HU221497B1 - Antisens hiv splice donor oligodeoxynucleotides, containing 5-(n-alkin-1-yl)-pyrimidine bases, inhibiting hiv-proliferation, process for producing medicaments containing the same and the medicaments - Google Patents

Antisens hiv splice donor oligodeoxynucleotides, containing 5-(n-alkin-1-yl)-pyrimidine bases, inhibiting hiv-proliferation, process for producing medicaments containing the same and the medicaments Download PDF

Info

Publication number
HU221497B1
HU221497B1 HU9502742A HU9502742A HU221497B1 HU 221497 B1 HU221497 B1 HU 221497B1 HU 9502742 A HU9502742 A HU 9502742A HU 9502742 A HU9502742 A HU 9502742A HU 221497 B1 HU221497 B1 HU 221497B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antisense
hiv
bases
hexin
oligodeoxynucleotides
Prior art date
Application number
HU9502742A
Other languages
Hungarian (hu)
Other versions
HU9502742D0 (en
Inventor
László Ötvös
János Sági
András Jeney
Attila Szemző
Tóth Ferenc D.
Lajos Gergely
Lajos Gruber
Gyula Sági
Zsuzsa Tegyey
István Tömösközi
Dóra Bolyán
Éva Ruff
Original Assignee
MTA Központi Kémiai Kutató Intézete
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MTA Központi Kémiai Kutató Intézete filed Critical MTA Központi Kémiai Kutató Intézete
Priority to HU9502742A priority Critical patent/HU221497B1/en
Publication of HU9502742D0 publication Critical patent/HU9502742D0/en
Publication of HU221497B1 publication Critical patent/HU221497B1/en

Links

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya az olyan 17–26 nukleotidegységet tartalmazóoligodezoxinukleotidok, amelyek nukleotidsorrendje komplementere(antiszensz) a HIV-vírus-RNS splice donor részének 275–305.nukleotidig terjedő szakasza nukleo- tidsorrendjével, és amelyoligodezoxinukleotidokban a timinbázisok helyett 4–10 szénatomosoldalláncú 5-(n-alkin-1- il)-uracil, előnyösen 5-(n-hexin-1-il)-uracil, vagy a citozinbázisok helyett 4–10 szénatomos oldalláncú 5-(n-alkin-1-il)- citozin, előnyösen 5-(n-hexin-1-il)-citozin van, vagymindkét pirimidinbázis helyett 4–10 szénatomos oldalláncú 5-(n- alkin-1-il)-pirimidin, előnyösen 5-(n-hexin-1-il)-pirimidin van, és azoligodezoxinukleotidokban a nukleotidokat összekötő csoport foszfor-diészter vagy tiofoszfor-diészter. Ezek az antiszenszoligodezoxinukleotidok in vitro jelentős HIV-ellenes hatássalrendelkeznek MT-4 sejtkultúrában, és így gyógyszerkészítményekhatóanyagaként HIV- fertőzések kezelésére alkalmazhatók. ŕSUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to oligodezoxynucleotides having a nucleotide sequence of 17 to 26 nucleotides, the nucleotide sequence of which is complementary (antisense) to the nucleotide sequence of the 275-305 nucleotide portion of the HIV viral RNA splice donor portion, and in which oligodeoxynucleotides are 4- (5 n-n-chain) instead of thymine bases. -alkin-1-yl) -uracil, preferably 5- (n-hexin-1-yl) -uracil, or, instead of cytosine bases, (C5-C10) 5- (n-alkin-1-yl) cytosine, preferably 5 - (n-hexin-1-yl) -cytosine, instead of any pyrimidine base, 5- (n-alkin-1-yl) -pyrimidine (4-10 carbon atoms), preferably 5- (n-hexin-1-yl) -pyrimidine and in the azoligodoxynucleotides the nucleotide linking group is a phosphorus diester or thiophosphoric diester. These antisense oligodeoxynucleotides have a significant anti-HIV activity in vitro in MT-4 cell culture and can therefore be used as a drug active agent for the treatment of HIV infections. ŕ

Description

A találmány az olyan 17-26 nukleotidegységet tartalmazó oligodezoxinukleotidokra vonatkozik, amelyek nukleotidsorrendje komplementere (antiszensz) a humán immunhiány vírus (HIV)-RNS splice donor részének 275-305. nukleotidig terjedő szakasza nukleotidsorrendjével, és amely oligodezoxinukleotidokban a timinbázisok helyett 4-10 szénatomos alkilláncú 5-(nalkin-l-il)-uracil, előnyösen 5-(n-hexin-l-il)-uracil, vagy a citozinbázisok helyett 4-10 szénatomos alkilláncú 5-(n-alkin-l-il)-citozin, előnyösen 5-(n-hexin-lil)-citozin van, vagy mindkét pirimidinbázis helyettThe present invention relates to oligodeoxynucleotides having 17-26 nucleotide units whose nucleotide sequence is complementary (antisense) to the human immunodeficiency virus (HIV) RNA splice donor portion 275-305. which in the oligodeoxynucleotides is 5- (nalkin-1-yl) -uracil, preferably 5- (n-hexin-1-yl) -uracil, instead of the thymine bases, or 4-10 instead of the cytosine bases. C 5 -alkyl 5- (n-alkynyl-1-yl) -cytosine, preferably 5- (n-hexin-1-yl) -cytosine, or instead of both pyrimidine bases

4-10 szénatomos alkilláncú 5-(n-alkin-l-il)-pirimidin, előnyösen 5-(n-hexin-l-il)-pirimidin van, és az oligodezoxinukleotidokban a nukleotidokat összekötő csoport foszfor-diészter vagy tiofoszfor-diészter. Ezek az antiszensz oligodezoxinukleotidok in vitro jelentős HIVellenes hatással rendelkeznek MT-4 sejtkultúrában. A találmány továbbá az ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre, illetve az ilyen vegyületek és gyógyszerkészítmények előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik. A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti vegyületek alkalmazása gyógyszerkészítmények előállítására, HIV-fertőzések kezelésére.The C4-C10 alkyl chain is 5- (n-alkin-1-yl) -pyrimidine, preferably 5- (n-hexin-1-yl) -pyrimidine and the nucleotide linker in the oligodeoxynucleotides is a phosphorous diester or thiophosphoric diester. These antisense oligodeoxynucleotides have significant anti-HIV activity in vitro in MT-4 cell culture. The invention further relates to pharmaceutical compositions containing such compounds and to processes for the preparation of such compounds and pharmaceutical compositions. The present invention also provides the use of the above compounds for the preparation of a medicament for the treatment of HIV infections.

Ismeretes, hogy a génexpresszió gátlásának legújabb és eddig legszelektívebb módja az úgynevezett antiszensz oligonukleotidok tervezésén és alkalmazásán alapuló technológia. Ez egyben a gyógyszertervezés egy új szintjét is képviseli. Az antiszensz oligonukleotid a gátolni kívánt gén egy adott szakaszával komplementer oligonukleotid.It is known that technology based on the design and application of so-called antisense oligonucleotides is the latest and most selective way of inhibiting gene expression. It also represents a new level of drug design. An antisense oligonucleotide is an oligonucleotide complementary to a particular region of the gene to be inhibited.

A gátolni kívánt gén lehet például egy, az emberben patogén hatású vírus génje. A gén egy adott szakasza értelemszerűen a gén, rendszerint a vírus-DNS vagy -RNS, vagy az mRNS egy olyan kritikus szakasza, amely szterikusan hozzáférhető az antiszensz oligonukleotid számára, és a hozzá való kötődése révén a génexpressziója gátolt lesz. A komplementaritás alatt a Watson-Crick-féle bázispárosodás elvét értjük (adenin-timin és guanin-citozin párok). Az antiszensz oligonukleotidok rendszerint 15-30 nukleotid hosszúságúak [lásd például a J. L. Tonkinson & C. A. Stein Antiviral Chem. & Chemother. 4, 193-200 (1993); Μ. K. Ghosh & J. S. Cohen Progress in Nucleic Acid Rés. Mól. Bioi. 42, 79-126 (1992); vagy C. Héléne & J.-J. Toulmé Biochim. Biophys. Acta 1049, 99-125 (1992) összefoglaló közleményeket.]The gene to be inhibited may be, for example, a gene of a virus that is pathogenic to humans. Obviously, a particular region of a gene is a critical region of the gene, usually viral DNA or RNA or mRNA, which is sterically accessible to the antisense oligonucleotide and by binding to it will inhibit gene expression. Complementarity refers to the principle of Watson-Crick base pairing (pairs of adenine-thymine and guanine-cytosine). Antisense oligonucleotides are usually 15 to 30 nucleotides in length (see, for example, J. L. Tonkinson & C. A. Stein Antiviral Chem. &Amp; Chemother. 4: 193-200 (1993); Μ. K. Ghosh & J. S. Cohen Progress in Nucleic Acid Rés. Mole. Biol. 42: 79-126 (1992); or C. Héléne & J.-J. Toulmé Biochim. Biophys. Acta 1049, 99-125 (1992).]

A terápiás célra tervezett antiszensz oligonukleotidoknak a következő tulajdonságokkal kell rendelkezniük:Antisense oligonucleotides designed for therapeutic purposes must have the following characteristics:

1. Nagy biológiai stabilitás, vagyis a nukleinsavakat bontó enzimekkel, a nukleázokkal szemben mind a vérben, mind a sejtekben ellenállónak kell lenniük.1. High biological stability, that is, they must be resistant to nucleic acid-degrading enzymes, both in blood and in cells.

2. A sejtekbe, a hatás helyére megfelelően magas koncentrációban kell bejutniuk, és2. They must enter the cells at the site of action at a sufficiently high concentration, and

3. a kiválasztott gén tervezett nukleinsavszakaszával erős és tartós komplexet, úgynevezett duplexet kell létrehozniuk a hatás elérése céljából.3. create a strong and long-lasting complex, called a duplex, with the intended nucleic acid sequence of the selected gene to achieve the effect.

Amennyiben az antiszensz oligonukleotid megfelelő biológiai stabilitású, megfelelő koncentrációban bejut a sejtekbe, és erős és tartós duplexet hoz létre a kiválasztott gén megfelelő szakaszával, kétféle úgynevezett terminálási esemény révén fejtheti ki szekvenciaspecifikus antiszensz hatását:If the antisense oligonucleotide enters the cells with the appropriate biological stability, at the right concentration, and produces a strong and durable duplex with the appropriate region of the selected gene, it can produce sequence-specific antisense effects through two so-called termination events:

1. A kialakult duplex olyan stabil, hogy a génexpresszió fizikailag gátlódik (például a mRNS-en a fehérjeszintézis tartósan megakad), és1. The resulting duplex is stable enough to physically inhibit gene expression (e.g., protein synthesis on the mRNA is permanently blocked), and

2. Ha a kialakult duplex egy RNS-DNS, úgynevezett hibrid duplex, vagyis a célgénszakasz egy RNS (vírusa RNS vagy mRNS) és az antiszensz egy dezoxi-oligonukleotid, akkor ennek a hibrid duplexnek az RNSrészét az endogén RNáz-H enzim, amelynek a hibrid duplex bontása a specificitása, elbontja.2. If the resulting duplex is an RNA DNA called a hybrid duplex, i.e. the target gene region is an RNA (virus RNA or mRNA) and the antisense is a deoxy oligonucleotide, the RNA portion of this hybrid duplex is the endogenous RNase-H enzyme. hybrid duplex decomposition is the specificity, decomposes.

