HU226255B1 - Mycobacterium vaccae for down-regulation of the th2 activity of the immune system - Google Patents

Description

A találmány kiterjed továbbá egy készítményre olyan betegség kezelésében történő alkalmazásra, amelyet egy egyén immunrendszere Th2-aktivitásának a serkentődése jellemez, ahol a kezelés magában foglalja az egyén immunrendszerének Th2-aktivitásának korlátozását a Th1-aktivitásának a serkentődése nélkül, amely készítmény Mycobacterium vaccaeből származó antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyagot tartalmaz, és nem tartalmaz nem M. vaccae eredetű antigént, immunogént vagy allergént, és ahol a rendellenesség Krónikus Fáradtság Szindróma, öböl-háború Szindróma, Teljes Allergia Szindróma, asztma, szénanátha vagy ekcéma.

HU 226 255 Β1

A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 10 lap ábra)

HU 226 255 Β1

A találmány olyan rendellenességek kezelésével kapcsolatos, amelyeket az jellemez, hogy az immunrendszer működése a Th1-sejtek tevékenységétől a Th2sejtek tevékenységének irányába tolódik el. A találmány azon a meglepő felfedezésen alapszik, hogy a Mycobacterium vaccae preparátumok képesek arra, hogy kiváltsák a Th1-sejtek nemspecifikus szisztémikus működésének az eltolódását, különösen a Th2-sejtek aktivitásának korlátozásával, a kísérő Th1-sejtek aktivitásának egyidejű serkentése nélkül. A rendellenességek, amelyekre a jelen találmány alkalmazható, magukban foglalják a Krónikus Fáradtság Szindrómát, az öböl-háború Szindrómát, a Teljes Allergia Szindrómát, asztmát, szénanáthát és ekcémát.

A Krónikus Fáradtság Szindrómában (Chronic Fatigue Syndrome, CFS) (Turnberg atal.) szenvedő betegek esetében előfordulhat, hogy allergiás tünetek gyakrabban fordulnak elő, kétszer nagyobb az allergiás bőr reakciók száma, az NK (Natural Killer, természetes ölősejtek) sejt aktivitása alacsony és az IFNy és IL-2 termelődése is alacsony (Straus, 1996.). Sokaknak az EB (Epstein-Barr) vírus elleni antitest szintje magas, amely szintén a csökkent Th1-sejtaktivitással rendelkező egyének egyik jellemzője. A betegek depressziósak és hangulatuk is változó. Ezek a tulajdonságok a Th1-aktivitás Th2-aktivitás felé történő eltolódásával függnek össze a citokinprofilban. Ez az eltolódás a modem életvitel következménye lehet, amelynek során a lakosság nem kap elegendő Th1-sejteket indukáló ingert, és inkább a Th2-sejteket indukáló immunizálásoknak és allergéneknek teszik ki.

A jelen találmány feltalálói úgy gondolják, hogy az Öböl-Háborús Szindróma a CFS egy speciális esetét jelenti, ahol a Th2-sejteket indukáló ingereket azonosítani lehet, mivel az Öböl-háborúban teljesítő személyzet többször kapott Th2-sejteket indukáló oltásokat. Az oltások vagy fertőzések szisztémikus hatást fejtenek ki és nemspecifikusan növelik vagy csökkentik a más nem rokon antigénekre adott válasz Th1/Th2-sejtek citokinegyensúlyát (Shaheen és munkatársai, 1996, Shirakawa és munkatársai, 1996) és befolyásolják (pozitívan vagy negatívan) az össze nem függő betegségek túlélését (Aaby, 1996, Aaby és munkatársai, 1995). A feltalálók azon meggyőződését, hogy az Öböl-háborúban alkalmazott oltások szisztémikus Th2-sejt-aktiválódást indukáltak, az oltás protokolljának négy jellemzője támasztja alá:

(i) Az Öböl-háborúban a brit csapatoknál Pertussist alkalmaztak adjuvánsként és ennek adjuváns hatása elsősorban Th2-sejt-aktiválódásra hat (Mu & Sewell, 1993, Ramiya és munkatársai, 1996, Smit és munkatársai, 1996).

(ii) Az Öböl-háborús csapatok katonáinak Th2-sejteket Indukáló immunogéneket adtak pestis, lépfene, tífusz, tetanusz és kolera ellen. Azonkívül az ilyen nagy antigénterhelési tendenciák a Th2-sejt-aktiválódás irányába történő válaszreakciókhoz vezetnek (Aaby, 1995, Bretscher és munkatársai, 1992, Hernandez-Pando & Rook, 1994).

(iii) Az oltásokat a csapatok háborús zónába történő telepítése után vagy éppen az odautazásuk előtt adták be, amikor a stresszes szintek magasak lehettek. A megnövekedett glükokortikoid (például kortizol) szintek jelenlétében az immunizáció a Th2-sejt-aktiválódás irányába történő válaszreakciókhoz vezetnek (Bernton és munkatársai, 1995, Brinkmann & Kristofic, 1995, Ramirez és munkatársai, 1996).

(iv) A csapatok karbamát- és szerves foszfortartalmú rovarölő szereknek is ki voltak téve, amely vegyületek a normális Th1-sejt-aktiválódásban alapvető IL-2vezérelt folyamatokat gátolják (Casale és munkatársai, 1993). Ennek a komponensnek a fontossága bizonytalan. Habár, a hírek szerint, a rovarölő szereket az Öbölben gyakran helyi forrásokból szerezték be, így azok tisztasága nem ismert és még több mérgező szennyezést tartalmazhattak.

Ily módon az alkalmazott körülmények között az összetett oltások hosszan tartó szisztémikus citokinegyensúlyhiányt okozhattak. Hasonló jelenség fordulhat elő elszórtan a civil lakosság körében az oltások vagy más Th2-sejteket indukáló környezeti hatások és fertőzések következtében és visszavezethető a széles körben elterjedt Krónikus Fáradtság Szindróma előfordulására.

A fentieket a továbbiakban részletesen ismertetjük.

A jelen feltalálók azt a meglepő megfigyelést tették, hogy az (elölt) Mycobacterium vaccae preparátumok nemspecifikus módon képesek hatásosan helyreállítani a szisztémikus Th1-sejt-aktiválódás Th2-sejt-aktiválódás irányába történő eltolódását. A hatás abból áll, hogy az immunrendszer működése eltolódik a Th2-sejtek aktiválódásától oly módon, hogy tartalmazza az olyan antigénekre adott immunválaszt, amelyek nincsenekjelen a beinjektált M. vaccae preparátumban.

Ezt kísérletileg egy állatmodellben és egy embermodellben szemléltettük. Reprezentatív kísérleteinket az alábbiakban foglaljuk össze. Közelebbről, kísérleteink meglepően a Th2-sejtek aktivitásának korlátozódását mutatják, amely nem kapcsolódhat a Th1-sejt aktiválódásának fokozódásával.

Röviden, az M. vaccae kezelést kapott kísérleti állatokban az ovalbuminra (egy, magával a M. vaccaeval kapcsolatban nem lévő allergén) adott válasz IL—4 (Th2) függő antitest titerének csökkenéseként figyelhető meg a nemspecifikus szisztémikus Th2-sejt-aktivitástól történő eltolódás egerekben, amelyeket úgy előimmunizáltunk, hogy Th2-sejt-választ hozzon létre. Az M. vaccae preparátum egyszeri injektálása képes kiváltani ezt a hatást, és további injektálások fokozhatják azt. A hatás nemspecifikus, mivel nincs szükség az injektált preparátumban az ovalbumin bármelyik komponensének jelenlétére.

Emberekben (rákos betegekben) a hatás forbol-mirisztát-acetáttal és kalcium-ionoforral történő stimulálás után a perifériás vérben spontán módon IL-2-t (jellegzetes Th1 citokin) kiválasztó limfociták megjelenésével és az IL-4-et (jellegzetes Th2 citokin) szekretáló T-sejtek számának csökkenésével volt kimutatható. Az aktivált Th1-fenotípust mutató limfociták aránya fokozatosan nő minden egymást követő M. vaccae injektálás után, 10⁹ organizmust 3-5-ször injektálva egyes egyé2

HU 226 255 Β1 nekben egy platóértéket ér el (0., 15., 30. napon, majd havonta beadva).

