oldószerrel, például alkohollal vagy vízzel elkészítjük az extraktumokat, a lipideket dietil-éterrel vagy petroléterrel kiextraháljuk, kristályosítunk vagy kromatografálással frakcionálunk, a komponenseket a kívánt arányban összekeverjük. A N. sativa kivonat három alakban készíthető el - olaj, folyadék vagy kristály. A szükséges eljárások jól ismertek. A N. sativa kivonat előnyös elkészítését az 1. példában írjuk le.

A kivonat bejuttatása: A N. sativa kivonat beadható önmagában vagy megfelelő közeg vagy vivőanyag kíséretében. A készítmény bejuttatása történhet enterálisan - azaz szájon vagy végbélen keresztül - és parenterálisan, például intraperitoneális, intramuszkuláris, intravénás vagy szubkután úton. A készítmény tartalmazhat adalék anyagokat, például vírusellenes szereket, immunmodulátorokat, antitesteket, más kemoterápiás hatóanyagokat vagy ezek kombinációját. A dozírozott alakban lévő készítmény lehet kapszula, tabletta, kúp stb.

Dózisok: Úgy találtuk, hogy az N. sativa leghatékonyabb, ha napi 30 g mennyiségben alkalmazzuk. Hatásos tartomány a napi 20-40 g.

A N. sativa kivonatról ismert, hogy növeli a humán amnion „WISH”-sejtek védelmét a vezikuláris szomatitisz vírus (VSV) citoplasztikus hatásával szemben. 3,5x10⁴ WISH-sejtet 18-24 órán át 37 °C hőmérsékleten kitéve a növényi kivonat hatásának, a kivonat 1:1000 hígításánál értük el a maximális védelmet.

Egy 70 kg tömegű ember szervezetének elméletileg 7χ10¹³ sejtje van. A N. sativa kivonat napi 20-40 g, előnyösen 30 g adagja véd meg a vírusos fertőzéssel szemben az endémiás területeken.

Az elmondottakat az alábbiakban kísérletekkel és vizsgálati eljárásokon keresztül szemléltetjük. Mindezek kizárólag szemléltető jellegűek, és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

Kísérletek

Az N. sativa rákbetegség kezelésére való alkalmasságának értékelésére mérjük a kivonatnak a csontvelősejtekre és a perifériás fehérvérsejtekre gyakorolt hatását.

A csontvelősejteket N. sativa kivonattal inkubálva, meghatározzuk a sejtszám növekedését. Az eredményeket összehasonlítjuk a csontvelő növekedési faktoraival és a biológiai választ módosító anyagokkal (GMCSF, G-CSF, eritropoietin, interferon, IL—2 és STS) kapott eredményekkel. A vizsgálatokhoz humán amnion vagy „WISH” sejteket és egér kötőszöveti sejteket is használtunk.

A példákban az alábbi számításokat alkalmazzuk: százalékos növekedés kiszámítása % növekedés=1- ——^2_χ100,

Rmax ~ Rc ahol R_T az extraktummal vagy növekedési faktorral kezelt tenyészet átlagos sejtszáma, R_c a kontroll kiindulási átlagos sejtszáma, R_max átlagos maximális sejtszámnövekedés extraktum vagy növekedési faktor nélkül.

HU 226 319 Β1

Gátlási százalék kiszámítása:

% gátlás=1- ^Rt-^Rc x100,

Rjnax — R_C ahol R_T az extraktummal vagy Albánnal kezelt tenyészet átlagos sejtszáma, R_c a kontroll kiindulási átlagos sejtszáma, R_max az átlagos maximális gátlás extraktum vagy Albrin nélkül.

Az alábbiakban a kísérleteknél használt néhány eljárást ismertetjük. Az ismert biztonsági előírásokat a biológiai anyagok kezelésekor figyelembe kell venni.

1. eljárás

Áramlásos sejtszámlálás közvetlen immunfluoreszcenciás festéssel

Az automatizált áramlásos sejtszámlálás hatásos, érzékeny és mennyiségi módszert nyújt a sejtpopulációk, szubpopulációk és a szuszpenzióban való összetételük analizálására. A sejtek egész életük folyamán felületi antigéneket fejeznek ki és juttatnak ki, melyek jelzik a típusukat, az érettségi fokukat, aktivációs állapotukat. Monoklonális antitesteket (mAB) termelünk, melyek specifikusan kötik ezeket a felületi antigéneket. Meghatározott klinikai alkalmazások vannak a leukémia és a limfoma diagnózisára, a T-sejt-altlpusok analízisére, a transzplantátum kilökődésének nyomon követésére, a kemoterápiás anyagok különféle sejttípusra kifejtett hatásának figyelésére és a sejtaktivitás mérésére.

A teljes vért, a csontvelőt vagy a sejtszuszpenziót először a vörösvértesteket feloldó oldattal kezeljük, mossuk, majd a specifikus membránantigénnel szembeni jelzett mAB-val keverjük össze. A közvetlen festési eljárást követően történik az analízis egy FACSCAN Immunocytomertry Systems áramlásos sejtszámláló készüléken (FACSCAN Users’ Guide, Becton Dickinson).

Mindegyik mintánál feltüntetjük az alábbi adatokat:

1) a beteg neve; 2) a mintavétel dátuma; 3) a mintavétel időpontja; 4) a mintavevő nevének kezdőbetűi és 5) a panelszám. A betegmintákat a nővér vagy a mintavevő azonosítja általában oly módon, hogy ellenőrizzük a beteg nevét a csuklószalagon. Minden egyes mintát egy, csak rá vonatkozó számmal látunk el, hogy biztosítsuk a minta beazonosítását.

A perifériás vért aszeptikusán gyűjtjük egy megfelelő edénybe (például levendulakék jelű Vacutainercsőbe, EDTA antikoaguláns), és szobahőmérsékleten szállítjuk, előnyösen 48 órán belül. A minimálisan szükséges térfogat panelenként 2 ml teljes vér. Az optimális mennyiség körülbelül 3 ml teljes vér panelenként.

A csontvelőmintát aszeptikusán gyűjtjük megfelelő edénybe (például lásd vérmintánál), és szobahőmérsékleten szállítjuk 48 órán belül. A minimális szükséges csontvelőminta panelenként körülbelül 2 ml, az optimális térfogat 3 ml.

Szilárd tumorokhoz tartozik a mell-, a nyirokmirigy-, a vastagbél-, a petefészek-, a tüdő- és a bőrtumor. Tájékoztatást a Humán Tumor Colony Assay (HTCA) Pharmocasensitivity Procedure nyújt az eljárásokhoz (lásd 5. eljárás). A tumormintákat szobahőmérsékleten szállítjuk 48 órán belül. A minimális mennyiség panelenként 2 ml sejt, az optimális körülbelül 3 ml sejt, mindkét esetben 1x10⁶/ml sejtkoncentrációnál.

Anyagok

EDTA Vacutainer Blood Collection Tűbe (vérgyűjtő csövek),

12x75 mm műanyag kémcsövek, szérumfuga,

FACSCAN Flow Cytometer (áramlásos sejtszámláló), mikropipetták (20 μΙ és 100 μΙ), mikropipettacsúcsok, ismétlő pipetta, kis főzőpoharak, gézlapok, monoklonális antitestek, vörösvértesteket lizáló oldat, foszfátpufferos sóoldat (PBS),

0,5%-os p-formaldehid, transzportközeg, ml-es, kónikus csövek, ismétlő pipettacsúcsok, biztonsági védőlemez,

Sorvall TR6000 centrifuga,

Coulter Cytotrol kontrollsejtek.

Reagensek

A) Monoklonális antitestek - a megfelelő regenerációhoz és tároláshoz, lásd a különböző mAB-hez mellékelt utasításokat. A Coulter mAB-nél regenerálás után 1:2 arányban desztillált vízzel hígítunk, és a preparátumot megfelelő edénybe helyezzük.

B) Lizálóoldat - (Becton-Dickinson, megrendelési szám 92-0002). A munkánál használt 1x-es oldat elkészítésénél a 10x-es törzsoldathoz hozzáadunk 90 ml desztillált vizet. Alapos összekeverés után szobahőmérsékleten tároljuk. Egy hét eltelte után az oldatot már nem használjuk.

C) Foszfátpufferes sóoldat (PBS) Ca⁺⁺ és Mg⁺⁺ nélkül (Gibco 310—4190AJ).

D) 0,5%-os paraformaldehidoldat. 2,5 g paraformaldehidet (Baker S-898-7) 500 ml PBS-ben (Ca⁺⁺ és Mg⁺⁺ nélkül) oldunk.

E) Coulter Cytotrol kontrollsejtek. A Cytotrol sejteket a készítmény előirata szerint élesztjük fel. Ezeket a sejteket naponta frissen kell előkészíteni.

Minőségi ellenőrzés

Minden egyes betegnél kell készíteni „leukogate” és negatív kontrollcsöveket. Minden egyes aznap alkalmazott mAB-hez kell használni Cytotrol kontrollt.

Eljárás

A kémcsöveken feltüntetjük a beteg nevét és a megfelelő mAB-t. Mikropipetta segítségével minden kémcsőbe bemérünk 20 μΙ megfelelő antitestet. Mikro5

HU 226 319 Β1 pipettával minden csőhöz hozzáadunk 100 μΙ teljes vérmintát. A csövek tartalmát vortexszel összekeverjük. A csöveket szobahőmérsékleten hagyjuk állni 15 percen át. Az ismétlődő pipettával (4-re állítva) 2 ml 1^χ lizálóoldatot adunk minden csőhöz. A csöveket szobahőmérsékleten tartjuk 10 percen át. A csöveket szérumfugán centrifugáljuk nagy fordulatszámmal 3 percen át vagy Sorvall TR6000 centrifugában percenként 3000 fordulatszámnál 5 percen keresztül. A felülúszót óvatosan leöntjük, hogy az üledék ne csússzon ki. A csövek száját a gézlapokon leitatjuk. Az üledéket vortexolással összetörjük (biztonsági védőlapot használva). Az ismétlő pipettával minden csőhöz hozzáadunk 1 ml 1 χ PBS-oldatot, és ismét vortexolunk védőlemez mögött. A csöveket szérumfugán centrifugáljuk nagy fordulatszámon 3 percen át vagy Sorvall TR6000 centrifugában percenként 3000 fordulatszámmal 5 percen át. A felülúszót óvatosan kiöntjük, hogy az üledék ne csússzon ki. A csövek száját gézlemezeken leitatjuk. Az üledéket vortexolással összetörjük (védőlemez). Ismétlő pipettával 0,5 ml 0,5%-os paraformaldehidoldatot adunk a csövekhez. Vortexolás után a csöveket parafilmmel fedjük, és hűtőszekrényben tartjuk az áramlásos sejtszámlálás elvégzéséig.

Mintaanallzis

Mindegyik csövet analizáljuk egy FACSCAN áramlásos citométeren Simulset Software-t használva a felületmarkerek megállapítására (FACSCAN Users’ Guide és Simulset Software Manuel). A komplett vérsejtszámot (CBC) használjuk fel az összes fehérvérsejt és a limfociták százalékos megoszlásának megállapításánál (győződjünk meg, hogy a CBC meghatározás mintavétele ugyanakkor történt, mint az FC-hez mintavétel).

2. eljárás

Telepképző sejtek

Hogy kiszámolhassuk a csontvelő működőképességét, elvégezzük a törzssejttesztet. A terápia megkezdése előtt tájékozódunk a telepképző képesség (Colony Forming Unit-CFU) állapotáról. Ez lehetővé teszi a gyógyszerezés pontos meghatározását a kialakult lehetséges toxicitásnak megfelelően. Ugyancsak lehetővé teszi a gyógyszerezés toxicitásának előrejelzését. Ha a törzssejteket különféle hatóanyagokkal kezeljük, a CFU karaktere segít meghatározni a sejtvonalak kialakulásának predominanciáját. Kimutatott, hogy az interferon meghosszabbítja a mielopoietikus differenciálódást; ezért a CFU növekszik. Ez bizonyítja az interferonnak a csontvelő gyógyulására kifejtett hatását, és megerősíti, hogy az interferonnak védőhatása van a csontvelőre.

A vérképzésben részt vevő különböző növekedési faktorokkal irányítható a különféle sejtvonalak telepképző képességének (CFU) kialakulása.

A minta kezelése

Minimálisan 4,0 ml, optimálisan 5,0 ml monocitasejtszuszpenzióra van szükség 1,0*10⁶ sejt/ml koncentrációnál.

4-6 50 ml-es Falcon-csőbe kimérünk 20-20 ml szöveti transzport közeget. A csöveket jégdara közé helyezzük. Az eljárás alatt arcvédőmaszkot, kesztyűt és köpenyt kell használni. 2500 egység, konzerválószert nem tartalmazó heparint adunk steril körülmények között a közeghez. Ezt legfeljebb 15 perccel azelőtt lehet elvégezni, hogy a csontvelőmintát megkapjuk. A cső tartalmát jól összekeverjük. Ha a csontvelőmintát fecskendővel adjuk a közeghez, kétszer óvatosan átöblítjük a közeggel a fecskendőt. A fecskendőt Sharps-tartályba dobjuk. A csövet kupakkal lezárjuk, és alaposan összekeverjük. A mintákat az alábbi adatokkal látjuk el: 1) a beteg teljes neve; 2) a mintavétel dátuma; 3) a mintavétel ideje;

4) a mintát átvevő technikus nevének kezdőbetűi. A mintákat a szállításhoz jégdara közé helyezzük.

Anyagok

Ficoll-Hypaque, kupakos kémcső, 15 ml-es, steril,

Falcon-csövek 50 ml-es, lamináris sterilfülke, UV fénnyel, centrifuga, steril, eldobható pipetták,

1,0 ml-es,

5,0 ml-es,

10,0 ml-es,

25,0 ml-es,

RPM11640 (1x) közeg,

Iscove-féle módosított Dulbecco médium (1 χ), fetális szarvasmarhaszérum (FBS), penicillin/sztreptomicin,

L-glutamin (100χ), nyomelemoldat (100^χ),

2-merkapto-etanol, inzulin/transzferin/nátrium-szelenit közegkiegészítő (ITS), üveg kémcső, 12-75 mm, tripánkék festék (0,4%), hemocitométer fedőlemezekkel, mikroszkóp (fény, inverz), szövettenyésztő edények - 25 cm²-es, szomatosztatin, 50 μg/ml (Sandoz-Sandostatin), interferon, 3x10⁶ U/ml (Roferon A - Hoffman LaRoche), interleukin-2 (Boehringer Mannheim GmbH, kát. sz.: 799068),

GM-CSF (Amgen, kát. sz.: 13050),

G-CSF (Amgen, kát. sz.: 10050),

Epogen (Amgen, kát. sz.: 06050),

PIXY 321 (Immunex), szén-dioxid-inkubátor, kézi számláló, jégdara.

Közeg és reagensek

A közegek elkészítése után a készítményt az alábbi adatokkal látjuk el: 1) a termék neve; 2) az elkészítés dátuma; 3) a felhasználhatóság befejező dátuma; 4) tárolási útmutatás; 5) a technikus nevének kezdőbetűi.

HU 226 319 Β1

10%-os RPM1 1640 (1*) G,G Fortified-közeg

Mennyiség Alkotórész
500,0 ml	RPMI 1640 (1 *) L-glutaminnal
50,0 ml	fetális szarvasmarhaszérum (hővel inaktivált)
5,0 ml	L-glutamin (100*), 200 mM
1,5 ml	peniciliin/sztreptomícin
2,0 ml	nyomelemkeverék (100*), liofilizált
0,5 ml	2-merkapto-etanol
5,0 ml	ITS közegkiegészitő, liofilizált, gamma-sugárral kezelt.

Valamennyi alkotórészt lamináris steril fülkében egyesítjük, és 0,22 μ-os szűrőn átszűrve sterilizáljuk. A szűréshez 60 μ-os előszűrőt alkalmazunk. A kész közeget megcfmkézzük, és 2-10 ’C hőmérsékleten tároljuk.