A természetes nukleotidokból, mind a ribo- mind a 2’-dezoxiribonukleotidokból felépített antiszensz oligonukleotidokkal a fenti követelményrendszer nem valósul meg, mivel ezek biológiai stabilitása nagyon alacsony. Felezési idejük vérszérumban kevesebb mint egy óra. Ezért jelenleg csak a kémiailag módosított, megerősített oligonukleotidok használatosak biológiai célokra.With the antisense oligonucleotides constructed from the natural nucleotides, both ribo- and 2'-deoxyribonucleotides, the above requirement is not fulfilled as their biological stability is very low. They have a serum half-life of less than one hour. Therefore, at present, only chemically modified, amplified oligonucleotides are used for biological purposes.

Az antiszensz technológia elterjedése óta, az utóbbi 6-7 évben nagyszámú kémiai módosítást írtak le és alkalmaztak [lásd például a P. Dán Cook Anti-Cancer Drug Design 6, 585-607 (1991) és E. Uhlmann & A. Peyman Chem. Rév. 90, 543 -584 (1990) összefoglaló közleményeket], A nukleotidegységek foszfát- és/vagy cukorrészének (1. képlet) kémiai módosítása értelemszerűen növeli a nukleázokkal szembeni stabilitást, mivel a molekulák ezen részei az enzimek támadási pontjai, illetve ezek közvetlen környezete. E módosítások egy része, például a nemionos oligonukleotidok, amelyek az oligonukleotidok polianion jellegét megszüntetik, növelik a sejtbe jutási képességet is. Ugyanakkor a cukor-foszfát módosítások túlnyomó többsége csökkenti a duplexképzési hajlamot, illetve a kialakuló duplex erősségét. Egy további hátrányuk, hogy a fenti második terminálási esemény a nemionos, továbbá számos cukormódosított oligomerrel, melyek RNS-analógok, nem következik be.Since the spread of antisense technology, in the last 6 to 7 years, numerous chemical modifications have been described and applied (see, for example, P. Danish Cook Anti-Cancer Drug Design 6: 585-607 (1991) and E. Uhlmann & A. Peyman Chem. Port. 90, 543-584 (1990)]. Chemical modification of the phosphate and / or sugar moiety of the nucleotide units (Formula 1) naturally increases the stability to the nucleases, since these parts of the molecules are the attack sites of the enzymes and their immediate environment. Some of these modifications, such as nonionic oligonucleotides, which abolish the polyanion nature of the oligonucleotides, also increase cellular uptake. However, the vast majority of sugar-phosphate modifications reduce the tendency for duplex formation and the strength of duplex formation. A further disadvantage is that the above second terminating event does not occur with the nonionic and also with many sugar-modified oligomers which are RNA analogs.

Az antiszensz hatás növelése céljából a nukleotidok harmadik komponensének, azaz a heterociklusos bázisoknak a kémiai módosítására a 90-es évek elejéig csak korlátozottan került sor. Feltételezték, hogy ezek módosítása éppen ellenkező, az antiszensz effektust csökkentő hatású lehet (lásd P. Dán Cook és Uhlmann és Peymann fent idézett közleményét). Az AIDS-betegség megelőzésére, illetve gyógyítására irányuló későbbi kutatások azonban kimutatták, hogy ha a HIV-vírus Revválasz-eleméhez (RRE) kötődni képes Rev-re nézve komplementer egyes oligodezoxinukleotidokban a foszfátrészt tiofoszfátrésszé alakítják, és ugyanakkor a timidinbázis (azaz 5-metil-uracil-bázis) helyére 5-propiniluracil-bázist építenek be, jelentősen nő a vegyületek in vitro körülmények között észlelt vírusellenes hatása [Biochemistry 33, 8391-8398 (1994); Antiviral Research 28, 28-91 (1995)]. A hatásnövekedést a szerzők elsősorban a propinilcsoport beépítésének tulajdonították; a foszfátrész tiofoszfátrésszé alakítása önmagában csak kismértékű hatásnövekedést eredményezett. Tapasztalataink szerint azonban ezek a vegyületek nukleá2In order to increase the antisense effect, chemical modification of the third component of the nucleotides, the heterocyclic bases, was limited until the early 1990s. It has been speculated that modifying these may be counter-productive and may reduce the antisense effect (see P. Dan Cook and Uhlmann and Peymann, supra). However, subsequent research to prevent or cure AIDS disease has shown that when Rev is able to bind to the Rev Response Element (RRE) of the HIV virus in some oligodeoxynucleotides, the phosphate moiety is converted to the thiophosphate moiety and the thymidine base (i.e., 5-methyl 5-propynyluracil base is incorporated in place of uracil base), the antiviral activity of the compounds observed in vitro is significantly increased (Biochemistry 33: 8391-8398 (1994); Antiviral Research 28, 28-91 (1995)]. The effect was attributed primarily to the incorporation of the propynyl group; conversion of the phosphate moiety to the thiophosphate moiety alone resulted in only a small increase in activity. However, in our experience, these compounds are nucleic

HU 221 497 Al zokkal szemben nem elég stabilok, így az élő szervezetben nukleázok hatására elbomolva nem képesek kellően erős, illetve kellően hosszan tartó hatást kifejteni.They are not sufficiently stable against algae and are therefore not sufficiently potent or long-lasting to be degraded by nucleases in the living organism.

A találmány célja olyan HIV-ellenes hatású antiszensz oligodezoxinukleotidok előállítása, amelyek humán T-sejtekben hatásosan gátolják a HIV-vírus szaporodását toxikus mellékhatások nélkül.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide antisense oligodeoxynucleotides having anti-HIV activity which effectively inhibit the growth of HIV in human T cells without toxic side effects.

A találmány alapja az a felismerés, hogy a HIVvírus RNS-e [a HIV-RNS teljes nukleotidsorrendjét lásd például: Y. Li és munkatársai: J. Virol. 66, 6587-6600 (1992)] splice donor szakaszának 290. nukleotidjától kezdődően az 5’ irányban 7-15. és a 291. nukleotidjától a 3’-irányban 5-14 nukleotidnyi, azaz 17-26 nukleotid hosszúságú szakaszaival (pontosabban a 275-299, 280-299, 283-299, valamint a 280-296 és 280-305 szekvenciákkal) komplementer, természetes nukleotidokból felépített antiszensz oligodezoxinukleotidok gyenge, de mérhető HIV-ellenes hatást mutattak HIV-1 vírussal akutan fertőzött MT-4 sejtkultúrákban. Felismertük, hogy ha ezekben az oligodezoxinukleotidokban a pirimidinbázisok 5-ös helyzetébe 4-10 szénatomos n-alkin-l-il-csoportokat építünk be, és/vagy a nukleotidokat összekötő foszfor-diészter-csoportokat tiofoszfor-diészter-csoportokra cseréljük, igen nagy mértékben nő a vegyületek HIV-ellenes hatása. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy a pirimidinbázisok 5-ös helyzetében 4-10 szénatomos n-alkin-l-il-csoportokat tartalmazó vegyületek nukleázokkal szemben lényegesen stabilabbak, mint a megfelelő propin-l-il-analógok, így azoknál lényegesen hosszabb ideig képesek teljes értékű hatást kifejteni.The present invention is based on the discovery that HIV RNA (for the complete nucleotide sequence of HIV RNA see, for example, Y. Li et al., J. Virol. 66, 6587-6600 (1992)], starting from nucleotide 290 of the splice donor region in the 5 'direction 7-15. and nucleotide 291 complementary to the 5 'to 14', i.e. 17 to 26 nucleotide (more particularly 275-299, 280-299, 283-299, and 280-296 and 280-305) sequences in the 3 'direction, antisense oligodeoxynucleotides constructed from natural nucleotides showed weak but measurable anti-HIV activity in MT-4 cell cultures that were infected with HIV-1 virus. It has now been found that the incorporation of C4-C10 n-alkin-1-yl groups at the 5-position of the pyrimidine bases in these oligodeoxynucleotides and / or the exchange of the phosphorus diester linking nucleotides to thiophosphoro diester the anti-HIV activity of the compounds increases. It has further been found that compounds containing C4-C10 n-alkynyl-1-yl groups at the 5-position of the pyrimidine bases are substantially more stable to nucleases than their corresponding propin-1-yl analogs, and thus have a substantially longer effect.

Példaként közöljük, hogy a splice donor-RNS 280-299. szekvenciájával komplementer antiszensz oligodezoxinukleotid IC50-értéke 63 pg/ml. Ha ebbe az oligodezoxinukleotidba (a) a három timinbázis helyett 5-(n-hexin-l-il)-uiacil-bázist építünk be, az IC50-érték 38 pg/ml-re csökken;By way of example, splice donor RNA 280-299 is disclosed. sequence complementary antisense oligodeoxynucleotide IC 50 -value of 63 pg / ml. When this oligodeoxynucleotide (a) is replaced with 5- (n-hexin-1-yl) ylcyl base instead of the three thymine bases, the IC 50 is reduced to 38 pg / ml;

(b) a kilenc citozinbázis helyett 5-(n-hexin-l-il)-citozin-bázist építünk be, az IC50-érték 9 pg/ml-re csökken;(b) replacing the nine cytosine bases with 5- (n-hexin-1-yl) -cytosine base, the IC 50 being reduced to 9 pg / ml;

(c) az összes timin- és citozinbázis helyett 5-(nhexin-l-il)-uracil és 5-(n-hexin-l-il)-citozin-bázist építünk be, az IC50-érték 3 pg/ml-re csökken;(c) replacing all thymine and cytosine bases with 5- (nhexin-1-yl) uracil and 5- (n-hexin-1-yl) cytosine base with an IC 50 of 3 pg / ml; decreases;

(d) a nukleotidokat összekötő foszfor-diészterkötéseket tiofoszfor-diészter-kötésekre cseréljük, az IC50-érték 2 pg/ml-re csökken, és 20 pg/ml koncentrációnál HIV-1 vírussal akutan fertőzött MT-4 sejtkultúrában a fertőzéstől számított 18. napig nem észleltünk HIV-szaporodást;(d) replacing the phosphorus diester linkages linking the nucleotides with thiophosphorus diester linkages, decreasing the IC 50 to 2 pg / ml, and at a concentration of 20 pg / ml in an MT-4 cell culture acutely infected with HIV-1 18. no HIV multiplication was observed for days;