Ezenkívül a további eredményeink magukban foglalják a Krónikus Fáradtság Szindrómában szenvedő betegek azon eseteit, akiknél M. vaccae preparátumokkal kedvező hatásokat értünk el.

A jelen feltalálók korábban ismertették az M. vaccae alkalmazását a tuberkulózis (GB-A-2156673 számú szabadalmi bejelentés), rák (ZA 95/2644 számú szabadalmi bejelentés), HÍV (WO 94/06466 számon közzétett nemzetközi bejelentés) és krónikus gyulladás (GB-B-2252044 számú szabadalmi bejelentés) kezelésére. A WO 92/08488 számon közzétett nemzetközi bejelentés (szintén a jelen feltalálóktól) az M. vaccae adjuvánskénti alkalmazását ismerteti egy fontos antigénnel együtt, ahol azt figyeltük meg, hogy az antigénre adott válasz T-sejt-összetétele a Th2-mintázattól a Th1-mintázatba alakult át. A WO 92/08488 számon közzétett nemzetközi bejelentés nem utal arra, hogy az M. vaccae okozhat-e nemspecifikus Th2/Th1 eltolódást az immunrendszer működésében, vagy bármilyen más eltolódást, mint az M. vaccaeval beadott antigénre specifikusan adott válasz esetén. Azonkívül sem a WO 92/08488 számú közzétételi iratban, sem máshol nincs olyan ajánlás, hogy az M. vaccae a Th2-sejtek működését korlátozhatja, a Th1-sejtek működésének egyidejű serkentése nélkül.

Az M. vaccaeról mintThl-adjuvánsról szóló beszámolók az Abou-Zeid és munkatársai (1997), Skinner és munkatársai (1997a) és Skinner és munkatársai (1997b) publikációit foglalják magukban. Ez található még Mosmann és Sad (1996) publikációjában, amely a Th2-sejt sejtburjánzására gátlóhatással levő Th1 citokin serkentését ismerteti.

A jelen találmány általánosan az egyén immunrendszere Th2-aktivitásának korlátozására vonatkozik a Th1-aktivitás serkentődése nélkül, különösképpen az olyan rendellenességek kezelésében, amelyekre az jellemző, hogy az immunrendszer aktivitása a Th 1-től a Th2 irányába tolódik el, különösen ahol a Th2-aktivitás korlátozása az előnyös a vele együtt előforduló Th1-aktivitás serkentődése nélkül.

A jelen találmány a Mycobacterium vaccae antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyagának olyan gyógyszer előállítására történő alkalmazására vonatkozik, amely egy egyén gyógykezelésére alkalmas. Közelebbről, a találmány Mycobacterium vaccaeből származó, antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyag alkalmazását nyújtja olyan betegség kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására, amelyet egy egyén immunrendszere Th2-aktivitásának a serkentődése jellemez, ahol a kezelés magában foglalja az egyén immunrendszere Th2-aktivitásának korlátozását (csökkentését) a Th1-aktivitásának a serkentődése nélkül, amely gyógyszer nem tartalmaz nem M. vaccae eredetű antigént, immunogént vagy allergént, és ahol a rendellenesség Krónikus Fáradtság Szindróma, öböl-háború Szindróma, Teljes Allergia Szindróma, asztma, szénanátha vagy ekcéma.

A jelen találmány továbbá egy egyén gyógykezelésére alkalmazható anyagot vagy készítményt nyújt, amely anyag vagy készítmény magában foglalja a Mycobacterium vaccaeból származó antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyagot. Közelebbről, a találmány készítményt biztosít olyan betegség kezelésében történő alkalmazásra, amelyet egy egyén immunrendszere Th2-aktivitásának a serkentődése jellemez, ahol a kezelés magában foglalja az egyén immunrendszerének Th2-aktivitásának korlátozását a Th1-aktivitásának a serkentődése nélkül, amely készítmény Mycobacterium vaccaeből származó antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyagot tartalmaz, és nem tartalmaz nem M. vaccae eredetű antigént, immunogént vagy allergént, és ahol a rendellenesség Krónikus Fáradtság Szindróma, Öböl-háború Szindróma, Teljes Allergia Szindróma, asztma, szénanátha vagy ekcéma.

A M. vaccae preparátum tehát bármilyen külső („idegen”) antigén, immunogén vagy allergén anyag nélküli.

A kezelendő rendellenességek a betegek immunrendszerének Th1-aktivitásától a Th2-aktivitás irányába történő általános, nemspecifikus eltolódással jellemezhetőek. Ez az egyénben a lecsökkent IL-2- vagy a megnövekedett IL—4- vagy IL-5-termeléssel, illetve az IL—13 mint egy jellegzetes Th2 citokin és az interferongamma (IFNy) mint tipikus Th1 citokin detektálásával állapítható meg vagy diagnosztizálható. Más Th1/Th2 citokinek is szóba jöhetnek. Az immunrendszer Th1 irányából a Th2 irányába történő nemspecifikus eltolódása nem tulajdonítható annak vagy nem okozhatja az, hogy az egyént egy különleges antigén érte vagy egy különleges patogén fertőzte meg. A kezelendő egyének nem szenvedhetnek tuberkulózisban vagy más mikobakteriális fertőzésben. Azok a rendellenességek, amelyek a jelen találmány szerint kezelhetők, magukban foglalják a Krónikus Fáradtság Szindrómát, az Öböl-háborús Szindrómát és a Teljes Allergiás Szindrómát (Straus, 1996). Más rendellenességek, amelyekben a Th1 serkentődese nélkül a Th2 korlátozása előnyös, a jelen találmány szerint kezelhetők.

A Krónikus Fáradtság Szindróma például az úgynevezett 1994 CDC kritériumok (Fukuda és munkatársai) vagy az úgynevezett Oxford kritériumok (Sharpé és munkatársai) alkalmazásával határozható meg. A Krónikus Fáradtság Szindrómáról a jelenlegi ismereteinket a Tumberg és munkatársai által 1996. októberben publikált cikkben vitatták meg és foglalták össze.

A Mycobacterium vaccae anyag a M. vaccae elpusztult sejtjei lehetnek vagy az anyag azokat tartalmazza. Az ilyen sejtek elpusztíthatók például sugárkezelés alkalmazásával, például ⁶⁰Co 2,5 Mrad dózis alkalmazásával, vegyi úton vagy bármely más eszközzel, bár a gőzsterilezés javasolt, például 69 kPa nyomáson, 10 percig, 115 °C-125 °C hőmérsékleten. A gőzsterilezés hatásosabb készítményt eredményezhet, mint a sugárkezelés.

Az M. vaccae sejteket elpusztításukat megelőzően alkalmas szilárd közegen növeszthetjük. Egy módosított Sauton-féle folyékony közeg ajánlható (Boyden és munkatársai) agarral, előnyösen 1,3% agarral megszilárdítva. Aerob inkubálás után, amely általában 32 °C-on 10 napig tart, az organizmusokat összegyűjt3

HU 226 255 Β1 hetjük, majd megmérjük és hígítószerben szuszpendálva az anyag kész a beadásra. A tárolást, ha az alkalmazás előtt szükséges, 4 °C-on végezzük.

A sejtek növesztésére a szilárd közeg helyett egy folyékony közeg, így a módosított Sauton közeg (Boyden és munkatársai) alkalmazható, például fermentorban.

Az hígítószer pirogénmentes, nem pufferolt sóoldat lehet. Előnyösen az hígítószer boráttal pufferolt, előnyösen egy olyan felületaktív anyagot tartalmaz, mint a Tween 80®. Alkalmas borátpuffer: Na₂B₄O₇.10H₂O-3,63 g, H₃BO₃-5,25 g, NaCI-6,19 g, Tween 80® 0,0005%, 1 liter desztillált vízben feloldva. Ezek a hígítószerek gyógyászatilag elfogadottak.

Az említett humán eredményeket az M. vaccae beadásával kaptuk, ilyen az SRL172 egy GMP készítmény, amely humán alkalmazásra hozzáférhető több kutató Federal Drug Administration IND-jei és az egyesült királyságbeli Medicines Control Agency CTX-ei alatt. GLP akut toxikológiát a Huntingdon Research intézet végezte el. Az 1. fázisú és 2. fázisú biztonsági adatokat az USA-ban kaptuk meg, és letétbe helyeztük az FDA-nál. Az SRL172 a 3. fázisban van a tuberkulózis immunterápiájának vizsgálatainál. Az SRL172 előnyösen alkalmazható a jelen találmány szerint.

