HU217570B - Eljárás klór-tetraciklin és tetraciklin szintézisét kódoló DNS klónozására alkalmazható bifunkcionális kozmidok előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány új, a tetraciklin, valamint a klór-tetraciklinbiőszintézisét szabályőzó izőlált DNS klónőzásában, valamint heterőlóggazdaszervezetben, példáűl Streptőmyces lividansban való kifejezésérehasználható kőzmidők előállítására vőnatkőzik. Az igényelt plazmidőkat(kőzmidőkat) egy Escherichia cőliban készült kőzmid könyvtárátvizsgálásával állítják elő, azt a tűlajdőnságűkat használva aszelekcióra, hőgy Streptőmyces lividansban tetraciklin-rezisztenciátőkőznak. Az LP2127 és LP2128 plazmidőkat visszanyerik az ilyentetraciklin-rezisztens Streptőmyces lividans izőlátűmőkból, amelyekrőlagarőn és főlyékőny tenyészetek HPLC-elemzésével kiműtatják, hőgy atetraciklin és a klór-tetraciklin szintézisét irányítják. ŕ

Description

A találmány olyan új és hasznos kozmidok előállítására és alkalmazására vonatkozik, amelyek különböző klónozási és expressziós lehetőségeket biztosítanak. A találmány szerinti kozmidok például a klór-tetraciklin és tetraciklin teljes szintézisútját kódoló géncsoport klónozására és így a Streptomyces aureofaciensben végbemenő bioszintézisét kódoló DNS klónozására, valamint annak Streptomyces lividans gazdaszervezetben történő kifejezésére használhatók. Ezeknek a kozmidoknak a használata megnövekedett fermentációs termelési szintet eredményez, valamint új termékek, például antibiotikumok, fehérjék és/vagy polipeptidek új kiválogatási módszerét teszik lehetővé.

A klór-tetraciklin antibiotikumot és származékait (például a tetraciklin, demetil-klór-tetraciklin, demetiltetraciklin) kereskedelmi mennyiségben Streptomyces aureofaciens szubmerz fermentációjával állítják elő (Dugar et al., 1948). A mikroorganizmussal több mint 30 éven át végzett ipari kutatás kifinomult fermentációs technikákat és táptalaj-összetételeket eredményezett, amelyek lehetővé tették a fermentációs kitermelés jelentős emelését (Goodman, 1985). A kitermelés emelésében elért említett eredményeket az tette lehetővé, hogy olyan Streptomyces aureofaciens mutánsokat izoláltak, amelyek több antibiotikum termelésére voltak képesek (Veselova, 1969). Ezeket a nagy termelőképességű mutánsokat elsősorban mutagenezis, majd ezt követő randomszelekció útján izolálták a nagyobb termelőképességre végzett átvizsgálás alapján. Ugyanez a technika tette lehetővé az antibiotikum bioszintézisében blokkolt mutánsok izolálását, amelyek fontos eszközei voltak a klór-tetraciklin-képződés bioszintézisútja felderítésének (McCormick, 1968). Ezen eredmények ellenére a klór-tetraciklin bioszintézésének szabályozását nem sikerült teljesen megérteni. A Streptomyces genetika területén elért legújabb fejlődés megteremtette annak lehetőségét, hogy tanulmányozzuk az iparilag fontos metabolitokat termelő mikroorganizmusok molekuláris genetikáját.

A kromoszomális markerek Streptomyces protoplasztok fúziója, majd ezt követő regenerálása útján végbemenő rekombinációjának igazolása (Hopwood et al., 1978; Baltz et al., 1981) döntő esemény volt az aktinomicéták genetikájában. A protoplasztfüziós technika kifejlesztése előtt a genetikai keresztezéseket csak néhány olaj fajnál lehetett megbízhatóan elvégezni, amelyek igazolt konjugációs rendszerrel rendelkeznek (Hopwood, 1967), ma viszont a genetikai elemzést bármely olyan fajban el lehet végezni, amelyikből protoplaszt képezhető és abból a mikroorganizmus regenerálható. Még fontosabb, hogy a protoplasztok később ideális alanyoknak bizonyultak a plazmid DNS-sel végzett transzformációhoz, és ezzel megteremtődött annak lehetősége, hogy rekombináns DNS-kísérleteket lehessen végezni ezekben a mikroorganizmusokban (Bibb et al., 1978). Bizonyos antibiotikum- (tiostrepton, viomicin és neomicin) rezisztenciát kódoló gének izolálása lehetővé tette könnyen szelektálható klónozó vektorok konstruálását egyes természetes Streptomyces plazmidokból (Thompson et al., 1982).

Az egyik legelőször klónozott, az antibiotikum bioszintézisében részt vevő gén az O-metil-transzferáz volt, amely az undecil-prodigiozin (UDP) antibiotikum hatású pigment képződésében játszik szerepet (Feitelson et al., 1980). A gént azon az alapon azonosították, hogy képes volt az UDP bioszintézisútjában szereplő egyik ismert mutációt komplementálni. Az ezekben a korai, a bioszintézisgének izolálására irányuló erőfeszítésekben alkalmazott más technikák közé tartozott a mutációs klónozás, az OC31 fágot alkalmazva a metilenomicin esetében (Charter et al., 1983), a rekombináns kiónok sib szelekciója, in vitro enzimvizsgálatokat alkalmazva az aktinomicin fenoxazin-szintetáz esetében (Jones et al., 1984), valamint a szulfonamid-rezisztencia, amelyet a kandicidin termelésében szerepet játszó p-amino-benzoesav-szintetáz kódol (Gil et al., 1983). A bialafosz bioszintézisgéneket a blokkolt mutánsok komplementálása alapján azonosították (Murakami et al., 1986).

Az aktinorodin-bioszintézisben szerepet játszó géneket a Streptomyces coelicolor-bioszintézisben blokkolt mutánsainak komplementálása alapján klónozták (Malpartida et al., 1984). Ez utóbbi esetben különböző osztályokba tartozó mutánsokat komplementáló, egymással átfedő két kiónt kombináltak egyetlen plazmidban, amelyről később igazolták, hogy ha egy heterológ, Streptomyces parvulus gazdaszervezetbe juttatják be, akkor biztosítja ezen sejtekben az aktinorodin bioszintetizálóképességet.

További fontos megfigyelés volt az, hogy az antibiotikum-bioszintézisben szereplő gének a termelő mikroorganizmusban fizikailag kapcsolódnak az ugyanazzal az antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosító génhez. Tehát egy Streptomyces griseusból származó, streptomicin-rezisztenciát biztosító DNSszekvenciáról igazolták, hogy egybefügg azzal a DNSftagmenssel, amely komplementer bioszintézisblokkoló anyagokat kódol (Distler et al., 1985). Ugyanez volt megfigyelhető Streptomyces ffadiae esetén, amikor bioszintézisgéneket oly módon azonosítottak, hogy egy kozmidkönyvtárat vizsgáltak át homológia szempontjából, olyan kevert oligonukleotidot használva hibridizációs próbaként, amelyet azon az alapon terveztek meg és állítottak elő, hogy a tilozin bioszintézisútjában szereplő utolsó enzim aminoterminálisának megfelelő DNS-szekvenciát képviselje (Fishman et al., 1989). Egy korábban klónozott tilozin-rezisztenciagénről (tlrB) kimutatták, hogy megtalálható ebben a DNS-szakaszban, amely kilenc különböző blokkolt mutánst komplementált (Baltz et al., 1988). A puromicin (Var2 et al., 1988), valamint a tetracenomicin esetében (Motamedi et al., 1987) a Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben kifejeződő antibiotikum-rezisztenciagénre való primer szelekció tette lehetővé, hogy azonosítsák az ugyanazon a klónozott DNS-ffagmensen található antibiotikum-bioszintézisgéneket.

A nukleinsavpróbák alkalmazása segítette a bioszintézisgének izolálását. Ez a megközelítés azon a már meglévő információtömegen alapul, ami a bioszintézisútra vonatkozik, vagy már korábban elvégzett klóno2

HU 217 570 Β zási kísérletekből származik. így például az előzőkben említett tilozin esetében egy olyan próbát készítettek, amely egy bioszintézisenzim részleges aminosavszekvenciáján alapult (Fishman et al., 1987). Hasonlóképpen a Streptomyces clavuligerusból az izopenicillin-szintetázgént azon az alapon klónozták, hogy azonosítottak egy kiónt, amely hibridizált egy olyan oligonukleotid-próbához, amelyet az enzim N-terminális aminosavszekvenciája alapján konstruáltak (Leskiw, 1988). Az eritromicin bioszintézisében szereplő géneket azon az alapon azonosították, hogy egy korábban klónozott eritromicin-rezisztenciagén-próbával vizsgáltak végig egy kozmidkönyvtárat (Stanzák, 1986). Hasonlóképpen az oxitetraciklin bioszintézisében szereplő géneket úgy azonosították, hogy a hibridizációt vizsgálták mind egy korábban klónozott rezisztenciadeterminánshoz (Butler et al., 1989), mind pedig egy olyan oligonukleotidhoz, amely az anhidro-tetraciklinoxigenáz bioszintézisenzim részlegesen felderített aminosavszekvenciájának megfelelő DNS-szekvencia alapján szintetizálódott (Binnie et al., 1989). A heterológ actl és actIII próbák alkalmazása tette lehetővé a Streptomyces peuceticusban az antraciklin-bioszintézisben szerepet játszó gének azonosítását (Stutzman-Engwall et al., 1989).