(e) a nukleotidokat összekötő foszfor-diészterkötéseket tiofoszfor-diészter-kötésekre cseréljük, és ugyanakkor a timinbázisok helyére 5-(n-hexin-l-il)-uracil-bázisokat építünk be, az IC50-érték 1,2 pg/ml-re csökken, és 5 pg/ml koncentrációnál HIV-1 vírussal akutan fertőzött MT-4 sejtkultúrában a fertőzéstől számított 30. napig nem észleltünk HIV-szaporodást [összehasonlításként közöljük, hogy ugyanennek a vegyületnek az 5-(prop-l-inil)-uracil-analógja a HÍV szaporodását csak 15 napig gátolta];(e) replacing the phosphorus diester linkages linking the nucleotides with thiophosphoro diester linkages, while introducing 5- (n-hexin-1-yl) uracil bases in place of the thymine bases with an IC 50 of 1.2 pg / ml and no growth of HIV was detected at 5 pg / ml in MT-4 cells cultured in acute infection with HIV-1 virus for 30 days from infection [by comparison, 5- (prop-1-inyl) uracil analogue inhibited HIV proliferation for only 15 days];

(f) a nukleotidokat összekötő foszfor-diészterkötéseket tiofoszfor-diészter-kötésekre cseréljük, és ugyanakkor a citozinbázisok helyére 5-(n-hexin-l-il)-citozin-bázisokat építünk be, az IC50-érték 0,6 pg/ml-re csökken, és 5 pg/ml koncentrációnál HIV-1 vírussal akutan fertőzött MT-4 sejtkultúrában a fertőzéstől számított 18. napig nem észleltünk HIV-szaporodást;(f) replacing the phosphorus diester linkages linking the nucleotides with thiophosphoro diester linkages, and adding 5- (n-hexin-1-yl) cytosine bases in place of the cytosine bases with an IC 50 of 0.6 pg / ml and no growth of HIV was observed in MT-4 cell cultures of acute infection with HIV-1 virus at 5 pg / ml for 18 days after infection;

(g) a nukleotidokat összekötő foszfor-diészter-kötéseket tiofoszfor-diészter-kötésekre cseréljük, és ugyanakkor a timinbázisok helyére 5-(n-hexin-l-il)-uracilbázisokat, a citozinbázisok helyére pedig 5-(n-hexinl-il)-citozin-bázisokat építünk be, az IC50-érték 2 pg/ml-re csökken, és 5 pg/ml koncentrációnál HIV1 vírussal akutan fertőzött MT-4 sejtkultúrában a fertőzéstől számított 18. napig nem észleltünk HlV-szaporodást;(g) replacing the phosphorus diester linkages linking the nucleotides with thiophosphoro diester linkages, while replacing the thymine bases with 5- (n-hexin-1-yl) uracil bases and the cytosine bases with 5- (n-hexinyl-yl) cytosine bases were added, the IC 50 was reduced to 2 pg / ml and no HIV proliferation was observed in MT-4 cell culture acutely infected with HIV1 at 5 pg / ml for 18 days after infection;

(h) a nukleotidokat összekötő foszfor-diészterkötéseket tiofoszfor-diészter-kötésekre cseréljük, és ugyanakkor a timinbázisok helyére 5-(n-oktin-l-il)-uracil-bázisokat építünk be, az IC50-érték 2,5 pg/ml-re csökken, és 5 pg/ml koncentrációnál HIV-1 vírussal akutan fertőzött MT-4 sejtkultúrában a fertőzéstől számított 22. napig nem észleltünk HIV-szaporodást.(h) exchanging the phosphorus diester linkages linking the nucleotides with thiophosphoro diester linkages, and adding 5- (n-octin-1-yl) uracil bases in place of the thymine bases with an IC 50 of 2.5 pg / ml and at 5 pg / ml, no HIV multiplication was observed in MT-4 cell culture acutely infected with HIV-1 virus by day 22 of infection.

A kontrollként alkalmazott AZT-nél tapasztalt citotoxicitással szemben a fenti módosított antiszensz oligodezoxinukleotidok 100 pg/ml koncentrációig nem mutattak citotoxikus hatást.In contrast to the cytotoxicity observed with AZT as a control, the above modified antisense oligodeoxynucleotides up to 100 pg / ml did not show cytotoxic activity.

A találmány tehát olyan 17-26 nukleotidegységet tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotidokra vonatkozik, amelyek nukleotidsorrendje HIV-vírus RNS-e splice donor szakaszának 290. nukleotidjától kezdődően az 5’-irányban 7-15 és a 291. nukleotidjától a 3’irányban 5-14 nukleotid hosszúságú szakaszával komplementerek, és amely oligodezoxinukleotidokban a pirimidinbázisok legalább egy részének helyén 5(4-10 szénatomos n-alkin-l-il)-pirimidin-bázisok vannak, és/vagy a nukleotidokat összekötő foszfor-diészter-csoportok helyén tiofoszfor-diészter-csoportok vannak. Ezek az antiszensz oligodezoxinukleotidok in vitro körülmények között jelentős és hosszan tartó HIV-ellenes hatással rendelkeznek MT-4 sejtkultúrákban, citotoxikus mellékhatás nélkül.Thus, the present invention relates to antisense oligodeoxynucleotides comprising 17-26 nucleotide units having a nucleotide sequence of 7-15 nucleotides 5 'to 5' and 5 'to 14' nucleotides 291 to 291 of the splice donor region of HIV RNA. and wherein at least a portion of the pyrimidine bases in the oligodeoxynucleotides have 5 (C 4 -C 10) n-alkynyl-1-yl pyrimidine bases and / or the phosphorus diester groups linking the nucleotides have thiophosphoro diester groups. . These antisense oligodeoxynucleotides have significant and long-lasting anti-HIV activity in MT-4 cell cultures in vitro, without cytotoxic side effects.

A találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok egy előnyös csoportjában a timinbázisok helyén 5(4-10 szénatomos n-alkin-l-il)-uracil-bázisok vannak.In a preferred group of antisense oligodeoxynucleotides of the invention, thymine bases are substituted with 5- (C 4 -C 10) n-alkynyl-1-yl uracil bases.

A találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok egy másik előnyös csoportjában a timinbázisok helyén 5-(n-hexin-l-il)-uracil-bázisok vannak.In another preferred group of antisense oligodeoxynucleotides of the invention, the thymine bases are substituted with 5- (n-hexin-1-yl) uracil bases.

A találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok egy további előnyös csoportjában a citozinbázisok helyén 5-(4-10 szénatomos n-alkin-l-il)-citozin-bázisok, előnyösen 5-(n-hexin-l-il)-citozin-bázisok vannak.In another preferred group of antisense oligodeoxynucleotides of the invention, the cytosine bases are substituted with 5- (C 4 -C 10) n-alkin-1-yl cytosine bases, preferably 5- (n-hexin-1-yl) cytosine bases.

A találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok egy újabb előnyös csoportjában mind a citozinbázisok, mind pedig a timinbázisok helyén a megfelelő 5-(4-10 szénatomos n-alkin-l-il) [előnyösen 5-(nhexin-l-il)]-bázisok vannak,In another preferred group of antisense oligodeoxynucleotides of the invention, both the cytosine bases and the thymine bases have the appropriate 5- (C 4 -C 10) n-alkin-1-yl [preferably 5- (nhexin-1-yl)] bases. .

A találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok egy további előnyös csoportjának szekvenciája a HIV-vírus RNS-e 275-299, 280-299, 283-299, valamint a 280-296 és 280-305 szekvenciájával komplementer.A further preferred group of antisense oligodeoxynucleotides of the present invention has the sequence complementary to the HIV viral RNA 275-299, 280-299, 283-299, and 280-296 and 280-305.

HU 221 497 AlHU 221 497 Al

A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti antiszensz oligodezoxinukleotidok előállítása. Ezeket a vegyületeket önmagukban ismert módon állítjuk elő úgy, hogy a megfelelő nukleotidokat a megfelelő sorrendben összekapcsoljuk egymással.The invention also relates to the preparation of the above antisense oligodeoxynucleotides. These compounds are prepared in a manner known per se by coupling the appropriate nucleotides in the appropriate order.

A találmány tárgyát képezik a fenti antiszensz oligodezoxinukleotidokat tartalmazó gyógyászati készítmények is. Ezek a gyógyászati készítmények a találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidokat egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyaggal egyesítve tartalmazzák.The present invention also provides pharmaceutical compositions comprising the above antisense oligodeoxynucleotides. These pharmaceutical compositions comprise the antisense oligodeoxynucleotides of the invention in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or other excipients.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti antiszensz oligodezoxinukleotidok alkalmazása HlV-fertőzések kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállításában.The present invention also provides the use of the above antisense oligodeoxynucleotides in the manufacture of a medicament for the treatment of HIV infections.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmények előállítására oly módon, hogy a találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidokat a gyógyszerkészítésben általánosan alkalmazott nemtoxikus, közömbös, szilárd vagy folyékony hordozó-, hígítóés/vagy egyéb segédanyaggal összekeverjük, és enterális vagy parenterális beadást lehetővé tevő szokásos gyógyszerformákká alakítjuk. E követelményeknek megfelelő hordozó-, hígító-, illetve kötőanyagok például a víz, a zselatin, a laktóz, a szacharóz, a keményítő, a pektin, a sztearinsav, a magnézium-sztearát, a talkum, a különböző növényi olajok, továbbá a glikolok (például a propilénglikol vagy a polietilénglikol).The invention further relates to a process for the preparation of pharmaceutical compositions comprising admixing the antisense oligodeoxynucleotides of the invention with non-toxic, inert, solid or liquid carriers, diluents and / or other excipients commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions and conventional dosage forms for enteral or parenteral administration. Suitable carriers, diluents, or binders for these purposes include water, gelatin, lactose, sucrose, starch, pectin, stearic acid, magnesium stearate, talc, various vegetable oils, and glycols ( such as propylene glycol or polyethylene glycol).

A gyógyszerészeti segédanyagok közül megemlítjük a tartósítószereket, például a metil-4-hidroxi-benzoátot, a különböző természetes vagy szintetikus emulHIV-RNS: 3’-r(CGCAl 299........Pharmaceutical excipients include preservatives, such as methyl 4-hydroxybenzoate, various natural or synthetic emulHIV RNA: 3'-r (CGCA1 299 ........

a dezoxi-antiszensz: 5’-d(GCG TAC TCA CCA GTC GCC GC)-3’, és a tiofoszfor-diészter-kötésekkel (s) és a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracillal (hU) módosított (2. képlet) 20 tagú antiszensz dezoxioligonukleotid képlete:deoxy-antisense: 5'-d (GCG TAC TCA CCA GTC GCC GC) -3 ', with thiophosphoro diester linkages (s) and 5- (n-hexin-1-yl) uracil (instead of thymine) ( hU) modified 20-membered antisense deoxyoligonucleotide of formula (2):

5’-d(GsCsGs hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs GsCsCs GsC)-3’5'-d (GsCsGs hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs GsCsCs GsC) -3 '

A 2’-dezoxinukleotid-egységek összekapcsolásához Biosearch 8700 DNS-szintetizátort használtunk.A Biosearch 8700 DNA synthesizer was used to couple the 2'-deoxynucleotide units.