Az SRL172 olyan M. vaccae készítmény, amely az R877R-rel jelölt törzsből származik, és amelyet a Budapesti Egyezmény alapján a National Collection of Type Cultures-ben (NCTC), Central Public Health Laboratory, Colindale, Avenue, London NW9 5HT, UK 1984. február 13-án helyeztünk letétbe NCTC 11659 szám alatt. Az R877R törzset eredetileg a közép-ugandai Lango láp területéről izoláltuk (Stanford and Paul).

Az SRL172 törzs helyett más M. vaccae törzsek is használhatók. Egy organizmust mint M. vaccaehoz tartozó fajt biokémiai és antigénikus kritériumok alapján azonosíthatunk.

A jelen találmány esetében alkalmazott M. vaccae anyagot nem M. vaccae antigénhatású vagy immunszabályozó anyagtól mentesen adjuk be. Más szóval az alkalmazandó gyógyszer vagy készítmény M. vaccae antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyagból, így elpusztult sejtekből, azok extraktumából vagy származékából és egy gyógyszerészetileg elfogadható hígítószerből áll vagy azt tartalmaz.

A beadás előnyösen „terápiásán hatásos mennyiség”-ben történik, ez elégséges ahhoz, hogy a beteg esetében javulást mutasson. A legkisebb ilyen javulás lehet legalább egy tünet enyhülése. A beadott tényleges mennyiség és a beadás sebessége és mértéke annak a természetétől és súlyosságától fog függeni, amit kezelni fogunk. A kezelés előírása, például a dózis értékének eldöntése stb. az általános orvos és más egészségügyi orvos felelősségéhez tartozik.

Egy egyszeri dózis (ahol elpusztult sejteket kell beadnunk) általában 10⁷—10¹° elpusztított M. vaccae mikroorganizmust tartalmaz. A betegeknek 10⁸-10⁹ elpusztult M. vaccae egyszeri dózisát adhatjuk be, bár ha szükséges, a dózis ismételhető, például 2 héttől 6 hónapig terjedő intervallumokban.

A készítmény beadható egyedül vagy más kezelésekkel kombinálva, vagy egyidejűleg vagy egymást követően, a kezelendő beteg állapotától függően.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a hatóanyagon kívül gyógyszerészetileg elfogadható kötőanyagot, hordozóanyagot, puffért, stabilizálóanyagot vagy a szakember által ismert más anyagokat tartalmazhatnak. Ezen anyagoknak nem mérgezőeknek kell lenniük, és nem szabad a hatóanyag hatékonyságát befolyásolniuk. A hordozó vagy más anyagok jellege a kezelés módjától függ, amely előnyösen injektálással történik, például kután, szubkután vagy intradermálisan.

Injektáláshoz a hatóanyagnak parenterálisan elfogadható vizes oldat alakjában kell lennie, amely pirogénmentes, alkalmas pH-jú, izotonikusságú és stabilitású. Az alkalmas hígítószereket, amelyek gyógyászatilag elfogadhatóak és előnyben részesíthetőek, az előzőekben már tárgyaltuk.

Alkalmazhatunk orális beadást, ebben az esetben a gyógyszerkészítmény tabletta, kapszula, por vagy folyékony alakban fordulhat elő. A tabletta szilárd hordozót, így zselatint vagy egy adjuvánst tartalmazhat. A folyékony gyógyszerkészítmények általában egy folyékony hordozót tartalmaznak, ilyen a víz, petróleum, állati vagy növényi eredetű olajok, ásványolaj vagy szintetikus olaj. Tartalmazhatnak még fiziológiás sóoldatot, dextrózt vagy más szacharidoldatot vagy glikolokat, így etilénglikolt, propilénglikolt vagy polietilénglikolt.

Az M. vaccaet beadhatjuk aeroszol segítségével a légutakba, egy erre alkalmas készítmény alkalmazásával, amely például olyan méretű részecskéket tartalmaz, amelyek így eljuthatnak a légutak megfelelő részeibe. Ez inkább szárított por lehet, mint vizes szuszpenzió.

Az elpusztult sejtek helyett egy, az M. vaccaeből származó anyag, különösen egy, a szükséges aktivitással rendelkező extraktum vagy szintetikus molekula alkalmazható.

Ahogyan azt az előzőekben tömören ismertettük, a többszörös oltások, a stressz és más faktorok egy hosszan tartó szisztémikus citokin-egyensúlyhiányt okozhattak az Öböl-háborús veteránoknál. Ugyanez a hatás fordul elő szórványosan oltások vagy más Th2indukáló környezeti ingerek és fertőzések következtében a civil népesség körében, és ez indokolhatja a Krónikus Fáradtság Szindróma széles körű elterjedését.

Az erős immunogéneknek szisztémikus, hosszan tartó, nemspecifikus hatásai lehetnek a nem rokon antigénekre adott immunválasz természetére. Például a kanyarófertőzés csökkenti az atópia és a házi poratkára adott allergiás reakciók előfordulását (Shaheen és munkatársai., 1996). Hasonlóan a pozitív tuberkulin bőrpróbával rendelkező japán gyerekek kevésbé atópiásak, mint a tuberkulin-negatív gyerekek és a körforgásban lévő Th1/Th2 citokinek aránya is magasabb. Azonkívül nagyobb valószínűséggel szűnnek meg az atópiás tünetek azokban, akikben a BCG-vel történő ismételt injektálások után tuberkulin-átalakulás történik (Shirakawa és munkatársai., 1996).

HU 226 255 Β1

A kanyaró elleni oltás erre a másik példa. Amikor ezt az oltóanyagot standard dózisban adták be, jelentősebb mértékben csökkent a halálozás, mint amennyivel a nem beoltott népesség körében a kanyaró előfordulása megmagyarázhatná. A diftéria, tetanusz és a szamárköhögés vakcinái (Th2-indukáló) nem mutatják ezt a nemspecifikus védőhatást (Aaby és munkatársai., 1995). Azonban amikor a kanyaróvakcina magas titerét alkalmazták a halálozások száma növekedett, bár a kanyaróval szembeni védelmet megőrizték (Aaby,

1995, Aaby és munkatársai, 1995). Nyilvánvaló, hogy a halálozások növekedése együtt járt a Th2-sejtek irányába történő aktiválódással és egy Th2-komponens indukciójában történő dózisfüggő növekedés több más immunogén számára jól megalapozott (Bretscher és munkatársai, 1992, Hernandez-Pando&Rook, 1994). Az Öböl-háborúban alkalmazott vakcinák Th2-indukálók voltak (pestis, lépfene, tífusz, tetanusz, kolera), és felhalmozódva nagy antigénterhelést jelentettek, további Th2-indukálást elősegítve. Azonkívül ez a tendencia megnövekedett a pertussis adjuvánskénti alkalmazásától, mivel az potenciális indukálója a Th2-sejteknek (Mu&Sewell, 1993, Ramiya és munkatársai,

1996, Smit és munkatársai, 1996). A pertussis ezen tulajdonsága nemrég annak a lehetőségnek a megvitatásához vezetett, hogy a gyerekekben történő alkalmazása hozzájárul az atópia egyidejűleg megnövekedett gyakoriságához (Nilsson és munkatársai, 1996, Odent és munkatársai, 1994).

Azt a veleszületett hajlamot ezeknek a vakcináknak az esetében, hogy szisztémikus Th2-sejt-választ adjanak, jelentősen növelik az Öböl-háborús személyek beoltásakor őket ért stressz szekunder endokrin faktorai.

Sok szteroid hormon T-sejt-válaszokat modulál. A dehidroepiandroszteron (DHEA) vagy ismeretlen metabolitjai Th1-mintázat kialakulásának elősegítésére hajlamos. így a DHEA Idős egerekben helyreállíthatja az immunfunkciókat és korrigálhatja az öreg állatokban tapasztalható rendellenesen szabályozott citokinfelszabadulást (Daynes és munkatársai, 1993, Garg&Bondada, 1993). A DHEA hasonló tulajdonságait megvizsgálták idős emberekben (Morales és munkatársai, 1994). A DHEA fokozza az IL-2 és IFNy Th1 citokinek termelődését (Daynes&Araneo, 1989, Daynes és munkatársai, 1990, Daynes és munkatársai, 1995, Daynes és munkatársai, 1991). A DHEA az emberi perifériás vér T-sejtjeiből történő IL-2 szekréciót is fokozza (Suzuki és munkatársai, 1991).