IMDM/RMP11640 (1 *) - szövettranszport közege

Mennyiség	Alkotórész
500,0 ml	RPM11640(1*)
500,0 ml	IMDM(1*)
100,0 ml	FBS
5,0 ml	peniciliin/sztreptomícin
10,0 ml	L-glutamin (100*)
5,0 ml	nyomelemkeverék (100*)
5,0 ml	nem esszenciás anionsavak (100*)
0,5 ml	MÉM vitaminok
0,5 ml	2-merkapto-etanol
5,0 ml	ITS.

Az alkotórészeket lamináris steril fülkében egyesítjük, és 0,22 μ-os szűrőn átszűrve sterilizáljuk. A szűrésnél 60 μ-os előszűrőt alkalmazunk. Az elkészített közeget megcímkézzük, és 2-10 °C hőmérsékleten tároljuk.

Interferon fiola Roferon A Interferont (Hoffman-LaRoche Inc.) (3 000 000 U) használunk fel. 1 ml interferont adva 39 ml RPMI (1*)-hez, 75 000 U/ml koncentrációjú oldatot kapunk. 40 db 1 ml-es kivétekre osztjuk az oldatot, és ezeket lefagyasztjuk. A telepképzési vizsgálatoknál a 25 cm²-es edényekben lévő 4,0 ml közeg és 0,5 ml sejtszuszpenzió keverékéhez hozzáadunk 1 ml 75 000 U/ml koncentrációjú oldatot.

lntedeukin-2

A felolvasztott interleukin-2-oldatból kiveszünk 5 ml-t, melynek milliliteré 200 egységet tartalmaz. A maradék interieukin-2-oldatot azonnal lefagyasztjuk. 5 ml RPMI (1*) közeget adunk 5 ml interleukin-2-oldathoz, 100 egység/ml koncentrációjú oldatot nyerve. 10 kémcsőhöz, mely 9-9 ml közeget tartalmaz, hozzáadunk 1-1 ml 100 egység/ml koncentrációjú interleukin-2-oldatot, 10 egység/ml koncentrációjú oldathoz jutva. Ezek az oldatot 4-8 °C hőmérsékleten tartva, 30 napon át stabilak. A telepképzési vizsgálatoknál a 25 cm²-es edényben lévő 4,5 ml közeg és 0,5 ml sejtszuszpenzió keverékéhez hozzáadunk 0,5 ml oldatot (vagy 5 egységet).

Szomatosztatin (STS)

A szomatosztatin 50 pg/ml és 100 pg/ml oldatokat tartalmazó fiolákban kapható a Sandoz Ltd.-től. Tárolás 4-8 ’C hőmérsékleten. A telepképzéses vizsgálatoknál a 25 cm²-es edényekben lévő 4,0 ml közeg és 0,5 ml sejtszuszpenzió keverékhez hozzáadunk 1,0 ml 50 pg/ml koncentrációjú STS-t. Ha 100 pg/ml koncentrációjú oldatunk van, 0,5 ml STS-t adunk a 4,5 ml közeghez.

GM-CSF

250 pl 50 000 egységet tartalmazó GMCSF-t 50 ml közegben hígítunk 1000 egység/ml koncentrációjú oldatot nyerve. Kupakkal ellátott steril csövekbe kimérünk 5000 egységet tartalmazó 5 ml-es adagokat. Kilenc kivétet sterilen lezárunk, és 4 °C hőmérsékleten tartunk. A tizedik 1000 egység/ml koncentrációjú oldatot (5000 egység összesen) a következőképpen dolgozzuk fel. 5 steril csőbe kimérünk 1-1 ml-t. Hozzáadunk 19 ml közeget, 50 egység/ml koncentrációjú oldatot nyerve. (Valamennyi cső összesen 1000 egységet tartalmaz). A csöveket megjelöljük: GM-CSF 50 egység/ml (összesen 1000 egység). 4 ilyen csövet sterilen lezárunk, és 4 ’C hőmérsékleten tartunk. Az 5. csövet „használatban jelzéssel látjuk el, és 4 ’C hőmérsékleten tartjuk. A telepképzéses vizsgálatoknál az 5,0 ml közeget és 0,5 ml sejtszuszpenziót tartalmazó 25 cm²-es edényekhez 50 pl (vagy 2,5 egység) oldatot adunk.

G-CSF

125 pl 50 000 egységet tartalmazó G-CSF-t 50 ml közegben hígítunk, 1200 egység/ml koncentrációjú oldatot nyerve. 5 ml-es kivéteket szétosztunk steril, kupakos csövekbe. A csöveket megjelöljük: G-CSF, 6000 egység (1200 egység/ml). Feltüntetjük a dátumot. 9 ilyen csövet sterilen lezárunk, és 4 ’C hőmérsékleten tartunk. A 10. cső tartalmát, mely 5 ml 1200 egység/ml koncentrációjú oldatból áll (összesen 6000 egység), 1 ml-ként 5 steril csőbe osztjuk el. 19 ml közeget adva hozzá, 60 egység/ml koncentrációjú (összesen 1200 egység) oldatokat kapunk. A csöveket megjelöljük; G-CSF, 60 egység/ml (összesen 1200 egység). Feltüntetjük a dátumot. 4 ilyen csövet sterilen lezárunk, és 4 ’C hőmérsékleten tartjuk. Az ötödik csövet „használatban” jelöléssel látjuk el, és 4 ’C hőmérsékleten tartjuk. A telepképzéses vizsgálatoknál az 5,0 ml közeget és 0,5 ml sejtszuszpenziót tartalmazó 25 cm²-es edényhez 50 pl (vagy 3 egység) oldatot adunk.

Epogen ml 2000 egység epogent tartalmazó oldathoz hozzáadunk 19 ml közeget, 20 ml 2000 egységet, vagyis milliliterenként 100 egységet tartalmazó oldatot nyerve. 2 ml kivéteket mérünk kriovial csövekbe. Címkézés: epogen, 100 egység/ml és a dátum. 4 ’C hőmérsékleten tároljuk a csöveket. A telepképzéses vizsgálatoknál az 5 ml közeget és 0,5 ml sejtszuszpenziót tartalmazó 25 cm²-es edényhez 50 pl (vagy 5 egység) epogenoldatot adunk.

HU 226 319 Β1

PIXY 321 - GM-CSF/IL-3 ml-es steril kupakos csövekben 1 ml Pixy 321 oldatot (legyünk biztosak, hogy kvantitative bevittük az anyagot, a fiolát átöblítve) meghígítunk 9 ml 10%-os szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA), és az oldatot alaposan összekeverjük, fgy 1,0*10® egység/ml koncentrációjú oldatot nyerünk. 9 kriovialba kimérünk 1-1 ml 1*10⁶ egység/ml koncentrációjú oldatot. Címkézés: név, koncentráció, felhasználási határidő. Tárolás -70 °C hőmérsékleten. A megmaradt 1 ml-hez hozzáadunk 9 ml 10%-os BAS-t, és alaposan összekeverjük. Az 1,0*10® egység/ml koncentrációjú oldatból 1-1 ml-t szétmérünk 9 kriovialba. Címkézés: név, koncentráció és a felhasználhatósági határidő. Tárolás -70 °C hőmérsékleten. A maradék 1 ml oldathoz hozzáadunk 9 ml 10%-os BSA-t, és alaposan összekeverjük. A nyert 1*10⁴ egység/ml koncentrációjú oldatból 1-1 ml-t szétmérünk 9 kriovialba. Címkézés: név, koncentráció és a felhasználhatóság határideje. Tárolás -70 °C hőmérsékleten. A maradék 1 ml oldathoz hozzáadunk 9 ml 10%-os BSA-t, és alaposan összekeverjük. 10 kriovialba szétmérünk az oldatból 1-1 ml-t. Címkézés: név, „alkalmazott Pixy”, koncentráció és a felhasználhatóság határideje. Tárolás -70 °C hőmérsékleten. Egy cső tartalmát felolvasztjuk, és 4 °C hőmérsékleten tartva ezt használjuk. A csövet „használatban” jelzéssel látjuk el. A telepképzéses vizsgálatoknál 50 μΙ (vagy 2,5 egység) oldatot adunk a 25 cm²-es edényhez.

Eljárás

Minta kezelése

Steril pipettával 20-25 ml histopaquet mérünk ki megfelelő számú 50 ml-es, kupakos steril kónikus csövekbe. Egy másik steril pipettával 1:1 arányban a mintát óvatosan rárétegezzük a 45°-os szögbe beállított histopaquera. Hűthető centrifugában 4 °C hőmérsékleten centrifugálunk percenként 1600 fordulatszámmal 20 percen át (fékezés 2-állásban). A felülúszót eltávolítjuk és eldobjuk. A sejtes köztes réteget előre megjelölt csövekben lévő RPMI (1*) közegbe visszük. A sejteket kétszer mossuk RPMI (1*) közeggel, 5 percen át centrifugáljuk percenkénti 1600 fordulatszámon, 2-es állásban fékezve. A felülúszót eltávolítjuk és eldobjuk. A sejteket 5 ml RPMI (1*) közegben szuszpendáljuk.

Sejtkoncentráció kiszámítása

1) Megállapítjuk az életképes sejtek számát az alábbi egyenlet felhasználásával:

egy mezőben lévő sejt/ml = életképes sejtek száma híg ítási hemocitométer

X X faktor faktor

Példa a számolásra

A mezőben lévő életképes sejtek átlagos száma: 10 20, hígítási faktor: 10, mi11iliterenkénti sejtszám=20* 10*10⁴=2* 10⁶;

2) az életképes sejtek százalékát az alábbi képlettel számoljuk ki:

életképes sejtek _é|_etképes sejtek száma százaléka= -*100 teljes sejtszám;

3) a kívánt sejtkoncentráció (ebben a vizsgálatban 1*10® sejt/ml) eléréséhez szükséges hozzáadandó kö20 zegtérfogat kiszámítása az alábbi képlet felhasználásával történik:

V^WzCz például:

V^IOml

C₁=2*10® sejt/ml C₂=1*10® sejt/ml

^ϋυ 10 ml*2* 10® sejt/ml

1*10® sejt/ml ²

V₂=20 ml ml-10 ml=10 ml a hozzáadandó közeg térfogata, 35 hogy a nyert szuszpenzió sejtkoncentrációja 1*10® sejt/ml legyen;

4) az edény előkészítése:

db 25 cm²-es szövettenyésztő edényt ellátunk a következő jelölésekkel: 1) a beteg neve; 2) a vizsgálat száma; 3) dátum; 4) a növekedési faktor vagy BRM megjelölése;

5) az egyes 25 cm²-es edényekhez az I. táblázat összeállítása szerint hozzáadjuk a csontvelősejteket (BMC), a növekedési faktort vagy a biológiai választ módosító anyagot (biological response modifier, BRM) és a közeget.

Sejtszámlálés

12*75 mm-es üveg kémcsőbe egyesítünk:

0,1 ml jól összekevert sejtszuszpenziót,

0,2 ml 0,4% tripánkék festékoldatot,

0,7 ml közeget.

Ez 1:10 arányú hígítást jelent a sejtekre nézve. A szuszpenziót jól összekeverjük, és rávisszük a hemocitométer egyik kamrájára. Fénymikroszkóp alatt megszámoljuk az életképes sejteket (melyek nem adszorbeálták a tripánkék festéket) a négy 1 mm²-es négyzetes sarokmezőben.

Megszámoljuk az 1 mm²-es sarokmezőkben a teljes sejtszámot is (festett és nem festett).

/. táblázat

	BMC	Növekedési faktor vagy BRM	Közeg (M)
BMC+M (kontroll)	0,5 ml	-	5,0 ml
BMC+IFN+M	0,5 ml	1,0 ml	4,0 ml
BMC+IL-2+M	0,5 ml	0,5 ml	4,5 ml
BMC+STS+M	0,5 ml	1,0 ml	4,0 ml
BMC+GM-CSF+M	0,5 ml	50 μΙ	5,0 ml

HU 226 319 Β1

1. táblázat (folytatás)

	BMC	Növekedési faktor vagy BRM	Közeg (Μ)
BMC+G-CSF+M	0,5 ml	50 μΙ	5,0 ml
BMC+EPO+M	0,5 ml	50 μΙ	5,0 ml
BMC+PIXY+M	0,5 ml	50 μΙ	5,0 ml

megjegyzés: a végtérfogat minden edényben 5,5 ml.

6) A tenyészedényeket 37 °C hőmérsékleten tartjuk 5% szén-dioxidos inkubátorban. Az edényeket átnézzük és a szükségnek megfelelően ellátjuk tápközeggel, ügyelve arra, hogy ugyanannál a vizsgálatnál minden edény azonos bánásmódban részesüljön.

Az adatok leolvasása és feljegyzése

A telepképzéses vizsgálat 7., 14. és 21. napján inverz mikroszkóp alatt minden edényt megvizsgálunk a telepképződés szempontjából. Telepnek tekintjük, ha 40 vagy több sejt összetapad az edény fenekén. A lebegő telepeket nem vesszük figyelembe a számlálásnál. Átvizsgáljuk a teljes edényt, és minden edénynél feljegyezzük a telepek össz-számát.

Ha a 21. nap végére nincs növekedés, feljegyezzük: „növekedés nincs”, és további 7 napon át megtartjuk még az edényt.

3. eljárás

Immunmodulátor vizsgálat

A kutatók célja, hogy megjósolják egy rákterápia klinikai vagy in vitro válaszát, és in vitro vizsgálatok segítségével határozzák meg a beteg optimális kezelési módját. Az immunmodulátor vizsgálat egy in vitro eljárás annak megállapítására, hogyan fog reagálni a beteg bizonyos biológiai válasz módosítókra. További szükséges vizsgálatot jelent annak megállapítása, hogy a beteg széruma tartalmazza-e eredendően azokat a faktorokat, melyek a tumorsejtek növekedését elfojtják vagy aktiválják.

Ebben az eljárásban a beteg szérumát és/vagy teljes vérmintáját (WBC) különféle biológiai választ módosító anyagokkal (BRM) hozzuk össze, és együtt tenyésztjük a tumorsejtvonallal. Meghatározzuk a tumorsejtek növekedésének százalékos gátoltságát vagy serkentettségét. Ezek az információk elegendőek az onkológus számára, hogy az egyes betegeknél meghatározhassa a megfelelő és megtervezendő kezelési eljárást.

Mintavétel

Valamennyi mintán feltüntetjük a beteg nevét, a mintavétel dátumát és idejét és a mintát vevő nevének kezdőbetűit. Minden egyes mintánál egy saját vizsgálati számot használunk, ami végigköveti a mintát a vizsgálatok során.

Anyagok

1) teljes vér (WB) - 10 ml;

2) szérum - 3 ml;

3) csontvelő (BM) - egy csapolásból származó BM mintát 25 ml transzportközegbe viszünk. Az optimális térfogat 10*10® sejt/ml koncentrációnál: 3 ml;

4) plazmaferézises minta - 3 ml.

Az immunmodulátor vizsgálatokhoz a teljes vérmintára és a szérummintára is szükség van. Ha azonban csak az egyik minta áll rendelkezésre, egy részleges immunmodulátor vizsgálat azzal is elvégezhető.

A nővér vagy vérmintavevő azonosítja a beteget (ellenőrizve a csuklópántot és azonosítva a nevet).

A vérmintát aszeptikus körülmények között gyűjtjük. A vérminta gyűjtése és kezelése alatt kesztyűt és köpenyt kell viselni, és be kell tartani az „általános biztonsági előírásokat.

1) Teljes vérminta

a) Gyűjtése: 10 ml-es piros jelű „Vacutainer”-csőbe bemérünk 2500 egység tartósítószer nélküli heparint (Calciparine). Elvégezzük a vénapunktúrát, és levesszük a beteg vérmintáját a csőbe. A csőre feljegyezzük a beteg nevét és a vérvétel dátumát és időpontját. Néhányszor megdöntve a csövet összekeverjük a mintát az antikoagulánssal. A mononukleáris sejtek rétegének sűrűséggradienses elválasztásáig (lásd:

4. eljárás B-2 pontjánál) a csöveket hűtőszekrényben tartjuk.