Az 5’-0-(p,p’-dimetoxi)-tritil-5-(h-hexin-l-il)-2’-de- 45 zoxi-uridin-3’-O-(2-ciano-etil)-N,N-diizopropil-foszforamidit (DMT-2’-dezoxi-n-hexin-l-il-CED-foszforamidit, (3. képlet) 0,03 M acetonitriles (víztartalma <0,002%) oldatát tartalmazó üvegtartályt a szintetizátor 13-as (U jelű) helyére felerősítjük. A 9-12-es he- 50 lyen a természetes bázisokat tartalmazó védőcsoportokkal ellátott nukleozidok 3’-foszfor-N,N-(diizopropil)amiditjainak oldatait helyeztük el (9=A, 10=C, 11 =G, 12=T) a fentivel azonos koncentrációban. A 8-as helyen lévő tartályban a kondenzációs reakcióban aktiválóágensként szereplő 1-H-tetrazol 0,47 M-os acetonitriles oldatban van.5'-O- (p, p'-Dimethoxy) trityl-5- (h-hexin-1-yl) -2'-deoxyoxyuridin-3'-O- (2-cyanoethyl) ) A glass container containing 0.03 M acetonitrile (water content <0.002%) in N, N-diisopropylphosphoramidite (DMT-2'-deoxy-n-hexin-1-yl-CED-phosphoramidite, Formula 3) was synthesized in the synthesizer. Attached to position 13 (U) In position 9-12, solutions of the 3'-phosphorus-N, N- (diisopropyl) amide of nucleosides with protecting groups containing natural bases were placed (9 = A, 10 = C, 11 = G, 12 = T) in the same concentration as above The 1-H-tetrazole used as the activating agent in the condensation reaction in the tank at position 8 is in 0.47 M acetonitrile.

A szekvencia első tagja 3’-hidroxilcsoportján keresztül szpészeren át kontrollált pórusú üvegfelülethez (CPG) van kovalensen kötve. A hordozóhoz kötött 5’-dimetoxi- 60 geáló-, diszpergáló- és nedvesítőszereket, a színezőanyagokat, az ízjavító szereket, a pufferolóanyagokat, valamint a szétesést és oldódást elősegítő szereket.The first member of the sequence is covalently linked via a spacer-controlled pore glass surface (CPG) via its 3'-hydroxyl group. Carrier-bound 5'-dimethoxy-60 gelling, dispersing and wetting agents, coloring agents, flavoring agents, buffering agents, and disintegrating and dissolving agents.

A szokásos gyógyszerformákon a fenti gyógyszerészeti segédanyagok segítségével előállítható készítményeket értjük, amelyek lehetnek szilárd gyógyszerformák, így például tabletták, kapszulák, porok, drazsék, pirulák vagy granulátumok, illetve folyékony gyógyszerfonnák, például szirupok, oldatok, emulziók vagy szuszpenziók, továbbá parenterális készítmények, így injekciós és infúziós oldatok, valamint rektális készítmények, például végbélkúpok. A találmány szerinti kompozíciók napi dózisa számos tényezőtől, így például a beteg állapotától és a kezelés módjától függ. Felnőtteknek célszerűen naponta testtömeg-kg-onként 0,5-1200 mg hatóanyagot adagolunk. Ennek megfelelően előnyös naponta 1-3-szor 0,01-0,2 g hatóanyag-tartalmú tablettát, kapszulát vagy drazsét adagolni.Conventional dosage forms include those prepared by the aforementioned pharmaceutical excipients which may be solid dosage forms such as tablets, capsules, powders, dragees, pills or granules, or liquid dosage forms such as syrups, solutions, emulsions or suspensions, and parenteral preparations such as injectables. and infusion solutions, and rectal preparations such as suppositories. The daily dose of the compositions of the invention will depend on many factors, such as the condition of the patient and the mode of treatment. Suitably, 0.5 to 1200 mg of active ingredient per kg of body weight per day is administered to adults. Accordingly, it is preferable to administer a tablet, capsule or dragee containing from 0.01 to 0.2 g of active ingredient 1 to 3 times daily.

A találmány szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidokat az alábbi példákkal ismertetjük.The antisense oligodeoxynucleotides of the present invention are illustrated by the following examples.

1. példaExample 1

A H1V-RNS 280-299. nukleotídszekvenciájával 25 komplementer, tiofoszfor-diészter-kötést és a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI538) szintézise A HÍV RNS-e 280-299. nukleotidszekvenciája és az ezzel komplementer antiszensz oligodezoxinukleotid nukleotidsorrendje az alábbi (a hármas tagolás a jobb áttekintést szolgálja):A H1V-RNS 280-299. Synthesis of 25 antisense oligodeoxynucleotides (KKKI538) complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 280-299 containing thiophosphoro diester linkage and 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine. nucleotide sequence and the complementary antisense oligodeoxynucleotide have the following nucleotide sequence (triplicate for a better overview):

G AGU GGU CAG CGG CG)-5’G AGU GGU CAG CGG CG) -5 '

..................................280 tritil-védőcsoportot tartalmazó nukleozidból 1 mikromólnyi mennyiséget (20-25 mg a felkötött mennyiség függvényében) (38-40 mikronról nukleozid/g hordozó) 1 mmx30 mm méretű reaktorba töltünk, amelyet mind40 két végén szűrővel ellátott kupakkal zárunk. A készülékbe a célszekvenciát programozzuk be úgy, hogy a T szimbólumokat U-val helyettesítjük (Sequence menü), majd elindítjuk a szintézist (Run menü)................................... 1 micromolar (20-25 mg of the bound nucleoside) of 280 trityl protecting nucleosides (38-40 microns nucleoside / g carrier) into a 1 mm x 30 mm reactor, sealed at each end with a filter cap. Program the target sequence into the device by replacing the T symbols with U (Sequence menu) and then starting the synthesis (Run menu).

Első lépésként a hordozóhoz kötött nukleozidról 2,5%-os diklór-ecetsav diklór-metános oldatával 90 s alatt eltávolítjuk a dimetoxi-tritil-védőcsoportot, majd acetonitriles mosás után a célszekvencia következő tagjával való kondenzáció következik: a 9-13-as hely valamelyikéről kb. 15 mikromólnyi, a 8-as helyről kb. 75 mikromólnyi reaktánst a reaktorba adagolunk, s ott állni hagyjuk 3 percig. Acetonitriles mosás után a foszfitkötést tetraetil-tiuram-diszulfid 0,5 M-os acetonitriles oldatával tiofoszfáttá oxidáljuk (20 perc alatt, majd az el nem reagált 5’-hidroxilcsoportokat acetonit55 ril/kollidin/dimetil-amino-piridin/ecetsavanhidrid (73:15:2:10) elegyével acetilezzük. Mosás után a detritilezéssel kezdődő ciklus ismétlődik, míg a szekvencia összes tagja sorra kerül a kondenzációs reakcióban. Az utolsó tagról a már fent említett módon távolítjuk el a dimetoxi-tritil-csoportot.The first step is to remove the dimethoxytrityl protecting group from the nucleoside bound to the support with 90% dichloroacetic acid in dichloromethane for 90 s, followed by condensation with the following member of the target sequence after acetonitrile washing: approx. 15 micromolar, from position 8 approx. 75 microliters of reactant was added to the reactor and allowed to stand for 3 minutes. After washing with acetonitrile, the phosphite bond was oxidized to a thiophosphate solution with a 0.5 M solution of tetraethyl thiuram disulphide in thiophosphate (20 min, then unreacted 5'-hydroxyl groups were acetonitrile / collidine / dimethylaminopyridine / acetic anhydride (73:15). : 2: 10) After washing, the cycle starting with detritilization is repeated until all members of the sequence are sequenced in the condensation reaction, removing the dimethoxytrityl group from the last member as above.

HU 221 497 AlHU 221 497 Al

A hordozóhoz kötött, védett heterobázisokat tartalmazó oligonukleotidot 30%-os vizes ammóniaoldattal 20 °C-on 1 óra alatt hasítjuk le a hordozóról. Az így nyert oldatot 60 °C-ra melegítjük, és 8 órán át ezen a hőmérsékleten tartjuk, és így távolítjuk el a szabad 3 ’-hidroxilt tartalmazó oligomerről a többi védőcsoportot. Az oldatot bepároljuk, éterrel extraháljuk és a vizes oldatot HPLC segítségével tisztítjuk. A nyers oligonukleotidelegy a főkomponens mellett szennyezésként elsősorban rövidebb lánchosszúságú oligomereket tartalmaz.The oligonucleotide containing the protected heterobases bound to the support is cleaved from the support with 30% aqueous ammonia solution at 20 ° C for 1 hour. The resulting solution was heated to 60 ° C and held at this temperature for 8 hours to remove the other protecting groups from the free 3'-hydroxyl containing oligomer. The solution was evaporated, extracted with ether and the aqueous solution was purified by HPLC. The crude oligonucleotide mixture contains, in addition to the main component, oligomers of shorter chain lengths as impurities.

A főkomponens tisztítását fordított fázisú kromatográfiás elv alapján HPLC-vel végeztük, két Jasco PU980 HPLC pumpa és egy Jasco UV-975 UV/VIS detektor segítségével. A pumpák és a detektor önállóan programozhatok. Az UV abszorpciós adatok a detektorról BDS kártyán keresztül egy ARL AT386 számítógépbe kerülnek a BDS Barspec Data System szoftver segítségével. A kromatográfiás elválasztás a képernyőn követhető. Az elválasztást egy Shandon Hypersil ODS (Cl8), 5 mikrométer, 120 Á, 250 χ 8 mm (BST, Budapest) oszlopon végeztük lineáris acetonitrilgradienssel (A eluens: 0,1 M kálium-foszfát-puffer, pH=7,5% acetonitril, B eluens: 0,1 M kálium-foszfát-puffer, pH=7,50% acetonitril, 100% A-ról 100% B-re 45 perc alatt). Előzetes analitikai kép alapján 100-1000 A26o-egység, optimálisan 400 egységnyi (a 20 nukleotid hosszúságú tiooligonukleotid káliumsója esetén ez 16 mg) nyers oligomert vittünk fel a 250x8 mm-es félpreparatív oszlopra. A komponensek mennyiséget UV-spektroszkópiával határoztuk meg egy Hewlett-Packard HP8452A fotométerben.Purification of the principal component was performed by reverse phase chromatography on HPLC using two Jasco PU980 HPLC pumps and a Jasco UV-975 UV / VIS detector. The pumps and detector can be individually programmed. UV absorption data is transferred from the detector via a BDS card to an ARL AT386 computer using the BDS Barspec Data System software. The chromatographic separation can be followed on the screen. Separation was performed on a Shandon Hypersil ODS (Cl8), 5 micrometer, 120,, 250 χ 8 mm (BST, Budapest) with a linear gradient of acetonitrile (eluent: 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.5% acetonitrile). Eluent B: 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.50% acetonitrile, 100% A to 100% B over 45 minutes). Upon preliminary analysis of the image 100-1000 26 p-units, optimally loaded unit 400 (this is 16 mg and 20 nucleotides in length tiooligonukleotid potassium salt) of the crude oligomer is up to 250x8 mm semipreparative column. The amount of components was determined by UV spectroscopy on a Hewlett-Packard HP8452A photometer.