A glükokortikoidok, így a kortizol hatása a DHEA hatásaival ellentétes, fokozzák a Th2-aktivitást és együttműködik a Th2 citokinekkel (Fischer&Konig, 1991, Guida és munkatársai, 1994, Padgett és munkatársai, 1995, Wu és munkatársai, 1991). Az „ártatlan” T-limfociták proliferációja egy nemspecifikus inger (Brinkmann&Kristofic, 1995) vagy egy antigén által (oltásokat követően) Th2 citokinprofilú T-limfociták kifejlődéséhez vezet. Ezt inkább a normál körülmények között tartott kevés memóriasejtet tartalmazó „tiszta” laboratóriumi rágcsálókból származó lépsejtekkel lehet tisztán kimutatni (Ramirez és munkatársai, 1996).

Összefoglalva az „utolsó sor”-t, a kortizol kedvez a Th2 citokinprofil kifejlődésének az éretlen sejtekből (Brinkmann&Kristofic, 1995). Ezt a pontot nem szabad összekeverni azzal a ténnyel, hogy az érett Th2-sejtek citokinszekréciós aktivitását a kortizol könnyen gátolja, (gy a kortizolanalógok alkalmazása a Th2-mediált betegségek, mint a bőrkiütések, asztma, és szénanátha hagyományos kezelése esetén gyulladásgátló hatásokon keresztül és a Th2-sejtek citokintermelésének csökkenése által fejtik ki hatásukat (Corrigan és munkatársai, 1995) és mégis ugyanakkor a kortizol alkalmazása elő fogja segíteni az alapprobléma fennmaradását az újonnan verbuválódott T-sejtek Th2-sejtválasz irányába történő irányításával.

A pszichológiai és fizikai stressz a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyt aktiválja és így a változások sokaságához vezet beleértve a megnövekedett kortizoltermelődést. A táplálék és az alvás túlzott mértéke vagy hiánya a DHEA arányának csökkenését eredményezte a kortizolhoz viszonyítva (DHEA/kortizol arány). Ez közvetlenül a késleltetett hiperszenzitivitás (DTH) érzékenységének csökkenésével (ami egy Th1-sejtválaszjelző) és a szérum IgE-szintek egyidejű emelkedésével van összefüggésben. Az IgE teljesen a Th2 citokin termelődésének függvénye (Bernton és munkatársai, 1995). A DHEA és kortizol fentiekben ismertetett hatásainak figyelembevételével ez volt várható.

A stressz Th1->Th2 átkapcsoló hatásának egy további példája az EB vírus antitest növekedése azokban a diákokban, akik bizonyos mértékig stresszesen reagálnak a vizsgáikra. Ez a vírus rendszerint a Th1-válasz és a citotoxikus T-sejtek ellenőrzése alatt áll és az ellenőrzés elvesztése a vírus replikációját és emelkedett antitestszintet eredményez (Zwilling, 1992). Ehhez hasonlóan a vizsgaidőszak alatt orvostanhallgatóktól vett perifériás vér leukociták alacsonyabb IFNy, egy Th1 citokin mRNS-szintet mutattak (Glaser és munkatársai, 1993).

Hasonló vonásokat mutathatunk ki állatokban egy jobban ellenőrzött módszer segítségével. A zsúfoltság vagy korlátozottság következtében a stressz növelheti a mikobakteriális növekedést a tuberkulózisban szenvedő egerekben (Brown és munkatársai, 1993, Tobach&Bloch, 1956). Ez egy olyan modell, amely még egy kis Th2-komponensre is erősen érzékeny (Rook&Hemandez-Pando, 1996). Ezzel kapcsolatban más példákat is megemlítenek (Moynihan, 1994).

Figyelemre méltó bizonyíték, hogy a depresszió túlzott kortizol-közvetített hatásokkal társulhat az agyban (Raven és munkatársai, 1996-ban ismertették), és a stressz depresszióhoz vezethet. így a depresszió hajlamos társulni az olyan Th2-mediált betegségekkel, mint az asztma és ekcéma és néhány endokrin változás közös a Th2 betegségek és a depresszió esetében (Holsboer és munkatársai, 1984, Rupprecht és munkatársai, 1995).

A tuberkulózis esetében szisztémikus Th2-eltolódás van (Rook&Hemandez-Pando, 1996), és a mellékvese-szteroidok lebontási termékeinek szokatlan mintázata választódik ki a vizeletbe (Rook és munka5

HU 226 255 Β1 társai, 1996). (gy a kortizon metabolitjaihoz viszonyítva a kortizol metabolitjai megnövekedett mennyiségben vannak jelen. A betegség kezelése helyreállítja a Th1túlsúlyt és korrigálja a szteroid metabolitok mintázatát, úgy hogy a kortizon metabolitjai növekednek a kortizol metabolitjaihoz képest (Rook és munkatársai, 1996). A depresszió metirapon gyógyszerrel történő kezelése azonos változásokat okoz a szteroid metabolitok esetében (például növeli a kortizon metabolitjait a kortizol metabolitjaihoz viszonyítva) (Raven és munkatársai, 1995). Az M. vaccae SRL172 készítmény hatásos a tuberkulózis immunterápiájában.

Amint azt a fentiekben kifejtettük, az oltások szisztémikus változásokat indukálhatnak a Th1/Th2 egyensúlyban csakúgy, mint az antigénspecifikus immunizálásban, amire általában törekednek. A CFS kezeléséhez szükség lehet egy szisztémikus nemspecifikus Th1-eltolódás indukciójára azért, hogy a normális egészséges egyénekre jellemző Th1-túlsúlyt a Th2 felett visszaállítsuk. Ez az ellentéte annak az eltolódásnak, amit az Öbölben kapott oltások idézhettek elő a személyzet körében.

Az általunk bemutatott kísérleti eredmények meglepő módon azt mutatják, hogy a Mycobacterium vaccae készítmények csökkenthetik a káros Th 1-től a Th2 irányába történő eltolódást, amely az Öböl-háborús veteránoknál figyelhető meg.

A találmányt a kísérleti példák és a következő ábrák segítségével szemléltetjük.

Az 1. ábra a teljes szérum IgE- (ng/ml ±SD) változást mutatja az egerekben ovalbuminnal történt első immunizálást követő különböző napokon, az adatokat a 46. napon mért értékhez viszonyítva számoltuk. A teli körök az M. vaccae recipienseket jelentik; az üres négyzetek jelentik a sóoldatos kontrollokat. Az egyszerűség kedvéért az ovalbuminnal történő immunizálás és az M. vaccaeval vagy sóoldattal történt kezelés napjait megjelöltük.

A 2. ábra az ovalbuminnal kezelt egér lépsejtjeiből in vitro felszabadult IL—5 (pg/ml ±SD) méréseket mutatja. Az alkalmazott módszerrel mért minimális koncentráció 15,6 pg/ml volt.

A 3. ábra mutatja a sóoldat szubkután injektálásával végzett kezelés hatását (·), 10⁷ db M. vaccae sejtet tartalmazó készítményhez viszonyítva (o), a teljes szérum IgE-re (ng/ml), megelőzően ovalbuminnal immunizált BALB/c egerekben. A 3A. ábra 10⁷ módosítatlan M. vaccae (Mv), a 3B. ábra ovalbuminnal konjugált M. vaccae (Mv-OVA), a 3C. ábra NaCI-dal mosott és perjodáttal kezelt kontroll M. vaccae (NaCI-Mv) alkalmazását mutatja. Az adatok a 46. napon kapott minták leolvasásából nyert értékhez viszonyított relatív változást fejezik ki. Az immunizálás és a kezelés ütemezését az ábrákon jelöltük (ÓVA: ovalbuminnal történt immunizálás, 50 pg ÓVA IFA-ban (hiányos Freund-féle adjuváns, Incomplete Freund’s Adjuvant) oldva.