Minimálisan szükséges teljes vérminta: 7 ml.

Optimális teljes vérminta: 10 ml.

b) Elfogadhatatlan minta - az olvadt, nagyrészt hemolizálódott vagy fagyott minták elfogadhatatlanok.

c) A minta visszautasítása - ha valamelyik ismérv nincs meg, az elfogadhatatlan minta megvizsgálható, ha szükséges.

2) Szérum

a) Mintagyűjtés: 10 ml vért veszünk egy piros jelű Vacutainer-csőbe. A mintát 25 °C hőmérsékleten centrifugáljuk 10 percen át, percenként 2000 fordulatszámmal. A vizsgálatig a csöveket hűtőszekrényben tartjuk. Aszeptikus körülmények között leszívjuk a szérumot, és külön csőbe tesszük.

Minimálisan szükséges szérummennyiség: 3 ml.

Optimális szérummennyiség: 5 ml.

b) Elfogadhatatlan minta - túl sok fibrinolvadékkal a minta alkalmatlan.

c) A minta visszautasítása - ha bármelyik kritérium hiányzik, az elfogadhatatlan minta megvizsgálható, ha szükséges.

3) Plazmaferézis

a) Mintagyűjtés - 10 ml-es piros jelű Vacutainer-csőbe bemérünk 2500 egység tartósítószer nélküli heparint (Calciparine). A plazmaferézis kezdeténél mintát veszünk a plazmagyűjtő tartályból. A csövet 1-es számmal látjuk el. A vizsgálatig a csövet hűtőszekrényben tartjuk.

Minimálisan szükséges plazmamennyiség: 3 ml.

Optimális plazmamennyiség: 5 ml.

HU 226 319 Β1

b) Elfogadhatatlan minta - túl sok fibrinalvadékot tartalmazó minta vizsgálatra alkalmatlan.

c) Minta elutasítása - ha bármelyik kritérium hiányzik, az elfogadhatatlan minta megvizsgálható, ha szükséges.

4) Csontvelő

a) Mintagyűjtés - a csontvelőminta feldolgozása előtt nem több, mint 15 perccel 2500 egység Calciparine-t adunk aszeptikus körülmények között 25 ml szövettranszport közeghez. Aszeptikus körülmények között a csontvelőmintát gyorsan hozzáadjuk a transzportközeghez, és alaposan összekeverjük. Amíg a mononukleáris sejtek rétegét sűrűséggrádiens eljárással el nem választjuk (lásd: IV. rész, B-2 szakasz), a csöveket hűtőszekrényben tartjuk.

b) Elfogadhatatlan minta - a nagyrészt megalvadt minta, a nagyrészt hemolizált minta vagy a fagyott minta elfogadhatatlan.

c) A minta elutasítása - ha bármelyik kritérium hiányzik, az elfogadhatatlan minta vizsgálható, ha szükséges.

Anyagok

Az eljáráshoz az alábbi anyagok, eszközök szükségesek:

lamináris steril fülke,

Bacto agar, mérleg, bemérőpapír, bemérési eszközök, kupakos edények (steril) (250 ml, 500 ml), desztillált víz (steril), mikrohullámú kályha, autokláv,

RPM11640 közeg, gentamicin, eldobható pipetták (steril) (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, ml), glutamin, nyomelemek,

2-merkapto-etanol, Dulbecco PBS-sel,

ITS-oldat, fetális szarvasmarhaszérum, kémcső (kupakos, 5 ml, 10 ml),

Petri-csésze (steril; normál 100*15 mm; hálózatos, 35 mm),

Falcon-cső, kónikus cső (steril, műanyag), tripánkék festék (0,4%), hemocitométer fedőlemezekkel, mikroszkóp (szövettenyészeti inverz mikroszkóp, fénymikroszkóp), pH-papír (szűk spektrumú), mérőhenger (50 ml, 100 ml),

Histopaque 1077, vízfürdő, leszívatásos pipetta, hűthető centrifuga, szén-dioxidos inkubátor, biológiai választ módosító anyagok (BRM; rekombináns interferon-a-2a, rekombináns interleukin-2, interferon-α monoklonális antitestje),

Vortex keverő, hűtőszekrény (2-8 °C), kézi számláló,

Sharps tartály, csepegtetőlabda,

Pasteur-pipetta,

-70 °C hőmérsékletű hűtő, felületi fertőtlenítőszer, mikroüvegedény fertőtlenítő - Cleanser Beaker (250 ml),

Betadin fertőtlenítőoldat, fecskendők (1 cm³) (steril), tűk (különböző kaliberű),

Vacutainer-csövek (piros jelű és „tigris-tetős”).

Közegek és reagensek elkészítése

Agar

Alsó réteg (2,5%-os): 2,50 g Bacto agart kimérünk, és 100 ml-es kupakos edénybe teszünk. Hozzáadunk 100 ml desztillált vizet. Gyengéden összekeverjük.

Felső réteg (1,5%-os): 1,50 g Bacto agart kimérünk, és 100 ml-es kupakos edénybe teszünk. Hozzáadunk 100 ml desztillált vizet. Gyengéden összekeverjük. Mindkét edényt laza kupakkal a mikrohullámú kályhába helyezzük. 60 másodpercen át melegítjük maximális erővel, minden 20. másodpercben megkeverve. Forrás elkerülendő! A kész agaraidat tiszta. Ha az oldat túlmelegedik, nem használjuk fel, hanem újat készítünk. Autokláv indikátor szalaggal lazán lezárjuk a kupakot, és mindkét oldatot 20 percen át autoklávozzuk 22 psi nyomáson és 120-130 °C hőmérsékleten. Mindkét edényt vízfürdőbe tesszük a steril fülkébe. A vízfürdőt egész idő alatt 45-50 ’C hőmérsékleten kell tartani. Az agamak felhasználás előtt 50 °C hőmérsékletre kell hűlnie. Felhasználás előtt az agaroldatot jól megkeverjük.

Közeg

Az egyes közegeket elkészítésük után az alábbi címkézéssel látjuk el: 1) termék neve; 2) elkészítés dátuma; 3) a felhasználhatósági határ dátuma; 4) tárolási előírások; 5) a technikus nevének kezdőbetűi.

10% RPM11640 ff*J G,G Fortified-közeg Mennyiség Alkotórész

500,0 ml	RPMI 1640 (1*) glutaminnal
50,0 ml	fetális szarvasmarhaszérum, hővel inaktivált
5,0 ml	L-glutamin (100*) 200 mM
2,5 ml	penicillin/sztreptomicin
0,5 ml	2-merkapto-etanol
5,0 ml	inzulin/transzferin/nátrium-szelenit közegkiegészítő, liofilizált, gamma-sugárzással kezelt.

Steril fülkében egyesítjük valamennyi alkotórészt. 0,22 μ-os cellulóz-acetát-membránon átszűrve

HU 226 319 Β1 sterilizálunk. A szűrésnél 60 μ-os előszűrőt alkalmazunk. A kész közeget 2-10 °C hőmérsékleten tartjuk.

10%-os RPM11640 (2*) G,G Fortified-közeg Anyag Alkotórész

500,0 ml RPMI 1640 (2*) sejttenyészetközeg L-glutamin, por alakjában (egy csomag por alakú közeget 500,0 ml steril desztillált vízben oldunk)

50,0 ml fetális szarvasmarhaszérum, hővel inaktivált

5,0 ml L-glutamin (100*) 200 mM

2,5 ml penicillin/sztreptomicin

2,0 ml nyomelemkeverék (100*) liofilizált

0,5 ml 2-merkapto-etanol

5,0 ml inzulin/transzferin/nátrium-szelenit, közegkiegészítő, liofilizált, gamma-sugárzással kezelt.

Lamináris steril fülkében kimérünk 450 ml steril desztillált vizet egy 500 ml-es steril lombikba. Gyenge kevergetés közben hozzáadjuk a közegport. A közegpor tartóedényét átöblítjük, hogy eltávolítsuk a benne maradt anyagot is. 1,0 g nátrium-hidrogén-karbonátot adunk a közeghez. Steril desztillált vízzel 500 ml-re hígítunk. A közeg kémhatását 0,2-0,3 pH-értékkel alacsonyabbra állítjuk be a végső kívánt pH-értéknél (a pH-érték a szűrés alatt általában 0,1-0,3 értékkel növekszik). A kémhatás beállításához 1 n nátriumhidroxid-oldatot vagy 1 n sósavat használunk. Miután a kémhatást beállítottuk, szűrésig az edényt lezárva tartjuk. 0,22 μ-os cellulóz-acetátot membránon szűrve sterilizálunk. Szűrésnél 60 μ-os előszűrőt alkalmazunk. A kész közeget 2-10 °C hőmérsékleten tartjuk.

Az alsó rétegként használt közeg törzsoldata Mennyiség Alkotórész 125 ml fetális szarvasmarhaszérum

125 ml 2*G,G Fortified-oldat

250 ml 1*G,G Fortified-oldat.

Az alkotórészeket összekeverjük, és 2-10 °C hőmérsékleten tároljuk.

Hatóanyag-készítmények

A hatóanyagokból a vizsgálatokhoz szükséges koncentrációjú oldatokat készítünk. Valamennyi hígítás „RPMI 1640 1*G,G Fortified” közeggel készül.

Az IFN a-2a elkészítéséhez egy 10 ml-es kupakos csőben 0,1 ml Roferon-t (3 000 000 egység/ml) összekeverünk 9,9 ml 1*G,G közeggel. A csövet címkézzük a hatóanyag nevével, az elkészítés és a felhasználhatóság (az elkészítéstől számított egy hét) dátumával, a koncentráció oldatával (30 000 U/ml) és az elkészítő nevének kezdőbetűivel.

IL-2-készítmény 10 ml-es kupakos csőben; az IL-2-törzsoldat aliquotot (10 egység/ml) kivesszük a hűtőszekrényből. Ha ez nem áll rendelkezésünkre, elkészítjük az előírás alapján. A törzsoldatot tartalmazó csöveket -48 °C hőmérsékletű hűtőben tartjuk. A vizsgálat dózisa: 0,1 ml, ami 1 egység interleukin-2-t tartalmaz. Tehát 1 egység interleukin-2-t használunk az immunmodulátor vizsgálatoknál. Ebben a közegben az interleukin-2 30 napon át eltartható 2-8 °C hőmérsékleten.

LI-8-ABIFN (az IFN a-2A-val szembeni mAB) készítmény 10 ml-es kupakos csőben: a törzsoldat aliquotot (1000 egység/ml) kivesszük a hűtőből. A vizsgálatokhoz használt adag: 0,1 ml, így érjük el a 100 egység/ml ABIFN koncentrációt.

Eljárás

Alsó réteg (2,5%-os agar)

Az „alsó réteg törzsoldatból 8 ml-eket szétosztunk kellő számú steril, 15 ml-es, kupakos csövekbe (körülbelül 8 lemez készíthető 1 csőből). Lekupakolva tartjuk szobahőmérsékleten a csöveket, amíg a lemezeket el nem készítjük vagy 2-8 °C hőmérsékleten, ha a lemezek elkészítése másnap történik. Felhasználás előtt szobahőmérsékletre melegítjük. Ha az agar az alsó réteg lemezek elkészítéséhez kész, gyorsan dolgozunk, hogy az agar ne szilárduljon meg idő előtt. Steril 10 ml-es pipettával 2,0 ml 2,5%-os agart bemérünk egy 15,0 ml-es műanyag csőbe, ami 8 ml „alsó réteg közeget” tartalmaz, és kétszer összekeverjük felszíva és visszaengedve az oldatot. 9,0 ml keveréket felszívunk, és 1,0 ml-t adunk mindegyik hálózatos, 35 mm-es csészébe. Megforgatjuk a csészét, hogy az oldat befedje a fenekét. Vigyázunk rá, hogy ne keletkezzen buborék. Egyszerre 8 lemezt készítünk el, hogy az agar ne szilárduljon meg mielőtt kilemezeljük. A lemezeket egy sík felületen hagyjuk nyugalomban állni, hogy az agar megdermedjen. Azokat a lemezeket, ahol az agar eloszlása nem egyenletes, nem használjuk fel. Ha a lemezeket néhány nap múlva használjuk fel, szobahőmérsékleten tároljuk, ha másnap felhasználjuk, 37 °C hőmérsékletű szén-dioxid-inkubátorban tartjuk.

Sejtvonalak elkészítése

A vizsgálatokhoz általában az L929 sejteket használjuk, de vastagbél-, prosztata- vagy petefészeksejtek is alkalmazhatók. A kívánt sejtvonal folyékony tenyészetét mikroszkóp alatt megvizsgáljuk, és annak alapján, hogy a sejtréteg mennyire összefüggő, kiválasztjuk azt, amelyiket fel kívánjuk használni. Pipettával eltávolítjuk a felülúszót és eldobjuk. 5 ml tripszinoldatot adunk a sejtekhez, kezelés után 2 ml-t eltávolítunk. Egy percig inkubáljuk az edényeket a tripszinnel. Tenyerünkkel ütögetjük az edényt, hogy a sejtek leváljanak. 7 ml L929 sejtközeget adunk az edényhez, hogy a reakciót leállítsuk. A sejteket 50 ml-es kónikus csőbe visszük át, és további közeget adunk hozzá (20 ml-ig). A csövet 5 percen át centrifugáljuk percenkénti 1600-as fordulatszámmal, fékezés 2-es állásban. A felülúszót eltávolítjuk, az üledéket az L929 sejt közegében szuszpendáljuk. A sejteket újracentrifugáljuk 1600 fordulatszámmal 5 percen át, 2-es állásban fékezve. A felülúszót eltávolítjuk, és az üledéket a megfelelő közegben szuszpendáljuk.

HU 226 319 Β1

A betegből származó sejtek kezelése (teljes vérből

Calciparine-nal vagy csontvelőminta Calciparinenal)

Megfelelő méretű (a minta térfogatától függően) kupakos műanyag csöveket ellátunk a beteg nevével, és megfelelő térfogatú histopaque-t mérünk be. Azonos mennyiségű histopaque-t és teljes vérmintát használunk, azaz ha 8 ml vérmintán van, a 15 ml-es kupakos csövek mindegyikébe 4 ml histopaque-t és 4 ml teljes vérmintát mérünk. Ha 75 ml csontvelőmintát kaptunk, 10 négy 50 ml-es kónikus csőbe 18,75 ml histopaque-t és 18,75 ml BM mintát mérünk. A teljes vért nagyon lassan rétegezzük a 45°-os szögben tartott histopaque-ra. 4 °C hőmérsékleten centrifugálunk percenkénti 1600 fordulatszámmal, 2-es állásban fékezve. A felülúszót eltávo- 15 Htjuk és eldobjuk. A sejtes interfázist eltávolítjuk, és egy másik csőbe visszük át, ami 10 ml RPMI 1*G,G közeget tartalmaz. A sejteket gyorsan összekeverjük a közeggel, mert a histopaque toxikus a sejtekre, ha hosszabb Ideig hat rájuk. A sejteket kétszer mossuk 10 ml RPMI 1*G,G közeggel. 5 percen át centrifugáljuk 1600 percenkénti fordulatszámon, 2-es állásban fékezve. A felülúszót eltávolítjuk és eldobjuk. A sejteket 5 ml RPMI 1*G,G közegben szuszpendáljuk.

Sejtszámlálás

12*75 mm-es üveg kémcsőbe bemérünk 0,7 ml közeget, 0,2 ml tripánkék oldatot és 0,1 ml sejtszuszpenziót; így tízszeres hígítást érünk el. A kémcső tartalmát jól összekeverjük, és a sejtszuszpenziót a hemocito- 30 méter számlálókamrájába visszük. Fénymikroszkóp alatt megszámoljuk az élő sejteket (melyek nem adszorbeálták a tripánkék festéket) a négy 1 mm²-es sarokmezőben. A sejtvonalak és a betegből nyert sejtek koncentrációja az immunomodulátor vizsgálatokhoz a 35 következő (sejt/ml értékben):

L-sejtek 5*10⁵, vastagbél 1 *10⁵, prosztata 5*10⁴, mell 5*10⁴, petefészek 2*10⁴, betegből származó sejtek 1 *10⁶.