A főcsúcsnak megfelelő frakcióról ezután vákuum rotációs bepárlóval szobahőmérsékleten eltávolítjuk az acetonitrilt, és tovább koncentráljuk 10-100 ml térfogatra. Ezután dialízissel sómentesítjük (Spectrapor dialízismembrán, molekulatömeg-átengedés határa: 3500 alatt, Serva). A dialízist nagy tisztaságú ionmentes vízzel szemben végeztük (Milli-Q), a sókiáramlást vezetőképesség-méréssel követtük. A sómentesített oligomeroldatot liofileztük -25 °C-on tároltuk.The main peak fraction was then removed by vacuum rotary evaporation at room temperature and further concentrated to a volume of 10-100 mL. It is then desalted by dialysis (Spectrapor dialysis membrane, molecular weight transfer limit: below 3500, Serva). Dialysis was performed against high purity deionized water (Milli-Q), and the salt flow was monitored by conductivity measurement. The desalted oligomer solution was lyophilized and stored at -25 ° C.

A kondenzálások lépesenkénti hozama kb. 97-98%, ennek alapján egy 20 tagú oligomer kb. 60%-os hozammal nyerhető. Ez 1 mikromólos szintézislépték esetén kb. 100 A260 nyers egységnek felel meg. Ebből a HPLCtisztítás után átlagosan kb. 50 A260 egységnyi (kb. 2 mg káliumsó) tiszta oligonukleotidot kaptunk.The yield per step of condensation is approx. 97-98%, based on which a 20-membered oligomer is ca. It is obtained in 60% yield. This is approx. 100 Corresponds to 260 raw units. Of this, on average, ca. 260 units (about 2 mg of potassium salt) of pure oligonucleotide were obtained.

A szintetizált oligonukleotidok nukleotidsorrendjét (szekvenciáját) a DNS-szintetizátor programja garantálja. A szintetizált és tisztított oligonukleotidok szerkezetét a következő analízisekkel igazoltuk.The nucleotide sequence (sequence) of the synthesized oligonucleotides is guaranteed by the DNA synthesizer program. The structure of the synthesized and purified oligonucleotides was confirmed by the following analyzes.

1. Összetétel-analízis: az oligonukleotidot foszfordiészteráz és lúgos foszfatázenzimekkel nukleozidokig bontottuk, és a hidrolíziselegyet HPLC segítségével analizáltuk. Az analízis a várt nukleozid-összetételt eredményezte: 45% C, 25% G, 15% A és 15% hU, ±2,5% hibával, amely megfelel a fenti szerkezeti képletben szereplő 9 db C, 5 db G, 3 db A és 3 db hU arányának.1. Composition Analysis: The oligonucleotide was cleaved to nucleosides with phosphoesteresterase and alkaline phosphatase and the hydrolysis mixture was analyzed by HPLC. Analysis yielded the expected nucleoside composition: 45% C, 25% G, 15% A and 15% hU, ± 2.5% error, corresponding to 9 C, 5 G, 3 A in the above structure and 3 pieces of hU.

2. Szekvenciaanalízis: ehhez az oligonukleotidot az 5’-láncvégen gamma-[32P]ATP-vel megjeleztük, és az ismert Maxam-Gilbert-technikával analizáltuk.2. Sequence Analysis: For this purpose, the oligonucleotide was labeled at the 5 'end with gamma [ 32 P] ATP and analyzed by the known Maxam-Gilbert technique.

A szekvenálógélről leolvasható szekvencia megegyezett a fenti képletben leírt szekvenciával.The sequence read from the sequencing gel was the same as that described in the above formula.

3. Az oligonukleotid tisztaságát analitikai fordított fázisú HPLC-módszerrel vizsgáltuk. A kromatogram alapján az oligonukleotid 95%-os tisztaságú volt.3. The purity of the oligonucleotide was assayed by analytical reverse phase HPLC. According to the chromatogram, the oligonucleotide was 95% pure.

4. A tiofoszfor-diészter oligonukleotidokat 31P-NMR-rel analizáltuk. A spektrum alapján az oligonukleotidban az intemukleotidkötések 98%-a tiofoszfor-diészter volt.4. Thiophosphoro diester oligonucleotides were analyzed by 31 P-NMR. Based on the spectrum, 98% of the intemucleotide bonds in the oligonucleotide were thiophosphoric diester.

5. A duplexképzési hajlamot a szintén megszintetizált szensz dezoxioligonukleotiddal képzett komplex erősségének meghatározásával mértük. Az 260 nm-nél mért fényabszorpció-hőmérséklet görbéjéből számolt stabilitás minden oligonukleotiddal lényegesen magasabb volt mint 37 °C.5. The tendency to duplex formation was measured by determining the strength of the complex with the synthesized sense deoxyoligonucleotide. The stability of the light absorption temperature curve at 260 nm for each oligonucleotide was significantly higher than 37 ° C.

2. példaExample 2

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI 515, 516) szintéziseHIV-RNA 280-299. synthesis of antisense oligodeoxynucleotide (KKKI 515, 516) complementary to its nucleotide sequence

A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje:Nucleotide sequence of the 20-membered oligomer:

5’-d(GCG TAC TCA CCA GTC GCC GC>3’5'-d (GCG TAC TCA CCA GTC GCC GC> 3 '

Az oligomer előállítását, tisztítását és analízisét az 1. példában leírt eljárással végeztük, az alábbi módosításokkal :The oligomer was prepared, purified and analyzed by the procedure described in Example 1 with the following modifications:

- a szekvencia programozásánál az eredeti T szimbólumon nem változtattunk,- the original T symbol was not changed when programming the sequence,

- a programot úgy változtattuk meg, hogy a kondenzációs lépés után az el nem reagált 5’-hidroxilcsoportok acetilezése történt, majd a foszfitkötést 0,01 M jódoldattal (acetonitrilkollidin-víz=64:6:30 elegyében oldva a jódot) oxidáltuk foszfáttá. Ez a vegyület a találmány szerinti vegyületek körén kívül esik; a példát referenciaként közöljük.- the program was changed by acetylation of unreacted 5'-hydroxy groups after the condensation step and oxidizing the phosphite bond to phosphate with 0.01 M iodine (dissolved in acetonitrile collidin-water = 64: 6: 30). This compound is outside the scope of the compounds of the invention; the example is provided as a reference.

3. példaExample 3

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI 513) szintéziseHIV-RNA 280-299. synthesis of antisense oligodeoxynucleotide (KKKI 513) complementary to its nucleotide sequence and containing 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine

A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje :Nucleotide sequence of the 20-membered oligomer:

5’-d(GCG hUAC hUCA CCA GhUC GCC GC)-3’5'-d (GCG hUAC hUCA CCA GhUC GCC GC) -3 '

Az oligomer előállítását, tisztítását és analízisét a 2. példában megadott módon hajtjuk végre, azzal a különbséggel, hogy a szintetizátor 13-as (U jelű) helyére 5’-0-(p,p’-dimetoxi)-tritil-5-(«-hexm-l-il)-2’-dezoxiuridin-3’-0-(2-ciano-etil)-N,N-diizopropil-foszfor-amidit 0,03 M acetonitriles (víztartalma <0,002%) oldatát tartalmazó üvegtartályt helyeztünk, és a készülékbe a célszekvenciát programoztuk be úgy, hogy a T szimbólumokat U-val helyettesítettük (Sequence menü).The preparation, purification and analysis of the oligomer was carried out as in Example 2, except that the synthesizer 13 (U) was replaced by 5'-O- (p, p'-dimethoxy) trityl-5- ( Glass container containing a solution of 0.03 M acetonitrile (water content <0.002%) in N-N-N-diisopropylphosphoramidite (-hexm-1-yl) -2'-deoxyuridine-3'-O- (2-cyanoethyl) and the target sequence was programmed into the device by replacing the T symbols with U (Sequence menu).

4. példaExample 4

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, a citozin helyett 5-(n-hexin-l-il)-citozint tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI 520, 552) szintéziseHIV-RNA 280-299. synthesis of antisense oligodeoxynucleotide (KKKI 520, 552) complementary to its nucleotide sequence and containing 5- (n-hexin-1-yl) cytosine instead of cytosine

A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje (a hC rövidítésNucleotide sequence of the 20 membered oligomer (abbreviated as hC)

5-(n-hexin-1 -il)-citozint jelent):Means 5- (n-hexin-1-yl) -cytosine):

HU 221 497 AlHU 221 497 Al

5’-d(GhCG TAhC ThCA hChCA GThC GhChC GhC)-3’5'-d (GhCG TAhC ThCA hChCA GThC GhChC GhC) -3 '

Az oligomer előállítását, tisztítását és analízisét a 2. példában megadott módon hajtjuk végre, azzal a különbséggel, hogy az elrendezést úgy változtattuk meg, hogy a szintetizátor 10-es (C jelű) helyére 5’-0-(p,p’dimetoxi)-tritil-5-(n-hexin-l-il)-2’-dezoxi-citidin-3’O-(2-ciano-etil)-N,N-diizopropil-foszfor-amidit (4. képlet) 0,03 M acetonitriles (víztartalma <0,002%) oldatát tartalmazó üvegtartályt helyeztünk.The preparation, purification and analysis of the oligomer was carried out as in Example 2, except that the arrangement was changed by replacing the synthesizer with 10 '(C) at 5'-O- (p, p'dimethoxy). -trityl-5- (n-hexin-1-yl) -2'-deoxycytidin-3'O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramide (Formula 4), A glass container containing 03 M acetonitrile (water content <0.002%) was placed.

5. példaExample 5

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt és a citozin helyett 5-(n-hexin-l-il)-citozint tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI554) szintézise A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje:HIV-RNA 280-299. Synthesis of an antisense oligodeoxynucleotide (KKKI554) complementary to its nucleotide sequence and containing 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine and 5- (n-hexin-1-yl) cytosine instead of cytosine The nucleotide sequence of the 20-membered oligomer is:

5’-d(GhCG hUAhC hühCA hChCA GhUhC GhChC GhC)-3’.5'-d (GhCG hUAhC hühCA hChCA GhUhC GhChC GhC) -3 '.