A 4. ábra a sóoldat szubkután injektálásával végzett kezelés hatásait mutatja (·), 10⁷ db M. vaccae sejtet tartalmazó preparátumhoz viszonyítva (o), az ovalbumin specifikus IgE-η (ng/ml) keresztül előzőén ovalbuminnal immunizált BALB/c egerekben. A 4A. ábra a 10⁷ módosítatlan M. vaccae (Mv), a 4B. ábra ovalbuminnal konjugált M. vaccae (Mv-OVA) és a 4C. ábra NaCI-dal mosott és perjodáttal kezelt kontroll M. vaccae (NaCI-Mv) alkalmazását mutatja. Az adatok a 46. napon kapott minták leolvasásából nyert értékhez viszonyított relatív változást fejezik ki. Az immunizálás és a kezelés ütemezését az ábrákon jelöltük.

Az 5. ábra az ovalbuminnal tenyésztett splenociták által termelt IL—2 mennyiségét mutatja. A lépsejteket a 109. napon nyertük egerekből, melyeket a 0. és a 24. napon ovalbuminnal immunizáltunk, és az 53. és 81. napon sóoldattal, 10⁷ módosítatlan M. vaccae (Mv)-val, M. vaccaen konjugált ovalbuminnal (Mv-OVA) vagy megfelelő kontrollként NaCI-dal mosott és perjodáttal kezelt kontroll M. vaccaeval (NaCI-Mv) kezeltünk. Az IL—2 kiértékeléséhez 24 óra után tenyészet felülúszót gyűjtöttünk. Az adatokat a citokin átlagértékében adjuk meg±SD (pg/ml).

A 6. ábra az ovalbuminnal tenyésztett splenociták által termelt IL—5 mennyiségét mutatja. A lépsejteket a 109. napon nyertük egerekből, amelyeket a 0. és a 24. napon ovalbuminnal immunizáltunk, és az 53. és 81. napon sóoldattal, 10⁷ módosítatlan M. vaccae (Mv)-val, M. vaccaen konjugált ovalbuminnal (Mv-OVA) vagy megfelelő kontrollként NaCI-dal mosott és perjodáttal kezelt kontroll M. vaccaeval (NaCI-Mv) kezeltük. Az IL—5 kiértékeléséhez 24 óra után tenyészet felülúszót gyűjtöttünk. Az adatokat az IL—5 átlagértékében adjuk meg±SD (pg/ml).

A 7. ábra mutatja a különböző M. vaccae dózisok egyszeri szubkután injektálásával történt kezelés hatását a sóoldattal összehasonlítva a szérum IgE-szinteken keresztül előzetesen ovalbuminnal immunizált BALB/c egerekben. A szérum IgE-t a 32. napon (az M. vaccaeval vagy a sóoldattal történő kezelés előtt) vett minták segítségével nyert leolvasásokhoz viszonyított változásként (ng/ml) fejeztük ki (átlag ±SD). Az utókezelt mintákat az 52. és 70. napokon gyűjtöttük (például a 10 és 28 nappal a 42. napon történt M. vaccae vagy sóoldatos kezelés után). Az immunizálást és a kezelési programokat a kísérleti eljárásokban jelöltük. A különböző csoportok közötti összehasonlítást Mann-Whitney-féle U-teszttel végeztük.

A 8. ábra mutatja a splenociták által termelt IL—2 (8A. ábra) és IL—4 (8B ábra) mennyiségét OVA.BALB/c egerekben, amelyek kétszeres ovalbumin mennyiséget kaptak a különböző dózisú M. vaccaehoz: 10⁷, 10® vagy 10⁹ (pg/ml). A splenocitákat begyűjtöttük és a 82. napon ovalbuminnal tenyésztettük. Az immunizálás és a kezelés ütemezését a kísérleti eljárásokban jelöltük. Az IL-4 kiértékeléséhez 48 óra után és az IL—2 kiértékeléséhez 24 óra után tenyészet felülúszót gyűjtöttünk. Az adatokat a citokin átlagértékében adjuk meg±SD (pg/ml). A különböző csoportok közötti összehasonlítást Student-féle t-teszttel végeztük, (sóoldat: a sóoldatos kezelést megelőzően kétszer immunizáltunk ovalbuminnal; 10⁷ Nv: a 10⁷ M. vaccaeval történő kezelést megelőzően kétszer immunizáltunk ovalbuminnal).

HU 226 255 Β1

A 9. ábra az M. vaccae két szubkután injektálásával (53. és 81. napon) történt kezelés hatását mutatja a sóoldattal összehasonlítva a szérum IgE (9A. ábra) és ovalbumin-specifikus IgE- (9B. ábra) szinteken keresztül. Az immunizálás és a kezelés ütemezését az ábrán jelöltük. A szérum IgE-t a 46. napon vett mintákkal nyert leolvasásokhoz viszonyított változásként±SD fejeztük ki (ng/ml). A különböző csoportok közötti összehasonlítást Mann-Whitney-féle U-teszttel végeztük. (ÓVA: ovalbuminnal történő immunizálás; Mv: M. vaccaeval történő immunizálás).

A 10. ábra az ovalbuminnal tenyésztett splenociták által termelt IL-5 (10A. ábra), IL-2 (1 OB. ábra) és IFN-γ (10C. ábra) mennyiségét mutatja (pg/ml). A splenocitákat begyűjtöttük és a 109. napon ovalbuminnal tenyésztettük. Az immunizálás és a kezelés ütemezését a 9. ábrán jelöltük. Az IL—5 kiértékeléséhez 48 óra után és az IFN-γ, IL-2 kiértékeléséhez 24 óra után tenyészet felülúszót gyűjtöttünk. Az adatokat a citokin átlagértékében adjuk meg±SD. A különböző csoportok közötti összehasonlítást Student-féle t-teszttel végeztük, (sóoldat: a sóoldatos kezelést megelőzően kétszer immunizáltunk ovalbuminnal; 10⁷ Nv: a 10⁷ M. vaccaeval történő kezelést megelőzően kétszer immunizáltunk ovalbuminnal).

Az ide vonatkozó minden megemlített dokumentumot a hivatkozásba beépítettük.

1. példa

M. vaccae beadása kísérteti állatoknak, és annak szemléltetése, hogy ez az immunrendszer Th2aktivitásának nemspecifikus csökkenését eredményezi

6-8 hetes Balb/c egereket olajban (hiányos Freund-féle adjuváns) emulgeált 50 pg ovalbuminnal immunizáltunk a 0. és 24. napon. Ez köztudottan az immunválasz erős Th2-mintázatát, ennek kíséretében IgE termelődését és elsősorban két Th2 citokin, az IL-4 és IL—5 felszabadulását váltja ki.

Ezután az állatok sóoldatot vagy 10⁷ gőzsterilizált M. vaccaet kaptak az 53. és 81. napon (szubkután injektálással).

Szérummintákat vettünk a 46. napon (a sóoldat vagy az M. vaccae kezelés előtt) és a 67., 91. és 109. napon.

Ezután lépsejteket gyűjtöttünk az ovalbuminnal történő kezeléshez, amelyet egy in vitro tenyészrendszerben végeztünk. A tenyészetekből 48 óra után felülúszót gyűjtöttünk a citokinek ELISA próbájához.

Befogási próbát alkalmaztunk, Pharmingentől származó antitestpárokkal.

IL-5 #18051D befogás; #18062D (biotinilált) érzékelés.

Az észlelendő antitest kötődését sztreptavidin-retek-peroxidáz konjugátummal (Dako P0397) mutattuk ki, a festékképző az ABTS volt (Sigma A-1888).

IgE #02111D befogás; #02122D (biotinilált) érzékelés.

Az észlelendő antitest kötődését avidin-alkalikus foszfatázkonjugátummal (Sigma E-2636) mutattuk ki, a festékképző a pNPP volt (Sigma N-2770).

Az IgE-szintek eredményeit a 46. napon (az utolsó érték a kezelés előtt) mért szérumkoncentrációkhoz viszonyított változásként fejeztük ki ng/ml-ben megadva.

A 46. napi értéket levontuk minden azt követő vérvétel értékeiből.