Ezeket a technikákat önmagukban vagy egymással kombináltan alkalmazva vált lehetővé a teljes bioszintézisutak azonosítása vagy összeállítása, valamint néhány esetben a heterológ gazdaszervezetekben történő kifejeződés biztosítása. A bialafosz teljes bioszintézisútját a komplementáló aktivitásra és a bialafoszrezisztencia heterológ kifejeződésére végzett szelekciók kombinációjával klónozták (Murakami et al., 1986). Jóllehet azt közölték, hogy a teljes bioszintézisutat egy lépésben sikeresen izolálták Streptomyces lividansban oly módon, hogy a bialafosz-rezisztenciára szelektálták, nem említik, hogy a bioszintézisgéneket kifejezték volna. Az aktinorodin géncsoportjának öszszeállítását komplementáló klónokból, valamint kifejezését Streptomyces parvulusban a fentiekben tárgyaltuk (Malpartida et al., 1984).

Saccharopolyspora erythrea könyvtárból izoláltak egy olyan bifunkciós kozmidklónt, amely egy homológ eredetű eritromicinrezisztencia-determinánshoz hibridizál, és kimutatták, hogy eritromicin bioszintézisét irányítja, ha Streptomyces lividansba transzformálják (Stanzák et al., 1986). Egy olyan Escherichia coli kozmidklón, amely hibridizál mind egy oxitetraciklinrezisztenciagén-próbához, mind egy bioszintézisgén-próbához (anhidro-tetraciklin-oxigenáz), lehetővé tette az oxitetraciklin-bioszintézis géncsoportjának izolálását Streptomyces rimosusból (Binnie et al., 1989). Ezt követően egy Streptomyces plazmid vektorba történő szubklónozás lehetővé tette az oxitetraciklin Streptomyces lividansban való termelését.

A tetracenomicintermelő törzsből két átfedő kiónt azonosítottak azon az alapon, hogy Streptomyces glaucescens blokkolt mutánsokat komplementáltak velük, valamint azon az alapon, hogy tetracenomicin-rezisztenciát biztosítottak Streptomyces lividansban (Motameti et al., 1987). Abban az esetben, amikor külön-külön volt jelen a két ffagmens Streptomyces lividansban, és együtt fermentálták őket, illetve amikor egyszerre voltak jelen ugyanabban a Streptomyces lividans gazdaszervezetben, tetracenomicin keletkezett. Egy Streptomyces peuceuticus DNS Escherichia coli könyvtárából Streptomyces coelicolor actl és actIII próbákhoz való hibridizálás alapján izolált bifunkciós klónokról kimutatták, hogy a pigmentált antibiotikum szintézisét irányították, ha Streptomyces lividansba juttatták be (Stutzman-Engwall, 1989).

Emellett a cefamicin C-termelés bioszintézisútját is izolálták (Chen et al., 1988). Ebben az esetben Streptomyces lividans random kiónjait vizsgálták át egyenként a cefamicin C-termelő képességük alapján agarkorong fermentációs módszer alkalmazásával. A 30 000 átvizsgált Streptomyces lividans transzformánsból egy transzformánsról sikerült igazolni, hogy cefamicin C-t termel. J. T. Fayerman [Biotechnology, 4, 786-789 (1986)] általános stratégiákat ismertet Streptomyces által kódolt antibiotikumok klónozására és expresszálására Streptomyces lividansban.

A találmány szerinti megoldás hasznos génsebészeti eszközt biztosít tetraciklin- és klór-tetraciklin-termelésért felelős bioszintézisutakat kódoló DNS-szakaszok klónozására és/vagy expresszálására.

A mellékelt 1. ábra a bifunkciós kozmidvektor komponenseinek szerkezetét és a kozmidkarok előállítási módszerét ábrázolja. Az L és R kozmidvektorkarokat az A és B plazmidból állítjuk elő a 3. példában közölt részletek szerint. Az egyszeres vonalak a konstrukció Escherichia coli replikon részeit mutatják. Az A plazmidban az Escherichia coli rész a pBR322 plazmid 3,7 kb méretű EcoRI-Sáli fragmenséből származik (Sutcliffe, 1979). A B plazmid az SCP2* plazmidnak egy 5,9 kb méretű EcoRI-Sáli fragmensét tartalmazza [sraffozott rész], amely a replikációs funkciókat biztosítja az aktinomicétákban (Larson et al., 1986). Mindkét plazmidon található három, a pHC79 (Hohn et al., 1980) plazmidnak egy 700 bp méretű BglII-BstEII, cos-tartalmú fragmenséből származó random tapadós vég [üres rész]. Az A plazmidon lévő tiostrepton-rezisztenciagén [sötét rész] a pIJ702 plazmidból (Katz et al., 1983) kinyert 1,1 kb méretű, Bell fragmensből származik. Az A plazmidon lévő 1,1 kb méretű spacer régió [pontozott rész] lambda-bakteriofág SacI ffagmenséről származik (Sanger et al., 1982).

A 2. ábra az LP²127 és az LP²128 fizikai térképe. Restrikciós térképezés alapján mindkét plazmidnak azonos a szerkezete, ezért egyetlen, mindkét plazmidra jellemző szerkezetet mutatunk be itt és a 3. ábrán. A vektorrészt dupla vonallal jelöljük; a TC/CTC bioszintézisrégiót egyetlen vonallal jelezzük. A Streptomyces aureofaciensből klónozott DNS 3,19 kb méretű; a vektor mérete 11,1 kb. Az említett vektorrégiók a pIBI-24 [vonalkázott rész] és a tiostrepton-rezisztencia [sraffozott rész]. A két, (+) jellel jelzett EcoRI restrikciós hasítási hely vektor eredetű, és a Sau3A-BglII kapcsolódási helyet veszik közre, amely a Streptomyces aureofaciens DNS és a vektor határvonalát jelenti.

HU 217 570 Β

A 3. ábra az LP²127 és LP²128 vektorban klónozott Streptomyces aureofaciens restrikciós endonukleázos térképe. Az LP²127-ben és az LP²128-ban klónozott 3,19 kb méretű DNS-t lineáris formában mutatjuk be. A térképet úgy rajzoltuk meg, hogy a vektorból származó EcoRI restrikciós hasítási helyeket mint bal és jobb oldali kiindulási, illetve befejező végeket tartalmazza. A restrikciós fragmensek méretét kilobázispárokban adjuk meg, és méretük az agaróz gélelektroforézis normális felbontási korlátain belül (körülbelül 500 bp) pontos.

A találmány tehát új kozmidokra vonatkozik, amelyek a tetraciklin és klór-tetraciklin teljes bioszintézisútjának Streptomyces aureofaciensből való klónozására és Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben való kifejezésére alkalmazhatók. Emellett ezeket a kozmidokat használjuk az ezen antibiotikumok (klórtetraciklin és tetraciklin) termelésének bioszintézisútját kódoló izolált DNS-géncsoport klónozására és kifejezésére. A találmány továbbá olyan DNS-re vonatkozik, amely a szakirodalomban ismertetett szigorú hibridizálási körülmények között hibridizál az LP²127 (ATCC 68357) és LP²128 (ATCC 68358) kozmidokban lévő, a klór-tetraciklin és tetraciklin bioszintézisútját kódoló DNS-csoporthoz. A találmány emellett ezen kozmidok említett antibiotikumok termelési szintjének emelésében, valamint olyan módszerekben való alkalmazására is vonatkozik, amelyeket a tetraciklin vagy klór-tetraciklinan alógokat termelő mikroorganizmusok szelektálásában alkalmazunk oly módon, hogy az Lp2l27 és LP²128 kozmidok felhasználásával ilyen analógokat termelő nukleotidszekvenciákat vizsgálunk át és expresszáltatunk.

Abból a célból, hogy a bioszintézisgéneket izoláljuk, egy olyan, rekombináns Streptomyces lividans könyvtárból kiválasztott kiónt alkalmazunk, amely tetraciklin-rezisztencia tulajdonságot fejez ki. A könyvtárat képező rekombináns kozmidokban lévő Streptomyces aureofaciens eredetű DNS-inszertek szükségszerűen nagyok, mivel az alkalmazott in vitro lambda-pakolórendszer korlátái olyan méretű kozmidmolekulákat igényelnek, amelyek 25-40 kb méretű DNS-inszerteket tartalmaznak, hogy életképes transzdukáló fágrészecskéket lehessen velük előállítani. Ha ebből a Streptomyces aureofaciens genom könyvtárból tetraciklin-rezisztens kiónokat szelektálunk, akkor a kozmidklónoknak egy korlátozott méretű csoportját izoláljuk. Ezek közül számosról vagy az összesről feltételezhető, hogy a szelektált tetraciklin-rezisztenciagénhez kapcsolódó antibiotikum bioszintézisgéneket is tartalmaznak. Azok között, amelyek elég nagyok és megfelelő pozícióban vannak, található az az alcsoport, amely a teljes bioszintézisutat tartalmazza. így a gének, illetve valójában az összes, a tetraciklin- és klórtetraciklin-képződést kódoló gén klónozása lehetséges anélkül, hogy előzőleg ismert lenne a régió szerkezete vagy szekvenciája. Jóllehet voltak publikációk, amelyek a tetraciklin-rezisztencia determináns (Reynes et al., 1988) és egy bróm-peroxidáz (Vám Pee, 1988) Streptomyces aureofaciensből történő klónozását írták le, ezek a publikációk semmiképpen nem terjedtek ki a klór-tetraciklin bioszintézisgének vagy a teljes géncsoport izolálására.