Az oligomer előállítását, tisztítását és analízisét a 4. példában megadott módon hajtjuk végre, azzal a különbséggel, hogy a programot és az elrendezést úgy változtattuk meg, hogy a szintetizátor 13-as (U jelű) helyére 5’-0-(p,p’-dimetoxi)-tritil-5-(«-hexm-l-il)-2’-dezoxiuridin-3’-(2-ciano-etil)-N,N-diizopropil-foszfor-amidit 0,03 M acetonitriles (víztartalma <0,002%) oldatát tartalmazó üvegtartályt helyeztünk, és a készülékbe a célszekvenciát programoztunk be úgy, hogy a T szimbólumokat U-val helyettesítettük (Sequence menü).The preparation, purification and analysis of the oligomer was carried out as described in Example 4, except that the program and the arrangement were changed by replacing the synthesizer 13 (U) with 5'-O- (p, p). '-dimethoxy) -trityl-5 - (' - hexm-1-yl) -2'-deoxyuridine-3 '- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramide (0.03 M in acetonitrile). water content <0.002%) and the target sequence was programmed into the apparatus by replacing the T symbols with U (Sequence menu).

6. példaExample 6

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, tiofoszfor-diészter-kötést tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI 517, 545) szintéziseHIV-RNA 280-299. synthesis of antisense oligodeoxynucleotide (KKKI 517, 545) complementary to the nucleotide sequence of

A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje:Nucleotide sequence of the 20-membered oligomer:

5’-d(GsCsGs TsAsCs TsCsAs CsCsAs GsTsCs GsCsCs GsC)-3’5'-d (GsCsGs TsAsCs TsCsAs CsCsAs GsTsCs GsCsCs GsC) -3 '

Az oligonukleotidot az 1. példában megadott módszerrel állítottuk elő, tisztítottuk és analizáltuk azzal a módosítással, hogy a szekvencia programozásánál az eredeti T szimbólumon nem változtattunk.The oligonucleotide was prepared, purified and analyzed by the method of Example 1 with the exception that the original T symbol was not altered in sequence programming.

7. példaExample 7

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, a citozin helyett 5-(n-oktin-l-il)-uracilt és tiofoszfor-diészter-kötést tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI 583) szintézise A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje (az oU rövidítés 5-(n-oktin-1 -il)-uracilt jelent:HIV-RNA 280-299. Synthesis of an antisense oligodeoxynucleotide (KKKI 583) complementary to its nucleotide sequence and containing 5- (n-octin-1-yl) uracil and thiophosphoro diester linkage instead of cytosine The nucleotide sequence of the 20-membered oligomer (the abbreviation oU is 5- (n-octin-1). -il) means uracil:

5’-d(GsCsGs oUsAsCs oUsCsAs CsCsAs GsoUsCs GsCsCs GsC)-3’5'-d (GsCsGs oUsAsCs oUsCsAs CsCsAs GsoUsCs GsCsCs GsC) -3 '

Az oligomer előállítását, tisztítását és analízisét az 1. példában megadott módon hajtjuk végre, azzal a különbséggel, hogy a programot és az elrendezést úgy változtattuk meg, hogy a szintetizátor 13-as (U jelű) helyére 5’0-(p,p’-dimetoxi)-tritil-5-(«-oktin-l-il)-2’-dezoxiuridin-3’-(2-ciano-etil)-N,N-diizopropil-foszfor-amidit 0,03 M acetonitriles (víztartalma <0,002%) oldatát tartalmazó üvegtartályt helyeztünk, és a készülékbe a célszekvenciát programoztuk be úgy, hogy a T szimbólumokat U-val helyettesítettük (Sequence menü).The preparation, purification and analysis of the oligomer was carried out as in Example 1, except that the program and the arrangement were changed by replacing the synthesizer 13 (U) with 5'0- (p, p '). -dimethoxy) trityl-5 - ((- octin-1-yl) -2'-deoxyuridine-3 '- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite 0.03 M acetonitrile (water content) A <RTIgt; glass </RTI> container containing <0.002%) solution was placed and the target sequence programmed into the apparatus by replacing the T symbols with U (Sequence menu).

8. példaExample 8

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, a citozin helyett 5-(n-hexin-l-il)-citozint és tiofoszfor-diészter-kötést tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI 549) szintézise A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje:HIV-RNA 280-299. Synthesis of an antisense oligodeoxynucleotide (KKKI 549) complementary to its nucleotide sequence and containing 5- (n-hexin-1-yl) cytosine and thiophosphoro diester linkage instead of cytosine The nucleotide sequence of the 20-membered oligomer:

5’-d(GshCsGs TsAshCsTshCsAs hCshCsAs GsTshCs GshCshCs GshC)5'-d (GshCsGs TsAshCsTshCsAs hCshCsAs GsTshCs GshCshCs GshC)

Az oligonukleotidot a 6. példában megadott módszerrel állítottuk elő, tisztítottuk és analizáltuk azzal a módosítással, hogy a szintetizátor 10-es (C jelű) helyére 5’-0-(p,p’-dimetoxi)-tritil-5-(M-hexin-l-il)-2’-dezoxi-citidin-3’-(2-ciano-etil)-N,N-diizopropil-foszforamidit 0,03 M acetonitriles (víztartalma <0,002%) oldatát tartalmazó űvegtartályt helyeztünk.The oligonucleotide was prepared, purified and analyzed by the method of Example 6 with the modification that the synthesizer at position 10 (C) was 5'-O- (p, p'-dimethoxy) trityl-5- (M-). Hexin-1-yl) -2'-deoxycytidine-3 '- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite was placed in a glass container containing 0.03 M acetonitrile (water content <0.002%).

9. példaExample 9

A HIV-RNS 280-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, a citozin helyett 5-(n-hexin-l-il)-citozint, a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt és tiofoszfor-diészter-kötést tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (KKKI 542) szintéziseHIV-RNA 280-299. synthesis of 5- (n-hexin-1-yl) cytosine, 5- (n-hexin-1-yl) uracil and thiophosphoro diester linkage (KKKI 542) complementary to its nucleotide sequence, containing cytosine instead of cytosine

A 20 tagú oligomer nukleotidsorrendje:Nucleotide sequence of the 20-membered oligomer:

5’-d(GshCsGs hUsAshCs hUshCsAs hCshCsAs GshUshCs GshCshCs GshC>3’5'-d (GshCsGs hUsAshCs hUshCsAs hCshCsAs GshUshCs GshCshCs GshC> 3 '

Az oligonukleotidot a 8. példában megadott módszerrel állítottuk elő, tisztítottuk és analizáltuk azzal a módosítással, hogy a szintetizátor 13-as (U jelű) helyére 5’-0-(p,p’-dimetoxi)-tritil-5-(«-hexin-l-il)-2’-dezoxiuridin-3’-(2-ciano-etil)-N,N-diizopropil-foszfor-amidit 0,03 M acetonitriles (víztartalma <0,002%) oldatát tartalmazó üvegtartályt helyeztük, és a készülékbe a célszekvenciát úgy programoztuk be, hogy a T szimbólumokat U-val helyettesítettük (Sequence menü).The oligonucleotide was prepared, purified and analyzed by the method of Example 8 with the modification that the synthesizer 13 (U) was replaced by 5'-O- (p, p'-dimethoxy) trityl-5 - (- Hexin-1-yl) -2'-deoxyuridine-3 '- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite was placed in a glass container containing 0.03 M acetonitrile (water content <0.002%) and the The target sequence was programmed into the device by replacing the T symbols with U (Sequence menu).

10. példaExample 10

A HIV-RNS 280-305. nukleotidszekvenciájával komplementer, tiofoszfor-diészter-kötést és a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (az 5 '-irányban + 6 bázis, KKKI 577) szintéziseHIV-RNA 280-305. synthesis of antisense oligodeoxynucleotide (5 '+ 6 base, KKKI 577) complementary to its nucleotide sequence and containing thiophosphoro diester linkage and 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine

A 26 tagú oligomer nukleotidsorrendje:Nucleotide sequence of the 26-membered oligomer:

5’-d(hUshUshUs hUshüsGs_GsCsGs hüsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs GsCsCs GsC)-3’ (A jel az 1. példában megadott szekvencia kezdete)5'-d (hUshUshUs hUshüsGs_GsCsGs hüsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs GsCsCs GsC) -3 '(The beginning of the sequence given in Example 1)

Az oligonukleotidot az 1. példában megadott módszerrel állítottuk elő, tisztítottuk és analizáltuk azzal a módosítással, hogy a szekvencia programozásánál a HIV-RNS-szekvencia alapján az 5’-irányban hat taggal hosszabb oligonukleotidot vettünk figyelembe.The oligonucleotide was prepared, purified and analyzed by the method of Example 1 with the exception that the oligonucleotide 5 'up to 5' in length based on the HIV-RNA sequence was used in the sequence programming.

11. példaExample 11

A HIV-RNS 275—299. nukleotidszekvenciájával komplementer, tiofoszfor-diészter-kötést és a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (a 3 '-irányban +5 bázis, KKKI 593) szintéziseHIV-RNA 275-299. Synthesis of an antisense oligodeoxynucleotide complementing its nucleotide sequence with a thiophosphoro diester linkage and 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine (+ 3 bases + 5 base, KKKI 593)

HU 221 497 AlHU 221 497 Al

A 25 tagú oligomer nukleotidsorrendje:Nucleotide sequence of the 25-membered oligomer:

5’-d(GsCsGs hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsGs5'-d (GsCsGs hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsGs

GsCsCs GsC_CsCsCs hUsC)-3’ (A jel az 1. példában megadott szekvencia kezdete)GsCsCs GsC_CsCsCs hUsC) -3 '(The beginning of the sequence given in Example 1)

Az oligonukleotidot az 1. példában megadott módszerrel állítottuk elő, tisztítottuk és analizáltuk azzal a módosítással, hogy a szekvencia programozásánál a HIV-RNS-szekvencia alapján a 3’-irányban öt taggal hosszabb oligonukleotidot vettünk figyelembe.The oligonucleotide was prepared, purified, and analyzed by the method of Example 1 with the exception that the oligonucleotide 3 'up to 5' was used in the sequence programming based on the HIV RNA sequence.

12. példaExample 12

A HIV-RNS 280-296. nukleotidszekvenciájával komplementer, tiofoszfor-diészter-kötést és a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (az 5 '-irányban -3 bázis, KKK1HIV-RNA 280-296. antisense oligodeoxynucleotide complementary to its nucleotide sequence, containing a thiophosphoro diester linkage and 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine (base 5 'in the 5' direction, KKK1

584) szintézise584)

A 17 tagú oligomer nukleotidsorrendje:Nucleotide sequence of the 17-membered oligomer:

5’-d(hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs GsCsCs5'-d (hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs GsCsCs

GsC>3’GSC> 3 '

Az oligonukleotidot az 1. példában megadott módszerrel állítottuk elő, tisztítottuk és analizáltuk azzal a módosítással, hogy a szekvencia programozásánál a HIV-RNS-szekvencia alapján az 5’-irányban három taggal rövidebb oligonukleotidot vettünk figyelembe.The oligonucleotide was prepared, purified, and analyzed by the method of Example 1 with the modification that the oligonucleotide 5'-down by 5 'based on the HIV-RNA sequence was used in programming the sequence.