Eredmények

Az M. vaccae injektálása csökkentette az ovalbuminnal történt immunizálás okozta IgE-szintek emelkedését. Az M. vaccaeval történt kezelés szignifikáns csökkenést idézett elő minden vizsgált időpontban. Az eredményeket az 1. ábra mutatja be. Hasonlóan, ha a donorállatokat M. vaccaeval kezeltük, az immunizált állatokból származó lépsejtek nem voltak képesek IL-5-öt felszabadítani in vitro ovalbuminra adott válaszban, míg a sóoldattal kezelt immunizált állatokból származó lépsejtek nagy mennyiségű IL-5-öt szabadítanak fel ovalbuminra adott válaszban. Az eredményeket a

2. ábrán mutatjuk be. Az ovalbumin nélkül tenyésztett kontrollmintákban nem volt IL-5 kimutatható (az adatokat nem ábrázoltuk).

Következtetés

Az M. vaccae csökkenti az immunválasz Th2 mintázatát, még akkor is, amikor (i) egy potenciális aliergénnel (ebben az esetben az ovalbumin) történő immunizálás után, és (ii) Th2-indukáló molekula epitópjai nélkül adjuk be.

Következésképpen az immunválasz Th2 profiljának nemspecifikus szisztémikus korlátozódása áll fenn, függetlenül az allergénre magára kifejtett közvetlen adjuvánshatástól.

2. példa

Különböző M. vaccae készítmények hatása a szérum IgE-szintre

Egy további kísérletben a konjugált M. vaccae-OVA szérum IgE-titerre kifejtett hatásának meghatározásához BALB/c egereket IFA-ban emulgeált ovalbuminnal immunizáltunk IgE-válaszok indukálása céljából, majd kétszer kezeltük őket sóoldattal, módosítatlan M. vaccaeval, konjugált M. vaccae-OVA-val vagy a hasonló OVA-t nem tartalmazó „mű”-konjugált készítménnyel, a NaCI-dal tisztított és perjodáttal kezelt M. vaccaeval (NaCI-Mv). A 46. napon az ovalbuminnal immunizált egereknél 112,9±10 (S.E.) ng/ml volt az IgE-szint, összehasonlítva: a nem immunizált állatokban 55,4±1,7 (S.E.) ng/ml volt ez az érték (p<0,01). Minden egér esetében a 46. nap értékét használtuk az adatok 0 kezdő (például 46. nap) értékhez normalizálására és azt minden elkövetkező értékből levontuk. Következésképpen a felvitt értékek a 46. naphoz viszonyított változásokat jelentik ng/ml-ben.

A teljes szérum IgE-szint állandóan növekedett a kontroliegerekben (sóoldattal kezelt) a kísérlet ideje alatt (3A-C. ábrák). A módosítatlan M. vaccaeval történt kezelés során a teljes IgE elfojtása volt tapasztalható az egerekben (3A. ábra). Ellentétben a NaCI mosott, perjodáttal kezelt készítmények nem voltak hatásosak az IgE-elfojtásban, akár az ovalbuminnal konju7

HU 226 255 Β1 gált (3B. ábra) akár konjugálatlan (3C. ábra), bár a kontroll NaCI-Mv egy dózisa a teljes szérum IgE átmeneti elfojtását mutatta (p<0,05) (3C. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az IgE korlátozódásának képességét befolyásolta a NaCI mosás vagy a konjugációs eljárás.

Ellentétben ezzel, sem a módosítatlan M. vaccae, sem a kontroll NaCI-Mv nem korlátozta az ovalbuminspecifikus IgE-t (4A. és 4C. ábra). Azonkívül az ovalbumin-specifikus IgE-válasz valójában fokozódott a konjugált Mv-OVA-val történt kezelés során.

3. példa

Különböző M. vaccae készítmények hatása lépsejtek IL-2 termelésére

Ovalbuminnal immunizált egerekből lépsejteket gyűjtöttünk a 109. napon és in vitro tenyésztettük őket ovalbuminnal. Az ovalbumin érzékennyé tett egerekből származó lépsejtek, amelyek sóoldatos kezelést kaptak, in vitro körülmények között nem voltak képesek IL-2-t termelni. Immunizált egerekből származó lépsejtek, amelyeket ovalbuminkomponenseket nem tartalmazó M. vaccae készítményekkel kezeltünk, ovalbuminra adott válaszban kimutatható szintű IL-2-t termeltek, de ez a növekedés nem volt szignifikáns. Ezzel ellentétben a konjugált ovalbumint tartalmazó M. vaccae készítménnyel kezelt egerekből származó lépsejtekben az ovalbuminra adott válasz nagy mennyiségű IL-2-t szabadított fel (p<0,05, a sóoldatot kapottakhoz viszonyítva) (5. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ovalbumin M. vaccaen történő konjugációja növeli az ovalbuminra adott válaszban az IL-2 termelődését.

Ily módon nincs szignifikáns növekedés az ovalbuminra adott Th1 válaszban, kivéve, ha az ovalbumint tartalmazta (konjugálódott ahhoz) az M. vaccae. Azonkívül, ahogy rámutattunk, abban az esetben, amikor az ovalbumint tartalmazta, bár a Th1-válasz erősen szignifikánsan jelentkezett, a Th2 elfojtása mégsem javult, esetleg csökkenhetett (lásd más erre vonatkozó kísérleteket).

4. példa

Különböző M. vaccae készítmények hatása a lépsejtek IL-5 termelésére

Az ovalbumin-érzékennyé tett egerekből származó lépsejtek az ovalbuminra adott válasz során az

IL—5 nagy mennyiségét termelik (6. ábra). Azonban ovalbuminnal immunizált egerekből származó sejtek, amelyeket M. vaccaeval kezeltünk, akár kezeletlen, NaCI mosott kontroll, akár ovalbumin-konjugált, minden esetben szignifikánsan kevesebb IL-5-t szabadítottak fel az ovalbuminra adott válasz során. Ily módon, ellentétben az IgE méréseknél látható eredményekkel, sem magának a konjugációs eljárásnak, sem az ovalbumin jelenlétének az M. vaccaehoz kötve nincs hatása az IL-5 felszabadulásának korlátozásában. Ha valami, akkor az IL-5 kikapcsolásának a képessége csökkent az allergén M. vaccaehoz történő konjugálása által, miután az Mv-OVA-ra vonatkozó kontroll a NaCI-Mv volt (műkonjugált).

5. példa

Különböző dózisú M. vaccae hatása a szérum

IgE-re az állatokban

Az M. vaccae különböző dózisainak a szérum IgE-re kifejtett hatásának meghatározására BALB/c egereket kétszer (0. és 21. napon) immunizáltunk IFAban emulgeált ovalbuminnal IgE-válaszok indukálásának céljából. Az egerektől a 32. napon vért vettünk, majd a 42. napon sóoldattal vagy 10^{4 * * 7 *}, 10®, 10⁹ M. vaccaeval kezeltük őket.

A 32. napon az ovalbuminnal immunizált egereknél 117,09±35,81 (S.D.) ng/ml volt az IgE-szint, összehasonlítva: a nem immunizált állatokban 69,27+6,09 (S.D.) ng/ml volt ez az érték (p<0,001). Minden egér esetében a 32. nap értékét használtuk az adatok 0 kezdő (például 32. nap) értékhez normalizálására és azt minden elkövetkező értékből levontuk. Következésképpen a felvitt értékek a 32. naphoz viszonyított változásokat jelentik ng/ml-ben.

A kontrollegerekben (sóoldattal kezelt) az IgE válasz tovább emelkedett az 52. és a 70. napon, amikor további mintákat vettünk (10 és 28 nappal a 42. napon történt kezelés után) (7. ábra). Ezzel ellentétben az IgE szint növekedése elfojtódott a 10⁷,10®, 10⁹ M. vaccaeval kezelt egerekben. A p minden értéke 0,01-nél kevesebb a sóoldattal és a különböző dózisú M. vaccaeval kezelt egerek esetében.

6. példa

M. vaccae kezelés hatása a lépsejtek citokintermelésére

BALB/c egereket az 5. példában alkalmazott protokollnak vetettünk alá. Ezután a 82. napon a lépsejtjeiket összegyűjtöttük és ovalbuminnal, M. vaccaeval és conA-val in vitro tenyésztettük. A sóoldattal kezelt csoportból nyert lépsejtek az ovalbuminra adott válasz során IL-4-et termeltek, de IL-2-t nem (8A/B. ábra). Ovalbuminnal immunizált egerekből származó lépsejtek, amelyeket 10⁷ gőzsterilizált M. vaccaeval kezeltünk, az ovalbuminra adott válasz során IL-2-szintézist és csökkent IL-4-termelődést mutattak. Az ovalbuminra adott válasz során fellépő IL-2-szintézist a 10® vagy 10⁹ M. vaccaeval kezelt egerekből származó lépsejtek esetében is tapasztaltuk.