A DNS izolálására használt módszer lényege a sejtek lizozimes emésztése ozmotikus pufferben, majd óvatos lizálása, a fehérjék extrahálása, és végül a nagy molekulatömegű DNS dúsítása és töményítése. Jóllehet a leírt módszer hatékony, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy alternatív eljárások is alkalmazhatók, például olyanok, amelyeket Hopwood és munkatársai közöltek 1985-ben.

A példában használt összes DNS Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 törzsből származik, de a találmány semmiképpen nem korlátozódik erre az egy forrásra. Számos más, a tetraciklin osztályba tartozó antibiotikumot termelő Streptomyces aureofaciens törzs is használható a találmány szerinti eljárásban azonos eredménnyel. Ezek közé a Streptomyces aureofaciens törzsek közé tartoznak a mutáns törzsek, valamint alternatív vad típusú izolátumok, amelyek klór-tetraciklint, tetraciklint, 6-demetil-klór-tetraciklint, 6demetil-tetraciklint, 7-klór-5 a, 11 a-dehidrotetraciklint,

2-dekarboxamido-2-acetil-tetraciklint és a tetraciklinvegyületcsalád más tagjait termelik. A találmány vonatkozik még a klór-tetraciklin, tetraciklin és tetraciklin-rokon vegyületek klónozására más, ilyen vegyületeket termelő mikroorganizmusokból, például Streptomyces rimosusból, Streptomyces avellanusból, Streptomyces psammoticusból, Actinomadura brunneaból és Dactylosporangium vescaból.

A Streptomyces aureofaciens DNS-ét Sau3A restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük, így 35 kb méretű tartományba eső nagyméretű DNS-fragmenseket állítunk elő, amelyeknek a végei az alkalmazott bifunkciós kozmidvektor karjaival homológok. Ebben az esetben az optimális emésztési körülményeket empirikusan határozzuk meg úgy, hogy számos emésztést végzünk, és a végtermékeket agaróz gélelektroforézissel elemezzük. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy más könyvtárkészítési módszer és a kiválasztott klónozott DNS kinyerésére más módszer is alkalmazható. A példákban az Escherichia coli alkalmazása, valamint a lambda-fág pakolás miatt szükséges méretszelekció nem korlátozza a találmányt, mivel más vektorok is alkalmazhatók. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy monofunkciós Streptomyces vektorok, például a pIJ922 (Lydiate et al., 1985) is alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban, azzal a korlátozással, hogy a könyvtár készítését és a plazmid kinyerését az aktinomicétákon belül kell végezni.

A példákban található lépések közé tartozik a kozmidkarok és a méret alapján frakcionált DNS ligálási termékeinek in vitro pakolása, Escherichia coli X2819T törzsbe való transzdukciója, a transzduktáns populációk izolálása, DNS kinyerése belőlük, és ezzel kozmidkönyvtár előállítása. Az alkalmazott módszereket leírtuk, de a találmány nem korlátozódik a példákban leírtakra. Más módszerek is alkalmazhatók anélkül, hogy az eredményekben eltérés lenne. Tehát alternatív módszerek is használhatók a ligálásra és az in vitro pakolásra, valamint más rekombináció-deficiens (recA)

HU 217 570 Β

Escherichia coli gazdaszervezetek is használhatók, valamint más módszerek a könyvtár amplifikálására (például szelektív táptalajon való növesztés), a plazmid izolálására, amelyeket mind közöltek a szakirodalomban [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)].

A példákban az ezt követő lépés az egyesített kozmid DNS-készítmény bejuttatása Streptomyces lividansba, sejtkönyvtár készítése, ezt követően a könyvtár átvizsgálása olyan Streptomyces lividans transzformánsokra, amelyek 100 pg/ml tetraciklinre rezisztensek. Jóllehet sokkal munkaigényesebb módszer, de eljárhatunk úgy is, hogy a transzformánsokat közvetlenül replikalemez-készítési módszerrel vizsgáljuk át tetraciklin-rezisztencia szempontjából. Különböző tetraciklin-koncentrációkat használhatunk a vizsgálathoz, ami a forrásmikroorganizmus belső rezisztenciájától függ. Más tetraciklin-érzékeny, nem restriktív gazdaszervezetek, például a Streptomyces griseofuscus is alkalmazható Streptomyces lividans helyett.

Ezt követően kinyerjük a rekombináns plazmidot úgy, hogy plazmid DNS-t izolálunk a tetraciklinrezisztens Streptomyces lividansból, majd az említett DNS-t in vitro pakoljuk, és transzdukcióval bejuttatjuk Escherichia coliba. Az ilyen transzdukánsokból izolált plazmid DNS-t restrikciós enzimes feltérképezéssel jellemezzük szerkezetileg; így a példában ismertetett módszerrel izolált két plazmid, az LP²127 és LP²128 azonos szerkezetűnek bizonyult. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy más mikroorganizmusokból izolált hasonló DNS-régiók polimorfizmust mutathatnak a restrikciós hasítási helyek alapján, de egy megfelelő méretű, tetraciklin-rezisztenciát biztosító DNS-fragmenstől elvárható, hogy az alábbiakban ismertetett tulajdonságokkal rendelkezzen.

A tetraciklin-rezisztencia plazmideredetét azzal lehet igazolni, ha kimutatjuk, hogy a Streptomyces lividans LP²127 és LP²128 plazmidokkal kapott tiostrepton-rezisztens transzformánsai egyben tetraciklinrezisztensek is. A tetraciklin antibiotikumok keletkezését agarlemezen oly módon lehet igazolni, hogy az említett tiostrepton- és tetraciklin-rezisztens Streptomyces lividans antibiotikus aktivitást mutat Escherichia colival szemben, de kevésbé hatékony egy tetraciklinrezisztens Escherichia colival szemben.

Végül azt is igazoltuk, hogy a tetraciklinek szintézisét az LP²127 irányítja a Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben. Ezt mind szilárd agartáptalajon, mind folyékony táptalajon igazoltuk. Mind az eredetileg izolált tetraciklin-rezisztens Streptomyces lividans, mind a Streptomyces lividans LP²127-es transzformánsa termel tetraciklint és klór-tetraciklint olyan körülmények között, mint amilyen körülmények között ugyanez a termék izolálható a DNS forrásaként szolgáló Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 mikroorganizmusból. Másrészt pedig egy olyan Streptomyces lividans transzformáns, amely csak a plazmidvektort tartalmazza a beépített DNS nélkül, nem termel antibiotikumot.

A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal szemléltetjük.

A tetraciklineknek heterológ gazdaszervezetben való termelése nem korlátozódik a példákban ismertetett fermentációs körülményekre vagy az elemzésre használt HPLC-analitikai rendszerekre, habár ezek hatékony elemzést tesznek lehetővé. A tetraciklinek fermentációs úton való előállítására és elemzésére számos eljárást írtak le, és ezekkel az alábbiakban ismertetettek helyettesíthetők. Emellett jóllehet a Streptomyces lividanst használjuk a példákban heterológ gazdaszervezetként, az antibiotikum bioszintézisgének heterológ kifejezése számos aktinomicétában és más baktériumcsoportban is lehetséges, így például - nem korlátozó jelleggel - Bacillusokban, Corynebaktériumokban, Thermoactinomycesekben mindaddig, amíg ezek transzformálhatok a leírt, viszonylag nagy plazmidkonstrukciókkal. A transzformált mikroorganizmusok közé tartoznak például a Streptomyces griseofuscus és a Streptomyces ambofaciens, amelyekről ismert, hogy viszonylag nem restriktív tulajdonságúak.

1. példa

Streptomyces aureofaciens össz-DNS izolálása

A Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 liofilezett tenyészetét 0,8 ml IX szintetikus sóoldatban szuszpendáljuk (6 g Na₂HPO₄, 3 g K₂HPO₄, 0,57 g nátrium-citrát literenként), majd Bennett-agarra szélesztjük (1 g élesztőkivonat, 2 g NZ-amin A, 1 g húskivonat, 20 g D-glükóz, 20 g Bacto-agar literenként). Miután két napig 28 °C-on inkubáltuk, egy lemezen lévő sejteket 5 ml Trytic Soy Broth-ba (Difco) átmosunk, röviden (körülbelül 10 mp) ultrahanggal kezeljük mikrocsúccsal ellátott Heat Systems Ultrasonics W200P berendezésben. Oltóanyagot úgy állítunk elő, hogy az ultrahanggal kezelt szuszpenzióból 2 ml-t 50 ml Tryptic Soy Broth-ba (TSB) juttatunk, majd 2 napig 28 °C-on, 200/perc fordulatszámmal rázatva inkubáljuk. Ezután az oltóanyagból 5 ml-t 100 ml, 2% glicinnel kiegészített TSB-be oltunk át, majd 48 óra hosszat 28 °C-on 200/perc fordulatszámmal rázatva inkubáljuk.

A sejteket centrifugálással kinyerjük (9000xg, 30 perc). A kiülepedett sejteket 200 ml P táptalajjal mossuk [100 g szacharóz, 0,2 g K₂SO₄,2 ml nyomelem-oldat literenként; a nyomelemoldat összetétele: 40 mg/1 ZnCl₂, 10-10 mg/1 FeCl₃x6H₂O, CuCl₂x2H₂O, MnCl₂ x4H₂O, Na₂B₂O₇ χ 10H₂O és (NH₄)₆Mo₂₄ χ 4H₂O], A kiülepedett sejteket -20 °C-on lefagyasztjuk, majd felolvasztjuk és 10 mg/ml lizozimet tartalmazó (Sigma, háromszor átkristályosítva) 12 ml P⁺-oldatban szuszpendáljuk (összetétele: P táptalaj, kiegészítve 25 mmol/1 TES-pufferrel, 25 mmol/1 CaCl₂-vel, 10 mmol/1 MgCl₂vel, 3,7 mmol/1 K₂HPO₄-gyel). A sejteket szobahőmérsékleten 2 óra hosszat inkubáljuk, amíg protoplasztok képződése nyilvánvaló nem lesz. 2,5 mg Proteinase K-t adunk hozzá, és az elegyet 15 percig 37 °C-on inkubáljuk. A lízist úgy érjük el, hogy hozzáadunk 10 ml 0,2 mol/1 EDTA-t (pH=8,0), 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0 összetételű oldatot, majd közvetlenül utána

HU 217 570 Β

2,4 ml nátrium-lauril-szulfátot (SDS). A viszkózus elegyet 50 °C-on inkubáljuk 60 percig, alkalmankénti gyenge rázogatással.

Ha a lízis teljesen lejátszódott, akkor 20 ml puffereit fenolt (50 g fenol, 6,5 ml 100 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0, 1 mmol/1 EDTA pH = 8,0, 0,05 g 8-hidroxi-kinolin) adunk hozzá, az elegyet gyengén rázogatjuk, majd asztali centrifugán lecentrifugáljuk (1500xg, 30 perc). A felső vizes fázist összegyűjtjük, majd a fentiek szerint újra extraháljuk; az első extrakcióból származó fenolt visszaextraháljuk 20 ml 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 1 mmol/1 EDTA pH = 8 összetételű (TE) pufferrel. Az összegyűjtött vizes fázist ezután azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk, a fentiek szerint centrifugáljuk, és 10 ml-es részletekben kémcsövekbe osztjuk szét. 1 ml 3 mol/l-es ammónium-acetátot (pH=5,0) adunk mindegyik csőhöz, majd a viszkózus oldat tetejére 10 ml hideg etanolt rétegezünk. A DNS-t óvatosan egy üvegbotra tekerjük, kétszer hideg etanollal öblítjük, majd egy éjszakán át 4 °C-on 8 ml TE-pufferben oldjuk. A jelen lévő összes nukleinsav (főleg DNS) mennyiségét az A₂₆₀ spektrofotometriás érték alapján becsüljük.

2. példa

A Streptomyces aureofaciens DNS részleges emésztése és a megfelelő méretű DNS dúsítása A részleges emésztési körülményeket, amelyek a

Streptomyces aureofaciens DNS 35 kilobázis méretű Sau3A emésztési termékeit eredményezik, empirikusan határozzuk meg. Egy sorozat reakcióelegyet állítunk össze, a kémcsövekbe körülbelül 25 pg DNS-t mérünk be 300 pliter reakcióelegyben (összetétele: 100 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 7,4, 10 mmol/1 MgCl₂), majd Sau3A restrikciós endonukleázt (New England Biolabs) adunk hozzá 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 enzimegység/pg DNS mennyiségben. A reakcióelegyeket 60 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd 20 percre 65 °C-on kezeljük, végül jégbe helyezzük. 2020 plitert kiveszünk és 0,5%-os agaróz gélre visszük, hogy ismert hosszúságú ffagmensekkel (emésztetlen, valamint HindlII, illetve Xhol restrikciós enzimmel emésztett lambda-fág DNS) hasonlítsuk össze. A megmaradó térfogatban lévő DNS-t kicsapjuk oly módon, hogy egymás után 50 pliter 3 mólos ammónium-acetátot és 1 ml etanolt adunk hozzá, majd -20 °C-ra hűtjük. A kicsapott DNS-t centrifugálással ülepítjük (8800xg), 300 pliter 0,3 mólos ammónium-acetátban oldjuk, hasonlóképpen kicsapjuk, ülepítjük, mossuk etanollal, vákuumban szárítjuk, és a megszárított üledéket végül 100 pliter ΤΕ-pufferben oldjuk. Az etídium-bromiddal festett, egy éjszakán át 1 volt/cm-rel futtatott agaróz gél vizsgálata azt mutatja, hogy a 0,05 egység Sau3A/pg DNS értéknél kapjuk a főleg a keresett 35 kb mérettartományba tartozó emésztési termékeket.

3. példa

Kozmidkarok készítése

A bifunkcionális kozmidvektorok komponenseit az A és B plazmidokból (1. ábra) nyeljük ki. Az A plazmid a pIBI24-et tartalmazza, amely a replikációs origót, valamint egy ampicillin-rezisztenciagént biztosít ahhoz, hogy a vektor Escherichia coliban replikálódjon és szelektálható legyen. Ezzel a plazmiddal még egy tiostrepton-rezisztenciagén is rendelkezésre áll, hogy a plazmidot aktinomicétákban szelektálni lehessen, valamint a lambda bakteriofágból származó többszörös tapadási helyeket (cos) tartalmaz, amelyek az in vitro pakoláshoz szükségesek. A B plazmidot úgy terveztük, hogy tartalmazzon egy SCP2* replikációs origót az aktinomicétákban való fenntartás céljából, valamint több cos helyet.

Az A plazmidot Asp718 restrikciós enzimmel emésztjük, majd borjúból alkalikus foszfatázzal (CIAP) defoszforilezzük. A DNS-t ezután chlorpannal és kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és vákuumban szárítjuk. A DNS-t ezután feloldjuk, és BglII restrikciós enzimmel emésztjük. A B plazmidot Sáli restrikciós enzimmel emésztjük, majd ezt követően CIAPpal kezeljük. Chlorpanos extrakció, etanolos kicsapás és vákuumban való szárítás után a DNS-t feloldjuk és BglII restrikciós enzimmel emésztjük.

A fentiekben említett emésztési reakciókat agaróz gélre visszük, majd egy éjszakán át elektroforetizáljuk. Az A plazmidból egy 6,0 kb méretű fragmenst, a B plazmidból egy 8,0 kb méretű fragmenst (amely tartalmazza a fentiekben leírt funkciós régiókat) elektroelúcióval izolálunk az agaróz gélről.

4. példa

A kozmidkarok ligálása a Sau3A restrikciós enzimmel emésztett genomiális DNS-hez és in vitro pakolás

A Streptomyces aureofaciens DNS Sau3A restrikciós enzimmel emésztett és méretre „ellenőrzött” genomiális fragmenseit kapcsoljuk a kozmidkarokkal in vitro ligálás útján. 4 pl Sau3A restrikciós enzimmel emésztett Streptomyces aureofaciens DNS-t, amely körülbelül 8 pg-nak felel meg, elegyítünk 1-1 pl 1-es, illetve 2-es kozmidkarral 10 pl ligáié elegyben, amelynek összetétele 66 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 10 mmol/1 MgCl₂, 1 mmol/1 ATP, 10 mmol/1 ditiotreitol, valamint 40 egység (tapadósvég-egység) T4 DNS ligázzal (New England Biolabs). A ligáló elegyet 18 óra hosszat 11 °C-on inkubáljuk, majd in vitro pakolási eljárásnak vetjük alá oly módon, hogy a teljes 10 pl-es reakcióelegyet hozzáadjuk egy Packagene^R lambda DNS pakolórendszer-kivonathoz (Promega Biotec). Miután két óra hosszat inkubáltuk szobahőmérsékleten, 500 pl fág hígító puffért (PDB, összetétele: 100 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 10 mmol/1 MgSO₄), majd 25 pl kloroformot adunk hozzá. Az elegyet vortexeljük, majd 4 °C-on tároljuk.

5. példa

Transzdukció Escherichia coliba, bifunkciós kozmidkönyvtár előállítása

Az in vitro pakolóreakcióban előállított fágkészítményt Escherichia coli X2819T törzsbe (R. Curtiss) transzdukáljuk azzal a céllal, hogy több ezer transzdu6

HU 217 570 Β kánst kapjunk, amelyekből plazmid DNS-preparátum vagy bifunkciós kozmidkönyvtár állítható elő. Ebből a célból 0,3 ml, egy éjszakán át növesztett X2819T tenyészetet beoltunk 10 ml 20-10-5 táptalajba (20 g Trypton/1, 10 g élesztőkivonat/1, 5 g NaCl/1, 50 mg timidin/1), majd 2,5 óra hosszat 28 °C-on inkubáljuk. Négy részlet 0,8 ml-es X2819T sejtszuszpenziót elegyítünk 0,8 ml PDB-vel, majd mikrocentrifugában centrifugáljuk 5 percig teljes sebességgel. A kiülepített sejteket 100 pl PDB-ben szuszpendáljuk. Ezután mindegyikhez 50 μΐ, az in vitro pakolásból származó fágpreparátumot adunk. A fágok 37 °C-on, 25 perc alatt a sejtekre abszorbeálódnak. Mindegyik elegyhez 2 ml 20-10-5 táptalajt adunk, majd a szuszpenziót 28 °Con két óra hosszat rázatjuk. Egytized ml-es alikvot részeket szélesztünk összesen 50 Petri-csészére, amelyek 100 mg/l ampicillinnel (nátriumsó, Sigma) kiegészített 20-10-5 agart tartalmaznak (20-10-5 táptalaj plusz 20 g/1 Bacto agar). A lemezeket egy éjszakán át 28 °Con inkubáljuk, majd három napig szobahőmérsékleten tartjuk. Öt jellemző lemez telepszámát meghatározzuk, ennek alapján összesen körülbelül 12 000 ampicillinrezisztens telepet kaptunk.

Mindegyik lemezt 5 ml következő összetételű oldattal árasztjuk el: 50 mmol/1 glükóz, 25 mmol/1 TRISHC1 pH=8,0, 10 mmol/1 EDTA pH=8,0 (GTE). A telepeket egy steril szélesztőbottal szuszpendáljuk, majd az összes eluátumot egyesítjük, az így kapott sejtszuszpenziót 5 percig 9800xg-vel centrifugáljuk. Az ülepített sejteket 72 ml GTE-ben szuszpendáljuk. Ezután 8 ml, 40 mg/ml lizozimet tartalmazó GTE-t adunk hozzá. A lizozimes emésztést 20 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. Ezután 160 ml lúgos SDS-oldatot (8 g/1 NaOH, 10 g/1 SDS) adunk hozzá, óvatos keverés után viszkózus lizátumot kapunk. Miután 20 percig inkubáltuk jégen, 80 ml 5 mol/l-es kálium-acetátot adunk hozzá, összekeverjük, és további 20 percig jégen tartjuk. A preparátumot ezután centrifugáljuk (9800xg, 20 perc), a felülúszót összegyűjtjük, 200 ml hideg izopropanolt adunk hozzá, összekeveqük, majd 15 percig jégen tartjuk, utána centrifugáljuk (9800xg, 20 perc). A nukleinsavüledéket 20 ml TE-pufferben oldjuk, amelyet 1% nátrium-szarkozináttal egészítettünk ki. 22 g cézium-kloridot adunk hozzá, feloldjuk benne, majd 2 ml 10 mg/l koncentrációjú etídium-bromid-oldatot adunk hozzá. A cézium-klorid-etídium-bromid elegyet megfelelő csövekbe töltjük, és Beckman 70.Ti rotorban centrifugáljuk 19 óra hosszat 55 000/perc fordulatszámmal. A csövek oldalát injekcióstűvel átlukasztva kinyerjük a plazmidcsíkot. A mintából eltávolítjuk az etídiumbromidot oly módon, hogy négyszer extraháljuk azonos térfogatú, vízzel telített butanollal. A vizes oldat térfogatát TE-pufferrel 6 ml-re egészítjük ki; 1 ml 3 mol/l-es ammónium-acetátot adunk hozzá, majd a plazmid DNS-t 18 ml etanollal kicsapjuk. Miután -20 °C-ra hűtöttük, a DNS-t centrifugáljuk (3400xg, 30 perc). Egy második kicsapást is végzünk hasonlóképpen, majd a DNS-t etanollal mossuk, vákuumban szárítjuk, 1 ml TE-oldatban oldjuk, és a DNS-koncentrációt spektrofotometriásán meghatározzuk.

6. példa

A plazmidkönyvtár bejuttatása Streptomyces lividansba, és Streptomyces lividans rekombináns sejtkönyvtár készítése

Az előző lépésben előállított bifunkciós plazmidkönyvtárat Streptomyces lividans TK54-be transzformáljuk, ahol a Streptomyces gének fenotípusos kifejeződése lejátszódik. Ebből a célból a Streptomyces lividans TK54 protoplasztokat állítunk elő standard módszerekkel (Hopwood et al., 1985). Röviden a Streptomyces lividans TK54 törzs 45 órás tenyészetéből (ezeket úgy állítjuk elő, hogy egy spóraszuszpenzió 0,2 ml-ét 10-szer 50 ml-es komplett YEME táptalajba oltjuk, amelynek összetétele: 3 g/1 élesztőkivonat, 5 g/1 pepton, 3 g/1 malátaextraktum, 10 g/1 glükóz, 340 g/1 szacharóz, 5 g/1 glicin, 5 mmol/1 MgCl₂, 40 mg/l Lhisztidin és 40 mg/l L-leucin) a sejteket centrifugálással nyeljük ki (9800xg, 15 perc). A sejtüledéket kétszer mossuk P táptalajjal, majd 60 ml P⁺-ban szuszpendáljuk. 14 mg/ml lizozimet tartalmazó P⁺ táptalajt adunk hozzá, majd a szuszpenziót vízfürdőben 90 percig 30 °C-on, 150/perc rázatás mellett inkubáljuk. Ezt követően 100 ml P⁺ táptalajt adunk hozzá, és a protoplaszt-szuszpenziót steril, nem abszorbeáló gyapoton engedjük keresztül. A szűrletet centrifugáljuk (3800xg, 10 perc), majd a protoplaszt-üledéket felszuszpendáljuk és 100 ml P+ táptalajjal mossuk, végül egy második centrifugálás után 120 ml P+-ban szuszpendáljuk. A protoplaszt-készítményt 1,8 ml-es fagyasztócsövekbe osztjuk szét, majd -70 °C-on fagyasztjuk. A transzformálást úgy végezzük, hogy a Streptomyces lividans TK54 protoplaszt-preparátum 0,3 ml-es alikvot részeit (körülbelül 1 χ 10⁹ protoplaszt) hozzáadjuk 4 centrifugacsőben lévő 5 ml P+ táptalajhoz. A protoplasztot ülepítjük (3400xg, 10 perc), majd a visszamaradó térfogatban szuszpendáljuk. Ezután mindegyikhez hozzáadunk körülbelül 10 pg kozmidkönyvtár DNS-t, majd 0,5 ml 25%-os PEG 1000-et [1 g PEG 1000 (Sigma) 3 ml alábbi összetételű oldatban oldva: 25 g/1 szacharóz, 2 ml/1 500x nyomelemoldat, 0,25 g/1 K2SO4, 100 mmol/1 CaCl2, 50 mmol/1 TRIS-maleát, pH=8,0], Miután összekevertük és 30 másodpercig inkubáltuk, 5 ml P+-oldatot adunk hozzá. A protoplasztokat ezután ülepítjük, majd 1 ml P⁺-ban szuszpendáljuk. Egytized ml-es térfogatokat szélesztünk szárított R2YE agaira (összetétele: 100 g/1 szacharóz, 0,25 g/1 K₂SO₄, 2 ml/1 500x nyomelemoldat, 2 g/1 L-prolin, 20 g/1 D-glükóz, 5 g/1 élesztőkivonat, 0,05 g/1 KH₂PO₄, 25 mmol/1 TES, 25 mmol/1 CaCl₂, 5 mmol/1 MgCl₂, 20 g/1 Bacto-agar) és 28 °C-on inkubáljuk. 24 óra elteltével mindegyik lemezt felülrétegezzük 3 ml lágy, 500 pg/ml tiostreptont tartalmazó R agarral (összetétele ugyanaz, mint az előző agarénak, de nem tartalmaz élesztőkivonatot, glükózt vagy KH₂PO₄-et, és csak 8 g Bacto-agart tartalmaz), majd további 12 napig inkubáljuk.

Körülbelül 9100 tiostrepton-rezisztens telepet kapunk. Ezeket összegyűjtjük oly módon, hogy lemossuk az agarlemezek felszínéről 3 db, 25-25 ml 20%-os glicerint tartalmazó csőbe. A telepek szuszpenzióit fragmentáljuk oly módon, hogy 90 másodpercig ultra7

HU 217 570 Β hanggal besugározzuk, majd egyesítjük őket, és szétosztjuk 1,8 ml-es fagyasztócsövekbe és -70 °C-on fagyasztjuk. Ezt a fagyasztott preparátumot használjuk mint a Streptomyces lividans rekombináns sejtkönyvtárát.

7. példa

A Streptomyces lividans LL535, egy tetraciklinrezisztens transzformáns izolálása, amelyből az LP²127plazmid származik

Ezután a Streptomyces lividans rekombináns sejtkönyvtárat átvizsgáljuk, van-e benne tetraciklinrezisztens sejt. A fragmentált Streptomyces lividans sejtkönyvtár egytized ml-es részeit 100 pg/ml tetraciklinnel kiegészített Bennett-agarra szélesztjük. Miután 5 napig 28 °C-on inkubáltuk, két tetraciklin-rezisztens telepet detektálunk. Ezek közül az egyiket, az LL535-öt (először az LL529-2 jelzést kapta) választjuk ki a további elemzéshez. Az LL535 telepet friss Bennett-agarra szélesztjük, amely 100 pg/ml tetraciklint tartalmaz. A növekedést 3 napig 28 °C-on végzett inkubálás után figyeljük meg. A kapott tenyészetet 50 ml TSB táptalajba mossuk bele, amelyet 10 g/1 glükózzal (TBSG) és 100 μ g/ml tetraciklinnel egészítünk ki, majd a szuszpenziót 3 napig 30 °C-on inkubáljuk 200/perc fordulatszámmal rázatva. Az LL535 tenyészetet röviden kezeljük ultrahanggal, majd egy részét 1,8 ml-es fagyasztócsövekbe osztjuk szét, és -70 °Con tároljuk. A megmaradó térfogatot használjuk arra, hogy négy darab 2 literes lombikban lévő YEME táptalajt oltsunk be vele (összetétele ugyanaz, mint amit az előzőekben közöltünk, de tartalmaz 16 g/1 glicint, 25 mmol/1 MOPS-t és 100 μ g/ml tetraciklint, de nem tartalmaz MgCl₂-t, L-hisztidint vagy L-leucint). A két nap után kinőtt sejteket ezután az előzőekben leírt módon dolgozzuk fel (plazmidot izolálunk belőle, azzal a különbséggel, hogy mindegyik alkalmazott térfogat négyszerese annak, amit az előző példában alkalmaztunk). A végső DNS-csapadékot 1 ml TE-pufferben oldjuk.

A Streptomyces lividans LL535 transzformánsból izolált plazmid DNS 10 μΐ-es részét használjuk in vitro pakolási reakcióban, majd ezt követően Escherichia coli X2819T törzsbe transzdukáljuk, a fentiekben ismertetett módszereket alkalmazva. Egy ampicillin-rezisztens transzdukánst (jele LL537) 100 μ g/ml ampicillint tartalmazó 20-10-5 agar-táptalajra szélesztjük, majd az egynapos 30 °C-os inkubálás után kapott tenyészetet használjuk két 500 ml-es 20-10-5 táptalaj beoltására, amely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz. Egy éjszakán át 30 °C-on 200/perc fordulatszámmal rázatjuk, majd a plazmid DNS-t az előzőkben leírt módon izoláljuk. Az izolált plazmid DNS jele LP²127; a plazmid becsült mérete 43 kilobázispár.

Restrikciós enzimes térképet készítünk az LP²127 plazmidról restrikciós enzimekkel végzett egyszeres és kétszeres emésztés alapján. A BamHI, Bell, BglII, BsmI, BstBI, Clai, EcoRI, Miül, Ncol, SacI, Seal, Sphl és Stul (New England Biolabs) hasítási helyek helyzetét úgy határozzuk meg, hogy minden egyes enzimmel külön-külön, majd az enzimek kombinációjával emésztést végzünk, amelyek a vektorrészen ismert helyeken hasítanak, például EcoRI, EcoRV vagy Hindlll helyen. A restrikciós endonukleázos emésztéseket úgy hajtjuk végre, hogy 1-2 pg plazmid DNS-t elegyítünk 4 μΐ lOx sóoldattal, amely optimális az alkalmazott restrikciós enzimekre, majd körülbelül 5-40 egység enzimet adunk hozzá 40 pl össztérfogatban. Az alkalmazott lOx sóoldat összetétele: BamHI, EcoRV és Sáli enzimekhez: 1,5 mol/1 NaCl, 0,06 mol/1 TRIS-HC1 pH = 8, 0,06 mol/1 MgCl₂; BglII és Seal enzimekhez: 1,0 mol/1 NaCl, 0,1 mol/1 TRISHC1 pH = 7,4, 0,1 mol/1 MgCl₂; Bell enzimhez: 0,75 mol/1 KC1, 0,06 mol/1 TRIS pH=7,4, 0,1 mol/1 MgCl₂; BstBI enzimhez: 0,6 mol/1 NaCl, 0,06 mol/1 TRIS pH = 7,4, 0,06 mol/1 MgCl₂; Clai enzimhez: 0,5 mol/1 NaCl, 0,06 mol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0, 0,06 mol/1 MgCl₂; EcoRI enzimhez: 0,5 mol/1 TRISHC1 pH = 8, 0,1 mol/1 MgCl₂; Miül enzimhez: 0,5 mol/1 NaCl, 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH=7,4,0,1 mol/1 MgCl₂; SacI enzimhez: 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 0,1 mol/1 MgCl₂; Stul enzimhez: 1,0 mol/1 NaCl, 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0 és 0,1 mol/1 MgCl₂. A kettős emésztéseket olyan sóösszetétel mellett végezzük, amely kompatibilis mindkét enzimmel a gyártó előírásai szerint. Az összes emésztési reakciót 37 °C-on hajtjuk végre, kivéve a Bell restrikciós enzimmel végzett emésztést, amelyet 50 °C-on végzünk, valamint a BsmI és BstBI restrikciós enzimekkel végzett emésztéseket, amelyeket 65 °C-on végzünk. Az inkubálás ideje 60-120 perc. 5 pliter festékkeveréket adunk hozzá (50% glicerin, 0,1 mol/1 EDTA pH=8,0, 0,25% brómfenolkék) a reakció leállítására, valamint azért, hogy megkönnyítsük az agaróz gélre való felvitelt.

Az emésztés eredményét 0,8%-os agaróz gélen való elektroforézissel tesszük láthatóvá. A térképet az LP²127 közvetlen emésztésével, valamint a szubklónozott fragmensek emésztésével határozzuk meg. A Bell és Clai hasítási helyek térképezését akadályozza a gazdaszervezet metilezőképessége, ezért ezt az LP²258 plazmid alkalmazásával lehet kikerülni, amelyet úgy kapunk, hogy az LP²127 plazmidot in vitro pakoljuk, transzdukáljuk Escherichia coli GM119 (dam dem^-) törzsbe, majd a plazmid izolálását az előzőkben leírt módon végezzük. Az LP²127 plazmid fizikai szerkezetét a 2. ábrán mutatjuk be. Az LP²127 plazmidban klónozott 31,9 kb méretű Streptomyces aureofaciens DNS részletesebb restrikciós endonukleázos hasítási térképét a 3. ábrán mutatjuk be.

8. példa

Streptomyces lividans LL529-TT2 tiostreptonrezisztens, tetraciklin-rezisztens transzformáns izolálása, amelyből az LP²128 plazmid származik A Streptomyces lividans LL529-TT2 izolálását az

LL535-re leírt módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy a rekombináns Streptomyces lividans sejtkönyvtárat 50 pg/ml tiostreptont és 100 pg/ml tetraciklint tartalmazó Bennett-agarra szélesztjük. Miután 11 napig inkubáltuk, 28 °C-on végzett inkubálás után két rezisz8

HU 217 570 Β tens telepet figyeltünk meg. Ezek közül az egyiket, az LL529-TT2-t mindkét antibiotikumot tartalmazó Bennett-agarra szélesztjük. Miután három napig inkubáltuk 28 °C-on, a kapott tenyészetet használjuk 50 ml, 10 pg/ml tiostreptont és 100 pg/ml tetraciklint tartalmazó TSB táptalaj beoltására. Ezután öt napig 28 °C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámmal, majd plazmid DNS-t állítunk elő belőle miniprep-eljárással, amely hasonlít az előzőkben leírt plazmidizolálási eljárásra, egészen az izopropanolos kicsapási lépésig. Ebben az esetben azonban a használt térfogat csak egynegyede az előzőkben alkalmazottnak. Az izopropanolos kicsapás után a nukleinsavcsapadékot 1 ml TE-pufferben oldjuk, majd azonos térfogatú chlorpannal (500 g fenolt és 0,5 g 8-hidroxi-kinolint tartalmazó, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 nátrium-acetát, pH=6,0 összetételű oldattal egyensúlyba hozott, továbbá 500 ml kloroformot tartalmazó oldattal) kevertetés közben extraháljuk, majd mikrocentrifugában centrifugáljuk teljes sebességgel, 3 percig. A vizes fázist újra extraháljuk chlorpannal, majd hasonlóképpen kloroformmal. A végső vizes fázist összegyűjtjük, 100 μΐ 3 mol/l-es ammónium-acetátot és 1,8 ml etanolt adunk hozzá a nukleinsav kicsapására. -20 °C-ra hűtjük, majd a kicsapási reakcióelegyet lecentrifugáljuk (8800xg, 30 perc). A kapott csapadékot 300 μΐ 0,3 mol/1 ammónium-acetátban oldjuk, hasonlóképpen kicsapjuk 1 ml etanollal, majd centrifugáljuk. A kapott csapadékot etanollal öblítjük, vákuumban szárítjuk, majd 1 ml ΤΕ-pufferben oldjuk.

Az LL529-TT2 plazmid minipreparátumot használjuk az előzőkben leírt in vitro pakolás végrehajtására. Egy ampicillin-rezisztens transzdukánst (jele LL538) használunk a plazmid kinyerésére, amint azt az LL535 plazmidnál már leírtunk. A kapott tisztított plazmid jele LP²128. A 20 különböző restrikciós endonukleázzal való emésztés után kapott restrikciós mintázatot az LP²127 esetében kapottal hasonlítjuk össze, az emésztési termékeket ugyanazon a gélelektroforézis gélen elemezve. Az LP²128 esetében kapott gélmintázat azonos azzal, amelyet az LP²127 esetében látunk, jelezve, hogy a két plazmid egyforma. Tehát a 3. ábra mind az LP²128, mind az LP²127 szerkezetét leírja.

9. példa

Az LP²127 és LP²128plazmidokplazmidhoz kötött tetraciklin-rezisztenciát biztosítanak

Annak igazolására, hogy a megfigyelt tetraciklinrezisztenciák plazmidon kódolt természetűek, az LP²127 és LP²128 plazmidokat Streptomyces lividans protoplasztokba transzformáljuk, és a kapott tiostrepton-rezisztens transzformánsok tetraciklin-rezisztenciáját vizsgáljuk. A Stretomyces lividans protoplasztok előállítását és transzformálását, majd ezt követően a tiostrepton-rezisztens transzformálását, majd ezt követően a tiostrepton-rezisztens transzformánsok szelekcióját az előzőkben ismertetett módon végezzük. Az LP²127 és az LP²128 plazmidból 10-10 pg-ot, míg a tetraciklin-érzékeny kontroliból, az LP²111-ből 5 pg-ot transzformálunk (ez utóbbi vektor tartalmazza a pIBI24-et az SCP2* replikációs és stabilitási régiót, valamint a tiostrepton-rezisztenciagént). Mindegyik plazmidból 150 transzformánst vizsgálunk át oly módon, hogy steril fogpiszkálóval két különböző Bennettagarra oltjuk át, amelyek 100 pg/ml tetraciklint, illetve 25 pg/ml tiostreptont tartalmaznak.

A telepeket 5 napig 28 °C-on végzett inkubálás után vizsgáljuk át. Az összes LP²111 transzformánsból származó tiostrepton-rezisztens transzformáns tetraciklinérzékenynek, míg az LP²127-ből, illetve az LP²128-ból kapott transzformánsok 80%-a tetraciklin-rezisztensnek bizonyult.

10. példa

Klór-tetraciklin és tetraciklin előállítása LP²127 és

LP²128 plazmidot tartalmazó Streptomyces lividansszal

Egy egész sorozat kísérletet végzünk annak igazolására, hogy az LP²127 és az LP²128 a klór-tetraciklin (CTC) és a tetraciklin (TC) bioszintézisét irányítja a Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben. Az eredeti izolátum, az LL535, valamint az LP²127 plazmiddal transzformált Streptomyces lividans termel CTC-t és TC-t mind agaron, mind folyékony táptalajon végzett fermentációban, míg az inszertált DNS-szakasz nélküli plazmid klónozó vektort tartalmazó Streptomyces lividans nem termel tetraciklin-antibiotikumot. Az LP²128 Streptomyces lividansba transzformálva egy olyan antibiotikum termelését irányítja, amelynek Escherichia coli elleni aktivitása alapján arra lehet következtetni, hogy biológiai tulajdonságai alapján tetraciklin-antibiotikum. Az S. lividans gazdaszervezet nem mutat ilyen aktivitást.

Először az LL535 Streptomyces lividans törzset, egy tiostrepton-rezisztens izolátumot, amelyből az LP²127-et izoláltuk, Bennett-agarra szélesztjük (amely 25 pg/ml tiostreptont tartalmaz) olyan hígításban, hogy körülbelül 200 telep keletkezzen lemezenként. Az LL531 Streptomyces lividans törzset (amely a korábban ismertetett LP²111 plazmidvektort tartalmazza) hasonló módon szélesztjük körülbelül 400 telep per lemez sűrűségben.

Miután 8 napig inkubáltuk 30 °C-on, az LL535 telepek sárga fluoreszcenciát mutatnak, ha 366 nm-es UVfénnyel sugározzuk be őket. Ez jellemző a tetraciklint termelő tenyészetekre, és nem figyelhető meg az LL531-nél.

Ezután mindegyik lemezen megvizsgáljuk a biológiai aktivitást oly módon, hogy a telepeket 5 ml lágy 20-10-5 agar táptalajjal (8 g/1 Bacto-agar) rétegezzük le, amelyet 0,1 ml, egy éjszakán át növesztett vizsgáló mikroorganizmussal oltottunk be. A vizsgáló mikroorganizmus a Bacillus subtilis T1235 törzs, amely az University of Leicesterről, dr. Erié Cundliffe-tól szerezhető be. A T1235 egy tiostrepton-rezisztenciát kódoló plazmidot tartalmaz, emellett használjuk még az Escherichia coli MM294 törzset, valamint a pBR322 plazmidot tartalmazó MM294 törzset (a plazmid tetraciklin- és ampicillin-rezisztenciát biztosít) (ATCC 33625). A törzseket egy éjszakán át növesztjük 37 °C-on 10 ml 20-1—5 táptalajban, amelyet a T1235 esetében

HU 217 570 Β pg/ml tiostreptonnal, az MM294/pBR322 esetében pedig 100 pg/ml ampicillinnel egészítettünk ki. Rétegezés után a lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, majd ezután megvizsgáljuk a rétegező mikroorganizmus pázsitjában keletkező gátlási zónákat. Az LL531 törzs nem ad gátlási zónákat az Escherichia coli törzsekben, és csak néhány telep ad kis, lokalizált zónákat a Gram-pozitív TI235 törzzsel. Mindegyik utóbbi telep vörös pigmentet termel, ami az aktinorodin kifejeződésére jellemző; a Streptomyces lividansról ismert, hogy ezt az általában nem működő bioszintézisutat megfigyelhető frekvenciával fejezi ki (Horinouchi et al., 1989). Ezzel szemben az LL535 törzs egy olyan antibiotikum termelését mutatja, amely teljesen gátolja a T1235 és MM294 törzsek növekedését a rétegező agarban. (A későbbi kísérletekben, amikor lemezenként kevesebb telepet vizsgáltunk, kis, jól körülhatárolt és nagyon nagy gátlási zónák is találhatók az ezen vizsgáló mikroorganizmusok megfelelően szeparált telepei körül. Ebben a kísérletben az LL535 telepeket MM294/pBR322 törzzsel rétegezve diszkrét zónákat kapunk a telepek körül. Ez az MM294/pBR322-vel megfigyelt csökkent aktivitás annak tulajdonítható, hogy a pBR322 plazmidon kódolt tetraciklin-rezisztencia csökkent érzékenységet eredményez.

Az agaron keletkező antibiotikumot úgy jellemezzük, hogy az egybefolyó növekedést adó lemezek agarblokkjait extraháljuk. Az LL535 és LL531 törzsek 25 pg/ml tiostreptont tartalmazó Bennett-agaron nőnek; a Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 törzs, az LP²127 és LP²128 plazmidban lévő klónozott DNStörzs antibiotikumot nem tartalmazó agaron nő. Miután öt napig növesztettük 30 °C-on, 2,5 cm-es agarblokkokat vágunk ki, és 3 ml savas metanolban eldörzsöljük (összetétele: 11,5 ml koncentrált kénsav 4 liter metanolban). Öt percig vortexeljük, majd a felülúszót egy Acro LC-25 membránszűrőn szűrjük át és HPLCelemzésnek vetjük alá.

A HPLC-elemzéseket izokratikus körülmények között végezzük Cl8 fordított fázisú oszlopon, amelyben a mobil fázis oxalát puffer, pH=2,9, amely 22% DMF-et (Ν,Ν-dimetil-formamid) tartalmaz. Az áramlási sebesség 1 ml/perc, és az eluátumot 365 nm-en vizsgáljuk.

Standardként autentikus tetraciklint és klór-tetraciklint használunk.

A HPLC-kromatogramok azt mutatják, hogy az L1535 és az ATCC 13899 olyan anyagokat termelnek, amelyeknek a retenciós idejük azonos a tetraciklin és a klór-tetraciklin retenciós idejével. Az LL531 kivonatai nem mutatják ezeket a csúcsokat.

A Streptomyces lividansból az LP²127, LP²128, valamint az LP²63 (ez egy olyan plazmidvektor, amely a pIBI24-et tartalmazza a pIJ702 plazmid SacI hasítási helyére klónozva) plazmidok transzformálásával kapott tiostrepton-rezisztens transzformánsokat hasonló módon elemezzük az antibiotikum-termelés szempontjából, a T1235 és MM294 vizsgáló mikroorganizmusokkal való rétegezéssel. Az LP²127 és LP²128 transzformánsok olyan antibiotikumok termelődését mutatják, amelyek aktívak mindkét vizsgáló mikroorganizmussal szemben, míg az LP²63 transzformánsok nem mutatják ezt a termelődést, ezzel jelezve, hogy az antibiotikumtermelő képesség az LP²127 és LP²128 plazmidokban lévő Streptomyces aureofaciens DNS-től függ.

Folyékony táptalajon végzett fermentációkat is végzünk, hogy így is megerősítsük azt, hogy az LP²127 plazmidot tartalmazó Streptomyces lividans által termelt antibiotikumok a tetraciklin és a klór-tetraciklin. Az ATCC 13899-ből, az LL531-ből és az LL873-ból (ez utóbbi egy LP²127-tel transzformált Streptomyces lividans) ötven ml-es oltótenyészeteket készítünk S táptalajban (összetétele: 4 g/1 élesztőkivonat, 4 g/1 pepton, 10 g/1 glükóz, 0,5 g/1 MgSO₄x7H₂O), amely 5 pg tiostreptont tartalmaz; az ATCC 13899-et tiostrepton nélkül növesztjük. Három napig inkubáljuk 30 °C-on, majd 0,5 ml-t átviszünk a tenyészetből 25 ml-es táptalajokba, amelyek 10 pg/ml tiostreptont tartalmaznak (kivéve az ATCC 13899-et, ennek a táptalajában nincs antibiotikum). Miután tíz napig inkubáltuk 28 °C-on, a fermentléből 0,5 ml-es térfogatokat 4,5 ml savas metanollal hígítunk, az előzőkben leírt módon feldolgozzuk, majd HPLC-elemzésnek vetjük alá. Az LL531 törzs nem eredményez tetraciklin-vegyületeket, míg az ATCC 13899, LL535 és LL873 törzsek 37, 56, illetve 6 pg/ml klórtetraciklint termelnek. Ennek a három törzsnek a fermentlevében kis mennyiségű tetraciklin is kimutatható.

Az LL537 és LL538 Escherichia coli törzsek azok az Escherichia coli transzdukánsok, amelyekből az LP²127 és LP²128 plazmidokat izoláltuk. Ezeket a törzseket a Budapesti Egyezmény alapján letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland), letéti sorszámuk az alábbi: az LP²127-et tartalmazó Escherichia coli X2818T törzs (LL537) letéti száma ATCC 68537, az LP²128 plazmidot tartalmazó Escherichia coli X2818T törzs (LL538) letéti száma ATCC 68538. Mindkettőt 1990. július 10-én helyeztük letétbe, és legálisan bárki számára hozzáférhetők.

Az alábbiakban összefoglaljuk a leírás szövegében említett irodalmi hivatkozásokat.

BIBLIOGRÁFIA

1. Baltz, R. H. and P. Matsushima, 1981, Protoplast fusion in Streptomyces·. conditions fór efficient genetic recombination and cell regeneration. J. Gén. Microbiol., 127:137-146.

2. Baltz, R. H. and E. T. Seno, 1988, Genetics of Streptomyces fradiae and tylosin biosynthesis. Ann. Rive. Microbiol., 42:547-574.

3. Bibb, M. J., J. M. Ward, and D. A. Hopwood, 1978, Transformation of plasmid DNA intő Streptomyces protoplasts at high frequency. Natúré (London), 274:398-400.

4. Binnie, C., M. Warren, and M. J. Butler, 1989, Cloning and heterologous expression in Streptomyces lividans of Streptomyces rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis. J. Bateriol., 171:887-895.

5. Butler, M. J., E. J. Friend, I. S. Hunter, F. S. Kaczmarek, D. A. Sugden and M. Warren, 1989, Molecular cloning of resistance genes and

HU 217 570 Β architecture of a linked gene cluster involved in biosynthesis of oxytetracycline by Streptomyces rimosus. Mól. Gén. Génét., 215:231-238.

6. Chater, K. F. and C. J. Bruton, 1983, Mutational cloning in Streptomyces and the isolation of antibiotic production genes. Gene, 26:67-78.

7. Chen, C. W., H.-F. Lin, C. L. Kuo, H.-L. Társai and

J. F.-Y. Társai, 1988, Cloning and expression of a DNA sequence conferring cephamycin C production. Bio/Technology, 6:1222-1224.

8. Cox, K. L. and R. H. Baltz, 1984, Restriction of bacteriophage plaque formádon in Streptomyces spp. J. Bacteriol., 159:499-504.

9. Distler, J., K. Mansouri and W. Piepersberg, 1985, Streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus

II. Adjacent genomic location of biosynthetic genes and one of two stretomycin resistance genes. FEMS Microbiol. Lett., 30:151-154.

10. Duggar, Β. M., 1948, Aureomycin: a product of the continuing search fór new antibiotics. Ann. N. Y. Acad. Sci., 51:171-181.

11. Feitelson, J. S. and D. A. Hopwood, 1983, Cloning of a Streptomyces gene fór an O-methyltransferase involved in antibiotic biosynthesis. Mól. Gén. Génét., 190:394-398.

12. Fishman, S. E., K. Cox, J. L. Larson, P. A. Reynolds, E. T. Seno, W.-K. Yeh, R. Van Frank and C. L. Hershberger, 1987, Cloning genes fór the biosynthesis of a macrolide antibiotic. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:8248-8252.

13. Gil, J. A. and D. A. Hopwood, 1983, Cloning and expression of a p-aminobenzoic, acid synthetase gene of the candicidin-producing Streptomyces griseus. Gene, 25:119-132.

14. Goodman, J. J., 1985, Fermentation and mutational development of the tetracyclines. p. 5-57. In: J. J. Hlavka and J. H. Boothe (eds), Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 78, The Tetracyclines, Springer-Verlag, Berlin.

15. Hohn, B. and J. Collins, A small cosmid fór efficient cloning of large DNA fragments. Gene, 11:291-298.

16. Hopwood, D. A. and Η. M. Wright, 1978, Bacterial protoplast fusion: recombination in fused protoplasts of Streptomyces coelicolor. Mól. Gén. Génét., 162:307-317.

17. Hopwood, D. A., 1967, Genetic analysis and genome structure in Streptomyces coelicolor. Bacteriol. Rév., 31:373-403.

18. Hopwood, D. A., M. J. Bibb, K. F. Chater, T. Kieser, C. J. Bruton, Η. M. Kieser, D. J. Lydiate, C. P. Smith, J. M. Ward and H. Schrempf, 1985, Genetic manipulation of Streptomyces - a laboratory manual. The John Innes Foundation. Norwich, England.

19. Horinouchi, S., F. Malpartida, D. A. Hopwood and T. Beppu, 1989, afsB stimulates transcription of the actinorhodin biosynthetic pathway in Streptomyces coelicolor A3 (2) and Streptomyces lividans. Mól. Gén. Génét., 215:355-357.

20. Jones, G. H. and D. A. Hopwood, 1984, Molecular cloning and expression of the phenoxazinone synthase gene írom Streptomyces antibioticus. J. Bioi. Chem., 259:14 151-14 157.

21. Katz, E., C. J. Thompson and D. A. Hopwood, 1983, Cloning nad expression of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus in Streptomyces lividans. J. Gén. Microbiol., 129:2703-2714.

22. Larson, J. L. and C. L. Hershberger, 1986, The minimál replicon of a streptomycete plasmid produces ultrahigh level of plasmid DNA. Plasmid, 15:199-209.

23. Leskiw, Β. K., Y. Aharonowitz, M. Mevarech, S. Wolfe, L. C. Vining, D. W. S. Westlake and S. E. Jensen, 1988, Cloning and nucleotide sequence determination of the isopenicillin N synthetase gene from Streptomyces clavuligerus. Gene, 62:187-196.

24. Lydiate, D. J., F. Malpartida and D. A. Hopwood, 1985, The Streptomyces plasmid SCP2*: its functional analysis and development intő useful cloning vectors. Gene, 35:223-235.

25. Malpartida, F. and D. A. Hopwood, 1984, Molecular cloning of the whole biosynthetic pathway of a Streptomyces antibiotic and its expression in a heterologous hőst. Natúré (London), 309:462-464.

26. Maniatas, T., E. F. Fritsch and J. Sambrook, 1982, Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

27. McCormick, J. R. D., 1968, Point blocked mutants and biogenesis of tetracyclines. p. 163-173. In: G. Sermonti and M. Alecevic (eds), Genetics and Breeding of Streptomyces. Yugoslav. Acad. Sci. and Árts, Zagreb.

28. Motamedi, H. and C. R. Hutchinson, 1987, Cloning and heterologous expression of a gene cluster fór the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumor antibiotic of Streptomyces glaucescens. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:4445-4449.

29. Murakami, T., H. Anzai, S. Imái, A. Satoh, K. Nagaoka and C. J. Thompson, 1986, The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mól. Gén. Génét., 205:42-50.

30. Reynes, J. P., T. Calmels, D. Drocourt and G. Tiraby, 1988, Cloning, expression in Escherichia coli and nucleotide sequence of a tetracyclineresistance gene from Streptomyces rimosus. J. Gén. Microbiol., 134:585-598.

31. Sanger, F., A. R. Coulson, G. F. Hong, D. F. Hill and G. B. Peterson, 1982, Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. J. Mól. Bioi., 162:729-773.

32. Stanzák, R., P. Matsushima, R. H. Baltz and R. N. Rao, 1986, Cloning and expression in Streptomyces lividans of clustered erythromycin biosynthesis genes from Streptomyces erythreus. Bio/Technology, 4:229-232.

HU 217 570 Β

33. Stutzman-Engwall, K. J. and C. R. Hutchinson, 1989, Multigene families fór anthracycline antibiotic production in Streptomyces peucetius. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3135-3139.

34. Sutcliffe, J. G., 1979, Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi., 43:77-90.

35. Thompson, C. J., T. Kieser, J. M. Ward and D. A. Hopwood, 1982, Physical analysis of antibioticresistance genes írom Streptomyces and their use in vector construction. Gene, 20:51-62.

36. van Pee, K.-H., 1988, Molecular cloning and highlevel expression of a bromoperoxidase gene from Streptomyces aureofaciens Tu24. J. Bacteriol., 170:5890-5894.

37. Vara, J. A., D. Pulido, R. A. Lacalle and A. Jimenez, 1988, Two genes in Streptomyces alboniger puromycin biosynthesis pathway are closely linked. Gene, 69:135-140.

38. Veselova, S. I., 1969, Combined effect of nitrous acid, ultraviolet light, streptomycin and chlortetracycline on Actinomyces aureofaciens. Antibiotiki, 14:698-702.

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás LP²127 és LP²128 kozmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy az LP²127 kozmidot az ATCC 68357 számon deponált E. coliból, míg az LP²128 kozmidot az ATCC 68358 számon deponált E. coliból izoláljuk.
2. 2. Eljárás tetraciklin és klór-tetraciklin termelésére, azzal jellemezve, hogy egy prokarióta gazdaszervezetet egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított kozmiddal transzformálunk, és a transzformánsokat a tetraciklin és klór-tetraciklin kifejezéséhez alkalmas körülmények között tenyésztjük, és prokarióta gazdaszervezetként E. colit, Streptomyces lividanst, S. griseofuscust, S. ambofuchsust vagy egy Actinomyces, Bacillus, Corinebacterium vagy Thermoactinomyces törzset alkalmazunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta gazdaszervezetként Streptomyces lividanst alkalmazunk.
4. 4. Eljárás tetraciklin és klór-tetraciklin antibiotikum analógok bioszintézisútját kódoló nukleotidszekvenciák keresésére, azzal jellemezve, hogy

   i) az említett analógokat termelő törzsből származó nukleotidszekvenciákat szigorú hibridizációs körülmények között az 1. igénypont szerinti eljárással előállított kozmidok 3,19 kb méretű inszertumával hibridizáltatjuk, ii) a hibridizálódó DNS-szekvenciákat izoláljuk, és iii) az izolált DNS-szekvenciákat egy prokarióta gazdaszervezetbe transzformálva expresszáltatjuk, és az antibiotikum analógokat termelő gazdaszervezetekkel azonosítjuk a keresett nukleotidszekvenciákat, ahol prokarióta gazdaszervezetként E. colit, Streptomyces lividanst, S. griseofuscust, S. ambofuchsust vagy egy Actinomyces, Bacillus, Corinebacterium vagy Thermoactinomyces törzset alkalmazunk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta gazdaszervezetként Streptomyces lividanst alkalmazunk.