13. példaExample 13

A HIV-RNS 283-299. nukleotidszekvenciájával komplementer, tiofoszfor-diészter-kötést és a timin helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotid (a 3 '-irányban -3 bázis, KKK1HIV-RNA 283-299. antisense oligodeoxynucleotide complementary to its nucleotide sequence, containing a thiophosphoro diester linkage and 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine (base 3 ', 3', KKK1

585) szintézise585)

A17 tagú oligomer nukleotidsorrendje:Nucleotide sequence of A17 oligomer:

5’-d(GsCsG hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs5'-d (GsCsG hUsAsCs hUsCsAs CsCsAs GshUsCs

GsCs)-3’GsCs) -3 '

Az oligonukleotidot az 1. példában megadott módszerrel állítottuk elő, tisztítottuk és analizáltuk azzal a módosítással, hogy a szekvencia programozásánál a HIV-RNS-szekvencia alapján a 3’-irányban három taggal rövidebb oligonukleotidot vettünk figyelembe.The oligonucleotide was prepared, purified and analyzed by the method of Example 1 with the exception that the 3 'shorter oligonucleotide based on the HIV RNA sequence was used in programming the sequence.

A találmány tárgya szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok HIV-ellenes hatásaThe present invention relates to the anti-HIV activity of antisense oligodeoxynucleotides

Az anyagokat 1, 5,20 és 100 mikrogramm/ml koncentrációkban teszteltük MT-4 sejtvonalon. Az MT4 sejteket 20 TCID50 Ηΐν-1Ν|Β (NIH, USA) vírussal fertőztük. A sejteket a HIV-fertőzés előtt 4 órával kezeltük először az antiszensz oligonukleotidokkal, majd a HIV-fertőzés után 24 és 48 óra múlva (akut fertőzés). A vírustermelésre gyakorolt hatást a tenyésze10 tek felülúszójából történő reverz transzkriptázenzimaktivitásméréssel vizsgáltuk. A reverz transzkriptázaktivitás mértékét a [3H]dTTP-beépülés alapján határoztuk meg, és a minták aktivitását cpm/ml-ben adtuk meg.The substances were tested at concentrations of 1, 5.20 and 100 micrograms / ml on the MT-4 cell line. MT4 cells were 20 TCID 50 Ηΐν-1 Ν | Β (NIH, USA). Cells were treated with antisense oligonucleotides 4 hours before HIV infection, and 24 and 48 hours after HIV infection (acute infection). The effect on virus production was assessed by reverse transcriptase enzyme activity assay from culture supernatants. The degree of reverse transcriptase activity was determined by [ 3 H] dTTP incorporation and the activity of the samples was expressed in cpm / ml.

Az 5,20 és 100 mikrogramm/ml koncentrációjú hatóanyaggal a kezelést fertőzetlen MT-4 sejteken is elvégeztük a vizsgált vegyületek citotoxikus hatásának tesztelése céljából. A sejtek viabilitásának megítélése fénymikroszkópos megtekintés és trypán-kékkel vég20 zett szupravitális festés alapján történt. Vizsgáltuk továbbá a vegyületek sejtszaporodást befolyásoló hatását.At concentrations of 5.20 and 100 micrograms / ml, treatment was also performed on uninfected MT-4 cells to test the cytotoxic activity of the test compounds. Cell viability was assessed by light microscopy and trypan blue supavavital staining. The compounds were also tested for their effect on cell proliferation.

Az 1. ábra az 1., 6., 8. és 9. példa szerinti antiszensz oligonukleotidok HIV-ellenes hatását mutatja MT-4 sej25 tekben, a reverz transzkriptázenzim aktivitása alapján a fertőzéstől számított idő függvényében. Kontrollként a fertőzött, de az antiszensszel nem kezelt sejtekben mért vírusszaporodást (kezeletlen HIV-kontroll) adtuk meg. Referenciaként az AZT azonos körülmények között mért hatását is feltüntettük.Figure 1 shows the anti-HIV activity of the antisense oligonucleotides of Examples 1, 6, 8 and 9 in MT-4 cells as a function of the time of infection based on reverse transcriptase activity. As a control, virus growth (untreated HIV control) was measured in infected but untreated cells. For reference, the effect of AZT measured under the same conditions is also indicated.

A vírusszaporodás csúcsa rendszerünkben általában a hetedik napon következett be. Az 50%-os inhibícióhoz szükséges antiszenszkoncentráció (IC50) meghatározásához a vírusszaporodás csúcsánál mért aktivitáso35 kát használtuk fel kiindulási értékként.The peak of viral replication in our system generally occurred on the seventh day. The antisense concentration (IC 50 ) required for 50% inhibition was determined by measuring the activity at the peak of viral growth.

Az IC50-értékek meghatározását az 1-13. példában megadott összes antiszensz oligonukleotiddal elvégeztük a fenti módon. Az eredményeket a 1. táblázatban foglaltuk össze, kiegészítve a hatás időtartamával.The IC 50 values are determined as shown in Figures 1-13. All antisense oligonucleotides given in Example 1A were performed as described above. The results are summarized in Table 1, supplemented by the duration of the effect.

1. táblázatTable 1

A találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok HIV-ellenes hatása MT-4 sejtekbenAnti-HIV activity of antisense oligonucleotides of the invention in MT-4 cells

Antiszensz oligomer (KKKI-szám) Antisense oligomer (CCI number) HIV-RNS- szekvencia HIV RNA sequence Kémiai módosítás Chemical amendment ic50 (mikrogramm/ml)ic 50 (micrograms / ml) A hatás időtartama (nap/antiszensz koncentráció pg/ml) Duration of action (day / antisense concentration pg / ml) 1. példa (538) Example 1 (538) 280-299 280-299 tiofoszf., hU thiophosph., hU 1,2 1.2 30/5 30/5 1 2. példa (515,516) Example 1 2 (515,516) 280-299 280-299 - - 63 63 6/100 6/100 3. példa (513) Example 3 (513) 280-299 280-299 hU hU 38 38 10/100 10/100 4. példa (520,552) Example 4 (520,552) 280-299 280-299 hC hC 2 2 18/20 18/20 5. példa (554) Example 5 (554) 280-299 280-299 hU,hC Wow, hC 2,8 2.8 18/20 18/20 6. példa (517,545) Example 6 (517,545) 280-299 280-299 tiofoszf. thiophosphate. 2 2 18/20 18/20 7. példa (583) Example 7 (583) 280-299 280-299 tiofoszf., oU thiophosph., oU 2,5 2.5 22/5 22/5 1 8. példa (549) Example 8 (549) 280-299 280-299 tiofoszf., hC thiophosph., hC 0,6 0.6 18/5 18/5 9. példa (542) Example 9 (542) 280-299 280-299 tiofoszf., hU, hC thiophosph., hU, hC 2 2 18/5 18/5 1 10. példa (577) Example 10 (577) 280-305 280-305 tiofoszf., hU thiophosph., hU 6,5 6.5 30/10 30/10

HU 221 497 AlHU 221 497 Al

1. táblázat (folytatás)Table 1 (continued)

Antiszensz oligomer (KKKI-szám) Antisense oligomer (CCI number) HIV-RNS- szekvencia HIV RNA sequence Kémiai módosítás Chemical amendment IC50 (mikrogramm/ml)IC 50 (micrograms / ml) A hatás időtartama (nap/antiszensz koncentráció pg/ml) Duration of action (day / antisense concentration pg / ml) 11. példa (593) Example 11 (593) 275-299 275-299 tiofoszf., hU thiophosph., hU 2,5 2.5 22/20 22/20 12. példa (584) Example 12 (584) 280-296 280-296 tiofoszf., hU thiophosph., hU 2,4 2.4 22/5 22/5 13. példa (585) Example 13 (585) 283-299 283-299 tiofoszf., hU thiophosph., hU 2,6 2.6 22/5 22/5

Rövidítések: hU=5-(n-hexin-1 -il)-uracil hC=5-(n-hexin-1 -il)-citozin oU=5-(n-oktin-1 -i l)-uraci I tiofoszf.=tiofoszfor-diészter intemukleotidkötésAbbreviations: hU = 5- (n-hexin-1-yl) uracil hC = 5- (n-hexin-1-yl) cytosine oU = 5- (n-octin-1-yl) uracil thiophosph. = thiophosphoro diester intemucleotide bond

A 2. példa szerinti, természetes nukleotidokból felépített antiszensz oligonukleotid gyenge HIV-ellenes hatást mutatott. A hatás erősödött a timinbázis helyett 5-(n-hexin-l-il)-uracilt tartalmazó, 3. példa szerinti antiszensz oligomer alkalmazása esetén. Tovább növeke- 20 dett a HIV-ellenes hatás a 4. példa szerinti antiszensszel, amely 5-(n-hexin-l-il)-citozint tartalmazott módosított pirimidinbázisként. Ugyanilyen hatású volt az 5. példa szerinti, minden pirimidinbázisában módosított antiszensz, továbbá a bázisban nem módosított, de a foszfor-diészter intemukleotidkötések helyett tiofoszfor-diészter-kötéseket tartalmazó, 6. példa szerinti antiszensz. Az utóbbi kettővel a hatás 18 napig tartott 20 mikrogramm/ml koncentráció esetén. Meglepően nagy és tartós hatást az 1. példa szerinti antiszensz öli- 30 gonukleotid mutatott, amely mind 5-(n-hexin-l-il)-uracil, mind tiofoszfor-diészter-módosítást tartalmazott.The antisense oligonucleotide constructed from natural nucleotides of Example 2 showed a weak anti-HIV activity. The effect was enhanced with the antisense oligomer of Example 3 containing 5- (n-hexin-1-yl) uracil instead of thymine base. The anti-HIV activity was further enhanced with the antisense of Example 4, which contained 5- (n-hexin-1-yl) cytosine as a modified pyrimidine base. The antisense of Example 5, modified in all pyrimidine bases, and the antisense of Example 6, containing unmodified base but having thiophosphoric diester linkages instead of phosphorus diester intemucleotide bonds, had the same effect. With the latter two, the effect lasted for 18 days at a concentration of 20 micrograms / ml. The antisense oil gonucleotide of Example 1 which contained both a 5- (n-hexin-1-yl) uracil and a thiophosphoro di modification was surprisingly large and sustained.