Megjegyezzük, hogy az M. vaccaeval kezelt egerekben az IL-2-termelés nem volt szignifikáns (az SD nagyobb volt, mint a válaszok értékei), csak az egerek egy részét foglalja magában a csoport. A kezelt egerek nagy része nem termelt IL-2-t.

7. példa

M. vaccae kétszeres dózisának hatása a szérum

IgE-re

Minthogy az előzőekben bemutattuk, hogy 10⁷ M. vaccae dózist találtuk a saját antigénjeire Th1-válaszok kiváltására az optimális dózisnak és a próba kísérletekben leghatásosabb dózisnak (7. ábra), a későbbi tanulmányainkhoz ezt a mennyiséget választottuk. A BALB/c egereket kétszer immunizáltuk ovalbuminnal a 0. és 24. napon IgE-válaszok előidézésére, majd a

HU 226 255 Β1

46. napon vért vettünk tőlük, és sóoldattal vagy 10⁷ M. vaccaeval kezeltük őket kétszer az 53. és a 81. napon. A 46. napon az ovalbuminnal immunizált'egereknél 112,9±10 (S.E.) ng/ml volt az IgE-szint, összehasonlítva: a nem immunizált állatokban 55,4±1,7 (S.E.) ng/ml volt ez az érték (p<0,01). Minden egér esetében a 46. nap értékét használtuk az adatok 0 kezdő (például 46. nap) értékhez normalizálására és azt minden elkövetkező értékből levontuk. Következésképpen a felvitt értékek a 46. naphoz viszonyított változásokat jelentik ng/ml-ben.

A kontrollegerekben (sóoldattal kezelt) mért teljes szérum IgE-válasz folyamatosan növekedett a kísérlet ideje alatt. Ezzel ellentétben a 10⁷ gőzsterilizált M. vaccaeval kezelt egerekben az IgE-növekedés elfojtódott (9A. ábra). Eközben, ezzel a módszerrel mérve az antiOVA IgE elfojtása az M. vaccaeval történt kezelés hatására nem volt szignifikáns (9B. ábra). Azonban a későbbi kísérletek azt mutatják, hogy az ovalbumin-érzékennyé vált BALB/c egereknek, amelyek 4-szeres mennyiségű M. vaccaet kaptak, szignifikánsan alacsonyabb OVA-specifikus IgE-titerük volt.

Az ovalbuminra jelentkező lgG1- és lgG2a-antitestekre az M. vaccae kezelés nem volt hatással.

8. példa

M. vaccae kezelés hatása a lépsejtek IFN-q,

IL-2 és IL-5 termelésére

BALB/c egereket a 7. példában alkalmazott protokollnak vetettünk alá. Ezután a 109. napon a lépsejtjeiket összegyűjtöttük és ovalbuminnal in vitro tenyésztettük. A sóoldattal kezelt csoportból nyert lépsejtek az ovalbuminra adott válasz során IL-5-öt nagy mennyiségben termeltek, de IL-2-t nem. Azonban a kétszeres 10⁷ gőzsterilizált M. vaccaeval kezelt OVA-immunizált egerekből származó sejtek az ovalbuminra adott válasz során nem voltak képesek IL-5-öt kiválasztani (10A. ábra). A kétszeres dózis 10⁷ M. vaccaet kapott egerekből származó lépsejtek által az ovalbuminra adott válasz során az IL—4 termelődése úgy tűnik lecsökkent, de ennek a cltokinnek a szintje túl közel volt az immunpróba kimutatási határához, ahhoz hogy megbízható legyen. Ahogy azt az előzőekben bemutattuk (8A. ábra), az OVA-indukált IL—2 termelődést újra észleltük néhány M. vaccaeval kezelt egérből származó lépsejtek felülúszójából (1 OB. ábra), bár statisztikusan nem szignifikánsan. Csökkent Th2-aktivitást találtunk azokban az állatokban, amelyek nem mutattak IL-2-növekedést. Nem volt különbség a különböző csoportokból származó lépsejtek OVA-indukált IFN-γ szintézise között (10C. ábra).

összefoglalás

IFA-ban emulgeált ovalbuminnal kétszeri oltást kapott BALB/c egerekben tipikus Th2 típusú immunválasz fejlődött ki. Ez megnövelte a szérum IgE-szintet, és az ezekből az egerekből származó lépsejtek in vitro ovalbuminra adott válasz során IL-5-öt választottak ki, de IL-2-t nem. A legmeglepőbb felfedezés az volt, hogy ezeket az allergénspecifikus válasz eseményeket a BALB/c egerekben kis mennyiségű elölt M. vaccaeval végzett kezelés korlátozta, anélkül hogy OVA-ra vagy bármilyen ÓVA epitópokra szükség lenne az M.

vaccae preparátumban.

Hasonlóképpen kísérleteink azt tárták fel, hogy az ovalbuminnal előidézett szérum IgE nagy mennyiségét lefojtottuk az M. vaccae dózisának széles tartományban történő alkalmazása által. Ez váratlan, mivel az egerekben az eddigi dózisimmunválasz-tanulmányok a 10⁷ mennyiséget azonosították, mint az M. vaccaeban található mikobakteriális eredetű antigénekre adott Th1-válasz előidézésének és a Th2-komponensek érzékelése nélküli optimumát, míg a 10⁹ mennyiség esetében vegyes Th1+Th2 választ vált ki. Ezért valószínű, hogy ebben a modellben az M. vaccae hatásai nem a Th1 citokinek elfojtó hatásain keresztül érvényesülhetnek. Az IgE-szint szabályozásának további szintje tulajdonítható az IgE-kötött faktorok indukciójának.

Az ovalbuminra adott Th1-válaszban nincs szignifikáns növekedés, kivéve, ha az M. vaccae magában foglalja az ovalbumint (konjugálva van ahhoz), és amikor tartalmazza azt, jóllehet a Th1-válasz erősen szignifikánssá válik, a Th2-válasz elfojtása nem javul, és nem csökkenhet.

9. példa

A Th2és Th1 citokinprofil meghatározása

Rendelkezésünkre áll néhány adat a Krónikus Fáradtság Szindróma és öböl-háborús Szindróma citokinprofiljáról, de ezek ellentmondanak egymásnak, és az alkalmazott módszerek sem megbízhatóak, bár a teljes klinikai kép a fentiekben már ismertetett megnövekedett Th2/Th1 arányt mutatja (Straus, 1996).

Ennek bemutatására az optimális technológia spontán IL-2-t (Th1) vagy IL—4-t és IL-5-t (mindkettő Th2) szekretáló, vagy in vitro kalcium-ionofórral és forbol-mirisztát-acetáttal (PMA) történő stimulálás után ezen citokinek szekrécióját előidézni képes periférikus vérből származó T-sejtek pontos számának és arányának meghatározására az áramlásos citometria. [A szekréciót valójában egy inhibitor által blokkoltuk azért, hogy a sejtben felhalmozódjanak a citokinek, ahol egy alkalmazott fluoro-króm-jelölt monoklonális antitesttel tudjuk kimutatni azokat (fixálás és permeabilizálás után)].

A technológia alkalmazásával a normál donorok perifériás vérében a Th2-sejtek nagyon ritkán fordulnak elő, de a krónikus fertőzésekben vagy rákban szenvedő betegek keringésében gyakoriak lehetnek (nem publikált megfigyelés).

Egy másik technika a citokinszintek közvetlen meghatározása a plazmában vagy a szérumban. Az interleukin-13 (IL—13) jellegzetes Th2 citokinként és az interferon-gamma (IFNy) mint jellegzetes Th1 citokin detektálható.

Az Öböl-háborús veteránok citokinprofilját e technikák egyikének alkalmazásával vizsgálják. A tünetek javulásának szempontjából az M. vaccae kezelés alkalmazhatóságára következtetni enged a Th1->Th2 eltolódás meghatározása.

HU 226 255 Β1

10. példa

A kezeléshez szükséges M. vaccae elkészítése

Az M. vaccaet 1,3% agarral szilárdított, módosított Sauton-féle közeget tartalmazó szilárd közegen növesztjük. A közeget beoltjuk a mikroorganizmussal és aerob körülmények között 10 napig 32 °C-on inkubáljuk, lehetővé téve, hogy a mikroorganizmus növekedése megtörténjen. A mikroorganizmusokat összegyűjtjük, lemérjük, és hígítószerben szuszpendáljuk 100 mg mikroorganizmust adva a hígítószer ml-jéhez. Majd a szuszpenziót tovább hígítjuk pufferolt sóoldattal úgy, hogy 10 mg (10¹⁰) nedves tömegű mikroorganizmust kapjunk 1 ml hígítószerre és 5 ml-es többdózisos üvegcsékbe osztjuk szét. Az élő mikroorganizmusokat tartalmazó üvegcséket 10 percig 69 kPa nyomáson gőzsterilizáljuk (115 °C-125 °C) a mikroorganizmusok elpusztítása céljából. Az Így előállított hatóanyagot 4 °C-on tároljuk felhasználásuk előtt.

11. példa

M. vaccae alkalmazása Th1/Th2 citokin eltolódással jellemzett betegségek kezelésében

A 3. példával összhangban elkészített szuszpenzió 0,1 ml-ét, amely az M. vaccae 1 mg nedves tömegét tartalmazza, erőteljesen összeráztuk, majd intradermális injekcióval a bal deltaizmon át közvetlenül adtuk be.

A betegekben a Th1 és Th2 citokinszinteket periodikusan mértük, a Th2-től Th1 irányába történő eltolódás megerősítésére, különösképpen a Th2-aktivitás korlátozódásának meghatározására, amíg a betegek tüneteinek javulása megfigyelhető. ¹²

12. példa

Krónikus Fáradtság Szindrómában szenvedő betegek kezelése M. vaccaeva/ (1) Egy 70 éves, pikkelyes-sejt tüdőrákban szenvedő és ezzel egyidejű Krónikus Fáradtság Szindróma diagnózisú beteget kezeltünk SRL-172-vel, izgalommal számolt be arról, hogy a tünetei javultak az SRL-172-vel történt utóbbi 2 oltás után. Sokkal jobban érezte magát, és a fájdalmai megszűntek. Mint orgonatanámő, több további tanítványt vállalt, ami a javulását jelezte. A beteget több, mint 1 évig SRL-172-vel kezeltük és folyamatosan jó egészségi állapotról számolt be.

(2) Egy beteg, akinek 7-8 éves a Krónikus Fáradtság Szindrómájának a kortörténete, olyan tünetekkel, amelyek magában foglalják az általános fáradtságot, migréneket, depressziót, élelmiszer-allergiát és nyirokcsomó-megnagyobbodást, SRL-172-vel történt beoltást követően javulásról számolt be. A torokfájása, a megdagadt mirigyek és az élelmiszer-allergia szempontjából sokat javult, így a Thyroxinból kisebb mennyiség alkalmazására volt szüksége. Sokkal világosabban beszélt és azt mondta, hogy kevésbé depressziós.

(3) A fejfájás bizonyos formájának, depresszió és többszörös élelmiszer-allergia tüneteivel rendelkező beteget vettünk fel. Az SRL-172-vel történő kezelést megelőzően sok más kezelést próbáltunk meg eredménytelenül. A tüneteinek megfékezésének megkísérlése végett Nalcron nagy mennyiségét alkalmaztuk szabályosan (80 db Nalcron 100 mg-os kapszulát, minden nap egyet ebéd előtt és után). Amióta SRL-172-t kap 2 hónapos intervallumokban a Krónikus Fáradtság Szindrómájának tünetei csakúgy, mint az élelmiszer-allergiája jelentékeny mértékben javult és bízik benne, hogy ameddig a szabályozott oltásokkal folytatja, jól fogja érezni magát.

References

Aaby, P. (1995) Soc. Sci. Med. 41: 673-86.

Aaby et al., (1995) Brit. Med. J. 311: 481-5.

Abou-Zeic etal., (1997) Infect. Immun. 65: 1856-1862. Bemton etal., (1995) Ann. NY Acad. Sci. 774: 217-231. Bonicke ef a/., (1964) Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infection skr. Hyg. Abt. 1, Őrig., 192: 133.

Boyden etal., (1955) J. Immunoi. 75: 15.

Bretscher ef al., (1992) Science 257: 539-542. Brinkmann etal., (1995) J. Immunoi. 155: 3322-8. Brown etal., (1993) Infect. Immun. 61: 4793-4800. Casale et al., (1993) Immunopharmacol. Immunotoxicol. 15: 199-215.

Corrigan etal., (1995) Am. J. Respir. Cell. Mól. Bioi. 12: 567-78.

Daynes etal., (1989) Eur. J. Immunoi. 19: 2319-2325. Daynes etal., (1990) J. Exp. Med. 171: 979-996. Daynes etal., (1993) J. Immunoi. 150: 5219-5230. Daynes ef al., (1995) J. Invest. Dermatol. 105: 14S-19S.

Daynes etal., (1991) Rés. Immunoi. 142: 40-45. Fischer ef al., (1991) Immunology 74: 228-233.

Fukuda etal., (1994) Ann. Int. Med. 121: 953-9 Garg etal., (1993) Infect. Immun. 61: 2238-2241. Glaser etal., (1993) Behav. Neurosci. 107: 525-9. Guida etal., (1994) Blood 84: 2733-40. Hernandez-Pando ef al., (1994) Immunology 82: 591-595.

Holsboer ef al., (1984) New Eng. J. Med. 311:1127-, Morales ef al., (1994) J. Clin. Endocrinol. Metab. 78: 1360-1367.

Moynihan, J. (1994) Advances: Mind Body Health 10: 23-28.

Mu etal., (1993) Infect. Immun. 61: 2834-2840.

Nilsson etal., (1996) JAMA 275: 760.

Odent ef al., (1994) JAMA 272: 592-593.

Padgett ef al., Ann. NY Acad. Sci. 774: 323-325. Ramirez etal., (1996) J. Immunoi. 156: 2406-2412. Ramiya etal., (1996) J. Autoimmun. 9: 349-356.

Raven etal., (1995) Clin. Endocrinol. 43: 637-644. Raven ef al., (1996) Psychoneuroendocrinology 21: 277-286.

Rook etal., (1996) Annu. Rév. Microbiol. 50: 259-284. Rook etal., (1996) Q. J. Med. 89: 333-341.

Rupprecht ef al., (1995) Psychoneuroendocrinology 20:543-551.

HU 226 255 Β1

Shaheen etal., (1996) Láncét 347: 1792-6.

Skinner ef al., (1997a) Vaccines beyond 2000, July 6-9, Queensland Australia, Abstract.

Skinner etal., (1997b) Infect. Immun., 65: 4525-4530. Stanford and Paul, (1973) Ann. Soc. Belge Med. Trop. 53:141-389.

Sharp etal., (1991) J. R. Soc. Med. 84:118-21. Shirakawa etal., (1996) Science In press.

Smit ef al., (1996) Transplant Proc. 28: 665-666. Straus, S (1996) NIH Publication No. 90-3059: 1-5. Suzuki etal., (1991) Clin. Immunoi. Immunopathol. 61: 202-211.

Tobach etal., (1956) Am. J. Physiol. 187: 399-402. Turnberg ef al., (1996) Report of a joint working group of the Royal Colleges of Physicians, Psychíatrists and General

Practitioners. London: Royal College of Physicians 58: vol. 1).

Wu etal., (1991) J. Clin. Invest. 87: 870-877.

Zwilling, B. S. (1992) ASM News 58: 23-25.

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Mycobacterium vaccaeből származó, antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyag alkalmazása olyan betegség kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására, amelyet egy egyén immunrendszere Th2-aktivitásának a serkentődése jellemez, ahol a kezelés magában foglalja az egyén immunrendszere Th2-aktivitásának korlátozását a Th1-aktivitásának a serkentődése nélkül, amely gyógyszer nem tartalmaz nem M. vaccae eredetű antigént, immunogént vagy allergént, és ahol a rendellenesség Krónikus Fáradtság Szindróma, Öbölháború Szindróma, Teljes Allergia Szindróma, asztma, szénanátha vagy ekcéma.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az M. vaccaeből származó antigénhatású és/vagy immunszabályozó anyag tartalmazza az M. vaccae elpusztult sejtjeit.
3. 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a sejteket gőzsterilizálással elpusztítottuk.