A négy, 1 mm²-es sarki mezőben megállapítjuk a teljes sejtszámot (festett és testetlen sejtek).

A sejtszám kiszámolásához az alábbi képletet 45 használjuk: sejt/ml=átlagos sejtszám*hígítási faktor*hemocitométer faktor.

Például:

A betegből származó sejtek 10 ml közegben vannak. 0,1 ml sejtszuszpenziót adunk 0,2 ml tripánkék oldathoz és 0,7 ml közeghez. Négy 1 mm²-es mező5 ben 80 sejtet számolunk meg, mezőnként az átlag: 20 sejt.

20*10 (hígítási faktor)* 10⁴=2* 10⁶ sejt/ml.

Az élő sejtek százalékos arányát az alábbi képlettel számoljuk ki:

életképes sejtek száma életképes sejtek %= -*100 összes sejt száma.

A kellő sejtkoncentráció beállításához szükséges hozzáadandó hígító térfogat kiszámításához az alábbi képletet használjuk.

például:

VflOml Ci=2*10⁶ sejt/ml 20 C₂=1 *10® sejt/ml

C₂ ml 2*10⁶ sejt/ml=V? V₂=20 ml 25 1*10⁶ sejt/ml ml-10 ml=10 ml, vagyis 10 ml közeget kell adni a 10 ml eredeti sejtszuszpenzióhoz, hogy a kívánt 1*10® sejt/ml koncentráció álljon be.

A megfelelő számú lemezt az alábbi adatokkal címkézzük fel: 1) a minta száma; 2) a beteg neve; 3) a biológiai választ módosító anyag (BRM) neve; 4) az összeállítás dátuma.

A felső réteg elkészítése

All. táblázatban feltüntetett módon a kémcsőtartóba 15 ml-es steril, kupakos kémcsöveket rendezünk el és címkézünk meg. A csövek az egyes kontrollokat, a beteg szérumát (PT szérum), illetve a beteg teljes vérmintáját (PT. WBC) tartalmazzák. Ügyeljünk rá, hogy a 40 sejtkontrollt és az egyes BRM kontrolijait is megvizsgáljuk. A sejtkontroll mindent tartalmaz, amit a többi, kivéve a BRM-t. Minden egyes vizsgált sejtvonalra kontrollcsövek külön készletét kell összeállítani (vastagbél, L-sejt, prosztata). A felső réteg törzsoldatot mérjük az egyes csövekbe, majd hozzáadjuk a BRM, ABIFN, sejtvonal-szuszpenzió és -szérum vagy teljes vérminta megfelelő mennyiségét.

II. táblázat

A felső réteg összeállítása (valamennyi ml-ben)

	Felső réteg	BMR	ABIFN	PTWBC vagy szérum	L-sejtek	Agar 1,5%	össztér- fogat
Sejtkontroll	2,1	-	-	-	0,3	0,6	3,0 ml
IFN kontroll	2,0	0,1	-	-	0,3	0,6	3,0 ml
IL—2 kontroll	2,0	0,1	-	-	0,3	0,6	3,0 ml
ABIFN kontroll	2,0	-	0,1	-	0,3	0,6	3,0 ml
PT. szérum	1,9	-	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml

HU 226 319 Β1

II. táblázat (folytatás)

	Felső réteg	BMR	ABIFN	PTWBC vagy szérum	L-sejtek	Agar 1,5%	össztér- fogat
PT. szérum/ABIFN	1,8	-	0,1	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. szérum/IFN	1,8	o,1	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. szérum/IL-2	1,8	0,1	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. WBC/szérum	1,9	-	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. WBC/szérum/ABIF	1,6	-	o,1	0,2 0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. WBC/IFN	1,8	0,1	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. WBC/IFN szérum	1,6	0,1	-	0,2 0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. WBC/IL-2	1,8	0,1	-	0,2	0,3	0,6	3,0 ml
PT. WBC/IL-2/szérum	1,6	0,1	-	0,2 0,2	0,3	0,6	3,0 ml

Az agar kivételével valamennyi alkotórészt bemérjük a megfelelő csőbe. A csővel végezni kell, mielőtt a következő csővel foglalkoznánk. 2 ml-es pipettával 0,6 ml 1,5%-os agart mérünk egyszerre a 25 csövekbe, kezdve az 1-es számú csővel. A cső tartalmát kétszeri felszívódással és visszaengedéssel összekeverjük. Felszívunk 2,2 ml oldatot és 1,0 ml-t adunk az egyes hálózatos Petri-csészékben lévő lemezekre (a másik lemez tetejére), ügyelve arra, hogy buborék ne keletkezzen az agarban. Óvatosan körkörös mozgással egyenletesen elosztjuk a rávitt anyagot. Hagyjuk az agart megdermedni, majd körülbelül 0,5 ml desztillált vizet adunk hozzá, hogy a lemezt nedvesen tartsuk, és a csészét behelyezzük egy nagy, megcímkézett Petri-csészébe. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben.

Eredmények értékelése nap elteltével a lemezeket az alábbiak szerint értékeljük. Megvizsgáljuk a lemezeket a telepek és aggregátumok keletkezése szempontjából. Ha vannak ilyenek, megszámoljuk, hogy egy hálózati mezőben hány aggregátum vagy telep van a rétegben (aggregátum, ha 4-20 sejt van egy halmazban, telep, ha 20 sejtnél több). Ha nincs telep vagy aggregátum, 4 mezőben megszámoljuk az egyedülálló sejteket és átlagoljuk az értékeket. Az átlagot megszorozzuk 15*13,36 szorzattal (15: a mezők száma a középső sorban; 13,36 a lemez területe). A lemezek az 5., 6. vagy 8 napon értékelhetők.

4. eljárás

Humán interferon vizsgálat

Az interferonok citokinok, melyek képesek a vírusok növekedését gátolni, és megvédik a sejteket a vírus citopatikus hatásával szemben. Az interferonok immunregulációs hatásának is klinikai jelentősége van.

A hatás a természetes „killer” (NK) limfociták aktivitá30 sának fokozásában, a hisztokompatibilitási antigének növekedésében, a monocita/makrofágok aktiválásában, a B-sejt működésének aktiválásában nyilvánul meg. Az első természetes interferont Isaac és Linderman fedezték fel 1975-ben, és 1986-ban regisztrálta az FDA a rekombináns interferon-a-2-t, egy új fázist nyitva ezzel a bioterápiában. A vizsgálatok célja, hogy meghatározzuk a betegek szérumában az interferonszintet nemzetközi egység/ml értékben kifejezve. A szérumminták és kontrollok humán interferon hatóerejének meghatározásához WISH-sejteket használunk, amiket a vezikuláris sztomatitisz vírus citopatikus hatásának teszünk ki.

Minták

A mintákat a következő adatokkal címkézzük fel: 1) a beteg neve; 2) a mintavétel dátuma; 3) a mintavétel időpontja; 4) a mintát vevő nevének kezdőbetűi; 5) a vizsgálat neve.

Szérum optimális mennyiség: 3,0 ml, minimális mennyiség: 1,0 ml.

A mintát aszeptikus körülmények között gyűjtjük egy „tigris” tetejű Vacutainer-csőbe, hagyjuk megalvadni, majd szobahőmérsékleten centrifugálunk 10 percen át percenkénti 2000 fordulatszámmal. A szérumot steril műanyag csőbe öntjük, ellátjuk a megfelelő jelöléssel, és a vizsgálatig lefagyasztva tartjuk.

Plazmaferézis optimális mennyiség: 3,0 ml, minimális mennyiség: 1,0 ml.

A mintát steril körülmények között gyűjtjük a plazmaferézises eljárás során nyert plazmából egy 10 ml-es piros jelű Vacutainer-csőbe. A plazmaferézismintát tartalmazó csőhöz hozzáadunk 2500 egység Calciporine-t, és alaposan összekeverjük. A fenti ada13

HU 226 319 Β1 tokon kívül a mintát még ellátjuk a plazmazacskó számával, melyből nyertük. A mintát tovább öntjük egy steril műanyag csőbe, kupakkal lezárjuk, felcímkézzük és a vizsgálatig lefagyasztva tartjuk.

Eszközök lamináris steril fülke UV-lámpával, mélyhűtő, -70 °C, hűtőszekrény, 2-8 °C, autokláv, analitikai mérleg, hűthető centrifuga,

CO₂-inkubátor, spektrofotométer (Bio-Rad 96 lyukú lemezleolvasó 540 mm-es szűrővel), lyukú mikrotiterlemez - steril, lapos fenekű, fedeles,

Falcon 3872, pipettor, motorizált, mikropipetták,

Costar octapettes - 50 μΙ, 100 μΙ, 200 μΙ, Wheaton többcsatornás pipetta, 50-200 μΙ sorozat,

MLA, 40 μΙ, steril, eldobható eszközök:

pipetták, 1 ml, 5 ml, 10 ml és 25 ml, pipettacsúcsok, Wheaton 851247, műanyag vályúk, géz, kriovialok (cryovial), ml-es, kónikus csövek kupakkal, kémcsövek, tenyészedények (75 cm²-es, 150 cm²-es),

Kimtex törlők, veszélyes hulladékgyűjtő edény és zacskók, rozsdamentes acélkádak tetővel.

Anyagok

Basal Médium Eagle 1 *(BME), 500 ml, Gibco kát. sz.: 320-101AJ, fetális szarvasmarhaszérum (FBS) 100 ml, Hyclone kát. sz.: A-1111-D,

L-glutamin, kát. sz.: 320-5030AG,

Hepes-puffer (1M), 100 ml Gibco kát. sz.:

380-5630AG, penicillin/sztreptomicin,

WISH-sejtek (humán amnion) ATCC 25-CCI, vezikuláris sztomatítisz vírus, ATCC, humán interferon (a) NIAID kát. sz.: Ga23-530, gamma-interferon kontroll, neutrálvörös festék, Sigma N-2880, foszfátpufferes sóoldat (PBS),

PBS Ca²⁺ és Mg²⁺ nélkül, pH=7,4, Gibco kát. sz.: 310-4190AJ,

PBS Ca²⁺- és Mg²⁺-ionokkal, pH=6,8, Gibco kát. sz.: 310-4040AJ, jégecet, Sigma kát. sz.:

A-6283 desztillált víz, etil-alkohol, Aldrich kát. sz.: 18,738-0 betegtől származó szérum,

One-Stroke Environ Calgon Vestal No. 539708, tripszin-EDTA (1*), 100 ml, Gibco kát. sz.: 610-5200AG, tripánkék, Gibco kát. sz.: 6305250AG.

A reagens elkészítése

Valamennyi közeget sterilre szűrjük, és ellátjuk a nevével, a készítés és felhasználhatóság dátumával, a tárolási útmutatással és az elkészítő nevének kezdőbetűivel. A kész közeg 2-8 °C hőmérsékleten tartva, három hónapig stabil.

BME 15% FBS-sel

500 ml BME-hez hozzáadunk 75 ml FBS-t, 5,0 ml penicillin/sztreptomicin oldatot, 10 ml glutaminoldatot, és 5 ml Hepes-puffert (A WISH-sejtek tápközege).

BME 10% FBS-sel

500 ml BME-hez hozzáadunk 50 ml FBS-t, 2,5 ml penicillin/sztreptomicin oldatot, 10 ml glutaminoldatot és 5 ml Hepes-puffert.

BME 2% FBS-sel

500 ml BME-hez hozzáadunk 10 ml FBS-t, 2,5 ml penicillin/sztreptomicin oldatot, 10 ml glutaminoldatot és 5 ml Hepes-puffert.

Vezikuláris sztomatítisz vírus (VSV)

Elkészítjük a WISH-sejtek két 150 cm²-es tenyészetét. Amint a sejtréteg összefüggővé válik, a felülúszót eldobjuk. Egyszer mossuk 2% FBS-t tartalmazó friss BME-vel. A VSV törzspreparátumot 1000-szeresre hígítjuk 2% FBS-t tartalmazó BME-vel. Mindegyik WISH-tenyészetre ráviszünk 8-10 ml 1000-szeresre hígított VSV preparátumot, hogy az a teljes sejtréteget beborítsa. A tenyészeteket 5%-os CO₂-inkubátorban tartjuk 37 °C hőmérsékleten 1 órán át. Mindegyik tenyészethez hozzáadunk 15 ml 2% FBS-t tartalmazó BME-t, és 5%-os CO₂-inkubátorban tartjuk 37 °C hőmérsékleten 1-3 napon át vagy amíg a sejtréteg csaknem egészében nem mutatja a vírusos citopatikus hatást (CPE). A sejttenyészet levét összegyűjtjük, és 20 percen át percenkénti 3000 fordulatszámmal 4 °C hőmérsékleten tisztára centrifugáljuk. A vírusokat tartalmazó felülúszó kivétet 10 ml-es csőbe helyezzük, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk. Ez a vírus-törzspreparátum általában 1*10⁹ plakk-képző egységgel rendelkezik milliliterenként, ha WISH-sejteken értékeljük. A törzsoldatot 2% FBS-t tartalmazó BME-vel 1:10 arányban meghígítva kapjuk azt az 1*10® plakkképző egység/ml koncentrációjú preparátumot, amivel dolgozunk, 1-1 ml ilyen VSV preparátumot Kriovialcsőbe teszünk, és -70 °C hőmérsékleten tárolunk. Ebből a VSV preparátumból 1:100, 1:200 és 1:300 arányú hígításokat készítünk, és ezekkel beoltjuk a 96 lyukú titerlemezen összefüggő sejtréteget képző WISH-sejteket, hogy megállapítsuk azt a hígítási fokot, mely 24-48 óra alatt csaknem 100%-os CPE-t vált ki.

HU 226 319 Β1

Humán α-interferon (National Institute of Health, kát. sz.: Ga 23-902-530)

1,0 ml steril desztillált vízzel elkészítjük az oldatot, ügyelve arra, hogy ne történjen anyagveszteség az ampulla nyakában. Az interferonoldatot 2% FBS-t tartalmazó BME-vel (penicillin/sztreptomicin nélkül, Hepes nélkül) meghígítjuk 105 lU/ml koncentrációra. 200 μΙ kivéteket Kriovialakban -70 °C hőmérsékleten tartunk. A kivéteket ezen a hőmérsékleten tartva, 2 éven át stabilak.

Neutrálvörös festék

500 mg festékport 500 ml desztillált vízben oldva, 0,1 %-os törzsoldatot készítünk. Egy órán át szobahőmérsékleten kevertettünk mágneses keverővei. 10 percen át autoklávozzuk az oldatot 15 psi nyomáson. Miután lehűlt, a törzsoldatot barna üvegbe töltjük, felcímkézzük és hűtőszekrényben tároljuk. A felső folyadék elkészítéséhez 15 ml neutrálvörös törzsoldatot 85 ml PBS-sel (Ca²⁺- és Mg²⁺-ionokat tartalmazó, pH=6,85) hígítunk.

Eluálóoldat ml jégecethez hozzáadunk 49 ml desztillált vizet és 50 ml 100%-os etanolt. Az oldatot kupakos üvegben tartjuk szobahőmérsékleten.

Gamma-interferon kontroll

3,0* 10⁶ egység/ml aktimmunoldat elkészítéséhez 50 μΙ aktimmunt (Actimmune) meghígítunk 49,95 ml 2% FBS-t tartalmazó BME-vel, és alaposan összekeverjük, hogy 3000 egység/ml koncentrációjú oldatot kapjunk. 10 ml-es kivéteket teszünk csövekbe, és „IFNgamma-törzsoldat” 3000 egység/ml névvel és a készítés és felhasználhatóság dátumával látjuk el. -70 °C hőmérsékleten tartva, 2 éven át stabil. A vizsgálatokhoz 1 ml törzsoldatot 9,0 ml 2% FBS-t tartalmazó BMEvel hígítunk, 300 egység/ml koncentrációjú oldatot nyerve. Ebből az oldatból 200 μΙ térfogatú kivéteket Kriovial-csövekbe teszünk, és -40 °C hőmérsékleten tartunk (stabilitása 2 év). Felhasználás előtt friss kontrollal ellenőrizzük a hatásosságot.

Eljárás

Első nap

A 24 minta interferonoldatait munkalapokra visszük fel. Az 1. munkalap a referensanyagé, a 2-25. munkalap a betegből nyert mintáké, a 26. munkalap a gamma-konrollé, a 27. munkalap az α-kontrollé. Kivesszük a beteg mintákat, az interferonreferenciát és a kontrollokat a hűtőből. Azonosítjuk a mintákat a munkalapjaikkal. Kilenc steril 96 lyukú mikrotiterlemezt a minták számával (két párhuzamos készítve), a lemez számával és dátummal látunk el. Két 150 cm²-es edényből az összefüggő WISH-réteg sejtjeit összegyűjtjük és mossuk. A sejteket tartalmazó csöveket címkézzük a sejtek nevével, a passzázs számával, a dátummal és a műveletet végző nevének kezdőbetűivel.

A WISH-sejtek passzázsának kevesebbnek kell lennie, mint P250. Mielőtt ezt a passzázst elérnénk, fiatalabb passzázst kell kivenni a folyékony nitrogénből, és folyadéktenyészetet kell készíteni.

A sejtszámlálást ezt alábbiak szerint végezzük: 12*75 mm-es csőbe bemérünk 0,5 ml WISH-sejtszuszpenziót és 0,5 ml 0,4%-os tripánkékoldatot (1:2 hígítás). Alaposan összekeverjük a cső tartalmát, és fénymikroszkóp alatt megszámoljuk az élő sejteket négy 1 mm²-es sarokmezőben, kiszámolva az egy mezőre jutó átlagot. 1 mm²-es sarokmezőben megszámoljuk az összes sejtet, és ugyancsak kiszámoljuk az átlagot. Az élőképes sejtek százalékos arányát megkapjuk, ha az életképes sejtek számát osztjuk a sejtek összes számával és az eredményt szorozzuk 100-zal. Az életképes sejtek százalékos arányát felvezetjük a munkalapon.

Az élő sejt/ml koncentrációt az alábbi egyenlettel számoljuk ki:

élő sejtek átlagos száma négyzetenként*hígítási faktor*hemocitométerfaktor=sejt/ml.

A WISH-sejtek szuszpenzióját 3,5* 10⁵ sejt/ml koncentrációjúra hígítjuk az alábbi képlet alapján:

ViCt=V₂C₂ például:

V.,=40 ml

Ο,=2,0*10⁶ sejt/ml

C₂=3,5*10⁵ sejt/ml

V₂=

V₂= 40 ml*2,0*10⁶ sejt/ml

C₂ 3,5* 10⁵ sejt/ml

V_z=229ml

Ha tehát az eredeti 40 ml térfogatú sejtszuszpenzióhoz hozzáadunk 189 ml 10% FBS-t tartalmazó BME-t, 3,5* 10⁵ sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót kapunk. A hígított WISH-sejtszuszpenzációt félretesszük a mikrotiteren való felhasználhatóságig és steril körülmények között a 96 lyukú titerlemez minden lyukába (a „vakokat” is beleértve) bemérünk 100 μΙ 10%-os BME-t. Az „1” oszlop „B-G” sorának lyukaiba bemérünk további 60 μΙ 10%-os BME-t. Az 1. számú lemez B1 és C1 lyukaiba (mindegyik mintából párhuzamosokat készítünk) bemérünk 40 μΙ referensanyagot. A D1 és E1 lyukakhoz 40 μΙ betegből származó szérumot teszünk. Az összes soron következő lyukpárhoz hozzáadjuk az egyes szérumminták 40 μΙ-ét. A vizsgálat utolsó lemezén lesznek a gamma-interferon és az α-interferon (referens) kontrollok. A B-G sorokban az „1 oszloptól a „10” oszlopig 100 μΙ-es nyolccsatornás pipettával hígítási sort készítünk. A lyukakban lévő anyagot néhányszor felszíva és visszaengedve, összekeverjük a tartalmukat, majd 100 μΙ-t viszünk át a következő oszlopba a „10.” oszlopig. A „10.” oszlopból kikerülő 100 μΙ anyagot eldobjuk. A vakokként szolgáló A és H sorok kivételével minden lyukhoz hozzáadunk 100 μΙ 3,5* 10⁵ sejt/ml koncentrációjú WISH-sejtszuszpenziót. Mindegyik lemez „11.” oszlopa a sejtkontroll, a „12.” oszlopa a víruskontroll. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten és 5%-os CO₂-légtérben inkubáljuk 18-24 órán át. Az OneStroke Environ-t tartalmazó rozsdamentes acélká15

HU 226 319 Β1 dat, a törlőket és a gézlapokat steril fülkében egy éjszakán át fehér fénynek tesszük ki.

Második nap

Inverz mikroszkóp alatt ellenőrizzük a sejtréteg folytonosságát. Ellenőrizzük a betegszérum toxicitását (fekete szélek). Steril körülmények között a közeget a lemezről kiborítjuk az OneStroke Environt tartalmazó rozsdamentes acélkádba, és leitatjuk a gézen. A vakok kivételével minden lyukban megmossuk a sejteket 100 μΙ 2% FBS-t tartalmazó BME-vel, a lemezt kiborítjuk és leitatjuk. A „11.” oszlop lyukaiba bemérünk 50 μΙ 2%-os BME-t. Minden egyes lyukhoz (a vakokat is beleértve) hozzáadunk 100 μΙ 2%-os BME-t. Az „1-10.” oszlop „minta lyukaihoz és a „12.” oszlop lyukaihoz hozzáadunk 50 μΙ VSV-t (olyan koncentrációban, ami 90%-os CPE-t eredményez 24-48 óra alatt). A lemezeket 24-48 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten és 5%-os CO₂-légtérben.

Harmadik nap

Mikroszkóp alatt ellenőrizzük a 90-100%-os CPE-t a vírusos kontrolinál. A referencia- és mintalyukaknál 50%-os CPE várható. Az 50%-os CPE-nek csökkennie kell a referenciasor „4. és „6.” oszlopai között. Addig kell a lemezt inkubálni, amíg ez meg nem történik. Az OneStroke Environt tartalmazó rozsdamentes acélkádat a lemezek leitatásához szükséges Kimtex-törlőkkel behelyezzük a steril fülkébe. Kiborítjuk a lemezeket és leitatjuk. Valamennyi mintalyukhoz hozzáadunk 100 μΙ 15%-os neutrálvörös festékoldatot. 45 percen át inkubáljuk a lemezeket 37 °C hőmérsékleten és 5%-os CO₂-légtérben. A lemezeket kiborítjuk és leitatjuk. 200 μΙ PBS-sel, pH=6,85, öblítünk, ismét kiborítjuk a folyadékot és leitatjuk a lemezt. A lemezeket Kimtextörlőre leborítva néhány napig hagyhatjuk száradni a kiértékelésük előtt. Eluáláshoz minden egyes lyukba bemérünk 100 μΙ eluálóoldatot.

A lemezt mikrolemezleolvasón értékeljük 540 mm-es szűrő alkalmazásával. A menüből kiválasztjuk a „Microman”-t, hogy hozzáférhessünk a „Microplate Manager” programhoz. „Analysis alatt kiválasztva: „Multiple Readings”.

Kiválasztva:

„Single Wavelength

540 mm

Mixing duration - 5 seconds

Reading per plate - 1

Number of plates - 9

Filename-date” (azaz, 0722).

Eltávolítjuk az 1. számú mikrotiterlemez tetejét, és behelyezzük a leolvasóba „start”. Miután a teljes lemezt leolvastuk, kinyomtatjuk a nyers oldatokat: „Fiié” alatt kiválasztva: „Open and Lotus Results”. Nyíl le a „Filename-hez vagy begépeljük a fiié nevét és a lemez számát. „Open”. A megjelenő üzenetre: „Savé current results...” a válasz: „No. Ha a „Raw Data Reports” megjelenik a képernyőn a Fiié alatt kiválasztjuk a „Print”-et. Kiválasztjuk a „Row Data Report-ot és OK. A Fiié alatt kiválasztjuk a „Close”-t. Minden kinyomtatandó lemeznél ezt megismételjük.

Eredmények

A) Átlagoljuk a sejtkontrollok („11.” oszlop) és a víruskontroli („12.” oszlop) optikai sűrűségi (O. D.) adatait.

B) Átlagoljuk a betegminták és a referenciaminták párhuzamosainak O. D. adatait (azaz „1-„10”. oszlopokban a B és C, D és E stb. párokat).

C) Az 50%-nál lévő O. D. kiszámolása

X víruskontrollok+X víruskontrollok -- =OD

D) Az O. D. értékek és a nekik megfelelő IFN hígítások beviteléhez:

1. Bevisszük az első O. D. átlagot, megnyomjuk az „X-Y2”-t.

2. Bevisszük a megfelelő IFN hígítást és megnyomjuk a „LÓG”, majd a „Σ+” gombokat.

3. Bevisszük a második O. D. átlagot, és megnyomjuk az „X-Y”-t.

4. Bevisszük a megfelelő második IFN hígítást és megnyomjuk a „LÓG”, majd a „Σ+” gombokat.

5. Bevisszük a harmadik O. D. átlagot, és megnyomjuk az „X-Y”-t.

6. Bevisszük a megfelelő harmadik IFN hígítást, és megnyomjuk a „LÓG”, majd „Σ+” gombokat.

E) A korrelációs koefficiens (+) kiszámításához:

1. Megnyomjuk a „2nd, majd a „CORR (+)” gombokat.

2. A korrelációs koefficiensnek (r) -1,0±0,1 értéknek kell lennie.

3. Bevisszük az O. D. 50% értéket, megnyomjuk a „2nd”, majd az „y’(x) gombokat.

F) A titernek (lóg 10) egység/ml értékre való átszámolásához megnyomjuk az „INV”, majd „LÓG” gombokat.

G) Az adatok törléséhez megnyomjuk a „2nd”, majd az „STO”, majd a „CE/C” gombokat.

H) Hogy az IFN egység/ml értéket átalakítsuk International Reference Units/ml értékekre:

1. A referens IFN egység/ml=a referens Faktor Inti Rét. Units/ml.

2. Minta IFN egység/ml=minta titer (IRU/ml) faktor.

5. eljárás

Humán tumor-telepképzési kemoszenzitivitás vizsgálat (farmakoszenzitivitás)

A humán tumor-telepképzési vizsgálat (Humán Tumor Colony Assay, HTCA: klonogén vagy tumortörzssejt-vizsgálat) egy félszilárd közegen történő in vitro tenyésztés, melyet eredetileg Salmon, Hamburger és munkatársaik írtak le. A HTCA-val a humán tumorból biopsziával nyert friss mintákban lévő klonogén tumorsejtek növekedését és kemoszenzitivitását vizsgálhatjuk. Az említett technika első leírása óta jelentősen nőtt a humán tumorok in vitro közvetlen vizsgálata. Kitűnő bizonyítékok születtek arra nézve, hogy a HTCA technikával nyert telepek tumorsejtekből állnak, és a tumortelepekben olyan klonogén sejtek vannak, melyek önmegújulásra képesek (a tumortörzssejt meghatározó tulajdonsága). Specifikus hatóanyagok HTCA-val vizsgált kemoszenzitivitása bizonyítja, hogy betegenként meglepően eltérő a hatóanyag-érzékenység, mégha ugyanolyan hisztopatológiai tumorokról van is szó. Kli16

HU 226 319 Β1 nikai korreláció állapítható meg az in vitro kemoszenzitivitás és a metasztázisos rákbetegek kemoterápiára való reagálása között. A vizsgálatok sorozatai szerint a HTCA lehetőséget ad, hogy a specifikus kemoterápiás hatóanyaggal kezelt betegeknél 71 %-os, illetve 90%-os valós mértékben előre megjósoljuk a hatóanyaggal szembeni szenzitivitást, illetve rezisztenciát. A vizsgálat tehát olyan prognózisos tényező, mellyel beazonosíthatók a kemoszenzitív betegek és ami lehetőséget ad az egyedi kemoterápia beállítására.

A szilárd tumortömegből, a maligánt aszciteszekből vagy a csontvelőből vett tumormintákat mechanikusan szuszpendáljuk, hogy minél nagyobb mértékben közelítse meg az a „magános sejtekből álló szuszpenzió” állapotot. Ezeket a sejteket a kemoterápiás hatóanyagokkal, a biológiai választ módosító anyagokkal vagy hormonokkal együtt agart tartalmazó tenyészközegben szuszpendáljuk, és félszilárd alsó lemezre rétegezzük, vagyis „lemezeljük”. Az alsó lemez megakadályozza, hogy a normál humán fibroblasztok, amik a tumorsztróma fő alkotórészei, hozzátapadjanak a tenyészedény fenekéhez, és telepeket alkossanak, amik összeolvadhatnak a tumorsejt-eredetű telepekkel. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten szén-dioxidban dúsított, nedves légtérben inkubáljuk, és a 7., 14. és 21. napon megszámoljuk a telepeket (20 sejtnél több csoport) és az aggregátumokat (4-20 sejtből álló csoport). Minden egyes tumornál negatív és pozitív kontrollt állítunk be. Ezekből az adatokból az egyes hatóanyagoknak a tumorra gyakorolt hatása meghatározható.

Minták

A vizsgálatokat az alábbi típusú mintákon végezhetjük el sebészeti úton eltávolított szilárd tumorokból vagy biopsziával nyert minták;

leszívatással és biopsziával nyert csontvelőminták; aszciták;

mellhártyafolyadék; mellkascsapolással nyert folyadék.

A mintavételekkel optimálisan 20 ml 1,0*10® életképes sejt/ml koncentrációjú mintához kell jussunk. Elfogadható minimum a 12 ml 1,0*10® életképes sejt/ml koncentrációjú minta. Valamennyi mintát ellátjuk a beteg nevét, a mintagyűjtés dátumát, a tumor típusát és a mintavevő nevének kezdőbetűit feltüntető jelöléssel.

Anyagok

Az eljáráshoz az alábbi anyagokra és eszközökre van szükség Lamináris steril fülke,

Bacto agar, analitikai mérleg, bemérőpapír, bemérőeszközök, steril kupakos csövek (100 ml, 250 ml, 500 ml és

1000 ml), desztillált víz, mikrohullámú kályha, autokláv,

RPMI 1640 közeg (1* és 2*), sósav (1 n HCI), nátrium-hidrogén-karbonát, penicillin/sztreptomicin, eldobható pipetták (steril; 1, 2, 5, 10 és 25 ml),

Select-A-Pette pipettor (1 ml),

Select-A-Pette csúcsok (steril),

Eppendorf-pi petták,

Eppendorf Combitipek (steril, 2,5; 5,0 és 12,5 ml), glutamin, nyomelemek,

2-merkapto-etanol Dulbecco PBS-sel,

ITS-oldat, fetális szarvasmarhaszérum, kémcsövek (10*75 mm, üveg, eldobható, 15 ml-es, steril, eldobható kupakkal),

Petri-csészék, steril (normál, 100*15 mm és hálózatos, 35*10 mm), steril, kónikus, 50 ml-es csövek (Falcon), homogenizátor, tripánkék festékoldat (0,4%), hemocitométer fedőlemezekkel, mikroszkóp (inverz és fény), kézi számláló, pH-papír (szűk spektrumú), mérőhenger (50 ml és 100 ml),

Histopaque-1077, vízfürdő, pipettaszívó segédeszköz, hűthető centrifuga, tenyészedény folyékony közegű tenyészethez (25 cm²),

C02-inkubátor, kemoterápiás hatóanyagok, biológiai választ módosító anyagok (BRM), hormonok,

Vortex-keverő, hűtőszekrény (2-10 °C), szike (eldobható és steril), hengeres Pasteur-pipetták 5 3/4” (eldobható), csepegtetőlabdák,

-70 °C hőmérsékletű mélyhűtő, felületfertőtlenítő,

70%-os alkohol rugalmas fecskendőflaskában,

Contrad üvegedény fertőtlenítő/tisztító, hőmérő (-20 °C-tól +120 °C-ig), főzőpohár (500 ml),

Betadine fertőtlenítőoldat, fecskendők (eldobható, steril, 1 és 10 cm³), tűk (különféle kaliberű).

A közegek és reagensek elkészítése

Agar

Alsó réteg - 2,5%-os oldat: kimérünk 2,5 g Bacto agart, és 100 ml-es kupakos edénybe tesszük. Hozzáadunk 100 ml desztillált vizet. Gyengén összekeverjük.

Felső réteg - 1,5%-os oldat: kimérünk 1,50 g Bacto agart, és 100 ml-es kupakos edénybe tesszük. Hozzáadunk 100 ml desztillált vizet. Gyengén összekeverjük.

HU 226 319 Β1

Mindkét edényt lazán lekupakolva behelyezzük a mikrohullámú kályhába. 60 másodpercen át melegítünk maximális energiával, minden 20. másodpercben megkeverve. Kerüljük el a forrást. Amikor az agar kész, az oldat kitisztul. Ha az oldat túlmelegszik, az agart nem használjuk fel. Mindegyik lazán kupakolt edényre egy darab autoklávszalagot teszünk és az oldatokat 20 percen át autoklávozzuk 22 psi nyomáson. Mindkét edényt a steril fülkében vízfürdőbe tesszük. Ezt a fürdőt egész idő alatt 45-50 °C hőmérsékleten kell tartani. Felhasználás előtt az agart le kell hűteni 50 °C hőmérsékletre. Felhasználás előtt az agart jól meg kell keverni. Az egyes közegek elkészítése után az edényeket az előzőekben ismertetett adatokkal felcímkézzük.

Közegek

10% RPM11640 (1»)

Mennyiség Alkotórész
500,0 ml 50,0 ml	RPMI 1640 (1*) L-glutaminnal fetális szarvasmarhaszérum, hővel inaktivált
5,0 ml	L-glutamin (100*) 200 mM
1,5 ml	penicillin/sztreptomicin
0,5 ml	2-merkapto-etanol
5,0 ml	inzulin/transzferin/nátrium-szelenit közegfolyadék, liofilizált, gamma-sugárzással kezelt

Steril fülkében egyesítjük az alkotórészeket. 0,22 μ-os membránon sterilre szűrjük az oldatot. A szűrésnél 60 μ-os előszűrőt alkalmazunk. Az oldatot felcímkézzük, és 2-10 °C hőmérsékleten tároljuk.

10% RMP11640 (2*) G,G Fortified

Mennyiség Alkotórész
500,0 ml 50,0 ml	RPM11640 (2*) por alakú sejtkultúraközeg L-glutaminnal (a por tartályát összesen 500,0 ml steril desztillált vízben oldjuk) fetális szarvasmarhaszérum, hővel inaktivált
5,0 ml	L-glutamin
2,5 ml	penicillin/sztreptomicin
2,0 ml	nyomelemkeverék (100*), liofilizál
0,5 ml	2-merkapto-etanol
5,0 ml	inzulin/transzferin/nátrium-szelenit közegadalék, liofilizált, gamma-sugárzással kezelt

Lamináris steril fülkében egy 500 ml-es steril edénybe bemérünk 450 ml steril desztillált vizet. Gyenge kevertetés mellett a por alakú közeget hozzáadjuk a vízhez. A por edényét kiöblítjük, hogy a nyomokat is kimossuk. 1,0 g nátrium-hidrogén-karbonátot adunk a közeghez. Steril desztillált vízzel a térfogatot kiegészítjük 500 ml-re. 1 n sósavval vagy 1 n nátrium-hidroxidoldattal a készítmény kémhatását 0,2-0,3 pH-egységgel alacsonyabbra állítjuk be a végső kívánt pH=7,2 értéknél (szűrés alatt az oldat kémhatása 0,1-0,3 egységgel növekszik). Miután beállítottuk a kémhatást, az edényt szűrésig lezárva tartjuk. Azonnal sterilizálunk, az oldat 0,22 μ-os membránon való átszűrésével. A szűrésnél 60 μ-os előszűrőt alkalmazunk. Tanácsolt a pozitív nyomás. A készítményt megcímkézve 2-10 °C hőmérsékleten tároljuk.

Alsó réteg közegének törzsoldata

125 ml fetális szarvasmarhaszérum,

125 ml 2*G,G Fortified-oldat,

250 ml 1*G,G Fortified-oldat.

Összekeverjük, megcímkézve 2-10 °C hőmérsékleten tároljuk.

Felső réteg közegének törzsoldata

150 ml fetális szarvasmarhaszérum,

150 ml 2*G,G Fortified-oldat,

150 ml 1*G,G Fortified-oldat.

Az alkotórészeket összekeverjük, a készítményt megcímkézve 2-10 °C hőmérsékleten tároljuk.

A hatóanyagok készítményei

Kéthetenként elkészítjük a hatóanyagok, hormonok és biológiai válaszokat módosító anyagok aliquotjait a szokásos eljárással. A vizsgálatoknál felhasznált aliquotokat 4 °C hőmérsékleten, felhasználásra készen tároljuk.

Eljárások

Az alsó réteget tartalmazó csövek elkészítése ml-es kupakos csövekbe bemérünk 8-8 ml-t az alsó réteg közegtörzsoldatából (egy cső tartalma 8 lemez alsó rétegéhez elegendő). A hatóanyagokat párhuzamos tesztekben vizsgáljuk). A lemezek elkészítéséig a csöveket szobahőmérsékleten tartjuk lezárva vagy, ha másnap készítjük a lemezeket a tárolás 28 °C hőmérsékleten történik. Győződjünk meg arról, hogy felhasználás előtt a készítmény szobahőmérsékletű.

Az alsó réteg kilemezelése (dolgozzunk gyorsan, hogy megakadályozzuk az agar idő előtti megdermedését): steril 10 ml-es pipettával felszívunk 2,0 ml 2,5%-os agaroldatot, és 8 ml alsó réteg közeget tartalmazó 15 ml-es műanyag csőhöz adjuk. A csövek tartalmának kétszeri felszívásával és leeresztésével az oldatot összekeverjük. A készítményből 9,0 ml-t felszívunk, és 1 ml-ként szétmérjük nyolc steril, 35 mm-es, hálózatos csészébe. Körkörös mozgással beterítjük a csésze teljes fenekét. Vigyázzunk, hogy buborék ne keletkezzen. A lemezeket sík felületre helyezzük, és nyugalomban hagyjuk, amíg az agar megdermed. Azokat a lemezeket, ahol a réteg nem egyenletes, nem használjuk fel. Felhasználásig néhány napon át a lemezeket szobahőmérsékleten tarthatjuk vagy a felhasználás előtti éjszakára 37 °C hőmérsékleten CO₂inkubátorba tesszük.

Sejtszuszpenzió elkészítése

Szilárd tumor

Steril Petri-csészébe steril szikével és csipesszel a tumormintát borsószem nagyságúra aprítjuk. Az eredeti transzport közeget megőrizzük a centrifugáláshoz. A darabokat egy kónikus üvegcsőbe helyezzük, amibe egy lazán illeszkedő homogenizálórúd illik. Hozzáadunk 5,0 ml transzportközeget. A tumordarabokat

HU 226 319 Β1 gyengén homogenizáljuk, és a sejtszuszpenziót átvisszük egy steril 50 ml-es kónikus csőbe. Amikor az egész tumormintát elhomogenizáltuk, alaposan összekeverjük, és egy percen át nyugalomban hagyjuk, hogy ülepedjen le (ez lehetővé teszi, hogy a szövetcsomók kiülepedjenek). A felülúszót steril csőbe pipettázzuk, 10% FBS-t tartalmazó RPMI (1*) közeggel hígítjuk, és percenkénti 1600 fordulatszámmal centrifugáljuk 5 percen át. Eltávolítjuk a felülúszót, 10% FBS-t tartalmazó RPMI (1*) közegben szuszpendáljuk a sejteket, és megállapítjuk az össz-sejtszámot és az életképes sejtek számát.

Folyékony tumoroknál (oszcitesz, csontvelő stb.): megfelelő számú 50 ml-es, steril, kupakos, kónikus csőbe steril pipettával bemérünk 20-25 ml histopaque-t. Egy másik steril pipettával az aszcites, csontvelő- vagy más sejtszuszpenzió-mintát 1:1 arányban óvatosan rárétegezzük a 45° alatt tartott histopaque-ra. Hűtött centrifugában 4 °C hőmérsékleten centrifugáltunk 1600 percenkénti fordulatszámmal 20 percen át (fékezés 2-es állásban). A felülúszót eltávolítjuk és eldobjuk. Eltávolítjuk a sejtes interfázist, és egy előre megcímkézett csőben lévő RPMI (1 *) G,G Fortified-közegbe visszük át. A sejteket gyorsan hígítjuk a közeggel, mert a histopaque toxikus a sejtekre, ha hosszabb ideig ki vannak téve neki. A sejteket kétszer mossuk RPM11640 (1*) közeggel, és 5 percen át centrifugáljuk percenkénti 1600 fordulatszámon (fékezés 2-es állásban). A felülúszót eltávolítjuk és eldobjuk. A sejtüledéket 5 ml RPMI (1*) közegben szuszpendáljuk.

Sejtszám megállapítása

Egy 12*75 mm-es üvegcsőben

0,1 ml jól összekevert sejtszuszpenzió,

0,2 ml 0,4%-os tripánkékoldat,

0,7 ml közeg.

Ez 1:10 hígítást jelent.

A cső tartalmát jól összekeverjük, és a hemocitométer kamrájába viszünk a sejtszuszpenzióból. Fénymikroszkóp alatt megszámoljuk az életképes sejteket (melyek nem adszorbeálják a tripánkék festéket) a négy 1 mm²-es sarokmezőben. A sarokmezőben megállapítjuk a teljes sejtszámot (festett és nem festett) is.

A sejtkoncentráció kiszámolása

Az életképes sejtek számát az alábbi képlettel számoljuk ki:

életképes sejtek átlagszáma négyzetenként*hígítási faktorxhemocitométer faktor például:

sejt (életképes sejtek átlagos száma mezőnként)* 10⁴*10/hígítási faktor)=2*10⁶ sejt/ml.

Az életképes sejtek százalékos arányát az alábbi képlettel határozzuk meg:

életképes sejtek száma *100=% életképesség teljes sejtszám

A vizsgálatokhoz szükséges sejtkoncentráció (jelen esetben 1*10⁶ sejt/ml) beállításához az alábbi képletet használjuk fel:

V^=V₂C₂ például:

VflOml C₄=2*1O⁶ sejt/ml C2=1*10⁶ sejt/ml V2=

ml*2*10⁶ sejt/ml

-----=V₂=20 ml *10⁶ sejt/ml ml-10 ml=10 ml közeggel kell hígítani a 10 ml sejtszuszpenziót, hogy 1*10⁶ sejt/ml sejtkoncentrációjú szuszpenziót nyerünk.

A felső réteget tartalmazó csövek összeállítása ml-es kupakos csöveket felcímkézünk a hatóanyagok nevével. A csöveket elrendezzük a kémcsőtartóban. A felső rétegek készítményeit a III. táblázatban megadott térfogatokból (valamennyi ml-ben) állítjuk össze.

III. táblázat

	Felső fázis közege	Sejt- szusz- penzió	Ható- anyag	Agar
Kontroll	2,1	0,3	-	0,6
ABRIN	1,8	0,3	0,3	0,6
1. hatóanyag	1.8	0,3	0,3	0,6
2. hatóanyag	1,8	0,3	0,3	0,6
2. hatóanyag	1,8	0,3	0,3	0,6

Az agar kivételével az összes többi alkotórészt összemérjük a megfelelő csőbe. Egy cső összeállítását befejezzük, mielőtt a másikat elkezdenénk. 2,0 ml-es pipettával felszívunk 0,6 ml 1,5%-os agart. Bemérjük az agart a csőbe az 1. számú csővel kezdve. A cső tartalmát kétszer felszíva és visszaengedve összekeverjük a készítményt. 2,2 ml oldatot felszíva, 1,0 ml-t mérünk két hálózatos csésze mindegyikébe (a másik réteg tetejére), vigyázva arra, hogy buborék ne keletkezzen a rétegben. Körkörös óvatos forgatással egyenletesen elterítjük a rárétegezett oldatot. Hagyjuk az agart megdermedni, majd a csészét egy nagyobb Petri-csészébe tesszük, amiben 0,5 ml desztillált víz van. 5-7 párhuzamost készítünk a vizsgálandó hatóanyagonként. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk nedves 5% CO₂-t tartalmazó légtérben.

Folyékony tenyészet

Két 25 cm²-es tenyészedényt felcímkézünk. Egy edénybe 4,0 ml RPMI 1640 (1*) fortified+FBS közeget és 0,5-1,0 ml sejtszuszpenziót adunk.

A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 5% CO₂-t tartalmazó nedves légtérben. A kupakokat lazán helyezzük fel, hogy a szén-dioxid bejuthasson.

HU 226 319 Β1

DNS-analízis

DNS-vizsgálatokhoz legalább 1 ml sejtszuszpenziót teszünk félre (a DNS-vizsgálatokhoz nem szükséges, hogy a sejtek éljenek). A csöveken feltüntetjük a beteg nevét, a dátumot, a minta típusát és a kísértet számát, és a csöveket hűtőszekrénybe tesszük.

Folyékony nitrogén

Minimum 2 kriovialban a mintákat hosszabb időre folyékony nitrogénben tároljuk az előírásoknak megfelelően.

Eredmények kiértékelése

A farmakoszenzitivitási vizsgálat 24 órájában a sejtkontroli és az abrinos lemezeket inverz mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A teljes lemezt kiértékeljük. Valamennyi sejtcsomót megszámláljuk, és a háttérszámot feljegyezzük a munkalapra. Mindig a teljes lemezt átvizsgáljuk a telepek és aggregátumok megszámlálásakor szempontjából, a számláláshoz egy kézi számlálót használva. Ha nincs telep vagy aggregátum, négy négyzetben meghatározzuk a sejtek számát. A sejtszámot néggyel osztva megkapjuk az egy mezőre jutó sejtek átlagszámát. Ezt az értéket szorozva 15-tel, majd 13,36-tal megkapjuk a teljes sejtszámot a 35 mm-es lemezre vonatkoztatva. A reprezentatív telepeket, aggregátumokat és/vagy sejteket mikrofotografáljuk, és a naplóhoz mellékeljük, mielőtt a lemezeket eldobnánk. Győződjünk meg róla, hogy a kontroll a várt tartományon belülre esik, ha nem, azt dokumentáljuk.

1. kísérlet

A N. sativa csontvelősejtekre kifejtett hatása N. sativa preparátum elkészítése:

1) A száraz magvakat finomra őröljük, és 5 g port soxhlet készülékben háromszor extrahálunk 95%-os etanollal. A Wheaton soxhlet készülék három részből áll: egy edényből, amiben 95%-os etanolt melegítünk, a középső rész az extraktor, a felső rész egy Allihn kondenzor, melyen a hűtővíz számára egy belépő és kilépő csonk van. A N. sativa magvainak száraz porát szűrőpapírba csomagoljuk, és az extraktorba helyezzük.

2) Az összegyűlt extraktumot csökkentett nyomáson 10 ml térfogatúra pároljuk, és szilikagél (Kieselgel 60, Fluka) oszlopra visszük. Az eluálást 95% metanol/víz, 9:1 arányú elegyével végezzük. Az oszlop elkészítésénél a metanol/víz elegyben szuszpendált szilikagélt homokra ülepítjük. Miután a N. sativa kivonatot rávittük az oszlop tetejére, megkezdjük az eluálást.

3) Az aktív frakciót (barna szín jelzi) összegyűjtjük, és vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) elválasztjuk. A N. sativa aktív frakcióját egy csíkban felvisszük a kereskedelmi forgalomból beszerezhető kromatográfiás lemezre, és TLC kádban kloroformban futtatunk.

4) Az aktív anyag oldószerfronttal mozgó foltját eltávolítjuk, és egy éjszakán át metanolban kioldjuk. Az oldatot csökkentett nyomáson alkoholmentesre pároljuk.

5) A kivonatot oldatként 2 °C hőmérsékleten tároljuk.

A magvakban az aktív anyag körülbelül 2,2 tömeg%-ban található.

Az aktív vegyület mennyiségének kiszámolása: 1 g magvat adunk 10 ml vizsgálati közeghez, vagyis 22 mg/ml aktív anyag van a közegben. Ebből a vizsgálatnál felhasználunk 40 μΙ-t, ami megfelel ténylegesen 88 μg aktív anyagnak. Ezt tovább hígítjuk 1:10, 1:100 és 1:1000 arányban, az aktív anyag mennyisége ennek megfelelően 8,8 μg, 880 ng, illetve 88 ng.

Telepképzési vizsgálat

Minta

A csontvelőből optimálisan 5,0 ml sejtszuszpenzióra van szükség, melyben a monocitasejtek koncentrációja 1,0*10⁶ sejt/ml.

Vizsgálati eljárás

A vizsgálatot Metcalf (1984, 1985) módszerének módosított változatával végezzük. Az eljárást részletesen leírva fentebb a 2. eljárásban ismertettük. Minden egyes 25 cm^{1 2}-es tenyészedényhez 1*10⁶ és 100 μ N. sativa kivonatot adunk, és 37 °C hőmérsékleten, 5% CO₂-légtérben inkubálunk.

A sejtek immunofluoreszcens festése: A perifériás vérsejteket aszeptikus körülmények között gyűjtjük. Az analitikai vizsgálatok egy-egy paneljéhez 3,0 ml teljes vér szükséges, a vizsgálatokat Karén (1989), valamint Merkel és munkatársai (1987) részben módosított eljárásával végezzük. Az eljárást részletesen fentebb az 1. eljárásnál ismertettük.

A rákos betegekből nyert perifériás vér sejtjeit a N. sativa kivonattal inkubáljuk 18 órán át 37 °C hőmérsékleten 5% CO₂-t tartalmazó légtérben. A CD3, CD19, HLADR, LAK CD3+/CD56+, NK CD CD3-/CD56+, CD38, CD37 és CD33 antitest felületi markereket a Becton Dickinson FacScan serial No. 81326 alapján állítottuk össze. Ezeknek az antitesteknek a segítségével jellemezhetjük a sejttípusokat. A „klaszter” elnevezést (cluster designation, CD) az olyan két vagy több monoklonális antitest (mAB) csoportjára használjuk, melyek statisztikailag hasonlóan fejeződnek ki a normál és neoplasztikus sejteken és sejtvonalakon, valamint ugyanazt az antigént vagy kötőhelyet (epitopot) ismerik fel. Amíg egy CD csoporthoz tartozó mAB-k általában ugyanazon az antigénen lévő különböző epitopokat ismernek fel, néhány CD csoport, elsősorban a nem limfoid klaszterek, olyan mAB-ket tartalmaznak, melyek nem ugyanazon antigénekhez kötődnek.

Az 1. kísérletnél kapott eredményeket összevetjük a csontvelő növekedési faktoraival és biológiai válaszokat módosító anyagokkal, nevezetesen a GM-CSFfel, G-CSF-fel, eritropoietinnel, interferonnal, IL-2-vel és STS-sel kapott eredményekkel.

A 7., 14. és 21. napon minden edényt megvizsgálunk egy Reichart Jung Biostar inverz mikroszkóp alatt. Telepnek azt az edény fenekéhez tapadt sejtcsoportot tekintjük, ami 40 vagy ennél több sejtből áll.

A telepképzési vizsgálatot [colony forming cell unit (CFU) assay] két rákos betegtől nyert 1 *10⁶ csontvelősejten végezzük, 100 μΙ N. sativa növényi kivonat jelenlétében, illetve anélkül inkubálva a sejteket.

HU 226 319 Β1

Eredmények: Az 1*10⁶ csontvelősejten végzett telepképzési vizsgálat szerint 100 μΙ növényi kivonat jelenlétében 15 napos inkubálás után a CFU 600%-os növekedése figyelhető meg. Ez a növekedés 125%-os volt a 21 napos Inkubáció után. A különféle növekedési faktorok és módosító anyagok közül az IL—2 és GM-CSF maximálisan 120%, illetve 115%-kal emelkedik a 15 napos inkubálás után. A növekedési faktor/módosító anyagok jelenlétében történt 21 napos inkubálás után nem volt jelentékeny CFU emelkedés. Az interferon a 15 napos inkubálás után csekély emelkedést mutat, de 21 nap után a kimutatható reakció elhanyagolható.

A N. sativa kivonat segít helyreállítani az immunszuppresszált rákos betegek immun kompetens sejtjeit. A telepképzéses vizsgálatok azt mutatják, hogy növekszik a CFU-érték, ha a rákos betegből származó csontvelősejteket N. sativa kivonat vagy különböző növekedési faktorok jelenlétében inkubáljuk, jelezve, hogy a N. sativa kivonattal helyettesíthető e néhány növekedési faktor hatása. Noha a növényi kivonatot hígítás nélkül használtuk, nem volt toxikus hatása a csontvelő sejtekre. A N. sativa növényi kivonat tehát segít helyreállítani az immunszuppresszált rákos betegek immunkompetens sejtjeit, és az egészséges egyedekben túlstimulálja a csontvelőképzést.

2. kísérlet

Az Immunkompetens sejtek száma/vérképzés növekedése és a N. sativa kivonat közötti korreláció

Immunmodulátor vizsgálat

Az immunmodulátor vizsgálatokkal értékelni tudjuk a beteg szérumának és fehérvérsejtjeinek aktivitását az interferon, az interieukin és a limfokln vonatkozásában, kimutatva az interferongátló faktor és a limfokingátló faktor jelenlétét. Az immunmodulátor vizsgálat részletes leírását fentebb a 3. eljárásnál adtuk meg.

Az immunkompetens sejtek/vérképzés növekedése és a N. sativa kivonat lehetséges összefüggésének vizsgálatához az immunkompetens sejtek különféle felületi markereit analizáljuk automata áramlásos citometriávai, amint azt a 3. eljárásnál már leírtuk.

Az eredmények a CD19, HLADR, NK CD3-7CD56+ és a CD38 populáció növekedését mutatják. Nincs különös változás a CD3, CD37 és a CD33 felületi markerindexben. A kötőszöveti „L” sejtek szaporodása figyelhető meg, ha 7 napon át rákos beteg szérumának és N. sativa kivonatnak jelenlétében inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, 5% CO₂-t tartalmazó légtérben.

Sejtvonal: ATCC-től származó L929 egérkötőszöveti sejteket használunk, melyeket 20% fetális lószérummal (BioWittaker) kiegészített MÉM közegben (GIBCO) növesztünk, ahogy a fentiekben már leírtuk.

Vizsgálat: A vizsgálatok Medenica és munkatársai (1990) eljárásával történnek. Az 5* 10⁵ „L sejt/ml kiindulási koncentrációjú tenyészetben a szaporodást kétrétegű agaron követjük nyomon, ahol az 1,5% agart tartalmazó alsó fázis 125 ml FBS-ből, 125 ml „2*G,G Fortified oldatból és 250 ml 1*G,G Fortified-oldatból áll. A felső réteg törzsoldata 150 ml FBS-ből, 150 ml 2*G,G Fortified-oldatból és 150 ml 1*G,G Fortified-oldatból áll. 2,0 ml felső réteg törzsoldathoz hozzáadunk 0,1 ml N. sativa kivonatot, 0,3 ml „L” sejtszuszpenziót és 0,6 ml 1,5%-os agaroldatot, így az össztérfogat 3,0 ml. Az „L” sejtek növekedését Reichert Jung biostar inverz mikroszkóp alatt vizsgáljuk, miután a tenyészetet 7 napon át 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben inkubáltuk.

Az eredményeket a IV. táblázatban foglaltuk össze.

IV. táblázat

Inkubációs keverék	Sejtszám	%-os növekedés
„L” sejt+közeg	2,0* 104	0
„L sejt+IFN+közeg	2,7* 104	35
„L” sejt+IL-2-+közeg	2,3*104	15
„L sejt+szérum+növényi kivonat	4,7*104	135
„L sejt+teljes vérminta+növényi kivonat	7,4* 104	270

Az „L” kötőszöveti sejteket 5*10⁵ sejt/ml koncentrációban. IFN, IL—2 vagy növényi kivonat jelenlétében inkubáljuk 7 napon át 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben. Az adatok SD-ja <10%. Eredmények: Rákos betegek perifériás sejtjeit N. sativa kivonat jelenlétében 18 órán át 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben inkubálva, a CD19, HLADR, NK CD3-/CD56+ és CD38 populációk növekednek, amint azt az 1. ábra mutatja. A CD19 felületi marker index a kontrolihoz képest 90%-kal emelkedik, a HLADR, NK CD3-/CD56+ és a CD38 populációk esetében pedig ez a növekedés 44, 38, illetve 5%-os. Nincs jelentős változás a CD3 populációnál.

A N. sativa kivonat - inkább, mint az immunobiológiailag kompetens sejtek számának növekedése - elősegíti a B-sejteken lévő szabad tumorantigén-kötőhelyeket, ezáltal növelve a CD 19 és az azzal kapcsolatos sejtpopulációt. Az áramlásos citometriaanaiízis adatai a CD19, HLADR, NK CD3-/CD56+ és a CD38 populáció növekedését jelzik. Nincs jelentős változás a CD3, CD37 és a CD33 felületi markerindexeknél. Ezek az adatok világosan mutatják az immunkompetens sejtek proliferációját, főként vonatkozik ez a tumorantigénekkel szembeni tumorális immunválasz sejtjeire. így az extraktum inkább, mint az immunológiailag kompetens sejtszám növekedése, elősegíti a B-sejteken lévő szabad tumorantigén-kötőhelyeket, növelve ezáltal a CD 19 és az azzal kapcsolatos sejtpopulációt.

Az 5*10⁵ sejt/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót N. sativa növényi kivonattal, a betegek szérumával vagy fehérvérsejtjeivel inkubálva, az „L” kötőszöveti sejtek száma növekszik. Csak a közegben inkubálva, az „L” sejtek száma 2,0* 10⁴, ami a rákos beteg szérumának vagy a növényi kivonatnak a jelenlétében 4,7* 10⁴ értékre, illetve a rákos beteg fehérvérsejtjeinek és a növényi kivonatnak a jelenlétében 7,4* 10⁴ értékre nő.

HU 226 319 Β1

A növekedés tehát 135, illetve 270%-os, amint az a IV. táblázatban (fent) látható. Ugyanilyen, a N. sativa kivonat szempontjából optimális körülmények között az 5*10⁵ „L sejtet interferon, illetve interleukin-2 jelenlétében inkubálva csak csekély 35, illetve 15%-os növekedést tapasztalunk.

Az immunmodulátor vizsgálatok tehát azt mutatják, hogy az „L” kötőszöveti sejtek proliferációja fokozódik a N. sativa kivonat jelenlétében, azaz az extraktumnak pozitív immunomodulátor hatása van. Hasonló eredményeket kapunk a betegek fehérvérsejtjeivel is.

Az eredmények azt mutatják, hogy a beteg szérumában interferongátló faktor (IIF) található, melynek következtében ha csak a beteg szérumának jelenlétében inkubálunk, az „L” sejtek nem szaporodnak. A beteg szérumában lévő IIF és limfokingátló faktor (LIF) hatását a N. sativa kivonattal történő utólagos kezelés elnyomja, és ezért megtörténik az „L” sejtek fokozott szaporodása. Az IIF nem azonosítható az interferonnal szembeni antitestekkel.

Az IIF olyan faktor, ami nem engedi az autológ (saját) interferon termelődését az emberi szervezetben. Ha az inducer beindítja az interferon termelését, az emberi szervezet egy másik fehérjét termel, ami lehetetlenné teszi az interferon termelését. Az LIF valamennyi faktort magában foglalja, melyek a citokinaktivitást, beleértve az interferon feronokat, elnyomják.

A kötőszöveti sejteknek az IIF és LIF csökkentése által történő megnövekedett stimulációja lehetővé teszi, hogy az emberi szervezet saját interferont termeljen, ami azután interferál a kötőszöveti sejtek termelésének kontrollálásával. Ebből következően a N. sativa potenciálisan felhasználható a kötőszöveti betegségek esetében, például a reumatikus artritisszel, a bőrtuberkulózisnál (lupus) és az autoimmun betegségeknél.

3. kísérlet

A vezikuláris sztomatítisz vírus citopatikus hatása Sejtvonal: A humán amnion vagy „WISH”-sejteket az American Type Cell Culture (ATCC) törzsgyűjteményből szereztük be, és Basal Eagle Médium (BEM) (GIBCO) növesztjük, amit 15% fetális szarvasmarhaszérummal egészítettünk ki.

Vírus: A vezikuláris sztomatítisz vírust (VSV) az ATCCtől kapjuk. A VSV törzsoldatot 1000-szeresre hígítjuk 2% fetális szarvasmarhaszérumot (FBS) tartalmazó BEM közeggel.

Vizsgálat: A vizsgálatot úgy hajtjuk végre, ahogyan azt a 4. eljárásban leírtuk. A N. sativa növényi kivonat „WISH”-sejteket megvédő mennyiségének a meghatározásához kiszámoljuk a teljes vírusos citopatikus hatást (CPE), 8-10 ml 1:1000 arányban meghígított VSV törzsoldattal beoltva minden egyes WISH-sejtes tenyészedényt (3,5* 10⁵ sejt/ml) úgy, hogy a vírusoldat befedje a teljes sejtréteget. Az edényeket 1 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 5% CO₂-t tartalmazó légterű inkubátorban. Minden egyes tenyészedényhez hozzáadunk 15 ml 2% FBS-t tartalmazó BMEM-t, és 37 °C hőmérsékleten 5% CO₂-t tartalmazó légtérben inkubálunk 1-3 napon át, illetve addig, amíg a sejtréteg nem mutatja a teljes vírusos citopatikus hatást (CPE). A N. sativa kivonatból hígítási sort készítünk egy 96 lyukú polisztirénlemezen. 40 μΙ kivonathoz hozzáadunk 100 μΙ 3,5*10⁵ sejt/ml koncentrációjú „WISH”sejtszuszpenziót, és a lemezeket 18-24 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben. A kontroli-lyukakban nincs növényi kivonat. A következő napon (18-24 óra elmúltával) Nikon TMS mikroszkóp alatt megvizsgáljuk a lemezeken a sejtréteg konfluenciáját. 50 μΙ VSV-t adunk a lyukakhoz (100% CPE-t okozó koncentrációban) és 24-48 órán át inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 5% CO₂-t tartalmazó légtérben.

A következő napon Nikon TMS mikroszkóp alatt ellenőrizzük, hogy a kontroli-lyukakban kialakult-e a 100%-os CPE. Ahogy erről meggyőződtünk, a lemezeket kiborítjuk és leitatjuk. 100 μΙ 15%-os neutrálvörös festékoldatot adunk minden lyukhoz. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben inkubáljuk 45 percen át. A lemezeket kiborítjuk, leitatjuk és 200 μΙ PBS, pH=6,85 pufferral kiöblítjük. A lemezeket ismét kiborítjuk és leitatjuk. 100 μΙ eluálóoldatot adunk minden lyukba, és az eluátumok extinkcióit Bio-Rad 3550 mikrolemezt leolvasó készüléken megmérjük.

Először tehát meghatározzuk a vezikuláris sztomatítisz vírusnak (VSV) azt a koncentrációját, ami 100%-os citopatikus hatást (CPE) okoz a humán amniotikus „WISH”-sejteken. Ezt 1*10⁵ plakkot képző egységet jelentett. A N. sativa kivonat WISH-sejteket megvédő optimális koncentrációját az extraktum hígítási sorozatával határozzuk meg.

Eredmények: A 2. ábrán feltüntetett eredmények azt mutatják, hogy az 1:10 és 1:100 arányban hígított N. sativa extraktum jelenlétében inkubálva a „WISH”-sejteket, 25 és 65 5-ös védettséget érünk el. Ha 1:1000 arányban hígított N. sativa extraktumot adagolunk, észrevehető citopatikus hatás nem jelentkezik. A hatóanyag koncentrációját az „Anyag és módszer” szerint határozzuk meg. A szérum interferonszintjét a növényi kivonat hozzáadása után határozzuk meg Finter (1969) eljárásának módosított változatával.

A humán amnion „WISH-sejteknek a vezikuláris sztomatítisz vírus (VSV) citopatikus hatásától való védelmét figyelhetjük meg, ha 1:1000 arányban hígított N. sativa extraktumot adunk a sejtekhez. Ez 88 ng hatóanyagot jelent. Alacsonyabb hígításnál van valamilyen hatás. Elméletileg egy 70 kg-os betegnek a szervezetét 7*10³ sejt építi fel, így 20-40 g N. sativa kivonat alkalmazandó a vírussal szemben. A kivonat bevitelével a szérum interferonszintje növekszik, ezáltal a N. sativa kivonatnak interferonszerű antivirális aktivitása van. Az extraktum feltehetően blokkolja a „WISH”-sejteken mindazokat a receptorhelyeket, melyek nélkülözhetetlenek a vírusnak a sejtmembránhoz való kötődésénél.

4. kísérlet

Farmakoszenzitivitási vizsgálat

A tumor két típusú lehet: szilárd (solid) tumor és folyékony (liquid) tumor.

HU 226 319 Β1

Szilárd tumor: Kimetszünk 2 g tumormintát, borsószem nagyságú darabokra vágjuk, és gyengén elhomogenizáljuk 10% FBS-ben egy Potter-Elvehjam homogenizátor segítségével. A homogenizátumot 4 °C hőmérsékleten és percenként 1600 fordulatszámmal centrifugáljuk 20 percen át egy Mistral 3000i hűthető centrifugában. A sejteket 10% FBS-t tartalmazó RPMI 1640 közegben finoman felszuszpendáljuk.

Folyékony tumor: A mintákat a rákos beteg aszcitesz nedvéből nyerjük. A nedvet 1:1 arányban óvatosan histopaque-ra rétegezzük, és 1600 percenkénti fordulatszámmal, 4 °C hőmérsékleten 20 percen át centrifugáljuk hűthető Mistral 3000Í centrifugában. A sejteket 10% FBS-t tartalmazó RPMI közegben szuszpendáljuk. Vizsgálat: A vizsgálatot Van Hoff és munkatársai (1981) és Salmon és munkatársai (1978) módosított eljárásával végezzük; részletes leírása fentebb, az 5. eljárásban található. A N. sativa tumoricid hatását kettős agarrétegen ellenőrizzük. Az alsó rétegként szolgáló meleg, 2,5%-os Bacto agar oldatot 35 mm-es, hálózatos Petri-csészékbe öntjük. A csészéket sík felületen hagyjuk állni, amíg az agar meg nem dermed. 2,1 ml felső réteg közeghez (ami áll 150 ml FBS-ből, 150 ml

2*G,G Fortified-oldatból és 150 ml 1*G,G Fortified-oldatból) hozzáadunk 0,3 ml tumorsejt-szuszpenziót és 0,6 ml 1,5%-os agaroldatot.

A felső réteget óvatosan rárétegezzük a 35 mm-es, hálózatos Petri-csészében lévő alsó réteg tetejére.

Kontrollként a tumormintákat extraktum nélkül és Abrin jelenlétében növesztjük. A növényi kivonattal kezelt tumorsejtek növekedését a 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben történő inkubálás 7., 14. és 21. napján vizsgáljuk meg, Reichert-Jung biosztar in15 verz mikroszkóp alatt megszámlálva a sejteket. A közeg, az Albrin vagy a növényi kivonat jelenlétében 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben végzett inkubálás 7., 14. és 21. napján nyert sejtszámadatokat az V. táblázatban foglaljuk össze.

V. táblázat

Inkubációs keverék			Inkubációs idő
	7. nap	Gátlási %	14. nap	Gátlási %	21. nap	Gátlási %
Tumorsejt+közeg	8,2χ104	0	10,0x104	0	10,5x104	0
Tumorsejt+ABRIN	8,1 *104	1,2	9,8x104	2,0	10,3x104	1,9
Tumorsejt+kivonat	5,3χ104	35,0	5,4x1ο4	46,0	5,5x1ο4	48,0

Az adatok SD-értéke <10%. A gátlási százalék kiszámítását az „Anyagok és módszerek” fejezetben írtuk le.

A 7., 14. és 21. napos inkubálás után a növényi kivonat tumoricid aktivitást mutat. Ezek szerint a N. sati- 35 va kivonatnak többoldalú gyógyító hatása van a rákbetegségekre anélkül, hogy toxikus lenne.

Eredmények: 2 g tumormintát - akár szilárd tumorból származik, akár malignáns aszciteszből - mechanikusan homogenizálva, 8,2><10⁴ sejtet tartalmazó szusz- 40 penziót készítünk. A tumorsejteket 37 °C hőmérsékleten és 5% CO₂-t tartalmazó légtérben a N. sativa kivonat jelenlétében inkubálva a növekedés gátlása a 7.,

14. és 21. napon 35, 46, illetve 48%. Hasonló körülmények között az Abrin jelenlétében történő inkubáció 45 nem okoz érdemleges gátlást.

A N. sativának tumorelienes aktivitása van. A farmakoszenzitivitási vizsgálatok adatai a N. sativa tumorellenes aktivitását jelzik, minthogy a tenyészet a sejtnövekedés 25-90%-ban gátolt. A korábbi gyors farmako- 50 szenzitivitási vizsgálatoknál, ahol a sejteket a N. sativa kivonattal 2 órán át inkubáltunk, hasonló eredményekre jutottunk. A kivonat főként a melanoma és a vastagbélrák típusok ellen mutat tumorellenes aktivitást. A N. sativa növényi kivonata elpusztítja a tumorsejteket, és 55 csak az egészséges sejtek maradnak meg, valószínűleg a hatóanyag azon képességével magyarázhatóan, hogy hozzákötődik a kóros sejtek felszíni azialofentinjéhez (lektin), ami a tumorsejtek aggregálódását és kicsapódását eredményezi. Ezenkívül a kivonat enzime- 60 két és a nukleinsavszintézisben, valamint a metabolizmusban részt vevő nem kívánt géntermékeket is gátol.

A találmány oltalmi köre természetesen nem korlátozódik az itt részletezett esetekre, hanem kiterjed mindazokra a változatokra is, melyek a szabadalmi igénypontokból erednek.

Irodalom

Agarwal, R., Kharya, M. D., and Shrivastava, R., 1979, „Antimicrobial anthelmintic activities of the essential oil of Nigella sativa Linn,” Indián J. Exp. Bioi. 17, 1264.

Akhtar, M. S.; Riffat, S., 1991, „Field Trial of Saussurea Láppá Roots Against Nematodes and Nigella Sativa Seeds Against Cestodes in Children, JPMA J. Pák. Med. Assoc. 41 (8) 185-7.

al-Awadi, F. M., Khattar, M. A. and Gumaa, K. A., 1985, „On Che Mechanism of the Hypoglycemic Effect of a Plánt Extráét,” Diabetologia 28, 432-434.

al-Awadi, F.; Fatania, H.; Shamte, U., 1991, „The Effect of a Plant’s Mixture Extract on Liver Gluconeogenesis in Streptozotocin Induced Diabetic Rats, Diabetes Rés. (Scotland) 18 (4): 163-8.

Aruna, K.; Sivaramakrishnan, V. M., 1990, „Plánt Products as Protective Agents Against Cancer,” Indián

J. Exp. Bioi. 28(11): 1008-11.

Aruna, K.; Sivaramakrishnan, V. M., 1992, „Anticarcinogenic Effects of Somé Indián Plánt Products,” Food Chem. Toxicol. (England) 30 (11) 953-6.

HU 226 319 Β1

Bitterman, W. A.; Farhadian, H.; Abu Samra, C; Lerner, D.; Amoun, H.; Krapf, D; Makov, U. E., 1991, „Environmental and Nutritional Factors Significantly Associated with Cancer of the Urinary Tract among Different Ethnic Groups, Urol. Clin. North. Am. 18 (3) 501-8.

Chopra, R. N., Chopra, I. C., Handa, K. L., and Kapur, L. D., 1982, Indigenous Drugs of India, Academic Publishers; Calcutta, India.

Datta, A. K., Biswas, A. K. and Ghosh, P. D., 1983, „Chromosomal variations in callus tissues of two species of Nigella sativa, L.,” The nucleus 26 (3) 173-177.

Eikadi, A,; Kandil, O., 1937, „The Black Seed Nigella sativa and Immunity Its Effects on Humán Cell Subsets,” Fed. Proc. 45 (4) 1222.

Finter, N. B., 1969, „Dye Uptake Methods fór Assessing Viral Cytopathogenicity and Their Application to Interferon Assays, J. Gén. Virol. 5, 419-427.

Karén, D. F., 1989, „Flow Cytometry in Clinical Diagnosis,” American Society of Clinical Pathology (press).

Kirtikar, K. R. and Basu, B. D., 1982, Indián Medicinái Plants, Vol. I, Bishen Singh and Mahendra Pál Singh, eds., Dehra Dun, India.

Kumar, Β. H. and Thakur, S. S., 1989, „Effect of Certain Νοπ-edible Seed Oils on Growth Regulation in Disdercus Similis (F), J. Anim. Morohol. Physiol. 36 (2) pp. 209-218.

Medenica, R., Alonso, K., Huschart, T. and Tyler,

K., 1990, „Tumor Tissue Culture fór Determining Efficient Drug fór Intra-Arterial, Intra-Hepatic Chemotherapy and Interferon of Colon Carcinoma Liver Metastasis, Abstract presented at Conference on Combining BRM with Cytotoxic in the Treatment of Cancer.

Merkel, D. E., Dressler, L. G. and McGuire, W. L., 1987, „Flow Cytometry Cellular DNA Contents and Prognosis in Humán Malignancy,” J. of Clinical Oncology, 5, 1690-1703.

Metcalf, D„ 1984, Clonal Culture of Hematopoietic Cells, Elsevier/North American Biomedical Press.

Metcalf, D., 1985, „The Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factors,” Science 229,16-22.

Nadkami, K. M., 1976, „Crocus sativus, Nigella sativa,” Indián Matéria Medica, K. M. Nadkarni (ed) Bombay, India; Popular Prakashan, Vol 1, pg. 386-411.

Nair, S. C.; Salomi, M. J.; Panikkar, B.; Pannikar, K. R., 1991, „Modulatory Effects of Crocus sativus and Nigella sativa Extracts on Cisplatin-lnduced Toxicity in Mice, J. Ethnopharmocol. 31 (1): 75-83.

Salmon, S. E., Hamburger, A. W., Soehnlein, B., 1973, „Quantitation of Differential Sensitivity of Humán Tumor Stem Cells to Anticancer Drugs,” N. Eng. J. Med. 298, 1321-1327.

Salomi, N. J.; Nair, S. C.; Jayawardhanan, K. K.; Varghese, C. D.; Panikkar, K. R., 1992, „Anititumour Principles from Nigella sativa Seeds, Cancer Lett 63 (1):41-6.

Salomi, M. J.; Nair, S. C.; Panikkar, K. R., 1991, „Inhibitory Effects of Nigella sativa and Saffron (Crocus Sativus) on Chemical Carcinogenesis in Mice,” Nutr Cancer 16(1): 67-72.

Sayed, M. D., „Traditional Medicine in Health Care,” 1930, J. Ethnopharmocol. 2 (1): 19-22.

Shayeb, N. A. and Mabrouk, S. S., 1984, „Utilization of Somé Edible and Medicinái Plants to Inhibit Aflatoxin Formation,” Nutrition Reports International 29 (2).

Siddiqui, Μ. B., Álam, Μ. M., Húsain, W. and Sharma, G. K., 1988, „Ethno-medicai Study of Plants used fór Terminating Pregnancy,” Fitoterapia V. LIX, no. 3, 250.

Salmon, SE; Hamburger, AW; Soehnlein, B; et al., 1978, „Quantitation of differential sensitivity of humán tumor stem cells to anticancer drugs,” N. Engl. J. Med. 298:1321-1327.

Srivastava, K. C., 1989, „Extracts from Two Frequently Consumed Spices-Cumin (Cuminum cyminum) and Turmeric (Curcuma Longa)-lnhibit Platelet Aggregation and Altér Eicosanoid Biosynthesis in Humán Blood Platelets,” Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 37 (1)57-64.

Tennekoon, K. H.; Jeevathayaparan, S.; Kurukulasooriya, A. P.; Karunayake, E. H., 1991, „Possible Hepatotoxicity of Nigella sativa Seeds and Dregea Volubilis Leaves,” J. Ethnopharmocol. 31 (3): 283-9.

Vihan, V. S. and Panwar, H. S., 1987, „Galactopoietic Effect of Nigella sativa (H-Kalonji) in Clinical Cases of Agalactia in Goats,” Indián Vet. J. 64, 347-349.

Von Hoff, D. D., Cowan, J., Harris, J. and Reisdorf, G., 1981, „Humán Tumor Cloning: Feasibility and Clinical Correlations,” Cancer Chemother. Pharmacol. 6, 265-271.

Claims (12)

1. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának alkalmazása rákellenes kemoterápia mellékhatásaitól szenvedő emberek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, ahol az etanolos kivonatot embereknek napi 20-40 g/70 testtömeg-kg mennyiségben adjuk.

2. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának alkalmazása rákellenes immunkompetens emberi sejtek aktiválására és ezzel az emberi immunfunkció fokozására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, ahol az immunkompetens sejteket az alábbiak közül választjuk: CD 19, HLADR, NKCD3-/CD56+ vagy CD38, ahol az etanolos kivonatot embereknek napi 20-40 g/70 testtömeg-kg mennyiségben adjuk.

3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol Nigella sativa magvak etanolos kivonatának mennyisége elegendő az emberi testben rendes esetben jelen lévő egy vagy több faktor jelenlétének csökkentésére, ahol a faktorokat az alábbiak közül választjuk: interferon-inhibitor faktor és limfokin-inhibitor faktor.

4. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának alkalmazása emberekben a normál sejtek vírusok által okozott citopátiás hatással szembeni védelemre szolgáló gyógyszer előállítására, ahol a kivonatot a vírus

HU 226 319 Β1 citopátiás hatásával szemben effektív védelmet nyújtó koncentrációban juttatjuk be.

5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vírus a vesicular stomatitis vírus.

6. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának alkalmazása antitestet termelő emberi B-sejtek fokozására szolgáló gyógyszer előállítására, amely B-sejtek tumorantigén-kötőhelyekkel rendelkeznek, és ahol az etanolos kivonatot embereknek napi 20-40 g/70 testtömeg-kg mennyiségben adjuk.

7. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának alkalmazása emberi páciensekben a tumorsejteknek a nem tumorsejtekre kifejtett hatás nélküli gátlására szolgáló gyógyszer előállítására, ahol az etanolos kivonatot embereknek napi 20-40 g/70 kg-testtömeg mennyiségben adjuk.

8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tumorsejtet az alábbi csoportból választjuk: melanoma- vagy vastagbélráksejt.

9. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának al5 kalmazása emberi csontvelőképződés fokozására szolgáló humán gyógyszer előállítására, ahol a kivonatot csontvelőképződés stimulálására hatásos koncentrációban adjuk.

10. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának a 10 4-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazása, ahol a kivonatot embereknek napi 20-40 g/70 kg-testtömeg mennyiségben adjuk.

11. Nigella sativa magvak etanolos kivonatának 10. igénypont szerinti alkalmazása, ahol az említett adag

15 körülbelül 30 g/70 kg-testtömeg.