Ezt mutatja az IC50 alacsony értéke és az 5 mikrogramm/ml koncentráció mellett 30 napig, a vizsgálat teljes időtartamáig kitartó hatása (3. ábra). 35This is shown by its low IC 50 value and persistence of 5 micrograms / ml for 30 days for the duration of the study (Figure 3). 35

Hasonlóan jelentős antivirális hatást mutatott a 5(n-oktin-l-il)-uracillal és tiofoszfor-diészter-kötésekkel vegyesen módosított, 7. példa szerinti antiszensz, továbbá a 8-9. példa szerinti, szintén vegyesen módosított módosított antiszensz oligonukleotidok. Ugyan- 40 ilyen hatásúak voltak a 12-13. példa szerinti, rövidebb láncú, szintén vegyesen módosított antiszenszek is.Similarly, the antisense of Example 7 mixed with 5 (n-octin-1-yl) uracil and thiophosphoro diester linkages showed similar antiviral activity, as well as the antisense of Examples 8-9. Examples are the modified antisense oligonucleotides also exemplified by example. The same effects were observed in Figures 12-13. Examples include the shorter chain antisense, also mixed.

Citotoxikus hatást a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok egyikénél sem észleltünk a fenti kon- 45 centrációkban. Az AZT 5 mikrogramm/ml felett toxikus volt.No cytotoxic effect was observed with any of the antisense oligonucleotides of the invention at the above concentrations. AZT above 5 micrograms / ml was toxic.

Az 1-13. példa szerint előállított vegyületek retenciós idejét (tp perc) a 2. táblázatban közöljük. A ςértékeket HPLC-vel határoztuk meg az 1. példában a fő- 50 komponens tisztításánál ismertetett körülmények között, azzal a különbséggel, hogy az elválasztáshoz használt oszlop átmérője 8 mm helyett 4,6 mm volt.1-13. The retention times (tpm) of the compounds prepared in Example 1c are shown in Table 2. The ς values were determined by HPLC under the conditions described in Example 1 for purification of the major component, except that the column used for separation was 4.6 mm instead of 8 mm.

2. táblázatTable 2

Vegyület (a példa száma) Compound (example number) tjperc) tjperc) 1 l 1 l 20,5 20.5 1 2-1 2 - 16,0 16.0

Vegyület (a példa száma) Compound (example number) tr(perc) tr (min) 3. Third 16,8 16.8 4. 4th 17,9 17.9 5. 5th 18,5 18.5 6. 6th 19,4 19.4 7. 7th 21,0 21.0 8. 8th 23,2 23.2 9. 9th 24,1 24.1 10. 10th 24,7 24.7 11. 11th 25,2 25.2 12. 12th 18,0 18.0 13. 13th 18,3 18.3

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS

Claims (11)

1. 17-26 nukleotidegységet tartalmazó antiszensz oligodezoxinukleotidok, amelyek nukleotidsorrendje a HIV-vírus RNS-e splice donor szakaszának 290. nukleotidjától kezdődően az 5’-irányban 7-15. és a 291. nukleotidjától a 3’-irányban 5-14 nukleotid hosszúságú szakaszával komplementerek, és amelyekben a pirimidinbázisok legalább egy részének helyén 5-(4-10 szénatomos n-alkin-l-il)-pirimidin-bázisok vannak, és/vagy a nukleotidokat összekötő foszfor-diészter-csoportok helyén tiofoszfor-diészter-csoportok vannak.Claims 1. An antisense oligodeoxynucleotides comprising 17-26 nucleotide units, the nucleotide sequence of which is 7 'to 15' from nucleotide 290 of the splice donor region of the HIV RNA. and nucleotides 291 and 5 'to 14' in the 3 'direction, wherein at least a portion of the pyrimidine bases are 5- (C4-C10) n-alkin-1-yl) pyrimidine bases, and / or the phosphorus diester groups linking the nucleotides are substituted with thiophosphorus diester groups. 2. Az 1. igénypont szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok, amelyekben a timinbázisok helyén 5(4-10 szénatomos n-alkin-l-il)-uracil-bázisok vannak.The antisense oligodeoxynucleotides of claim 1, wherein the thymine bases are substituted with 5- (C 4 -C 10) n-alkynyl-1-yl uracil bases. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok, amelyekben a timinbázisok helyén 5-(n-hexin-l-il)-uracil-bázisok vannak.The antisense oligodeoxynucleotides according to claim 1 or 2, wherein the thymine bases are 5- (n-hexin-1-yl) uracil bases. 4. Az 1. igénypont szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok, amelyekben a citozinbázisok helyénThe antisense oligodeoxynucleotides of claim 1, wherein the cytosine bases are 55 5-(4-10 szénatomos n-alkin-l-il)-citozin, előnyösen 5(n-hexin-l-il)-citozin-bázisok vannak.55 are 5- (C 4 -C 10) n-alkynyl-1-yl cytosine bases, preferably 5 (n-hexin-1-yl) cytosine bases. 5. Az 1. igénypont szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok, amelyekben valamennyi pirimidinbázis helyén 5-(4-10 szénatomos n-alkin-l-il)-pirimidin-bázis,The antisense oligodeoxynucleotides of claim 1, wherein each pyrimidine base is replaced by a 5- (C 4 -C 10) n-alkin-1-yl pyrimidine base, 60 előnyösen 5-(n-hexin-l-il)-pirimidin-bázis van.Preferably, the base is 5- (n-hexin-1-yl) pyrimidine base. HU 221 497 AlHU 221 497 Al 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok, amelyekben a nukleotidokat összekötő csoport foszfor-diészter-csoport.6. The antisense oligodeoxynucleotides of any one of claims 1 to 5, wherein the nucleotide linker is a phosphorus diester group. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok, amelyekben az antiszensz oligodezoxinukleotidok a HIV-vírus RNS-e 275-299., 280-299., 283-299., valamint a 280-296. és 280-305. szekvenciájával komplementerek.7. The antisense oligodeoxynucleotides of any one of claims 1 to 5, wherein the antisense oligodeoxynucleotides are HIV RNA 275-299, 280-299, 283-299, and 280-296. 280-305. complementary to its sequence. 8. Gyógyszerkészítmények, amelyek gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyag mellett legalább egy, 1-7. igénypontok bármelyike szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidot tartalmaznak.Pharmaceutical compositions comprising, in addition to a pharmaceutically acceptable carrier and / or other excipient, at least one of claims 1-7. An antisense oligodeoxynucleotide according to any one of claims 1 to 3. 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidok alkalmazása gyógyszerkészítmények előállítására HIV-fertőzések kezelésére.9. Use of antisense oligodeoxynucleotides according to any one of claims 1 to 6 for the preparation of a medicament for the treatment of HIV infections. 10. Eljárás az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti 5 antiszensz oligodezoxinukleotidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő nukleotidokat a megfelelő sorrendben ismert módon összekapcsoljuk.10. Procedure 1-7. Antisense oligodeoxynucleotides 5 according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the corresponding nucleotides are linked in a known manner in the appropriate order. 11. Eljárás a 8. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-7.11. A process for the preparation of a pharmaceutical composition according to claim 8, characterized in that the method according to claims 1-7. 10 igénypontok bármelyike szerinti antiszensz oligodezoxinukleotidot a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekevetjük és gyógyszerkészítménnyé formáljuk.The antisense oligodeoxynucleotide of any one of claims 10 to 10 is mixed with a carrier and / or other excipient commonly used in the preparation of a medicament and formulated into a pharmaceutical composition.
HU9502742A 1995-09-20 1995-09-20 Antisens hiv splice donor oligodeoxynucleotides, containing 5-(n-alkin-1-yl)-pyrimidine bases, inhibiting hiv-proliferation, process for producing medicaments containing the same and the medicaments HU221497B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9502742A HU221497B1 (en) 1995-09-20 1995-09-20 Antisens hiv splice donor oligodeoxynucleotides, containing 5-(n-alkin-1-yl)-pyrimidine bases, inhibiting hiv-proliferation, process for producing medicaments containing the same and the medicaments

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9502742A HU221497B1 (en) 1995-09-20 1995-09-20 Antisens hiv splice donor oligodeoxynucleotides, containing 5-(n-alkin-1-yl)-pyrimidine bases, inhibiting hiv-proliferation, process for producing medicaments containing the same and the medicaments

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9502742D0 HU9502742D0 (en) 1995-11-28
HU221497B1 true HU221497B1 (en) 2003-01-28

Family

ID=10987226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502742A HU221497B1 (en) 1995-09-20 1995-09-20 Antisens hiv splice donor oligodeoxynucleotides, containing 5-(n-alkin-1-yl)-pyrimidine bases, inhibiting hiv-proliferation, process for producing medicaments containing the same and the medicaments

Country Status (1)

Country Link
HU (1) HU221497B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
HU9502742D0 (en) 1995-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU653504B2 (en) Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5455233A (en) Oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
AU687492B2 (en) Synthetic oligomers having phosphonate internucleosidyl linkages of undefined chirality mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
WO1988007544A1 (en) Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
EP0729474A1 (en) Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
HUT76094A (en) Oligonucleotide n3&#39;-p5&#39; phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
JPH10507635A (en) Use of 2&#39;-substituted oligonucleotides to down regulate gene expression
CA2152672A1 (en) Oligomers having improved stability at acid ph
JP2018109015A (en) Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
RU2740501C2 (en) Modified oligonucleotides which activate rnase h
DK174025B1 (en) Use of certain 2 &#39;, 5&#39; oligoadenylate analogues for the preparation of a drug against retroviral infections, novel among such types of compounds, also for use in the treatment of a retroviral infection, and the use of ........
EP0773951B1 (en) Dinucleoside-5&#39;,5&#39;-pyrophosphates
US5700785A (en) 3&#39;-deoxy or 3&#39;-O-substituted-2&#39;,5&#39;-oligoadenylates as antiviral agents
EP0739899B1 (en) Novel oligoribonucleotide derivatives and application thereof to antiviral agents
HU221497B1 (en) Antisens hiv splice donor oligodeoxynucleotides, containing 5-(n-alkin-1-yl)-pyrimidine bases, inhibiting hiv-proliferation, process for producing medicaments containing the same and the medicaments
CA2130926C (en) Dual action 2&#39;,5&#39;-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
DE69409097T2 (en) 5-ALKYL, 5- (1-ALKENYL) AND 5- (1-ALKYNYL) PYRIMIDINE-CONTAINING OLIGODESOXYNUCLEOTIDES AND PHARMACEUTICAL PREPARATIONS CONTAINING SUCH COMPOUNDS
WO1996003500A1 (en) Sustance with antiviral activity
WO1992003127A1 (en) Compositions and methods for treating hiv infections
JP3911703B2 (en) Antisense nucleic acid congeners
CA2149626A1 (en) Formation of triple helix complexes of single stranded nucleic acids using nucleoside oligomers which comprise pyrimidine analogs
IE83348B1 (en) Therapeutic uses of 2&#39;,5&#39;-oligoadenylate derivatives
JPH08157372A (en) New anti-hiv agent
IL106709A (en) Antiviral pharmaceutical compositions containing 2&#39;,5&#39;-oligoadenylates
NZ240169A (en) The use of 2&#39;,5&#39;-olioadenylates to treat virus infections

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20020805

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee