HU211629A9

HU211629A9 - Papillomavírus E2 transzaktivációs represszorok

Info

Publication number: HU211629A9
Application number: HU9500682P
Authority: HU
Inventors: Elliot J Androphy; James G Barsoum
Original assignee: New England Medical Center Inc; Biogen Inc
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 1995-12-28

Description

A találmány tárgyát olyan E2 transzaktivációs represszorok képezik, amelyek normál működéssel interferálnak a papillomavírus natív teljes hosszúságú E2 transzkripciós aktivációs fehérjéjével. A natív teljes hosszúságú transzkripciós aktivációs fehérje csak DNS-hez kötődve aktiválja a papillomavírus transzkripcióját, és a DNS-hez csak egy előzetesen képződött homodimer - nem-kovalens kölcsönhatással összetartott, azonos polipeptid alegységekből álló pár - formájában kötődik. A jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok olyan fehérjék, polipeptidek vagy más molekulák, amelyek natív teljes hosszúságú E2 polipeptidekkel inaktív heterodimereket képezve dimerizálnak, ilyenformán interferálnak a natív teljes hoszszúságú E2 polipeptidekből álló aktív homodimerek képződésével, ezáltal represszálják a papillomavírus transzkripcióját és replikációját. A jelent találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok előnyösen használhatók papillomavírus fertőzések és azokkal kapcsolatos betegségek kezelésében.

Előzmények

A papillomavírusok azoknak a kis DNS vírusoknak egy csoportját alkotják, amelyek betegségeket és patológiás elváltozásokat okoznak a humán és állati szervezetben. Ezek a daganatkeltő vírusok olyan jóindulatú tumorokat vagy léziókat idéznek elő, amelyek némely esetben rosszindulatúvá válhatnak. A papillomavírusokat gyanúba keverték mind a méhnyak-rák, mind egyéb anogenitális és epiteliális elfajulások okozójaként.

A papillomavírusok fehérjét és egy darab körkörös, kétszálú, átlagosan 7,8 kbp nagyságú DNS molekulát tartalmazó izokahedrális részecskékből állnak. Eddig több, mint tíz állati és több, mint ötvenöt humán papillomavírust azonosítottak [Biochim. et Biophys. Acta 1032. 1937 (1990); J. Virol. 63. 4898-4903 (1989)]. Egy részletesen tanulmányozott papillomavírus a szarvasmarha papillomavírus („BPV” = Bovine Papillomavírus).

Minden ismert papillomavírus hasonló fehérjéket kódol, amelyek analóg funkciókat töltenek be a megfertőzött sejtekben. Az E2 transzkripciós aktivációs fehérje (az „E2 fehérje) egy olyan transz-működésű faktor, amely cisz-működésű E2 átírást fokozó szekvenciákhoz (azaz E2 kötőhelyekhez) való specifikus kötődés révén aktiválja a transzkripciót a vírus DNSben [Natúré 324, 70-73 (1987)]. A 410 aminosavból álló papillomavírus E2 fehérjéről kimutatták, hogy klasszikus fokozó (enhancer) mechanirnussal idézi elő a promóter expresszióját [Cell 42, 183-191 (1985)]. így mint más transzkripciós faktoroknál, úgy tűnik, hogy az E2 fehérje funkciói külön moduláris doménekre lokalizálódnak [EMBO J. 7, 2823-2329 (1988)].

A papillomavírus fertőzések természetes gazdaszervezeteikben nem litikusak. jelezvén, hogy a papillomavírus transzkripciója és replikációja szigorúan kontrollált. Egy ustream szabályozó régió („URR” = Upstream Regulator/ Region) található a BPV és más papillomavírusok korai génjeihez közvetlenül 5’ helyzetben. Az URR cisz-működésű szabályozó szignálokat tartalmaz, beleértve a DNS replikációnak egy eredőjét és néhány olyan promótert, amelyek a korai gén transzkripcióban működnek közre. Az URR olyan transzkripciót fokozó elemeket is tartalmaz, amelyek aktiválják az URR promóterekből és heterológ promóterekből történő transzkripciót [Biochim. et Biophys. Acta 1032, 19-37 (1990)].

Az E2 fokozó elemek feltételesek, csak abban az esetben stimulálják a transzkirpciót, ha egy olyan fehérje aktiválja őket amelyet egy papillomavírus E2 nyílt leolvasási kerete („ORF” = Open Reading Frame) kódol. Az E2 ORF-ből származó géntermékek magukban foglalják a teljes hosszúságúmtranszkripciós aktivátomE2 fehérjét és a BPV 1 E2 fehérjéjének legalább két csonka változatát, amelyek transzkripciós represzszorként működnek. Vírusgéneknek E2 géntermékekkel történő transzkripciós aktiválása és represszálása kényes szabályozó körfolyamatot hoz létre a papillomavírus génkifejeződésében és DNS replikációjában. Az E2 gének és az E2 géntermékeket szolgáló DNSkötőhelyek jellemzőnek tűnnek minden papillomavírusra, bár a kötőhelyek elhelyezkedése változhat.

Az E2 fehérje általi transzkripciós szabályozás e fehérjének az. 5' ACC(G)NNNN(C)GGT3’ - minden papillomavírusban a cisz-működésű E2 fokozó elemekben található - nukleotid-szekvenciához való közvetlen kötődésétől függ [Virology 75/, 124-130 (1986); J. Virol., 67, 2599-2606 (1987); EMBO J. 7, 525-531 (1988). EMBO J. 7, 533-539 (1988)]. Ebben a szekvenciában N bármilyen nukleotidot; X bármilyen nukleotidot, de általában G-t; Y bármilyen nukleotidot, de általában C-t jelent. Úgy tűnik, hogy az E2 kötőhelyek a virálís promóter közvetlen szomszédságában találhatók, a szarvasmarha papillomavírus genom teljes hosszában tizenhét E2 kötőhely van [Genes Dev. 3, 510-526 (1989)]. Fokozó elemeket tartalmazó E2 kötőhelyek megtalálhatók minden papillomavírusnak az URR részén ugyanúgy, mint más helyeken a promóterek mellett a vírusgenom teljes hosszában.

Az E2 kötőhelyek ugyanúgy működhetnek a virális DNS replikáció egy elemeként, mint egy klasszikus transzkripciót fokozó elemként. Ezért az E2 közvetítette DNS kapcsolódás létfontosságú a papillomavírusok természetes életciklusában.

A 302-758 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés az E2 fehérje olyan módosított formáinak alkalmazásáról számol be, amelyek hozzákötődnek a papillomavírus DNS E2 kötőhelyeihez és blokkolják azokat anélkül, hogy transzaktivációt eredményeznének. Fenti bejelentés utal az E2 aktivációnak olyan DNS fragmentumok felhasználásával történő represszálásáról is, amelyek E2 kötőhelyeket imitálnak, és ily módon megkötve az E2 transzaktivátorokat, lehetetlenné teszik kötődésüket a vírus DNS E2 kötőhelyeihez.

Az E2 fehérje kapcsolódik az El fehérjeként ismert papillomavírus replikációs fehérjével is. Feltételezik, hogy ha az E2/E1 komplex az E2 kötőhelyhez kapcsolódik, lejátszódik a vírusgenom replikációja [International Papillomavírus Workshop, Heidelberg, Germany (May 1990); Science 250, 1654-1699(1990)].

A teljes hosszúságú E2 transzkripciós aktivátor polipeptidek (monomerek) körülbelül 50 kDalton móltö2

HU 211 629 A9 megűek. Bár a különböző papillomavírusok E2 fehérjéinek körében alacsony az aminosav-szekvencia homológia (körülbelül 35%), az E2 fehérjék tartalmaznak olyan állandó motívumokat, amelyek különböző funkciójú különleges szerkezeti doméneket alkotnak [J. Virol. 62, 1573-1581 (1988)].

Az E2 polipeptid C-terminális doménje felelős a vírus DNS E2 kötőhelyének felismeréséért. Az E2 polipeptid N-terminális doménje felelős a fehérjének a vírus DNS-hez történt kötődését követően a transzkripciós aktiválásért [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 510514 (1989)]. Az E2 fehérje in vivő körülmények között csak előzőleg képződött homodimer formájában kötődik hozzá a vírus DNS-hez. Minden ilyen vírusnál azt találták, hogy dimer E2 fehérjék invert ismétlődéshez (inverted repeat) közvetlenül hozzákötődve ellenőrzik a papillomavírus promótereket.

Szarvasmarha papillomavírus modellekben és néhány humán papillomavírusnál legalább két N-terminálisan csonka E2 fehérje fordul elő normális körülmények között és természetes represszorként működik. In vitro kísérletekben megerősítették, hogy az E2 fehérjék csonka formái, amelyek megtartották a DNS-hez való kötődési képességüket, de transzaktivációt nem végeznek. a transzaktivációra képes E2 polipeptideknek kompetitív inhibitorai [Cell 50, 69-78 (1987); Genes Dev. 4, 123-136 (1990); J. Virol. 63, 1743-1755 (1989)]. Ezt a gátlást eddig még nem tulajdonították bizonyosan a DNS-kötőhelyekért vagy az E2 polipeptideknek a dimerizációs folyamatban folytatott versengésének. vagy mindkettőnek. Feltételezték, hogy a transzkripciós represszió a natív teljes hosszúságú, azaz a transzkripciósán aktív E2 fehérjével való közvetlen versengés következtében jön létre a DNS-kötőhelyen. A WO 89/12461 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés vírusgén expressziót és vírusreplikációt gátló peptidekre hivatkozik. Azt állítják, hogy ezek az inhibitorok a vírus DNS-ben a transzaktivátor kötőhelyekre kapcsolódnak, ily módon blokkolva a natív transzaktivációs fehérjék kötődését ezekhez a helyekhez. És feltételezték, hogy nem működőképes fehérjekomplexek képződése szintén megakadályozhatja a transzkripció E2 aktiválását [Cell 50, 69-78 (1987)].

Bár ismert, hogy a papillomavírus E2 fehérjéje az a szekvencia-specifikus DNS-kötő fehérje, amely koordinálja a papillomavírus transzkripcióját, DNS-kötő és dimerizációs motívumainak szerkezetét eddig még nem határozták meg. A papillomavírus E2 transzaktivációs fehérjéjének mind a DNS-kötő aktivitása, mind a dimerizációs szignálja a fehérje karboxil végének 100 aminosavjában rejlik [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 510-514 (1989)]. E2 fehérjék - melyeknek egyike sem rendelkezik transzaktivációs képességgel - C-terminális 100, 125 vagy 249 aminosavja mind repressszálja az E2 függő génkifejeződést [EMBO J. 7,4245-4253 (1988)]. Bár az már ismert, hogy az E2 dimerizáció és a kötőhely specifikus DNS kötés képessége az E2 polipeptid C-terminális doménjében rejlik, ezen a doménen belül még nem azonosították az E2 dimerizációjáért felelős aminosav régiót [J. Virol, 62, 1573-1581 (1988)]. Mostanáig még nem választották el az E2 polipeptid dimerizációs funkcióját a DNS-kötő funkciójától. Tehát azok represszorok, amelyek a papillomavírus transzkripcióját és replikációját a natív teljes hosszúságú E2 polipeptidek dimerizációjával interferálva gátolják, ismeretlenek maradtak.

A találmány bemutatása

A jelent találmányban szétválasztottuk az E2 polipeptid dimerizációs funkcióját a DNS-kötő funkciótól. Ez a szétválasztás először tette lehetővé olyan E2 transzaktivációs represszor polipeptidek előállítását, amelyek a papillomavírus E2 polipeptidekkel homológok és amelyek interferálva a natív teljes hosszúságú E2 polipeptidek dimerizációjával, gátolják a papillomavírusok transzkripcióját és replikációját. Ezek az E2 transzaktivációs represszorok előnyösen fejtik ki anti-virális hatásukat a papillomavírus transzkripciójának E2 fehérje közvetítette fokozásával interferálva az ezzel a vírussal fertőzött sejtekben. Ajelen találmány transzaktivációs represszorait a papillomavírus által termelt teljes hosszúságú natív E2 polipeptidekkel történő inaktív E2 heterodimerek képzésének képessége jellemzi, és ezért ezeknek a polipeptideknek az aktív homodimer képzésével interferálnak. E képességek kifejtése során az E2 transzaktivációs represszorok csökkentik a teljes hosszúságú natív E2 polipeptidek aktív homodimereket alkotó képességét, ily módon szorítva vissza a papillomavírus transzkripcióját és replikációját.

A jelen találmánynak egy megvalósítási formája szerint az E2 transzaktivációs represszorok magukban foglalják legalább a dimerizációs régiót, de kevesebbet, mint az E2 polipeptid DNS-kötő doménje. Az ilyen represszorok, amelyek DNS-hez való kötődésnél a teljes hosszúságú E2 polipeptidekkel inaktív heterodimerek képzése révén interferálnak és amelyek az E2 polipeptidből kevesebbet tartalmaznak, mint a DNS-kötő dómén, redukált méretük következtében előnyösen csökkentik a represzszomak a papillomavírussal fertőzött sejtbe történő bejutása lehetséges problémáját. Ezek a represszorok felhasználhatók papillomavírus fertőzések kezelési eljárásaiban és a kezeléshez alkalmazott összetételekben.

A találmány tárgyát képezik a natív E2 polipeptidekkel homológ polipeptideket - amelyek a natív teljes hosszúságú E2 polipeptidekkel inaktív heterodimereket képeznek - kódoló DNS mutációinak izolálására irányuló módszerek is. Az ilyen mutációk felhasználhatók papillomavírus fertőzések kezelési eljárásaiban és a kezeléshez alkalmazott összetételekben.

Az ábrák rövid ismertetése

1. ábra: A vad típusú BPV1 E2 polipeptidje egy szegmensének aminosav-szekvenciáját ábrázolja, a 285. és 410. aminosavak közötti részt, amely a „DNS-kötő dómén”. A négyszögek (és a rövidítések közvetlenül a négyszögek fölött) jelzik az aminosav-szekvenciában végrehajtott változtatásokat E2 mutánsok (homológok) előállítása céljából, beleértve a jelen találmány szerinti transzaktivációs represszorokat.

2. ábra: Táblázatosán összefoglalja a különböző, a jelen találmány szerint készített E2 mutánsok DNSkötő, dimerizációs és repressziós aktivitását.

HU 211 629 A9

3. A,B,C ábra: A DNS-kötő („gél shift”) meghatározás elektroforézis géljeinek autoradiogramjait mutatja.

4. A,B ábra: Dimerizációs képességben hibás 36OS mutáns polipeptiddel végzett szuper-shift DNS-kötő meghatározás elektroforézis géljeinek autoradiogramjait mutatja.

5. ábra: Vázlatosan ábrázolja a PXB332 plazmid szerkezetét.

6. ábra: Vázlatosan ábrázolja a PXB323hGh plazmid szerkezetét.

7. ábra: Vázlatosan ábrázolja a PXB101 plazmid szerkezetét.

8. ábra: Vázlatosan ábrázolja a PXB323 plazmid szerkezetét.

9. ábra: Vázlatosan ábrázolja a pXB314 plazmid szerkezetét.

10. ábra: Vázlatosan ábrázolja a pEC337L, pEC339M, pEC340F, PEC340R, pEC340Y, és pEC344L plazmidok szerkezetét.

A találmány részletes leírása

A találmány tökéletes megértése végett a következő részletes leírást tesszük közzé.

A leírásban a következő kifejezéseket alkalmazzuk:

E2 transzaktivációs represszor - Bármely olyan fehérje, polipeptid vagy más molekula, amely interferál a papillomavírusnak a teljes hosszúságú natív E2 polipeptideknek az előzetesen létező heterodimerek formájában a DNS-en lévő E2 kötőhelyekhez való kapcsolódásából eredő transzkripciós aktivációjával.

DNS-kötő dómén - A BPV1 E2 fehérjének 285—410. aminosavjai. Natív minimális DNS-kötő dómén - BPV1 E2 fehérjéjének 325—410. aminosavjai, egy olyan aminosav-szekvencia, amely elegendő a dimerizációhoz és az E2 DNS-kötő helyekhez való kapcsolódáshoz.

Homológjellegű-egy olyan aminosav-szekvencia, amely a DNS-kötő doménnek legalább egy részéhez nagyon hasonló, de annak legalább egy mutációját tartalmazza, vagy egy olyan nukleinsav-szekvencia, amely egy olyan aminosav-szekvenciát kódol, amely a DNS-kötő doménnek legalább egy részéhez nagyon hasonló, de annak legalább egy mutációját tartalmazza.

Homológ - egy olyan polipeptid vagy nukleinsav, amely homológ jellegű a natív E2 polipeptiddel illetve a natív E2 génnel.

Mutáns - homológ vagy homológ jellegű.

Mutáció - helyettesítés (szubsztitúció), betoldás (inszerció) vagy kivágás (deléció) egy kívánt fehérjét vagy polipeptidet kódoló génben.

E2 fehérje dimerizációs régió - a DNS-kötő doménnek az a régiója, amely szükséges és elégséges a dimerizációhoz, de nem elegendő az ebből adimerizációból keletkező dimemek a DNS-hez történő kötődéséhez.

Transzport félrész - bármilyen kovalens toldalék egy E2 transzaktivációs represszorhoz, amely elősegíti e represszornak a célsejtekbe történő belépését.

Inaktív heterodimerek - olyan dimerek. amelyek két nem-azonos polipeptid alegységet tartalmaznak és amelyek nem kötődnek a DNS É2 kötő helyeihez.

Aktív homodimerek - olyan dimerek, amelyek két azonos, nem kovalens kölcsönhatással összetartott E2 polipeptid alegységet tartalmaznak és amelyek az E2 DNS-kötő helyekhez történő kapcsolódás révén transzkripciós aktivációt váltanak ki.

Riporter gén - olyan gén, amelynek kifejeződése az éppen vizsgált sejtbeli esemény megtörténésétől függ és kényelmesen megfigyelhető a genetikailag transzformáit gazda törzsben.

Riporter plazmid - olyan plazmid, amely egy vagy több riporter gént tartalmaz.

Riporter törzs - olyan genetikailag transzformálható egysejtű törzs, amely egy vagy több riporter plazmidot tartalmaz.

Aminosav - peptid, polipeptid vagy fehérje monomer egysége. A fehérjéket alkotó húsz aminosav (L-izomerek) a következő: fenil-alanin (Phe vagy F), leucin (Leu, L), izoleucin (Ile, I), metionin (Met, M), valin (Val, V), szerint (Ser, S), prolin (Pro, P), treonin (Thr, Tj, alanin (Ala, A), tirozin (Tyr, Y), hisztidin (His, H), glutamin (Gin, Q), aszparagin (Asn, N), glutaminsav (Glu, E), aszparaginsav (Asp. D), lizin (Lys, K), cisztein (Cys, C), triptofán (Trp, W), arginin (Arg, R) és glicin(Gly, G).

Ahogyan azt a megvalósítási példákban bemutatjuk, E2 transzaktivációs represszorokat előállíthatunk az E2 génnek - a DNS-kötő domént - a C terminális 126-maradékot - kódoló részében kiváltott véletlenszerű vagy irányított mutációval. Azok a mutációk, amelyek az E2 polipeptidek funkcionálisan hibás mutánsait vagy homológjait eredményezik, izolálhatok egy E2 transzaktivációs riporter plazmidot hordozó egysejtű gazda törzs transzformációjával. Az izolált mutációkat ezután analizálhatjuk a következők megadásával:

a) egy olyan fehérje kifejeződése, amelyet felismernek az E2 antitestek és körülbelül a teljes hosszúságú natív E2 polipeptidnek várható (50 kDalton) móltömeggel rendelkezik;

b) az E2 gén mutációt szenvedett régiójának nukleotid-szekvenciája, amely a E2 génnek - az E2 polipeptid C terminálisában található - DNS-kötő domént kódoló szakasza;

c) a natív E2 polipeptid C terminális régiójának megfelelő mutáns (homológ jellegű) polipeptid kötődési képessége az E2 DNS kötő helyekhez;

d) a natív E2 polipeptid C terminális régiójának megfelelő mutáns (homológ jellegű) polipeptid önmagával való dimerizációjának képessége;

e) a natív E2 polipeptid C terminális régiójának megfelelő mutáns (homológ jellegű) polipeptidnek az E2-függő transzaktivációra gyakorolt repressziós képessége eukarióta sejtekben.

A jelen találmány során állapítottuk meg először az E2 fehérje dimerizációs régiójának elhelyezkedését - az E2 DNS-kötő doménjében levő aminosav-szekvencia azon területét, amely felelős a dimerizációért a DNS kötési kölcsönhatásoktól függetlenül - a natív E2 fehérje 325. és 410. aminosavjai között. Ezenkívül felismertük, hogy az E2 fehérje dimerizációs régiója önmagában is

HU 211 629 A9 elegendő teljes hosszúságú E2 fehéijéknél a transzaktiváció elnyomására és hogy az E2 transzaktiváció visszaszorításához nem szükséges a DNS-hez való hozzákötődés. Továbbá felfedeztük, hogy az E2 aminosav-szekvenciában előidézett néhány mutáció megszünteti a DNS-hez való kötődést a dimerizáció megszüntetése nélkül.

A jelen találmánynak egy megvalósítási formája szerint egy E2 transzaktivációs represszor magában foglal egy olyan polipeptidet, amely az E2 DNS-kötő doménnel homológ aminosav-szekvenciával (1. számú szekvencia) rendelkezik vagy annak egy polipeptid-fragmentumával homológ, a nevezett polipeptid képes a papillomavfrus által termelt teljes hosszúságú natív E2 polipeptidekkel inaktív heterodimerek képzésére és a keletkezett heterodimerek nem képesek E2 DNS-kötő helyekhez kapcsolódni. Másképpen, egy jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszor alapvetően egy olyan polipeptidből áll, amely a natív E2 DNS-kötő doménnel homológ aminosavszekvenciával (1. számú szekvencia) rendelkezik, vagy annak egy polipeptid-fragmentumával homológ, a nevezett polipeptid képes a teljes hosszúságú natív E2 polipeptidekkel inaktív heterodimerek képzésére és a keletkezett heterodimerek nem képesek E2 DNS-kötő helyekhez kapcsolódni.

A jelen találmánynak egy másik megvalósítási formájában egy E2 transzaktivációs represszor magában foglal egy olyan polipeptidet, amely a natív E2 DNSkötő doménnek fragmentuma. Másképpen, egy jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszor alapvetően egy olyan polipeptidből áll, amely a natív E2 DNS-kötő doménnek fragmentuma.

A jelen találmánynak egy másik megvalósítási formájában egy E2 transzaktivációs represszor magában foglal egy olyan aminosav-szekvenciát, amelyet a következő szekvenciavázlatokban definiált aminosavszekvenciák csoportjából választunk ki: a 3. számú szekvenciavázlatban, 5. számú szekvenciavázlatban, 7. számú szekvenciavázlatban, 9. számú szekvenciavázlatban, 11. számú szekvenciavázlatban, 13. számú szekvenciavázlatban és a 15. számú szekvenciavázlatban definiált aminosav-szekvenciák. A jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok alapvetően a fenti aminosav-szekvenciák bármelyikéből állhatnak.

A találmány tárgyának kell tekinteni a 3. számú szekvenciával, 5. számú szekvenciával, 7. számú szekvenciával, 9. számú szekvenciával, 11. számú szekvenciával és 15. számú szekvenciával definiált E2 transzaktivációs represszoroktól eltérő, más E2 transzaktivációs represszorokat is. Még részletesebben, a jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok magukban foglalják az E2 DNS-kötő dómén fragmentumait vagy az E2 DNS-kötő doménnel homológ aminosav-szekvenciákat tartalmazó polipeptideket mindaddig, amíg ezek a polipeptidek interféráivá az aktív E2 homodimerek keletkezésével repressziós képességet mutatnak az E2 transzakvitációra.

A jelent találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok kémiailag szintetizálhatok a szokásos peptid szintetizáló technikákkal, mint például a szilárd fázisú szintézis [J. Am. Chem. Soc. 83, 2149-2154 (1963)].

Más módon, előállíthatók megfelelő gazdaszervezetekben, amelyeket a kívánt E2 transzaktivációs polipeptidet kódoló DNS-szekvenciákkal transzformáltunk. Egy jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszor előállítható például a következő lépéseket magában foglaló eljárással: a) a fenti polipeptidet kódoló DNSszekvenciával transzformált és azt kifejező, megfelelő gazdaszervezetek tenyésztése; b) az E2 transzaktivációs represszor kinyerése a tenyészetből.

Jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represzszorokat előállíthatunk még különböző helyeken csonkolt teljes hosszúságú natív E2 gén vagy annak egy részlete által olyan polipeptidet kódolva, amely a natív E2 kötő doménnek fragmentuma és amely tartalmazza az E2 dimerizációs régiót, de hiányoznak belőle a DNS kötéshez szükséges szekvenciák. Például egy papillomavírus E2 génjét csonkolhatjuk úgy, hogy olyan polipeptidet kódoljon, amely körülbelül a 338. és 360. közé eső aminosavakkal kezdődő és körülbelül a 410. aminosavval végződő aminosav-szekvenciából áll. A teljes hosszúságú natív E2 génnek vagy egy részletének ilyen csonkolása megvalósítható a szokásosan alkalmazott technikákkal, beleértve restrikciós enzimes emésztést és oligonukleotid linkereket, vagy exonukleázos emésztéssel. Ilyen eljárások kombinációja szintén alkalmazható az itt bemutatott vagy más E2 represszorok tervezésére.

Amennyiben egy jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszort a represszort kódoló DNS-szekvenciával transzformált egysejtű gazdaszervezetben történő kifejezéssel állítunk elő, a DNS-szekvenciát hatásosan kell hozzákötni egy expressziós kontroll szekvenciához egy megfelelő expressziós vektorban, és ebben a vektorban egy megfelelő egysejtű gazdaszervezet transzformálására felhasználni. Egy jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszort kódoló DNS-szekvencia ilyen hatásos hozzákapcsolása egy expressziós kontroll szekvenciához természetesen magában foglalja ennek a DNS-szekvenciának egy helyes leolvasási irányú transzlációs start szignállal való ellátottságát. Ha a kifejezendő DNS-szekvencia nem metioninnal indul, a start szignál egy ráadás aminosavban - metioninban - nyilvánul meg, amely a termék N terminálisán helyezkedik el. Bár ilyen metionin tartalmú E2 transzaktivációs represszorok közvetlenül alkalmazhatók a találmány szerinti készítményekben és eljárások során, általában célszerűbb a metionint felhasználás előtt eltávolítani. A szakmában használatos módszerek rendelkezésre állnak az ilyen N terminális metionin eltávolítására olyan polipeptidekről, amelyek ezzel együtt fejeződnek, ki. Például néhány gazdaszervezet és fermentációs körülmény lehetővé teszi lényegében minden N terminális metionin in vivő eltávolítását. Más gazdaszervezetek az N terminális metionin in vitro eltávolítását igénylik. Mind az in vivő, mind az in vitro módszerek jól ismertek a szakmában.

A gazdaszervezet/expressziós vektor kombinációk széles választéka alkalmazható a jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorokat kódoló DNSszekvenciák kifejezésére. A használható expressziós vektorok például tartalmazhatják kromoszómális, nemkromoszómális és szintetikus DNS-szekvenciák szeg5

HU 211 629 A9 menseit, úgy mint az SV40 különböző ismert származékát és ismert baktérium plazmidokat, például E. coli plazmidokat, beleértve a colEl, pCRI, pBR322, pMB9, pET-3A plazmidokat és ezek származékait, távolabbi gazdaszervezet sorozat plazmidjait, például RP4-et, fág DNS-eket, például a λ fág számos származékát, például NM989-et és más DNS fágokat, például Ml 3at és fonalas egyszálú DNS fágokat, élesztő plazmidokat, mint például a 2 μ plazmidot vagy ennek származékait, és plazmidok és fág DNS-ek kombinációjából származó vektorokat, úgy mint fág DNS-ek vagy más expressziós kontroll szekvenciák alkalmazására módosított plazmidokat. Állati sejtben történő kifejezéshez előnyben részesítjük a pJOD plazmid használatát, amely az adenovírus fő késői promóterét az SV40 átírását fokozóval (enhancer) meghosszabbítva tartalmazza [DNA and Cell Bioi. 9, 293-300 (1990)].

Ezenkívül az expressziós kontroll szekvenciák olyan szekvenciák, amelyek ellenőrzik a DNS-szekvencia kifejeződését, ha hatásosan kapcsolódnak hozzá - széles választékából bármelyik felhasználható ezekben a vektorokban a jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorokat kódoló DNS-szekvenciák kifejezésére. Ilyen használható expressziós kontroll szekvenciák magukban foglalják például az SV40 korai és késői promótereit, adenovírus vagy citomegalovírus közvetlen korai promóterét, a „lac” rendszert, a „trp rendszert, a TAC vagy TRC rendszert. T7 promótert, amelynek kifejeződését a T7 RNS-polimeráz irányítja, a λ fág fő operátor és promoter régióit, az fd burok fehérjéért felelős kontroll régiókat, a 3-foszfoglicerát kinázért vagy más glikolitikus enzimekért felelős promótert, a savas foszfatáz promóterét, például Pho5-öt, az élesztő oc-párosító faktorok promótereit. a baculovírus rendszer polihedron promóterét és más olyan szekvenciákat, amelyekről ismert, hogy ellenőrzik a prokarióta vagy eukarióta sejtek vagy azok vírusai génjeinek expresszióját. és ezek különböző kombinációit.

Állati sejtben történő kifejezéshez előnyben részesíthetjük egy olyan expressziós kontroll szekvencia használatát, amely az SV40 átírást fokozóval (enhancer) meghosszabbított adenovírus fő késői promóteréből származik.

Egysejtű gazdaszervezetek széles választéka szintén felhasználható a jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorokat kódoló DNS-szekvenciák kifejezésére. Ezek a gazdaszervezetek magukban foglalhatnak jól ismert eukarióta és prokarióta szervezeteket, úgy mint E. coli. Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces és egyéb gombákat, állati sejteket, úgy mint a kínai hörcsög petefészek (Chinese Hamster Ovary=CHO) és egér sejtek tenyészeteit, afrikai zöld majom (african green monkey) sejteket, mint például COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 és BMT10, rovarsejt-kultúrákat, humán és növényi sejtkultúrákat. Állati sejtben történő kifejezéshez előnyben részesítjük a CHO sejteket.

Természetesen be kell látni, hogy nem minden vektor és expressziós kontroll szekvencia működik egyformán jól a jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorokat kódoló DNS-szekvenciák kifejezésében.

Ugyanígy minden gazdaszervezet sem működik egyformán jól az azonos expressziós rendszerrel. A szakmában használatos módszerek valamelyikével azonban szelektálhatunk ezek között a vektorok, expressziós kontroll szekvenciák és gazdaszervezetek között anélkül, hogy kiterjedt kísérleteket végeznénk és anélkül, hogy eltérnénk a jelen találmány hatóterületétől. Például egy vektor kiválasztásakor a gazdaszervezetnél figyelembe kell venni, hogy a vektornak replikálódnia kell benne. Szintén figyelembe kell venni a vektor másolatainak számát, e másolatok kontrolljának képességét és bármilyen más, a vektor által kódolt fehérjék kifejeződését, mint például az antibiotikum rezisztencia markereket.

Egy expressziós kontroll szekvencia kiválasztásánál különböző faktorokat is figyelembe kell venni. Ezek magukban foglalják például a rendszer relatív erősségét, kontrollálhatóságát és az egyes jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszort kódoló DNS-szerkvenciával való összeférhetőségét, különös tekintettel a potenciális másodlagos szerkezetekre. Az egysejtű gazdaszervezeteket célszerű a választott vektorral való összeférhetőségük, a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejeződésekor esetleg keletkező bármilyen, rájuk nézve toxikus termék, kiválasztási sajátságaik, a helyes hajtogatottságú fehérjék előállítására való képességük, fermentációs igényeik és az egyes jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszort kódoló DNS-szekvenciák által kódolt termékek tisztításának egyszerűsége figyelembe vételével kiválasztani.

A jelen találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejeződésével előállított E2 transzaktivációs represszor polipeptidek izolálhatok a fermentációból vagy állati sejtkultúrából és a szokásos módszerek bármelyik változatának alkalmazásával tisztíthatok. A szakmában használatos módszerek egyikével megválaszthatjuk a legmegfelelőbb izolálást és tisztítási technikákat anélkül, hogy eltérnénk a jelen találmány hatóterületétől.

A jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok magukban foglalnak olyan nem-peptid vegyületeket - peptidként viselkednek -, amelyek képesek specifikusan inaktív komplexet képezni natív teljes hosszúságú E2 polipeptidekkel úgy, hogy megakadályozzák azok aktív homodimer képzését és ezáltal blokkolják a papillomavírus transzkripcióját és transzlációját. Az E2 dimerizációs dómén 3-dimenziós adataira alapozva olyan molekulák tervezhetők, amelyek stabil komplexet képeznek az E2 polipeptidekkel úgy, hogy megakadályozzák azok aktív homodimer képzését. Az E2 dimerizációs dómén 3-dimenziós adatait röntgen-kristallográfiával kaphatjuk meg.

A BPV 1-ben az E2 fehérje 333-344. aminosavjai által képviselt szerkezeti motívum nagyon állandó a papillomavírusok között, beleértve a humán papillomavírusokat [EMBO J. 7, 2823-2829 (1988)]. Néhány jelen találmány szerinti papillomavírus E2 represszor mutációkat tartalmaz ebben a nagyon állandó motívumban. Belátható, hogy a jelen találmány szerinti, BPV 1-ből származtatott E2 transzaktivációs represszorok felhasználhatók a humán papillomavírus fertőzések kezelésében. Továbbá belátható, hogy az itt illusztráci6

HU 211 629 A9 óként bemutatott szarvasmarha papillomavírusból (BPV1) történő E2 transzaktivációs represszorok előállítására irányuló eljárások humán papillomavírusokból kiindulva, hasonlóan felhasználhatók E2 transzaktivációs represszorok előállítására.

A jelen találmány szerinti eljárások és készítmények felhasználhatók bármilyen emlős, beleértve a humán szervezetet, kezelésére. A jelen találmánynak megfelelően az emlősöket gyógyászatilag hatásos mennyiségű E2 transzaktivációs represszor gyógyászatilag elfogadható beadása révén kezeljük annyi ideig, amely elegendő a papillomavírus fertőzés terjedésének gátlására vagy csökkentésére, a specifikus papillomavírus fertőzésekhez kapcsolódó tünetek enyhítésére, vagy kiújulásuk megakadályozására.

A jelen találmány szerinti eljárásokkal és készítményekkel kezelhető betegségeket a papillomavírus etiológiai ágens okozza. Ide tartoznak például az epitélium rosszindulatú elfajulásai, anogenitális rosszindulatú daganatok, úgy mint a méhnyak-rák, rosszindulatú léziók, jóindulatú léziók. papilloma-karcinómák, papilloadenocisztómák, papilloma neurophathicum, papillomatosis, bőr és nyálkahártya papillomák, kondilómák, szájüregi, garat, torok és nyelv papillomák, fibroblaszt daganatok és más. papillomavírussal összefüggő patológiás elváltozások. A jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok felhasználhatók epiteliális és intemális fibropapillomák kezelésére is állatokban. A jelen találmány módszerei és készítményei ezenkívül felhasználhatók tömör daganatok kiújulásának megelőzésére.

A jelen találmánynak megfelelően az E2 transzaktivációs represszorok bármilyen gyógyászatilag elfogadható adagolási formában - intratumorálisan, peritumorálisan, interléziósan, intravénásán, intramuszkulárisan. szubkután vagy perioléziósan, vagy helyi úton kifejthetik helyi terápiás hatásukat.

A fenti adagolási fonnák magukban foglalhatnak gyógyászatilag elfogadható, a szakmában ismert hordozókat és adjuvánsokat. E hordozók és adjuvánsok közé tartoznak például ioncserélők, timföld, alumínium-sztearát, lecitin, szérumfehérjék, úgy mint humán szérumalbumin, puffer anyagok, úgy mint foszfatázok, glicin, szorbinsav, kálium-szorbát. telített növényi zsírsavak részleges gliceridjeinek keverékei, víz, sók vagy elektrolitok, úgy mint promatin-szulfát, dinátrium-hidrogén-foszfát, kálium-dihidrogén-foszfát, nátriumklorid, cink sók, kolloidális kovasav, magnézium-triszilikát, polivinil-pirrolidon, cellulóz alapú anyagok és polietilén-glikol. E2 transzaktivációs represszorok helyi vagy gél alapú formájához adjuvánsokat választhatunk például a nátrium-karboximetil-cellulózok, poliakrilátok, polioxi-etilén-polioxi-propilén tömb polimerek, polietilén-glikol és fagyanta alkoholok csoportjából. Minden beadáshoz a megfelelő formát lehet használni.

A jelen találmány gyógyászati készítményeit a gyógyászatban használatos készítmények kiszerelésére szolgáló hagyományos módszerek alkalmazásával formulázhatjuk. Az ilyen készítmények előnyösen legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaznak. Lásd például Remington’s Pharmaceutical

Sciences (E. W. Martin). Ezenkívül a készítmények előnyösen egy gyógyászatilag elfogadható puffért, előnyösen keserűsót foszfát pufferben, tartalmaznak egy gyógyászatilag elfogadható olyan komponenssel együtt, amely az izotóniás nyomás beállítására szolgál, mint például nátriumklorid, mannit vagy szorbit.

A találmány szerinti gyógyászati készítmények egy vagy több E2 transzaktivációs represszort tartalmazhatnak aktív alkotórészként. Másképpen, egy transzaktivációs represszort tartalmazó készítmény beadható a betegnek egy ettől eltérő E2 transzaktivációs represzszort tartalmazó készítménnyel kombinálva vagy egymást követően.

Az E2 transzaktivációs represszor beadásának és adagolásának leghatásosabb módja a kezelendő betegség típusától, súlyosságától és lefolyásától, előző terápiától, a beteg egészségi állapotától és az E2 represzorra adott válasz-reakciójától és a kezelőorvos döntésétől függ. Az E2 represszor beadható a betegnek egyszeri alkalommal vagy kezelések sorozata folyamán.

A jelen találmánynak egy megvalósítási formája szerint papillomavírussal fertőzött sejteket telíthetünk egy E2 transzaktivációs represszorral, amely inaktív heterodimereket képez a fenti vírus által termelt, natív teljes hosszúságú E2 polipeptidekkel, interferálva a natív teljes hosszúságú E2 polipeptideket tartalmazó aktív homodimerek képződésével, ily módon szorítva vissza a vírus transzkripcióját és replikációját.

A papillomavírus fertőzés vagy az avval kapcsolatos betegség súlyosságától függően parenterális beavatkozással 1-1000 mg/testsúly kg dózisú E2 transzaktivációs represszor adható a betegnek egyszeri vagy többszöri adagolással, vagy tárolt formából kezelésenként kiengedve. Másképpen, körülbelül 1-1000 gg/ml mennyiségű E2 transzaktivációs represszor adható be a betegnek helyileg.

A jelen találmánynak egy másik megvalósítási formája szerint egy E2 transzaktivációs represszor beadható sorozatosan vagy kombinálva más, papillomavírus fertőzések vagy általuk okozott betegségek kezelésére szolgáló gyógyszerekkel. Ilyen gyógyszerek közé tartoznak az interferonok, úgy mint a természetes forrásokból származó vagy rekombináns technikákkal készült γ-IFN, α-IFN és β-IFN, a leukociták által képzett vagy rekombináns technikákkal előállított sejt-mediátorok, mint például az interleukin-1, interleukin-2, tumor nekrózis faktor, makrofág kolóniákat stimuláló faktor, makrofág migrációt gátló faktor, makrofág aktiváló faktor, limfotoxin és fibroblaszt növekedési faktor. Másképpen, az E2 transzaktivációs represszor beadható sorozatosan vagy kombinálva hagyományos gyógyászati ágensekkel, mint például szalicilsavval, podofillotoxinnal és retinasavval vagy sebészeti, lézerterápiás és krioterápiás beavatkozásokkal. Az ilyen kombinált terápiák előnyösebben hasznosíthatnak a hagyományos dózisokkal kevesebb adagokat ezekből az ágensekből, vagy kevésbé radikális beavatkozásokat foglalnak magukban, ezáltal elkerülik az esetleges mérgezéseket vagy az ezekkel a terápiákkal járó kockázatokat.

A jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorokat közvetlenül vagy közvetett úton juttathatjuk

HU 211 629 A9 be a papillomavírus által megfertőzött sejtekbe. Az E2 transzaktivációs represszorok közvetlen bejuttatása elősegíthető magának a polipeptidnek a kémiai módosításával. Egy ilyen módosítás magában foglalja az E2 transzaktivációs represszor lipofilitásának növelését annak érdekében, hogy fokozza kötődését a sejtfelszínhez, a fehérje nemspecifikus endocitózisát pedig stimulálja. A lipofilitás növelhető lipofil rész (például egy vagy több zsírsav molekula) E2 represszorhoz történő hozzáadásával. Zsírsavak széles választéka alkalmazható. Például a fehérje kiegészíthető palmitolajsavval. Másképpen, egy lipopeptidet állíthatunk elő fúzióval vagy kereszt-kötéssel, lehetővé téve az E. co/í-ból származó természetes lipopeptidhez hasonló, az N terminálison tripalmitoil-S-gliceril-ciszteilszeril-szerint tartalmazó E2 represszor létrejöttét. Ezen a Iipopeptiden mutatták be a fúziós peptidek megnövekedett felvételét [Immunobioi. /77, 158-170 (1988)]. A lipofilitás növelhető a fehérje észterezésével is tirozin vagy más aminosav maradékoknál. Az E2 transzaktivációs represszor felvétele növelhető egy bázikus polimer, úgy mint poliarginin vagy polilizin hozzáadásával [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75. 1872-1876 (1978)].

Mivel az E2 transzaktivációs represszorok néhány felvételi mechanizmusa magában foglalhatja a lizoszómákon való áthaladását és mivel a célsejtekben hosszú felezési időre van szükség, egy a jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszor módosítható úgy, hogy proteáz rezisztenciája, és ezáltal a polipeptid felezési ideje növekedjen a keringésben és a sejtekben. A jelen találmánynak egy megvalósítási formájában egy E2 transzaktivációs represszor proteáz rezisztenciáját úgy növeljük meg. hogy a polipeptid néhány vagy minden maradékának L-aminosavjai helyébe D-aminosavakat építünk be. Egy másik megvalósítási formában egy E2 represszor amino-terminálisát vagy karboxi-terminálisát vagy mindkettőt kémiai módosítással blokkoljuk. A jelen találmánynak egy további megvalósítási formájában a lizoszóma proteázok aktivitását egy olyan E2 transzaktivációs represszorral gátoljuk, amely készítmény lizomotróf ágenst - mint például klorokvint, amantadint, monenzint, metilamint vagy ammónium-kloridot - tartalmaz.

A jelent találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok közvetlen bejuttatását befolyásolhatjuk transzport részek alkalmazásával is, úgy mint fehérje hordozók (carriers). amelyekről ismert, hogy áthatolnak a sejtmembránokon. Például egy E2 transzaktivációs represzszor egyesíthető egy hordozó fehérjével, előnyösen genetikai fúzióval, amelyet kifejezhetünk egy olyan rendszerben, mint az £. coli vagy élesztő. Ajelen találmánynak egy megvalósítási formája szerint az E2 transzaktivációs represszor amino-végét standard technikák alkalmazásával egyesíthetjük egy transzport rész karboxi-végével.

Olyan nukleotid-szekvenciákat, amelyek ilyen hordozód transzaktivációs represszor fúziós fehérjéket kódolnak és hatásosan kapcsolódnak szabályozó szekvenciákhoz. előállíthatunk és bevihetünk megfelelő expressziós rendszerekbe a szokásos rekombináns DNS eljárások alkalmazásával. A kapott fúziós fehérje ezután tisztítható és tesztelhető 1) intakt eukarióta sejtekbe való belépési képessége és 2) az intakt eukarióta sejtekben az E2 függő génexpresszió és virális DNS replikáció gátlási képessége alapján.

Alkalmas hordozó fehérje kiválasztásánál a szakmában használatos módszerekkel felismerhető, hogy szükség van-e megfelelő kontroll kísérletek elvégzésére, többek között annak a lehetőségnek a tesztelésére, hogy a fúziós fehérje hordozó része kölcsönhatásba lép az E2 transzkripciós szabályozó rendszer elemeivel. Amennyiben úgy találjuk, hogy a fúziós fehérje hordozó része nemkívánatos kölcsönhatásokba lép, például aktiválja az E2 függő átírást fokozót, akkor a hordozó szekvencia azon részeit, amelyek felelősek ezekért a kölcsönhatásokért azonosítani kell és oly módon kivágni, hogy a szekvencia megtartsa hordozó képességét. Másképpen, az E2 transzkripciós szabályozó rendszer elemeivel kölcsönhatásba nem lépő néhány hagyományos hordozó szekvencia valamelyikét szubsztituálhatjuk.

Az alkalmas hordozó fehérjék közé tartoznak például a bakteriális hemolizinek vagy „elegyítő ágensek”, mint az alameticinnel vagy szulfhidrillel aktivált lizinek. Egyéb felhasználható hordozó részek, amelyek baktérium toxinok - mint például Pseudomonas exotoxin, tetanus toxin. ricin toxin és diftéria toxin - sejtbelépési komponenseit foglalják magukban. Szintén felhasználható a méhméregből származó melittin. Egyéb használható hordozó fehérjék magukban foglalnak olyan fehérjéket, amelyek vírusreceptorok, sejtreceptorok vagy specifikus receptorok intemalizált sejtligandumai, azaz olyanok, amelyek a sejtfelszíni receptorokkal való specifikus kölcsönhatás útján lépik át az emlős sejtek membránjait, amelyeket sejtfelszíni receptorok ismernek fel és visznek be a sejtbe. Ilyen sejtligandumok magukban foglalják például az epiderm növekedési faktort, fibroblaszt növekedési faktort, transzferrint és platelet-derived növekedési faktort. Másképpen, a ligandum lehet nem-peptid vegyület, mint a mannóz-6-foszfát, amely a mannóz-6-foszfát receptor segítségével teszi lehetővé az internalizációt. A transzport részt választhatjuk bakteriális immunogének, parazita immunogének, virális immunogének, immunglobulinok vagy ezeknek célmolekulákhoz kötődő fragmentumai, citokinek, növekedési faktorok, kolónia stimuláló faktorok és hormonok közül. A transzport rész származhat a HIV-1 tat fehérjéjéből is.

A fentiekben leírt kémiai módosulatok és fehérje hordozók - amelyek felhasználhatók önmagukban vagy kombináltan - mellett vagy azok alternatívájaként alkalmazhatunk más olyan ágenseket a találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok papillomavírussal fertőzött sejtekbe történő szállításának elősegítésére, amelyek lehetővé teszik a bejutást a keratinnal borított sejtrétegen keresztül. Helyileg történő alkalmazásoknál például az E2 transzaktivációs represszor beadható dimetil-szulfoxiddal kombinálva, amely a vele összekevert anyag sejtmembránba való behatolását elősegítő ágens. A használható keratinoldó ágensek magukban foglalják például a szalicilsavat, karbamidot és az α-hidroxisavakat. Ilyen alkalmazásoknál az E2 transzaktivációs represszort és minden egyéb ágenst helyileg adagolunk krém vagy gél formájában.

HU 211 629 A9

Egy E2 transzaktivációs represszor indirekt bejuttatása papillomavírussal fertőzött sejtekbe megvalósítható az E2 transzaktivációs represszort kódoló génnek megfelelő expressziós kontroll szekvenciákkal együtt ezekbe a sejtekbe történő bejuttatásával. Egy E2 transzaktivációs represszort kódoló gén bevihető a célsejtekbe a fertőzött sejtek kezelése nyomán, például megkaparva azokat és így lehetővé téve a DNS felvételét, elektroporációval, közvetlen injektálással vagy hibás rekombináns vírusok, mint például retrovírusok felhasználásával. Például egy E2 transzaktivációs represszort kódoló DNS-szekvencia bevihető a célsejtekbe retrovírus felhasználásával, az E2 transzaktivációs represszort kódoló DNS-szekvenciának egy RNS-be történő átírásával és a kapott RNS-szekvenciának a hibás retrovírusba való beépítésével.

Annak érdekében, hogy az itt leírt találmány teljesebben érthetővé váljon, a következő példákat tesszük közzé. Tudomásul kell azonban venni, hogy ezek a példák csak illusztráció célját szolgálják és nem azért készültek, hogy a jelen találmányt bármilyen értelemben korlátozzák. E példák minden részletében, minden molekuláris klónozási reakciót a Maniatis és a Sambrook-féle kézikönyvek [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) és Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)] módszerei szerint végeztünk el, a New England Biolabs-tól (Beverly, Mass.) beszerzett enzimek felhasználásával. Az ettől való eltéréseket jelezzük. Minden plazmid szerkezet épségét DNS szekvenálással hitelesítettük.

1. példa

Kémiai mutagenezis, a mutánsok fenotípusos szelektálása és irányított mutagenezis A vad típusú BPV1 E2 gén teljes hosszúságú kódoló szálát klónoztuk a pCO-E2 plazmidból [EMBO J. 7, 525-531 (1988)] az fonalas, egyszálú DNS bakteriofág M13 mp 18 törzsbe (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Md.) és egyszálú DNS-t izoláltunk az E2 fehérje DNS-kötő doménjének kémiai mutageneziséhez. Lásd a Sambrook-féle kézikönyv 4. fejezetét az M13 bakteriofág használatára vonatkozó standard módszerekhez.

Összefoglalva, annak érdekében, hogy nagyszámú mutánst hozzunk létre, a BPV1 E2 génjének egy szálán kémiai mutagenezist és reverz transzkripciót végeztünk, a kétszálú szegmenst egy vad típusú E2 élesztő expressziós vektorba vittük át és izoláltuk azokat a mutánsokat, amelyek korlátozott gén indukciót mutattak. Véletlenszerű mutációkat hoztunk létre az E2 fehérje DNS-kötő doménje C terminálisának 126-maradékát kódoló DNS-ben kémiai mutagenezissel, lényegében Myers és munkatársainak módszere [Science 229, 242-247 (1985)] szerint. Ez a módszer magában foglalja az egyszálú DNS kemikáliáknak - úgy mint salétromossavnak, hangyasavnak, hidrazinnal vagy kálium-permanganátnak - való rövid alávetését, amely mind a négy bázist tönkreteszi anélkül, hogy a DNS foszfodiészter vázát károsítaná.

Részletesebben, a teljes hosszúságú E2 gént tartalmazó egyszálú M13 DNS 20 gg-ját 1,3 mM kálium-permanganáttal kezeltük 5-10 percig. Az eljárás egy változatában az egyszálú DNS-t 12 M hangyasavval kezeltük

5-10 percig. Mindkét kémiai reagenssel szobahőmérsékleten végeztük és 1/10 rész 2,5 M nátrium-acetáttal (pH 7,0) állítottuk le a reakciót. A kémiailag módosított egyszálú DNS-t a reakcióelegyból kétszeri hideg etanolos kicsapással, élesztő RNS hordozó jelenlétében választottuk el. A kémiailag módosított DNS-t azután agaróz-gélektroforézissel tisztítottuk.

A második szál szintéziséhez az egyszálú DNS 3’-vel komplementer szintetikus oligonukleotid printereket hajlítottunk a BstXl helyhez, amely a BPV1 E2 génjének 3’ nem-kódoló régiójában a 3881. nukleotidnál található. Ennek a régiónak bármelyik része használható priming céljára és a primer pontos hossza nem kritikus - olyan hosszú, mint a stabil duplex képzéséhez elegendő hosszúságú primer. A primerek hajlításának körülményei és a primer kiterjesztés technikái jól ismertek a szakmában. Az általunk használt primer szekvenciája 5’ AGCAACTAGTCCCAAG 3’ (17. számú szekvencia), amely komplementer a BPV1 3904-3919. nukleotid szakaszával. A primer kiteijesztéshez T7 polimerázt (Sequenase 2.0, US Biochemicals, Cleveland, Ohio) használtunk. A primer kiterjesztési reakciót 37 °C-on végeztük körülbelül 1 órán át, mind a négy dNTP jelenlétében a forgalmazó ajánlásai szerint. Másképpen, muréna leukémia vírus reverz transzkriptázt (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Md.) használtunk primer kiteijesztéshez 40 C-on. Amikor a második szál szintéziséhez használt polimeráz egy károsodott bázissal találkozik a templát szálon, a négy dNTP valamelyikét beépíti a helyére. Ezért valószínűleg a nukleotid-szekvencia potenciálisan minden pontján véletlenszerű átmenetek és keresztezések keletkeztek - beleértve mind a négy bázist. Ilyenformán tehát a komplementer DNS szál szintézise mutációhoz vezetett azokon a helyeken, ahol a kódoló szálon kémiai kezelés történt.

A primer kiterjesztéssel termékeket (azaz a kettős szálú DNS-t) KpnI és BstXl restrikciós endonukleázokkal emésztettük, hogy szabaddá tegyük az E2 fehérje C terminális régióját kódoló 426 bp hosszúságú, véletlenszerű mutagenezisen átesett E2 gén fragmetumok sokaságát

A mutációt szenvedett fragmentumokat agaróz gélen tisztítottuk és szubklónoztuk azokat pYE2 élesztő expressziós vektorban levő vad típusú E2 génbe [J. Virol, 63, 4422-4425 (1989)] helyettesítve a megfelelő vad típusú 426 bp KpnI-BstXl fragmentumot a mutagenezisen átesett fragmentummal. A pYE2 plazmid magában foglal egy galaktóz upstream aktiváló szekvenciát („GÁL UAS”) és downstream restrikciós helyeket oly módon, hogy a GÁL UAS megfelelően használható a homológ E2 szekvenciák kifejeződésének hajtóerejeként. A GÁL UAS-ból történő génkifejeződést galaktóz jelenléte váltja ki, glükóz viszont erősen visszaszorítja azt. így tehát az E2 szekvenciák és E2 homológ szekvenciák kifejeződése élesztő táptalajban tetszés szerint szabályozható. Ezenkívül a pYE2 plazmid tartalmaz egy ura gént, egy szelekciós markért, amely lehetővé teszi a gazdaszervezet növekedését uracilmentes szelekciós táptalajon.

HU 211 629 A9

Az 1. ábra a vad típusú BPV1 E2 fehérje 285^)10. aminosavjainak szekvenciáját ábrázolja [Natúré 299, 529-534 (1982)]. A BPV1 E2 fehérjéjének ez a régiója a DNS-kötő doménként ismert [EMBO J. 7, 28232829 (1988)]. Az 1. ábra bemutatja azokat a változásokat is a BPVI E2 DNS-kötő doménjének aminosavszekvenciájában, amelyek a jelen találmány szerint készített különböző E2 transzkripciós represszor mutánsokat jellemzik. Ahogyan azt az 1. ábrán mutatjuk, a mutációk a DNS-kötő dómén teljes hosszában szétszórtanjelentek meg. Néhány, a dimerizáció szempontjából hibás E2 mutáns két vagy három nukleotidban mutatott eltérést a natív E2 fehérje szekvenciától.

A vad típusú E2 fehérje aminosav-szekvenciájának 340. helyén található cisztein az 1. ábrán minden olyan papillomavírus E2 fehérjéjében jelen van, amelyeknek szekvenciája ismert. Ezenkívül az E2 fehérje DNS-kötő aktivitása redukáló ágensek jelenlététől függ. Ennek megfelelően, a 340. helyen indukáltunk mutációkat annak kiderítésére, vajon kritikus-e ez a cisztein. Irányított mutagenezist alkalmaztunk a BPVI E2 génnek a 340. helyre ciszteint kódoló TGC kódonjában a G-t és C-t három másik nukleotiddal helyettesítve. Az irányított mutagenezist Kunkel és munkatársai módszere [Methods Enzymol. 154. 367-382 (1987)] szerint végeztük el.

A 2. ábra különböző, a jelen találmány szerint készített E2 transzaktivációs represszor mutánsokat azonosít és összegzi azok DNS-kötő, dimerizációs és repressziós aktivitását, ahogyan azokat a következő példákban meghatároztuk.

2. példa

Mutánsok screenelése egy riporter gén transzaktivációjával élesztőben

Az E2 mutánsokat egy E2 transzaktivációs riporter törzs riporter génjének transzaklivációjára nézve teszteltük. Még pontosabban az E2 mutációk populációját hordozó PYE2 plazmidot használtuk fel a pBY-4 élesztő riporter plazmidot [J. Virol, 63, 4422-4425 (1989)] tartalmazó BGW1-7A élesztő riporter törzs transzformálására. A pBY-4 plazmid β-galaktozidáz riporter gént tartalmaz egy E2 függő promoter kontrollja alatt, és még egy Leu2 gént, amely szelekciós markerként szolgál. A β-galaktozidáz gén kifejeződését a pBY-4 plazmidban E2 függővé tettük egy megfelelően elhelyezett. négy E2 kötő hellyel upstream megelőzött cyc1 minimál promoter kontrollja alatt tartva. Utána olyan transzformátumokat válogattunk ki leucin és uracil mentes. 2% glükóz tartalmú minimál táptalajon, amelyek mindkét plazmidot tartalmazták. A sejtek transzferje a leucin és uracil mentes glükóz minimál táptalajra erős pozitív szelekciós kényszert jelentett a mindkét plazmidot (pYE2 és pBY-4) magukban rejtő transzformátumoknak. mialatt egy E2 szekvenciák kifejeződését nem indukálta.

Bár nem szükséges, előnyben részesítünk egy ilyen, az E2 szekvenciák kifejeződése nélküli szelekciós kényszert magában foglaló lépést közvetlenül a transzformáció után annak a lehetőségnek a kizárására, hogy az E2 fehérje vagy E2 homológok kifejeződése esetleg szelektív hátrányt adhat át, amely megzavarná a kívánt transzformátumok megkülönböztetését egy kevert populációban.

A kiválasztott telepeket azután replikációs módszerrel szelektív élesztő minimál táptalajra vittük, amely 100 mM kálium-foszfátot (pH 6,9), 2% gálák tózt és 0,004% X-gal-t tartalmazott. X-gal egy színtelen β-galaktozidáz szubsztrát (5-bróm-4-klór-3-indoilβ-glükozid), amely β-galaktozidázzal hasítva kék színű terméket eredményez. A pYE2 plazmidon található E2 gén galaktóz indukálta kifejeződése az X-gal szín megjelenésével jelezte a pBY-4 plazmid által hordozott β-galaktozidáz gén E2 függő aktivitását. Galaktóz és X-gal tartalmú táptalajon a transzaktivációs E2 homológokat kifejező transzformátumok kékek, ugyanakkor a nem-aktiváló homológokat kifejező telepek világoskék vagy fehér színűek. A tenyészetek 48 órás 30 C-on történő inkubálása után vizuálisan határoztuk meg a színt egy 1-8 terjedő skálán. A telepeknek körülbelül

10—15%-a volt fehér vagy világoskék. A 2. ábrán felsorolt valamennyi E2 mutánst eredetileg izoláltuk mint fehér vagy világoskék telepet. A fehér telepek megszűnt transzaktivációjú mutációkat, míg a világoskékek redukált transzaktivációjú mutációkat tartalmaztak. A 366Y/376L, 386W, 360S, 3991. 408*, 411* és 3SLI mutánsokat mint világoskék telepeket izoláltuk a kezdeti screenelésnél. A 2. ábrán felsorolt többi mutánst mint fehér telepeket izoláltuk. A sötétkék telepek vagy mutációt nem szenvedett E2 szekvenciákat vagy olyan E2 mutációkat tartalmaztak, amelyek nem csökkentették az E2 transzaktivációt, így ezekkel nem foglalkoztunk tovább.

Minden mutáns kiónból izoláltuk a pYE2 E2 plazmidot és minen klón mutációt szenvedett E2 inszertumát szekvenáltuk standard módszerekkel.

Amint azt az 1. példában részleteztük, a cys340-nél levő öt mutáns nem a screenelésből ered, hanem irányított mutagenezissel állítottuk elő azokat.

3. példa

Az E2 fehérje és E2 homológok kifejezése élesztőben és E. coli-ban

A kiválogatott világoskék vagy fehér transzformátumokat az alábbiak szerint analizáltuk teljes hosszúságú E2 fehérjék kifejezésére nézve. Mivel az érés előtti terminációs kódonokat vagy nem-stabil E2 fehérjéket eredményező mutációk nem voltak kívánatosak, a kiválogatott világoskék és fehér telepkultúrákból kivontuk az összes fehérjét és standard immunobiot technikákkal teszteltük azokat. Csak azokat a mutáns kiónokat vizsgáltuk tovább, amelyek a vad típushoz hasonló mennyiségben termeltek körülbelül 50 kDalton molekulatömegű E2 antitestekkel reakcióba lépő fehérjét.

Először minden kiválasztott világoskék vagy fehér transzformátumot 50 ml, 2% galaktózt tartalmazó szelektív minimál táptalajon tenyésztettünk 7 órán keresztül 30 °C-on. Az E2 fehérjék kivonása céljából centrifugálással kinyertük a sejteket, fehérje extraháló pufferrel (200 mM Tris/HCl (pH 8,0), 400 mM ammóni10

HU 211 629 A9 um-szulfát, 10 mM magnézium-klorid, 1 mM EDTA és 10% glicerin (v/v) mostuk azokat. Utána a mosott sejteket 2 térfogatnyi, 5 mM DTT-vel és proteáz inhibitorokkal - 1 mM PMSF-fel, 1 mM TLCK-val, pepsztatinnal és 5 mM benzamidin-hidrokloriddal - kiegészített fehéije extraháló pufferben szuszpendáltuk.

0,45 mm átmérőjű mosott üveggyöngy (körülbelül az élesztősejt pellettel azonos térfogatú) hozzáadása után 6szori, egyenként 30 perces erőteljes keverés mellett szétverettük az élesztősejteket. A nehéz oldhatatlan törmeléket egy első centrifugálással távolítottuk el, a felülúszót pedig 1 órán át 4 'C-on, körülbelül 13.000 g mellett végzett centrifugálással tisztítottuk meg. A megtisztított felülúszóhoz azonos mennyiségű hideg, telített ammónium-szulfát oldatot adtunk és 15 percig jégbe hűtve kicsapattuk a fehérjéket. A kicsapott fehérjéket centrifugálással pellettáltuk JA-17 szögrotorban, 13.000 g mellett 10 percig 4 °C-on, majd feloldottuk 50 μΐ pufferben, amely 25 mM Tris/HCl-t (pH 8,0), 2 mM EDTA-t, 20% glicerint (v/v), 1 mM DTT-t és ugyanazokat a proteáz inhibitorokat tartalmazta, amelyeket a fehérje extrakciós pufferben alkalmaztunk.

Kifejeztük a BPV1 E2 polipeptid C terminálisának 126 aminosavját (plusz egy N terminális metionin maradékot) és a megfelelő mutáns polipeptideket (homológokat) a pET8C E. coli expressziós vektorban Studier leírása alapján [Methods Enzymol. 185, 60-90 (1990)]. miután az Ncol helyhez és ATG kódonhoz közvetlen 3’ egy KpnI helyet hoztunk létre. Ezután mutáns E2 szekvenciákat, mint KpnI-BstXl fragmentumokat vittünk be a pET8C-E2 vektorba. A pET8CE2 expressziós vektorokat az E2 homológok kifejezésére késztettük az E. coli BL21 (DE3)pLYSS gazdasejt transzformálásával [Methods Enzymol. 185, 60-90 (1990)]. A transzformált expressziós gazda törzsből indukciós körülmények között 50 ml tenyészetet készítettünk és centrifugálással kinyertük a sejteket.

A kinyert sejteket 1 mM PMSF-et tartalmazó 20 mM MES (pH 6,0) 4 ml-ében szuszpendáltuk és fagyasztásos-olvasztásos lízisnek vetettük alá. Az oldhatatlan törmeléket centrifugálással távolítottuk el. Az E2 polipeptideket és E2 homológokat kromatográfiásan

S-Sepharose oszlopon (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) részlegesen tisztítottuk. A fehérje oldatot egy 0,2 ml-es S-Sepharose oszlopra vittük fel, amelyet előzőleg a fagyasztásos-olvasztásos lízis pufferjével ekvilibráltunk. Az oszlopot 20 mM MES (pH 6,0), 100 mM NaCl, 5 mM DTT és 1 mM EDTA keverékével mostuk. Az E2 polipeptideket és E2 homológokat 20 mM MES (pH 6,0), 600 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% glicerin (v/v), 1 mM PMSF, 1 μΜ pepsztatin, pg/ml leupeptin és 2 pg/ml aprotinin keverék oldatával euáltuk az oszlopról. Ezután E2 homológok jelenlétére teszteltük az eulátumot az alábbiakban leírt hagyományos immunobiot eljárások szerint, amelyek elvégezhetők a szakmában mindennapos gyakorlatként standard technikák felhasználásával.

Molekulatömeg szerint SDS poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel oldottunk fehérjéket az eulátumban. Az elektroforézist követően az oldott fehérjéket standard blotting technikákkal nitrocellulóz membránokra vittük át. Ezután a nitrocellulóz membránokat szarvasmarha szérum albuminnal kezeltük a membrán nem-specifikus fehérje kötő helyeinek telítése céljából, és a membránt poliklonális nyúl anti-E2 szérumnak vetettük alá 1:2.500 szérum hígítás mellett 2 órán keresztül szobahőmérsékleten. Miután a meg nem kötődött antitestek eltávolítása céljából lemostuk a membránt, az elektroforetikus fehérjéhez kötődött antitesteket a nyúl immunglobulinokhoz kötődő antitestekkel konjugációba lépő alkalikus foszfatáz útján tettük láthatóvá.

4. példa

DNS-kötő meghatározások

Annak megállapítására, hogy melyik mutáns E2 polipeptid (homológ) kötődik E2 DNS-kötő helyekhez, DNS-kötő meghatározásokat végeztünk.

Először körülbelül 1 ng/μΐ koncentrációjú, részlegesen megtisztított E2 polipeptid vagy homológ (a 3. példában leírtak szerint elkészítve) 0,5-4,0 μΙ-ét kevertük körülbelül 1,5 pg poli Dl-dC-vel és körülbelül 300 ng lefejtett lazac sperma DNS-sel körülbelül 20 pl végtérfogatban 10 percig 4 'C-on. Ezután két vagy négy E2 DNS-kötő hellyel rendelkező, a végeken címkézett DNS fragmentumok körülbelül 0,5-2,0 ng-ját (körülbelül 10.000 cpm/reakció) adtuk hozzá és a keveréket jégre tettük. Az E2 kötő hellyel rendelkező DNS fragmentumok (próbák) a pBY-1 (egy E2 kötő hely), pBY-2 (két E2 kötő hely) vagy pBY-4 plazmidok Nsil restrikciós fragmentumaiból álltak [J. Virol. 63, 4422-4425 (1989)]. 30 perc elteltével 20 mM Hepes (pH 7,5), 20% glicerin (v/v) és 0,25% brómfenolkék keverékből 1/10 részt adtunk a DNS-fehérje keverékhez, elektroforézishez. Ezután újra oldottunk DNS-fehérje komplexeket nem kötött DNS-ből és fehérjéből elektroforézissel 4-5%-os poliakrilamid gélben 3-4 órán keresztül 150 Volt-nál. Az elektroforézis puffer 0,5 x TBE volt. Az elektroforézist követően a géleket megszáritottuk és röntgen filmre vittük. DNS-kötő meghatározásunkat a jól ismert módszereknek megfelelően végeztük [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 12.2.1-12.2.10 (1990)].

A 3. ábra e „gél shift” DNS-kötő meghatározások elektroforetikus géljeinek autoragiogramját mutatja. Amint ezen az ábrán látható, a minta minden sávban tartalmazott E2 kötő hellyel rendelkező radioaktív DNS próbát. Az A és B panelben levő DNS két E2 kötő helyet, a C panel DNS-e négy E2 kötő helyet tartalmazott. A minták jelölése a következő: „P” E2 kötő helyet tartalmazó radioaktív DNS próba hozzáadott fehérje nélkül; „wt” natív E2 represszor; „333” 333V mutáns polipeptid; „337” 337L mutáns polipeptid; „339” 339M mutáns polipeptid; „344” 344L mutáns polipeptid; „360” 360S mutáns polipeptid; „316” 316Y mutáns polipeptid; „370” 3701 mutáns polipeptid; „340R”, „340F”, „340Y”, „340S”, „340G” és „3SLI” olyan mutáns polipeptideket jelentenek, amelyek ezekkel a jelzésekkel vannak ellátva. A meghatározás alapja az, hogy a DNS próbához kötődő fehérje lassítja a DNS

HU 211 629 A9 vándorlását az elektroforézis folyamán. Ezért a fehérje hozzákötődése a DNS-hez eltolja a DNS sávját a kötődő fehérje távollétében megfigyelhető elektroforetikus helyzethez képest. A 3. ábra azt mutatja, hogy a 333V, 337L, 339M, 344L, 340F, 340R, 340Y és 360S mutáns polipeptidek nem tolják el a DNS próba elektroforetikus helyzetét, tehát nem kötődnek hozzá a DNS próba E2 kötő helyéhez. A 333V, 337L, 339M, 344L, 340F, 340R, 340Y és 403 mutánsok egyike sem volt képes stabilan hozzákötődni az E2 DNS elemhez ennél a gél shift elemzésnél.

A dimerizációs képességben hibás homológok további jellemzésére super-shift DNS-kötő meghatározásokat végeztünk a BPV1 E2 fehérje elleni monoklonális antitestek felhasználásával. A super-shift elemzéseket annak kiderítésére végeztük el, hogy a dimerizációs képességben hibás E2 homológok vajon hozzákötődnek-e a DNS E2 kötő helyéhez, ha monoklonális antitestekkel párokat képezünk belőlük a dimerizáció szimulálására. A super-shift elemzéseknél az E2 homológokat először a monoklonális antitesteket termelő hibridoma sejtkultúrából való táptalaj (DulBecco’s módosított táptalaj 10% borjúmagzat szérummal kiegészítve) körülbelül 2-4 μΐ-ével jégen 30 percig inkubáltuk, azután adtuk hozzá a címkézett DNS-t. A keveréket jégre tettük. 30 perc elteltével 20 mM Hepes (pH 7,5), 20% glicerin (v/v)( és 0,25% brómfenolkék keverékből 1/10 részt adtunk a DNS-fehérje-antitest keverékhez, elektroforézishez. Az elektroforézist a DNS-kötő meghatározásnál fent leírtak szerint végeztük el.

A 4. ábra a dimerizációs képességben hibás 360S mutáns polipeptiddel végzett super-shift DNS-kötő meghatározás elektroforetikus géljeinek autoradiogramját mutatja. Ezen az ábrán az A gél azt mutatja, hogy anti-E2 monoklonális antitest hiányában a 360S mutáns polipeptid nem kötődött hozzá az 1, 2 vagy 4 kötő hellyel rendelkező DNS próbákhoz. B gél szemlélteti, hogy anti-E2 monoklonális antitest jelenlétében azonban a 2 vagy 4 E2 kötő hellyel rendelkező DNS próbákkal kötődést mutatott a 36OS mutáns polipeptid. Az A gél mintái a következők voltak: „IP”, egy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba hozzáadott fehérje nélkül; „1 A, egy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba 360S mutáns polipeptid jelenlétében; „IB”, egy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba natív E2 represszor jelenlétében; „2P”, két E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba hozzáadott fehérje nélkül; „2A”, két E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba 360S mutáns polipeptid jelenlétében; „2B”, két E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba natív E2 represszor jelenlétében; „4P”, négy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba hozzáadott fehérje nélkül; „4A”, négy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba 360S mutáns polipeptid jelenlétében; „4B”, négy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba natív E2 represszor jelenlétében. A B gél mintái a következők voltak: „IP”, egy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba hozzáadott fehérje nélkül; „IA, egy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba 360S mutáns polipeptid és monoklonális antitest jelenlétében; „IB”, egy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba natív E2 represszor és monoklonális antitest jelenlétében; „2P”, két E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba hozzáadott fehérje nélkül; „2A”, két E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba 360S mutáns polipeptid és monoklonális antitest jelenlétében; „2B”, két E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba natív E2 represszor és monoklonális antitest jelenlétében; „4P”, négy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba hozzáadott fehérje nélkül; „4A”, négy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba 360S mutáns polipeptid és monoklonális antitest jelenlétében; „4B”, négy E2 kötő helyet tartalmazó DNS próba natív E2 represszor és monoklonális antitest jelenlétében.

Az E2 transzaktivációt elvesztett mutánsok kezdeti screenelése során azt tapasztaltuk, hogy amíg a 360S mutáns képtelen volt aktiválni az egy vagy két E2 kötő hellyel rendelkező promótereket, a négy E2 kötő helyet magában foglaló meghatározásoknál a transzaktiváció körülbelül 40%-a volt a natív E2 fehérjével végzett kontrollnak. A DNS-kötő meghatározásoknál az egy vagy két E2 kötő hellyel rendelkező DNS próbákkal a 360S mutáns polipeptid gyakorlatilag nem mutatott DNS-kötő aktivitást, viszont a négy E2 kötő hellyel rendelkező DNS próbával végzett meghatározásoknál a 360S hozzákötött egy kis frakcióhoz, a DNS próbáknak körülbelül 1%-ához. Ez azt bizonyította, hogy a 360S mutációnál maradhatott egy kevés dimerizációs aktivitás.

A 360S mutáns polipeptid dimerizációs hibáját egy olyan monoklonális antitesttel pótoltuk, amely az antitest két „karjával” két 36OS monomert tart szoros közelségben egymással, dimerizációt szimulálva. B202 monoklonális antitestet (Mab), amelynek epitópja közvetlenül a DNS-kötő doméntől upstream helyezkedik el, vagy Mab B201-et, amelynek epitópja távolabb, upstream az E2 fehérje 160-220 aminosavjai között található, tartalmazott a 360S polipeptiddel és a DNSsel együtt a próba. Míg monoklonális antitesteket részesítünk előnyben, hagyományos technikákkal készített poliklonális antitestek is alkalmazhatók a supershift elemzésekben. Mab 202 jelenléte gyakorlatilag teljesen visszaállította a 360 S polipeptid kötődését a két vagy négy E2 kötő hellyel rendelkező DNS próbához. Mab 202 nem állította vissza a 360S kötődését az olyan próbákhoz, amelyek csak egy E2 kötő helyet tartalmaztak (4. ábra). Mab 201 csak 5-10%-ban volt hatásos a 36OS mutáns polipeptid E2 kötő helyekhez való kötődésének visszaállításában (adatot nem mutatunk). Ez előre sejthető volt, mivel a Mab 201 epitópja messzebb volt az E2 dimerizációs régiót tartalmazó E2 DNS-kötő doméntől, mint a Mab 202 esetében. Ennélfogva azt vártuk, hogy a Mab 201 kevésbé lesz hatásos a 360S dimerizációs régióinak összetartásában, mint a Mab 202. Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a visszanyert DNS-hez kötődő monoklonális antitest a 360S polipeptid konformációjának megváltoztatásával kötődjön, super-shift elemzéseket végeztünk a 360S polipeptiden normál dimer B2O2 antitestekkel, amelyek két E2 polipeptidet (vagy homológot ) kötnek, és monomer B2O2 antitest fragmentumokkal, amelyek csak egy E2 polipeptidhez kötődnek, és ilyenformán

HU 211 629 A9 jutottunk eredményhez az E2 dimerek szimulálásában. Míg a normál dimer Mab 202 lehetővé tette a 360S DNS-hez való kötődését, a Mab 202 monomer formája nem állította helyre a 360S kötődését a DNS-hez gél shift DNS-kötő meghatározásoknál. Elkülönített kontrollok megerősítették, hogy a Mab 202 monomer formája hozzákötődött az E2 polipeptidekhez. Ezek az adatok erősen alátámasztják azt a feltételezésünket, hogy az E2 monomerek nem tudnak hozzákötődni az E2 DNS-kötő helyekhez.

Mivel az E2 kötő dómén nem mutat elsődleges szekvencia homológiát egyik ismert transzkripciós faktorral sem, az E2-nek a DNS kötési kölcsönhatásért felelős aminosavjai („DNA contact subdomain” = DNS-sel kölcsönhatásba lépő szubdomén) a jelen találmányt megelőzően ismeretlenek voltak.

A jelen találmány négy mutáns polipeptidjét, a 333V, 337L, 339M és 344L jelűeket az E2 fehérje 333-344. helyzetű, 12 aminosavat átfogó részéből izoláltuk. amely ennek a fehérjének egy nagyon állandó régiója minden papillomavírusnál. Mindegyiket fehér telepként izoláltuk a kezdeti screenelésnél (2. példa). Egyik sem tudta stabilan kötni az E2 DNS elemet a gél shift meghatározásnál. A 333. helyzetű glicin kicserélése val inra szintén megakadályozta dimer képződését (lásd az 5. példát), de mivel a többi mutáció (337L, 339M. 344L) előzőleg képződött dimerek formájában létezett, arra következtettünk, hogy ez a régió felelős a DNS kölcsönhatásokért. Ez a három utóbbi mutáció megváltoztatta a glutamin, lizin, és arginin pozitív töltésű aminosavakat, amelyekről ismert, hogy fehérje nukleinsav kölcsönhatásokban vesznek részt. A 333V transzkripciósán is különbözőnek tűnt más, dimerizációs képességben hibás mutánsoktól (alábbiakban leírva), amelyek négy E2 kötő hellyel rendelkező DNS-sel aktivitást mutattak, míg a 333V nem. A glicin nagymértékű állandósága ezen a helyen arra enged következtetni, hogy az E2 fehérje C terminális részének megfelelő harmadlagos hajtogatottságában kritikus szerepe van.

A natív E2 polipeptid 333-344. aminosav régiója aminosav-szekvenciájának összehasonlítása más transzkripciós faktorok DNS-kötő doménjével, nem tárt fel hasonlóságokat a DNS-kötő domének következő sajátságaiban: helix-turn-helix, helix-loop-helix, homeodomén, β-sheet vagy zinc finger classes. Az E2 polipeptidnek ez a régiója néhány bázikus aminosavat tartalmaz és nincsenek benne savas aminosav maradékok, azonkívül még gyakorlatilag nem hordoz elsődleges szekvencia homnológiát a transzkripciós faktorok jun/fos családjának alap régiójával, amelyről megmutattuk, hogy szükséges azok DNS-kötő képességéhez. Ezekhez hasonlóan azonban ez az E2 dómén is tartalmaz egy központi ciszteint (340. aminosav).

A 340R, 340Y és 340 F E2 mutációk, amelyekben a 340. ciszteint argininnel, tirozinnal vagy fenil-alaninnal cseréltük ki, összehasonlítható tulajdonságokkal rendelkeztek az ebben a régióban kémiai mutagenezissel és fenotípusos szelekcióval izolált mutációkkal. Ezek nem transzaktiválták az egy, kettő vagy négy E2 elemmel rendelkező E2 függő promótert, és hasonlóan hibásnak bizonyultak a DNS kötésben gél shift elemzésnél (3. ábra). Ezek a cisztein mutánsok képesek voltak dimerizálódni (lásd az 5. példát). Ezek az adatok azt sugallják, hogy a 340. cisztein helyettesítése terjedelmes aminosavakkal nem fehéije-fehérje kölcsönhatások gálása révén, hanem a DNS-sel kapcsolatban álló szubdomén destabilizálásával blokkolta a DNS kölcsönhatásokat.

5. példa ín vitro dimerizáció meghatározása

Annak meghatározására, hogy mely mutáns E2 polipeptidek tartották meg dimer képző képességüket, dimer E2 fehérjék alegységeit kötöttük kovalensen standard cross-linking reakciókkal. A reakció körülményeit úgy állítottuk be, hogy a kovalens kötés az előzőleg már létezett dimerek alegységei között könnyen létrejöjjön, míg minimális legyen a kovalens kötés a monomerek között. A cross-linking reakciót követően, a nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) standard technikáját - amely a fehérjéket nagyságuk alapján választja szét - alkalmaztuk annak meghatározására, hogy mely E2 mutációk eredményeztek dimereket képező polipeptideket. A vad típusú E2 fehérje DNS távollétében dimerizálódik.

A cross-linking reakciókban való felhasználásra E2 homológok durva kivonatát készítettük el élesztő kiónok tenyészeteiből (a 3. példában leírtak szerint, lásd fent). Ezután a fenti élesztő durva kivonatából vett mintákat 30 percig 1 cm távolságban ultraviola fénynek (354 nm) kitéve, létrehoztuk a keresztkötéseket.

A cross-linking reakciókat követően a fehérje mintákat SDS 3%-os, β-merkapo-etanol 5%-os végső koncentrációban történő hozzáadásával készítettük elő az SDS poliakrilamid gélelektroforézishez. Ezután felmelegítettük és körülbelül 3 percig 65 °C-on tartottuk a mintákat. A fehérjék beoldására 9%-os poliakrilamid gélt használtunk. Az elektroforézist követően a feloldott fehérjéket nitrocellulóz lapokra vittük fel standard elektroblot technika alkalmazásával. Ezután az E2 mutáns monomereket és a keresztkötéses dimereket (körülbelül 50 kDalton és körülbelül 100 kDalton) immunobiot technikával, a BPV1 E2 fehérje elleni poliklonális antiszérum felhasználásával mutattuk ki.

Ezeknek az elemzéseknek az eredményeit a 2. ábrán tesszük közzé. Amint azt az ábra mutatja, a dimerizációt meghiúsító mutációkat az E2 fehérje 360. aminosav pozíciójától legalább a 402-ig terveztük, lehetőség szerint kiterjesztve a dimerizációs régióval majdnem a polipeptid végéig (azaz a 410. aminosavig). A 360S mutáció volt az egyedüli egyes aminosav csere, amely minden dimerizációs aktivitász eltüntetett. A 360S mutáció érdekes módon megváltoztatott egy, a papillomavírusok között nagyon állandó triptofán maradékot. A 360S mutációt hasznosító élesztő és baktérium expressziós vektorok UV cross-linking analízise megmutatta, hogy ez a triptofán pontmutáns képtelen dimerek képzésére. A 36OS mutáns nagyon gyenge represszor, erősen alátámasztva azt a feltételezésünket,

HU 211 629 A9 hogy a dimerizációs funkció szükséges a papillomavírus transzaktivációjának és a vírusreplikációnak a visszaszorításához. A dimerizációs képességben hibás mutánsok 3SLI és 402* hasonlóan intakt DNS-kötő doménekkel rendelkeztek mint a 360S mutáns, a 3SLI és (kisebb mértékben) 402* super-shift elemzésnél kötődni tudtak a DNS-hez és sáv-eltolódást eredményeztek olyan monoklonális antitest jelenlétében, amely felismeri az E2 fehérje DNS-kötő doménjét (lásd a 4. példát). Feltételezzük, hogy ezt a super-shift aktivitást az antitest által összetartott E2 mutáns polipeptidek eredményezik szimulált dimerként. Olyan mutánsok, mint a 402*, amelyek kis inszerciókkal vagy deléciókkal rendelkeznek, esetleg a fehérje hajtogatottságban meglevő terjedelmes perturbációk következtében nem dimerizálódnak. Ezért nem világos, vajon e mutáció területe közvetlenül részt vesz-e a dimerizációban.

E2 dimerizációs funkció

Részben már jellemeztünk egy korábban publikált [EMBO J. 6, 145-152 (1987)] E2 mutánst 3812i-t (itt 402* jelölve), amely DNS kötésben hibás és élesztő transzaktivációs meghatározási rendszerünkben inaktív még négy E2 kötő hely esetében is. A 402* mutáns 4 aminosav in-frame inszercióját tartalmazza a 402. helyzetben. E mutáns biokémiájának analízise kimutatta, hogy in vitro nem dimerizálódik és nem kötődik DNS E2 kötő helyeihez DNS-kötő (gél shift) meghatározásnál. 402’ azonban kiegészíthető a DNS kötéshez egy políklonális anti-E2 szérummal super-shift elemzésnél. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az E2 fehérje dimerizációs régiója az E2 fehérje 360—402. aminosavjai által határolt terület maga, vagy befolyásolja azt.

Az E2 fehérje dimerizációs régiójában bekövetkezett más mutációkat világoskék telepekként izoláltunk kezdeti screenelésünk során. A 3SL1 és 366Y/376L mutánsok közepes transzaktivációs aktivitást mutattak, a 3991 mutáns egy C terminális metionint izoleucinre változtatott és ez kissé csökkentette az E2 függő promóterek aktiválásának képességét. A386W mutáns egy nagyon állandó arginint helyettesített triptofánnal és szintén részlegesen bizonyult hibásnak a promóter aktiválásban. Ezeknek a csökkent aktivációjú mutánsoknak a biokémiai tulajdonságait szemlélteti a DNS-kötő aktivitás gél shift elemzésnél (4. példa) és az in vitro képződött dimerek. A repressziós vizsgálatoknál a 386W és 3991 mutáns fehérjék hatásos represszorok voltak (lásd a 6. példát). Ezek a fehérjék dimerizálódtak és hozzákötődtek a DNS-hez. A 3SLI mutáns fehérje csökkent mértékű transzaktivációs repressziót mutatott. A biokémiai vizsgálatok azt mutatták, hogy csökkent dimerizációs képességgel rendelkezik, de nem annyira hibás, mint a 360S mutáns fehérje. A 408* és 411' mutációk az E2 fehérje 3’ végét érintették. Miközben az E2-nek ez a szegmense nem nagyon állandó a papillomavírusok körében, a 402. helyre történő négy aminosav inszerciója révén bekövetkező dimerizációs aktivitás elvesztése megmutatta, hogy ez a régió szükséges a dimerizációhoz. Mindazonáltal mind a 408csillag, amely az utolsó 3 aminosavat változtatta meg és még hozzáadott 8 aminosav maradékot, mind a 411*, amely a transzlációs stop kódont leucin kódonnal helyettesítette egy külön 22 C terminális aminosav maradékot eredményezve, nagyrészt megtartotta transzaktivációs funkcióját. A 402* mutáns polipeptid hibás dimerizációjának megfelelően nem volt képes visszaszorítani az E2 transzaktivációt. Mind a 408* és 411* mutáns polipeptidek képesek kötődni a DNS-hez és dimerizálódni az E. coli expressziós gazdasejtből tisztított 126 aminosavas formában. 408’ gyenge represszor volt, 411 csillag viszont nem fejtett ki repressziót. Nem világos, hogy a 411* mutáns miért nem szorítja vissza az E2 transzaktivációt, de feltételezzük, hogy csökkent képességgel rendelkezhet a teljes hosszúságú E2 fehérjékkel való heterodimer képzésben, a karboxil végéhez kapcsolódott 22 aminosavból álló fúziós peptid következtében.

Ezek a genetikai és biokémiai analízisek arra engednek következtetni, hogy az E2 fehérjének az a része, amely közvetlen kölcsönhatásba lép a DNS-sel, körülbelül a 333 és 344 aminosavak között helyezkedik el és a dimerizációs aktivitást egy olyan komplex dómén kódolja, amely a körülbelül 360 és 402 aminosavak közé eső szegmens! fogja át. Ennek megfelelően feltételezzük, hogy az E2 fehérjék DNS-kötő felismerése és dimerizációs funkciói elválnak egymástól és két új elem közvetíti azokat. Egy rövid alaprégió - valószínűleg nem helikális - szükséges a DNS kötéshez a dimerizációhoz viszont nem. Míg ebben az elemben egy állandó központi ciszteinre nincs szükség, ez egy kritikus helyet képvisel az E2 fehérje DNS-kötő kapacitásának módosításában, mivel a cisztein helyettesítése nagy kiterjedésű aminosavakkal hatásosan szünteti meg a DNS kötést. A dimerizációs elem egy kritikus triptofánt foglal magában a BPV-1 E2 polipeptiden a 360. helyzetben.

Meg kell jegyezni, hogy egy mutáns minden olyan esetben elveszítette DNS-kötő képességét, amelyekben dimerizációs képessége megszűnt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a dimerizáció előfeltétele a DNS kötésnek. Néhány mutáns génterméknek azonban, amelyik elvesztette DNS-kötő képességét, megmaradt a dimerizációs képessége. Azokban a mutáns géntermékekben, amelyek a jelen találmány szerinti E2 transzaktivációs represszorok új osztályát képviselik, a dimerizációs funkciót elválasztottuk a DNS-kötő funkciótól. A 337L, 339M, 340F, 340R, 340Y és 344L ebbe a csoportba tartozik. Ezeket a mutánsokat, amelyek anélkül dimerizáltak, hogy kapcsolódtak volna az E2 DNS-kötő helyekhez, tovább teszteltük E2 függő transzaktivációt visszaszorító kapacitásukra nézve tenyésztett állati sejtekben.

6. példa

E2 függő transzaktiváció visszaszorítása tenyésztett állati sejtekben

A következőkben meghatároztuk az olyan E2 mutánsok E2 függő transzaktivációt visszaszorító képességét tenyésztett emlős sejtekben, amelyek anélkül dimerizál14

HU 211 629 A9 tak, hogy az E2 DNS-kötő helyekhez kapcsolódtak volna. Ebben a meghatározásban egy E2 függő riporter plazmidot (vagy a klóramfenikol-acetiltranszferázt (CAT) kódoló génnel vagy a humán növekedési hormon (hGH=human growth hormoné) génjével jellemezve, amelyet három upstream E2 kötő helyet tartalmazó csonkolt SV40 promóter segítségével vezettünk be), a teljes hosszúságú vad típusú E2 transzaktivációs fehérjét az aktin promóter bevezetésével és a mutáns kiónt egy, a BPV 3089. nukleotidjánál (azaz a 160. aminosavnál) kezdődő E2 represszor formában szintén az aktin promóter bevezetésével, egyszeme vittük be tenyésztett egér embrió fibroplaszt sejtekbe jól felszerelt elektroporációs technikával. Az E2 represszor meghatározást a telítési szint alatti E2 transzaktivátor mennyiségnél végeztük, mivel az E2nek nagy mennyiségei represszálják az átírást, talán elnyomás („squelching”) által. A legnagyobb E2 indukciókat eredményező transzfekciók adták a legjobb E2 repressziót (lásd a II. táblázatot, lentebb) és reprodukálhatóságot is.

A riporter plazmidot úgy állítottuk össze, hogy a riporter gén kifejeződése nagyban függött az E2 transzaktivációtól (azaz magában foglalt egy, kettő vagy négy E2 DNS-kötő helyet a promóterhez és a riporter gén kódoló szekvenciájához képest megfelelően elhelyezve). A riporter gén kiválasztása elsősorban kényelmi szempontok szerint történik. Általában bármely olyan gén használható riporter génként, amelyiknek a kifejeződése közvetlenül vagy közvetetten olyan terméket eredményez, amely ésszerű pontossággal és megbízhatósággal mérhető. A jelen találmány szerint előnyben részesített riporter gének az E2 transzaktivációnak tenyésztett emlős sejtekben történő meghatározására, a hGH-t és CAT-t kódoló gének.

A pXB332hGH jelű hGH riporter plazmidot két lépésben állítottuk elő (5. és 6. ábrák). Először összeállítottuk a pXB332 plazmidot: a pC515-9 E2-függő riporter plazmidból [EMBO J. 7, 525-531 (1988)] származó E2-függő promótert (Sall-HindlII fragmentum) inszertáltuk a pXBlOO plazmid vektorba (lásd az 5. és

7. ábrát), amelyet előzőleg Xhol és HindlII restrikciós enzimekkel hasítottunk. Ezután a pOGH-ból HindlIIEcoRl fragmentumként kivágott hGH gént (Nichols Institute, San Juan Capistrano, Calif.) inszertáltuk a pXB332 plazmidba, amelyet előzőleg HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítottunk, így jött létre a pXB332hGH (6. ábra). A CAT riporter plazmidot a publikált módszer szerint állítottuk össze [EMBO J. 7, 525-532(1988)].

Az E2 transzaktivátor plazmid vektor magában foglalt egy teljes hosszúságú natív BPV1 E2 gént a pCO-E2 plazmidból, [EMBO J. 7, 525-531 (1988)] hatásosan hozzákötve kontroll szekvenciákhoz, amelyek nélkülözhetetlenül fontossá tették annak kifejeződését. így tehát az E2 transzaktivátor plazmid irányította az E2 fehérje szintézisét a riporter gén transzaktivációjához. Annak érdekében. hogy megbizonyosodjunk, represszor hatásokat észleltünk, a teljes hosszúságú E2 gén kifejeződését kontrolláló promóter nem volt olyan aktív, hogy telítési mennyiségben állítsa elő a teljes hosszúságú E2 fehérjét a represszor elemzési rendszer transzfekciós emlős sejtjeiben. Ha az E2 transzaktivátor gén túlzott mértékben fejeződik ki, a repressziós adatok megbízhatatlanok. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási formájában egy csirke β-aktin promótert alkalmazunk az E2 transzaktivátor gén kifejezésére.

A natív E2-t kódoló szekvenciákat és mutáns E2 -t kódoló szekvenciákat csirke β-aktin promóterrel fejeztük ki [Nucl. Acids Rés. 11, 8287-8301 (1983)]; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 2980-2984 (1984)] állati sejtekben pXBlOl vektor felhasználásával (lásd 7. ábra).

A PXBlOl plazmidot kétlépcsős eljárással állítottuk össze (7. ábra). Két oligonukleotidot szintetizáltunk és hajlítottunk polilinker képzésére:

5' GATCCTTTGCCGCCAC 3' (18. számú szekvencia)

5' GAAACGGCGGTGGTAC 3' (19. számú szekvencia)

Ez a polilinker Xhol, Hindin és BamHI belső restrikciós helyeket tartalmazott egy Aatn kompatíbilis függelékkel az 5’ végén és egy EcoRI kompatíbilis véggel a 3’ végen. Ezután AatlI és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítottuk a pBG312 plazmidot [Cell 45, 685-698 (1986)], szabaddá téve egy, a pBG312 plazmid Ad-2 promóterét tartalmazó fragmentumot. Apolilinkert a hasított pBG312-be az Ad-2 promóter helyére inszertáltuk, hogy előállítsuk a pXB 100 promóter mentes vektort. Ezután a pXBlOO plazmidot Xhol és BamHI enzimekkel hasítottuk (kihasználva a polilinker helyeket) és inszertáltuk a ρβΑο(-1-ből [Nucl. Acids Rés. 11, 8287-8301 (1983)] a csirke β-aktin promótert egy 280 bp XhoI-BamHI fragmentumként, hogy pXBlÖlet kapjunk. A natív teljes hosszúságú E2 fehérje kifejezésére a pCO-E2 plazmidból [EMBO J. 7, 525-531 (1988)] egy 1966 bp BamHI fragmentumot inszertáltunk a pXBlOl BamHI helyére, így kaptuk a pXB323 plazmidot (8. ábra).

A natív E2 fehérje C terminálisának 249 aminosavját tartalmazó polipeptid nem rendelkezik transzaktivációs kapacitással és képes visszaszorítani a natív teljes hosszúságú E2 fehérjével történő transzaktivációt [Cell 50, 69-78 (1987)]. A natív BPV1-E2 represszor kifejezésére a pXB323 plazmid 1362 bp NcoI-BamHI fragmentumát (a BPV1-E2 fehérje C terminálisának 249 aminosavját kódolja és metionninnal indul az Ncol helynél) inszertáltuk a pXBlOl BamHI helyére, hogy megkapjuk a pXB314 plazmidot (9. ábra). Szintetikus oligonukleotidokat is inszertáltunk, hogy összeilleszszük az 1362 bp fragmetum Ncol tapadós végét a pXBlOl BamHI tapadós végével. Ezeket a szintetikus oligonukleotidokat mutatjuk az alábbiakban:

5' GATCCTTTGCCGCCAC 3' (20. számú szekvencia)

3’ GAAACGGCGGTGGTAC 5’ (21. számú szekvencia)

Az E2 homológok E2 transzaktivációt visszaszorító kapacitásának tesztelésére az E2 DNS-kötő dómén mutáns formáit (a 2. és 3. példákban fent leírt fenotípusos screenelés során kiválasztott klónokból) KpnI-BstXl fragmentumokként inszertáltuk a KpnI-BstXl enzi15

HU 211 629 A9 mekkel hasított pXB314 plazmidba (lásd a 10. ábrát). Ezen az úton cseréltük ki a natív E2 polipeptid C terminálisának 249 aminosavjából álló polipeptid C terminális 126 amonosavját a megfelelő mutáns szekvenciákkal, létrehozva a meghatározott mutáns E2 represszor plazmidok mindegyikét, beleértve a pEC337L, pEC339M, pEC340F, pEC340R, pEC340Y és pEC344L plazmídokat.

Minden transzfekciót és meghatározást az E2 transzaktivátor telítési szint alatti mennyiségeivel végeztünk el. Ezt a fehérje kifejeződését vezérlő, mérsékelten gyenge aktin promóter alkalmazásával oldottuk meg. Ha másképpen nem jelezzük, minden lépést szobahőmérsékleten végeztünk.

A transzfekciókat a Balb/c3T3 egér embrió fibroblaszt sejtvonal A31 klónjával [Cell Physiol. 72, 141-148 (1968)] hajtottuk végre, amelyet az amerikai törzsgyűjteményből ATCC CCL163 nyilvántartási számon (ATCC = American Type Culture Collection) szereztünk be. A 3T3 sejtkultúra táptalaja BulBecco’s minimál táptalaj volt (Gibco, Grand Island, N.Y.), 10% donor borjúszérummal (Hazelton, Lenexa, Kans.) és 4mM glutaminnal (Whittaker. Walkersville, Md.) kiegészítve. A 3T3 sejtkultúrát 37 °C-os inkubátorban, 5,5% CO₂ atmoszférában tartottuk fenn. A sejteket 100 mm-es tenyésztő csészékben (Corning. Corning, N.Y., cat.no. 25020) szaporítottuk. A sejteket foszfát pufferes sóoldattal (Gibco) mosva és tripszinnel (Gibco) kezelve (a tenyésztő edényre tapadt sejtek eltávolítása céljából), majd friss tápközeg hozzáadásával és a tenyészet hígításával vittük át friss táptalajt tartalmazó edényekbe.

Tranziens elektroporációt végeztünk a mutánsok repressziós aktivitásának mérésére. Kereskedelemben kapható elektroporációs készüléket (Gene Pulser, BioRad. Richmond. Calif.) használtunk és a Chu és munkatársai szerinti módszerhez [Nucl. Acids Rés. 75, 1311-1326 (1987)] hasonló elektroporációs technikát alkalmaztunk a plazmidoknak a 3T3 sejtekbe történő bevitelére. Mindegyik elektroporációnál 400 pg DNS-t használtunk fel. Ebből a 400 pg DNS-ből 20 mng riporter plazmid. 20 pg transzakti vátor plazmid és 80 pg represszor plazmid volt. A maradék hering sperma DNS-ből (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) állt, amelyet ultrahanggal körülbelül 300-2000 bp méretű fragmentumokra tördeltünk szét. A DNS oldatához (0,4 ml) NaCl-ot adtunk összesen 0,1 M koncentrációban és ezután 2.5 térfogatnyi etanollal kicsaptuk a DNS-t. A kicsapott DNS-t Eppendorf centrifugában pelletáltuk, szövetkultúrával fedetten levegőn szárítottuk, majd reszuszpendáltuk a DNS-t 20 mM hepes (pH 7,05), 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0,7 mM Na₂HPO₄ és 6 mM dextróz („1 x HeBS”) 0,8 ml-ében. A DNS-t körülbelül 3-24 órán keresztül hagytuk reszuszpendálódni az 1 x HeBs elegyben.

Minden elektroporációhoz körülbelül 5 x ΙΟ⁶ 3T3 sejtet (amelyeket az előző napon vittünk át vagy töltöttünk fel) vettunk el a tenyésztő edényből tripszinnel kezelve és Damon/IEC HN-SII rotorral (körülbelül 250 x

g) felszerelt centrifugában 1000 rpm-nél 4 percig pelletáltuk a sejteket. Miután a pelletált sejtek fölül leszívással eltávolítottuk a tápoldatot, a sejteket a DNS plusz lx HeBS keverékében (lásd fent) szuszpendáltuk. Ezután a DNS-t és a sejteket tartalmazó oldatot egy elektroporációs küvettába vittük át. Azonnal kisütöttünk egy 960 pFos kondenzátort, ami 240 V-ot adott körülbelül 10 msecig. A sejteket 8 percig a küvettában hagytuk, majd egy 10 ml tápoldatot tartalmazó teszt csőbe vittük át azokat és a fentiek szerint pelletáltuk. Ezután leszívtuk a tápoldatot, majd a sejteket 10 ml tápoldatban reszuszpendáltuk, szélesztettük azokat egy 10 cm-es lemezre és a lemezt visszatettük sejttenyésztő inkubátorba.

Amikor hGH-t alkalmaztunk riporter génként, 4872 óra elteltéve kinyertük a tápoldatot a kiválasztott hGH meghatározására. Másik esetben, amikor CAT riporter gént alkalmaztunk, 48-72 óra elteltével kinyertük az elektroporáción átesett sejteket. A sejtszámkontrollt hGH elemzés alkalmazásánál a sejtek megszámlálásával, CAT elemzés alkalmazásánál pedig az extraktumok összes fehérje mennyiségének mérésével valósítottuk meg.

A riporter gén kifejeződésének mennyiségi meghatározására hGH elemzést végeztünk Selden módszere szerint [Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, N.Y. 9.7.1-9.7.2 (1987)]. A hGH elemzésekhez kereskedelemben kapható kit-et (Allegro Humán Growth Hormoné transient gene expression system kit, Nichols Institute, San Juan Capistrano, Calif.) használtunk A CAT elemzéseket Gorman és munkatársainak módszere [Mól. Cell Bioi. 2, 1044-1051 (1982)] szerint hajtottuk végre. Pozitív és negatív kontrollokat alkalmaztunk az adott esetnek megfelelően. Ilyen kontrollok magukban foglalták egy riporter plazmid transzfekcióját transzakti vátor plazmid nélkül (riporter háttér), egy riporter plazmid transzfekcióját transzakti vátor plazmid jelenlétében transzaktivációs represszor plazmid nélkül (nem represszált transzaktiváció) és egy riporter plazmid transzfekcióját transzaktivátor plazmid és BPV1 E2 natív represszort kifejező plazmid (azaz a natív E2 polipeptid C terminális 249 aminosavja) jelenlétében.

Az E2 homológok értékelésénél a riporter gén háttérszinthez, az E2 indukciós szinthez és a BPV E2 natív represszor kiváltotta represszióhoz képest mért adatokat használtuk fel. A riporter gén háttér aktivitást úgy vettük számításba, mint E2 transzaktivátor fehérje jelenléte nélküli riporter aktivitást. Az E2 indukciós szintet úgy számítottuk ki, hogy az E2 transzaktivátor fehérje jelenlétében mért riporter aktivitást elosztottuk a riporter háttér aktivitással. A repressziót a következő képlet segítségével számítottuk ki:

[(ACT E2-vel)-BKG] - [(ACT E2-vel és REP) - BKG] (ACT E2-vel) - BKG ahol:

ACT, a riporter aktivitás BKG. a háttér riporter aktivitás REP, represszor

HU 211 629 A9

Az I. táblázatban bemutatunk a fenti képlettel számi- aktivitásokat a megfelelő kontrollokkal összehasonlítva tott eredményekre egy példát. Az I. táblázat a represszor kiszámított megfelelő és megbízható átlagokkal illusztrálja.

1. táblázat

Transzfekció	hGH (Vg/ml)	Indukció	Represszió
pXB332hGH (riporter)	0,1	-	-
pXB332hGH +pXB323 (riporter + transzaktivátor)	10,0	100-szoros	-
pXB332hGH + pXB323 + pXB314 (riporter + transzaktivátor + natív represszor)	1,0	10-szeres	90,9%
pXB332hGH + pXB323 + pXB314.360S (riporter + transzaktivátor + homológ represszor)	7,0	70-szeres	30,3%

* Ebben a példában a homológ represszor (36OS) által kiváltott repressziót a natív represszor repressziójának 33%-ában is kifejezhetnénk.

AII. táblázat nyers adatokat és számított értékeket mutat néhány E2 represszor elrendezés esetében, amelyeket a fentiekben leírtak alapján végeztünk el.

A II. táblázatban CPM a minta percenkénti radiokta- 20 vitás számát jelenti;; CPM-BKGD a minta percenkénti radioaktivitás számából levonva a háttér sugárzás percenkénti számértékét; represszió %. a mutánsra a fenti képlettel kiszámolt represszió értékének százszorosa; natív represszió %-a, a mutáns esetében kapott represszió % osztva a natív represszor esetében a fenti képlettel kapott értékkel; C a hGH vagy CAT riporter plazmidot jelenti; 323 a PXB323 transzaktivátor plazmid; 314 a pXB314 natív represszor plazmid: és a nagybetűvel vagy csillaggal jelölt számok a tesztelt mutáns polipeptid-szekvenciákat jelentik (lásd a 2. ábrát).

II. táblázat

E2 represszió elemzések

Minta	CPM	CPM-BKGD	represszió %	a natív represszió %-ában
CAT elemzés 43
C	234	-	-	-
C+323	3278	3044	-	-
C+314+323	378	144	95,3	-
C+340S+323	572,5	338,5	88,9	93,3
CAT elemzés 44
C	161,5	-	-	-
C+323	9751	9589,5	-	-
C+314+323	509,5	348	96,4	-
C+337L+323	969,5	808	91,6	95,0
C+340R+323	538	376,5	96,1	99,7
C+360S+323	9096	8934,5	6,8	7,1
C+402*+323	5868,5	5707	40,5	42,0
CAT elemzés 45
C	292	-	-	-
C+323	5914	5622	-	-
C+314+323	398	106	98,1	-
C+339M+323	1738	1446	74,3	75,7
C+344L+323	579	287	94,9	96,7
C+360S+323	2656	2364	57,9	59,1
C+402*+323	3102	2810	50,0	51,0
CAT elemzés 46
C	122,5	-	-	-
C+323	2867	2744,5	-	-
C+314+323	218	95,5	96,5	-
C+337L+323	418,5	296	89,2	92,4

HU 211 629 A9

Minta	CPM	CPM-BKGD	represszió %	a natív represszió %-ában
C+339M+323	725,5	603	78,0	80,9
C+37OI+323	313,5	191	93,0	96,4
C+3SL1+323	1800	1677,5	38,9	40,3
C+3991+323	456	333,5	87,8	91,0
C+366Y/376L+323	2705,5	2583	5,9	6,1
CAT elemzés 4EP6
C	377	-	-	-
C+323	3906	3529	-	-
C+314+323	1053	676	80,8	-
C+316Y+323	3607	3230	8,5	10,5
C+340Y+323	756	379	89,3	110,5
C+344L+323	1429	1052	70,2	86,9
C+37OI+323	3214	2837	19,6	24,3
C+3SLI+323	2524	2147	39,2	48,5
hGH elemzés 42
^C	160	-	-	-
C+323	9937	9777	-	-
C+314+323	415	255	97,4	-
C+337L+323	862	702	92,8	95,3
C+34OR+323	452	292	97,0	99,6
C+344L+323	1680	1520	84,4	86,7
C+36OS+323	7925	7765	20,6	21,1
C+370I+323	8175	8015	18,0	18,5
hGH elemzés 43
C	303	-	-	-
C+323	14 552	14218	-
C+314+323	2237	1934	86,4	-
C+317STOP+323	12 830	12 527	11,9	13,8
C+333V+323	19 853	19 550	0	0
C+339M+323	16891	16 588	0	0
C+340F+323	2629	2326	83,6	96,8
hGH elemzés 45	-1
C	239	-	-	-
C+323	2455	2216	-	-
C+314+323	473	234	89,4	-
C+316Y+323	2287	2048	7,6	8,5
C+333V+323	4275	4036	0	0
C+340G+323	486	247	88,8	99,3
C+408*+323	1219	980	55,8	62,4
C+411*+323	4756	4517	0	0
hGH elemzés 46
C	169	-	-	-
C+323	5207	5038	-	-
C+314+323	282	113	97,8	-
C+340Y+323	289	120	97,6	99.8
C+386W+323	1147	978	80,6	82,4
C+4O8*+323	2024	1855	63,2	64,6
hGH elemzés 47

HU 211 629 A9

Minta	CPM	CPM-BKGD	represszió %	a natív represszió %-ában
C	110	-	-	-
C+323	1692	1582	-	-
C+3701+323	335	225	85,8	?
hGH elemzés #EP5
C	210	-	-	-
C+323	11 207	10 987	-	-
C+314+323	782	572	94,8	-
C+317STOP+323	10 943	10 733	2,4	2,5
C+339M+323	2376	2166	80,3	84,7
C+340F+323	1475	1265	88,5	93,4
C+340G+323	807	597	94,6	99,7
C+340R+323	763	553	95,0	100,2
C+340S+323	1290	1080	90,2	95,1
C+366Y/376L+323	8314	8104	26,3	27,7
C+386W+323	2151	1940	182,3	86,9
C+399I+323	1750	1540	86,0	90,7
C+411L+323	10 206	9996	9,1	9,6

A represszor:transzaktivátor arány = 4:1

A gondolatjel azt jelzi, hogy nem értelmezhető.

A kérdőjel azt jelenti, hogy a natív represszió %-át nem tudtuk kiszámítani, mivel ennél az elemzésnél nem végeztünk kontroll mérést a natív represszor plazmiddal (C+314+323).

A natív represszor négyszeres fölöslegben (tömegre számítva) történő alkalmazásánál a represszió egyik elemzésnél sem volt 80% alatt. A II. táblázatban bemutatott elemzések eredményeinek reprodukálhatósága általában magas volt. A 339M mutáns polipeptid egy elemzésnél egyáltalán nem fejtett ki repressziót, viszont jól represszált három másik elemzésnél. amelynél egy eltérő DNS preparátumot használtunk.

Hl. táblázat

Mutáns	A mutáns E2 represszor aktivitás összefoglalása¹
Represszió % E2 transzaktiváció csökkenés	Represszió a WT represszorral² kapott represszió %-ában	+/-
316Y	8,0	9,5	-
317 STOP	7,1	8,1	-
333V	0³	-	-
337L	90,4	93,7	+
339M	76,2	78,3	+
340F	86,1	95,1	+
340G	91,7	99,5	+
340R	95,6	99,9	+
340S	89,6	94,2	+

Mutáns	A mutáns E2 represszor aktivitás összefoglalása¹
Represszió % E2 transzaktiváció csökkenés	Represszió a WT represszorral² kapott represszió %-ában	+/-
340Y	93,5	105,1	+
344L	82,6	91,8	+
360S	32,3	33,1	-
366Y+376ZL	16,1	16,9	-
3701	66,1	70,9	+
374S/375L/3S 1K3SL1)	39,0	44,4	-
386W	81,4	84,6	+
3991	86,9	90,8	+
402* (4 AA inszertum)	45,2	46,6	-
4O8*(11AA inszertum)	59,5	63,5	+
411*	4,5	4,8	-

Minden énék 2-4 elemzés átlagál jelenti.

Minden mutáns represszon összehasonlítottunk a natív represszorral ugyanannál a meghatározásnál.

0 azt jelenti, hogy az aktiváció kissé erősebb volt ennek a mutánsnak a jelenlétében, mint a kontrolinál, amelynél nem voh jelen represszor.

Minden E2 homológot 2—4-szer teszteltünk E2-függő transzaktivációt visszaszorító képességére nézve emlős sejtekben. A III. táblázatban a transzaktivációs represszió elemzés eredményeinek egy összeállítását mutatjuk be. Arepressziós aktivitást a 2. ábrán is összefoglaltuk. Ezekből a meghatározásokból világossá vált,

HU 211 629 A9 a represszióhoz nem szükséges, hogy az E2 fehérje C terminális része képes legyen a DNS-hez kötődni.

A III. táblázat a repressziós hatásra nézve tesztelt összes mutáns eredményeinek összeállítását mutatja. Önkényesen úgy definiáltuk a represszort, mint azt a fehérjét, amely négyszeres feleslegben legalább 70% repressziót mutatott. A 337L, 340F, 340R, 340Y és 344L mutánsok, melyeknek mindegyike képes volt dimerizálódni, de nem kötődtek a DNS-hez, ugyanolyan alapvetően represszáltak, mint a natív represzszor. A 360S, 3SLI és 402* dimerizációs képességben hibás mutánsok nem represszáltak. A 316Y, 411* és 366Y/376L mutánsok sem represszáltak annak ellenére, hogy in vitro képesek voltak dimerek képzésére. A 316Y mutáns polipeptid azonban nagyon instabilnak mutatkozott, ez azt valószínűsíti, hogy 316Y, 411* és 366Y/376L mutáns polipeptidek esetleg azért nem fejtettek ki repressziót, mivel instabilitásuk folytán nagyon kis koncentrációban voltak jelen a sejtekben.

Tehát úgy tűnik, hogy a DNS kötés nem szükséges az E2 transzaktiváció repressziójához. Ehelyett egy, a DNS-kötő helyekért való versengéstől eltérő mechanizmus működik. Azok a mutánsok, amelyek nem képesek dimerizálódni - vagy amelyek nagyon gyengén teszik ezt - a 317STOP, 333V, 360S, 3SLI és 402* (4 aminosav inszertum), vagy nagyon gyengén vagy egyáltalán nem represszálnak. Feltételezzük, hogy a jelen találmány szerinti represszorok heterodimereket képeznek a teljes hosszúságú E2 fehérjével és ezáltal egy inaktív formába zárják azt.

A jelent találmány szerinti eljárással készített mikroorganizmusokból és rekombináns DNS molekulákból hiteles példányokat helyeztünk letétbe az In Vitro International Inc. törzsgyűjteményében (Linthicum, Md.) 1991. január 18-án, a következő jelölésekkel ellátva:

314: E. coli DH5/pXB314

337L: E. coli DH5/pXB337L

339M: E. coli DH5/pXB339M

340F: E. coli DH5/pXB340F

340R: E. coli DH5/pXB340R

340Y: E. coli DH5/pXB340Y

344L: E. coli DH5/pXB344L

Ezek a kultúrák rendre a IVI 10262, IVI 10263, IVI

10264, IVI 10265, IVI 10266, IVI 10267 és IVI 10268 nyilvántartási számokat kapták.

1991. június 20-án a letétbe helyezett azonosított kultúrákat az In Vitro International, Inc.-ból az amerikai törzsgyűjteménybe (American Type Culture Colection = ATCC) vittük át (Rockville, Md.). Az alábbi listán minden IVI nyilvántartási számnak feltüntetjük az ATCC megfelelőjét:

IVI 10 262 IVI 10 263 IVI 10 264 IVI 10 265 IVI 10 266 IVI 10 267 IVI 10 268

ATCC 68 734 ATCC 68 735 ATCC 68 736 ATCC 68 737 ATCC 68 738 ATCC 68 739 ATCC 68 740

Mialatt az előzőekben a jelen találmánynak számos megvalósítási formáját írtuk le, nyilvánvaló, hogy alap konstrukcióink változtathatók olyan megvalósítási formákat nyújtva, amelyek a jelen találmány eljárásait és termékeit hasznosítják. Ezért méltányolni fogják, hogy a jelen találmány hatóterületét inkább a hozzácsatolt igénypontokban definiáltuk, mint a példákban előzőekben bemutatott specifikus megvalósítási formákkal.

A következő „Szekvencia listá”-ban a leírásban hivatkozásként szereplő számozott szekvenciákról nukleotid-szekvencia és aminosav-szekvencia információt szolgáltattunk. Itt kell megjegyezni, hogy a páros számú (2„ 4., 6., 8., 10., 12., 14. és 16.) aminosav-szekvenciák megfelelnek egyenként a páratlan számú (1., 3.. 5.. 7., 9., 11., 13. és 15.) nukleotid-szekvenciáknak.

SZEKVENCIALISTA

1. számú szekvenciavázlat 35 A szekvencia hossza: 381 bázispár

A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: duplaszálú Topológia: lineáris

A molekula típusa: DNS (genomiális)

Hipotetikus: nem

Antiszenz: nem

Eredete: szarvasmarha papillomavírus 1. típus Név/kulcs: CDS Helyzet: 1..378

Az 1. számú szekvencia leírása:

CCG

GTG

GAC

TTG

GCA

TCA

AGG

CAG

GAA

GAG

CAG

TCG

ccc

GAC

48

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

TCC

ACA

GAG

GAA

CCA

GTG

ACT

CTC

CCA

AGG

CGC

ACC

AAT

GAT

96

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

GGA

TTC

CAC

CTG

TTA

AAG

GCA

GGA

GGG

TCA

TGC

TTT

GCT

CTA

ATT

TCA

144

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

He

Ser

35

40

45

GGA

ACT

GCT

AAC

GAG

GTA

AAG

TGC

TAT

CGC

TTT

CGG

GTG

AAA

AAG

AAC

192

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Cys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

HU 211 629 A9

CAT

AGA

CAT

CGC

TAC

GAG

AAC

TGC

ACC

TGG

TTC

ACA

GTT

GCT

240

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Ala

65

70

75

80

GAC

AAC

GGT

GCT

GAA

AGA

CAA

GGA

CAA

GCA

CAA

ATA

CTG

ATC

ACC

TTT

288

Asp

Asn

Gly

Ala

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Ala

Gin

lle

Leu

He

Thr

Phe

85

90

95

GGA

TCG

CCA

AGT

CAA

AGG

CAA

GAC

TTT

CTG

AAA

CAT

GTA

CCA

CTA

CCT

336

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

CCT

GGA

ATG

AAC

ATT

TCC

GGC

TTT

ACA

GCC

AGC

TTG

GAC

TTC

378

Pro

Gly

Met

Asn

lle

Ser

Gly

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

TGA

381

2. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 126 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje Az 2. számú szekvencia leírása:

Pro

Val

Asp

Leu Ala

Ser Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

Ser

Thr

Glu

Glu Glu

Pro Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

Gly

Phe

His

Leu Leu

Lys Ala

Gly

Ser

Cys

Phe

Ala

Leu

lle

Ser

35

40

45

Gly

Thr

Ala

Asn Gin

Val Lys

Cys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

His

Arg

His

Arg Tyr

Glu Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Ala

65

70

75

80

Asp

Asn

Gly

Ala Glu

Arg Gin

Gly

Gin

Ala

Gin

He Leu lle Thr Phe

85

90

95

Gly

Ser

Pro

Ser Gin

Arg Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

Pro

Gly

Met

Asn lle

Ser Gly

Phe

Thr

Ala

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

3. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 381 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: duplaszálú Topológia: lineáris

A molekula típusa: DNS (genomiális) Hipotetikus: nem Antiszenz: nem

Eredete: szarvasmarha papillomavírus 1. típus Név/kulcs: CDS Helyzet: 1..378

Az 3. számú szekvencia leírása:

CCG

GTG

GAC

TTG

GCA

TCA

AGG

CAG

GAA

GAG

CAG

TCG

CCC

GAC

Pro

Val

Asp

Leu

Ala

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

TCC

ACA

GAG

GAA

CCA

GTG

ACT

CTC

CCA

AGG

CGC

ACC

AAT

GAT

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

GGA

TTC

CAC

CTG

TTA

AAG

GCA

GGA

GGG

TCA

TGC

TTT

GCT

CTA

ATT

TCA

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Ala

Gly

Ser

Cys

Phe

Ala

Leu

lle

Ser

35

40

45

HU 211 629 A9

GGA	ACT	GCT	AAC	CTG	GTA	AAG	TGC
Gly	Thr 50	Ala	Asn	Leu	Val	Lys 55	Cys
CAT	AGA	CAT	CGC	TAC	GAG	AAC	TGC
His 65	Arg	His	Arg	Tyr	Glu 70	Asn	Cys
GAC	AAC	GGT	GCT	GAA	AGA	CAA	GGA
Asp	Asn	Gly	Ala	Glu 85	Arg	Gin	Gly
GGA	TCG	CCA	AGT	CAA	AGG	CAA	GAC
Gly	Ser	Pro	Ser	Gin	Arg	Gin	Asp

100

CCT	GGA	ATG	AAC	ATT	TCC	GGC	TTT
Pro	Gly	Met	Asn	Ile	Ser	Gly	Phe
		115					120
TGA

TAT	CGC	TTT	CGG	GTG	AAA	AAG	AAC	192
Tyr	Arg	Phe	Arg	Val	Lys	Lys	Asn
			60
ACC	ACC	ACC	TGG	TTC	ACA	GTT	GCT	240
Thr	Thr	Thr	Trp	Phe	Thr	Val	Ala
		75					80
CAA	GCA	CAA	ATA	CTG	ATC	ACC	TTT	288
Gin	Ala	Gin	Ile	Leu	Ile	Thr	Phe
	90					95
TTT	CTG	AAA	CAT	GTA	CCA	CTA	CCT	336
Phe	Leu	Lys	His	Val	Pro	Leu	Pro
105					110
ACA	GCC	AGC	TTG	GAC	TTC			378
Thr	Ala	Ser	Leu	Asp	Phe
				125

381

4. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 126 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje Az 4. számú szekvencia leírása:

Pro 1	Val	Asp	Leu	Ala 5	Ser	Arg	Gin
Ser	Thr	Glu	Glu 20	Glu	Pro	Val	Thr
Gly	Phe	His 35	Leu	Leu	Lys	Ala	Gly 40
Gly	Thr 50	Ala	Asn	Leu	Val	Lys 55	Cys
His 65	Arg	His	Arg	Tyr	Glu 70	Asn	Cys
Asp	Asm	Gly	Ala	Glu 85	Arg	Gin	Gly
Gly	Ser	Pro	Ser	Gin	Arg	Gin	Asp

100

Pro Gly Met Asn	Ile Ser Gly Phe
115	120

Glu	Glu 10	Glu	Glu	Gin	Ser	Pro 15	Asp
Leu	Pro	Arg	Arg	Thr	Thr	Asn	Asp
25					30
Gly	Ser	Cys	Phe	Ala	Leu	Ile	Ser
				45
Tyr	Arg	Phe	Arg	Val	Lys	Lys	Asn
			60
Thr	Thr	Thr	Trp	Phe	Thr	Val	Ala
		75					80
Gin	Ala	Gin	Ile Leu	. Ile	; Thr	• Phe
	90					95
Phe	Leu	Lys	His	Val	Pro	Leu	Pro
105					110
Thr	Ala	Ser	Leu	Asp	Phe

125

5. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 381 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: duplaszálú Topológia: lineáris

Hipotetikus: nem

Antiszenz: nem

Név/kulcs: CDS

Helyzet: 1..378

Az 5. számú szekvencia leírása:

CCG	GTG
Pro	Val
1
TCC	ACA
Ser	Thr
GGA	TTC
Gly	Phe

GAC	TTG
Asp	Leu
GAG	GAA
Glu	Glu 20
CAC	CTG
His 35	Leu

GCA	TCA
Ala	Ser
5
GAA	CCA
Glu	Pro
TTA	AAG
Leu	Lys

AGG CAG Arg Gin

GTG ACT Val Thr

GCA GGA Ala Gly

GAA GAA Glu Glu

CTC CCA Leu Pro

GGG TCA Gly Ser

GAG GAG Glu Glu

AGG CGC Arg Arg

TGC TTT Cys Phe

CAG TCG Gin Ser

ACC ACC Thr Thr

GCT CTA Ala Leu 45

CCC GAC Pro Asp 15

AAT GAT Asn Asp

ATT TCA Ile Ser

HU 211 629 A9

GGA

ACT

GCT

AAC

GAG

GTA

ATG

TGC

TAT

CGC

TTT

CGG

GTG

AAA

AAG

AAC

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Met

Cys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

CAT

AGA

CAT

CGC

TAC

GAG

AAC

TGC

ACC

TGG

TTC

ACA

GTT

GCT

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

GAC

AAC

GGT

GCT

GAA

AGA

CAA

GGA

CAA

GCA

CAA

ATA

CTG

ATC

ACC

TTT

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile

Leu

Ile

Thr

Phe

85

90

95

GGA

TCG

CCA

AGT

CAA

AGG

CAA

GAC

TTT

CTG

AAA

CAT

GTA

CCA

CTA

CCT

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

CCT

GGA

ATG

AAC

ATT

TCC

GGC

TTT

ACA

GCC

AGC

TTG

GAC

TTC

Pro

Gly

Met

Asn

Ile

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

TGA

192

240

288

336

378

381

6. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 126 aminosav

A szekvencia típusa: aminosav

Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje Az 6. számú szekvencia leírása:

Pro Val Asp Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

Ser Thr Glu Glu

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

Gly Phe His Leu

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

Ile

Ser

35

40

45

Gly Thr Alá Asn

Gin

Val

Met

Cys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

His Arg His Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

Asp Asn Gly Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile Leu Ile Thi

Phe

85

90

95

Gly Ser Pro Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

Pro Gly Met Asn

Ile

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

7. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza; 381 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: duplaszálú Topológia: lineáris

A molekula típusa: DNS (genomiális)

Hipotetikus: nem Antiszenz: nem

Eredete: szarvasmarha papillomavírus 1. típus Név/kulcs: CDS Helyzet: 1..378

Az 7. számú szekvencia leírása:

CCG GTG GAC TTG GCA TCA AGG CAG GAA GAA GAG GAG CAG TCG CCC GAC 48

Pro Val Asp Leu Alá Ser Arg Gin Glu Glu Glu Glu Gin Ser Pro Asp

10 15

TCC ACA GAG GAA GAA CCA GTG ACT CTC CCA AGG CGC ACC ACC AAT GAT 96

Ser Thr Glu Glu Glu Pro Val Thr Leu Pro Arg Arg Thr Thr Asn Asp

25 30

HU 211 629 A9

GGA

TTC

CAC

CTG

TTA

AAG

GCA

GGA

GGG

TCA

TGC

TTT

GCT

CTA

ATT

TCA

144

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

Ile

Ser

35

40

45

GGA

ACT

GCT

AAC

GAG

GTA

AAG

TTC

TAT

CGC

TTT

CGG

GTG

AAA

AAG

AAC

192

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Phe

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

CAT

AGA

CAT

CGC

TAC

GAG

AAC

TGC

ACC

TGG

TTC

ACA

GTT

GCT

240

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

GAC

AAC

GGT

GCT

GAA

AGA

CAA

GGA

CAA

GCA

CAA

ATA

CTG

ATC

ACC

TTT

288

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile

Leu

Ile

Thr

Phe

85

90

95

GGA

TCG

CCA

AGT

CAA

AGG

CAA

GAC

TTT

CTG

AAA

CAT

GTA

CCA

CTA

CCT

336

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

CCT

GGA

ATG

AAC

ATT

TCC

GGC

TTT

ACA

GCC

AGC

TTG

GAC

TTC

378

Pro

Gly

Met

Asn

Ile

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

TGA

381

8. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 126 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje Az 8. számú szekvencia leírása:

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Glu Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

Ile

Ser

35

40

45

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Phe

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile Leu

. Ile

> Thr Phe

85

90

95

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

1

10

Pro

Gly

Met

Asn

Ile

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

9. számú szekvenciavázlat

A molekula típusa: DNS (genomiális) Hipotetikus: nem Antiszenz: nem

Eredete: szarvasmarha papillomavírus 1. típus Név/kulcs: CDS Helyzet: 1..378

Az 9. számú szekvencia leírása:

CCG

GTG

GAC

TTG

GCA

TCA

AGG

CAG

GAA

GAG

CAG

TCG

CCC

GAC

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

HU 211 629 A9

TCC

ACA GAG

GAA

CCA

GTG

ACT

CTC

CCA

AGG

CGC

ACC

AAT

GAT

96

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

GGA

TTC

CAC

CTG

TTA

AAG

GCA

GGA

GGG

TCA

TGC

TTT

GCT

CTA

ATT

TCA

144

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

lle

Ser

35

40

45

GGA

ACT

GCT

AAC

GAG

GTA

AAG

CGC

TAT

CGC

TTT

CGG

GTG

AAA

AAG

AAC

192

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Arg

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

CAT

AGA

CAT

CGC

TAC

GAG

AAC

TGC

ACC

TGG

TTC

ACA

GTT

GCT

240

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

GAC

AAC

GGT

GCT

GAA

AGA

CAA

GGA

CAA

GCA

CAA

ATA

CTG

ATC

ACC

TTT

288

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

He

Leu

He

Thr

Phe

85

90

95

GGA

TCG

CCA

AGT

CAA

AGG

CAA

GAC

TTT

CTG

AAA

CAT

GTA

CCA

CTA

CCT

336

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

CCT

GGA

ATG

AAC

ATT

TCC

GGC

TTT

ACA

GCC

AGC

TTG

GAC

TTC

378

Pro

Gly

Met

Asn

lle

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115 120 125

TGA 381

10, számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 126 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje Az 10. számú szekvencia leírása:

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

lle

Ser

35

40

45

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Cys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

lle Leu

ι lle

! Thr

Phe

85

90

95

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

Pro

Gly

Met

Asn

lle

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

11. számú szekvenciavázlat

A molekula típusa: DNS (genomiális) Hipotetikus: nem Antiszenz: nem

Eredete: szarvasmarha papillomavírus 1. típus Név/kulcs: CDS Helyzet: 1 ..378

Az 11. számú szekvencia leírása:

HU 211 629 A9

CCG

GTG GAC

TTG

GCA

TCA

AGG

CAG GAA GAA

GAG

CAG

TCG

CCC

GAC

48

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

TCC

ACA

GAG

GAA

CCA

GTG

ACT

CTC

CCA

AGG

CGC

ACC

AAT

GAT

96

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

GGA

TTC

CAC

CTG

TTA

AAG

GCA

GGA

GGG

TCA

TGC

TTT

GCT

CTA

ATT

TCA

144

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

Ile

Ser

35

40

45

GGA

ACT

GCT

AAC

GAG

GTA

AAG

TAC

TAT

CGC

TTT

CGG

GTG

AAA

AAG

AAC

192

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

50

55

60

CAT

AGA

CAT

CGC

TAC

GAG

AAC

TGC

ACC

TGG

TTC

ACA

GTT

GCT

240

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

GAC

AAC

GGT

GCT

GAA

AGA

CAA

GGA

CAA

GCA

CAA

ATA

CTG

ATC

ACC

TTT

288

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile

Leu

Ile

Thr

Phe

85

90

95

GGA

TCG

CCA

AGT

CAA

AGG

CAA

GAC

TTT

CTG

AAA

CAT

GTA

CCA

CTA

CCT

336

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

CCT

GGA

ATG

AAC

ATT

TCC

GGC

TTT

ACA

GCC

AGC

TTG

GAC

TTC

378

Pro

Gly

Met

Asn

Ile

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115 120 125

TGA 381

12. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 126 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje Az 12. számú szekvencia leírása:

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

Ile

Ser

35

40

45

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Tyr

Arg

Phe

Leu

Val

Lys

Asn

50

55

60

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile Leu

. Ile

! Thr Phe

85

90

95

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

Pro

Gly

Met

Asn

Ile

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

13. számú szekvenciavázlat

A molekula típusa: DNS (genomiális) Hipotetikus: nem Antiszenz: nem

Eredete: szarvasmarha papillomavírus 1. típus Név/kulcs: CDS

HU 211 629 A9

Helyzet: 1..378

Az 13. számú szekvencia leírása:

CCG GTG

GAC

TTG

GCA

TCA

AGG

CAG

GAA

GAG

CAG

TCG

CCC

GAC

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

TCC

ACA

GAG

GAA

CCA

GTG

ACT

CTC

CCA

AGG

CGC

ACC

AAT

GAT

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

GGA

TTC

CAC

CTG

TTA

AAG

GCA

GGA

GGG

TCA

TGC

TTT

GCT

CTA

ATT

TCA

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

He

Ser

35

40

45

GGA

ACT

GCT

AAC

GAG

GTA

AAG

TGC

TAT

CGC

TTT

CTG

GTG

AAA

AAG

AAC

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Cys

Tyr

Arg

Phe

Leu

Val

Lys

Asn

50

55

60

CAT

AGA

CAT

CGC

TAC

GAG

AAC

TGC

ACC

TGG

TTC

ACA

GTT

GCT

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

GAC

AAC

GGT

GCT

GAA

AGA

CAA

GGA

CAA

GCA

CAA

ATA

CTG

ATC

ACC

TTT

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

lle

Leu

He

Thr

Phe

85

90

95

GGA

TCG

CCA

AGT

CAA

AGG

CAA

GAC

TTT

CTG

AAA

CAT

GTA

CCA

CTA

CCT

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

CCT

GGA

ATG

AAC

ATT

TCC

GGC

TTT

ACA

GCC

AGC

TTG

GAC

TTC

Pro

Gly

Met

Asn

lle

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

TGA

144

192

240

288

336

378

381

14. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 126 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje Az 14. számú szekvencia leírása:

Pro

Val

Asp

Leu

Alá

Ser

Arg

Gin

Glu

Gin

Ser

Pro

Asp

1

5

10

15

Ser

Thr

Glu

Pro

Val

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Asn

Asp

20

25

30

Gly

Phe

His

Leu

Lys

Alá

Gly

Ser

Cys

Phe

Alá

Leu

lle

Ser

35

40

45

Gly

Thr

Alá

Asn

Gin

Val

Lys

Cys

Tyr

Arg

Phe

Leu

Val

Lys

Asn

50

55

60

His

Arg

His

Arg

Tyr

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

65

70

75

80

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

lle Leu lle Thr Phe

85

90

95

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

100

105

110

Pro

Gly

Met

Asn

He

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

115

120

125

75. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 222 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: duplaszálú Topológia: lineáris

A molekula típusa: DNS (genomiális) Hipotetikus: nem Antiszenz: nem

HU 211 629 A9

Eredete: szarvasmarha papillomavírus 1. típus Név/kulcs: CDS Helyzet: 1..219

Az 15. számú szekvencia leírása:

GTA

AAG

TGC

TAT

CGC

TTT

CGG

GTG

AAA

AAG

AAC

CAT

AGA

CAT

CGC

TAC

48

Val

Lys

Cys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

His

Arg

His

Arg

Tyr

1

5

10

15

GAG

AAC

TGC

ACC

TGG

TTC

ACA

GTT

GCT

GAC

AAC

GGT

GCT

GAA

96

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

20

25

30

AGA

CAA

GGA

CAA

GCA

CAA

ATA

CTG

ATC

ACC

TTT

GGA

TCG

CCA

AGT

CAA

144

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile

Leu

Ile

Thr

Phe

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

35

40

45

AGG

CAA

GAC

TTT

CTG

AAA

CAT

GTA

CCA

CTA

CCT

GGA

ATG

AAC

ATT

192

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

Gly

Met

Asn

Ile

50

55

60

TCC

GGC

TTT

ACA

GCC

AGC

TTG

GAC

TTC

TGA

Ser

Gly

Phe

i'hr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

222

70

16. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 73 aminosav A szekvencia típusa: aminosav Topológia: lineáris

A molekula típusa: fehérje A 16. számú szekvencia leírása:

Val

Lys

Cys

Tyr

Arg

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

His

Arg

His

Arg

Tyr

1

5

10

15

Glu

Asn

Cys

Thr

Trp

Phe

Thr

Val

Alá

Asp

Asn

Gly

Alá

Glu

20

25

30

Arg

Gin

Gly

Gin

Alá

Gin

Ile

Leu

Ile

Thr

Phe

Gly

Ser

Pro

Ser

Gin

35

40

45

Arg

Gin

Asp

Phe

Leu

Lys

His

Val

Pro

Leu

Pro

Gly

Met

Asn

Ile

50

55

60

Ser

Gly

Phe

Thr

Alá

Ser

Leu

Asp

Phe

65

70

17. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 16 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris A 17. számú szekvencia leírása:

AGCAACTAGT CCCAAG 16

18. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 22 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris

A 18. számú szekvencia leírása:

CTCGAGAAGC TTGACGGATC CG 22

19. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 30 bázispár A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia száltípusa: egyszálú Topológia: lineáris

A 19. számú szekvencia leírása:

TGCAGAGCTC TTCGAACTGC CTAGGCTTAA 30

20. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 16 bázispár 40 A szekvencia típusa: nukleinsav

A szekvencia száltípusa: egyszálú

Topológia: lineáris

A 20. számú szekvencia leírása:

GATCCTTTGC CGCCAC 16

21. számú szekvenciavázlat

A szekvencia hossza: 16 bázispár

A szekvencia típusa: nukleinsav

A szekvencia száltípusa: egyszálú 50 Topológia: lineáris

A 21. számú szekvencia leírása:

GAAACGGCGG TGGTAC 16

Claims

55 SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy E2 transzaktivációs represszor, amely egy, a natív E2 DNS-kötő doménnel (1. számú szekvencia) homológ aminosav-szekvenciával rendelkező polipep60 tidből áll. az említett polipeptic natív E2 fehérjével

HU 211 629 A9 inaktív heterodimerek képzésére képes, és az említett inaktív heterodimerek nem képesek kötődni az E2 DNS-kötő helyekhez.
2. Egy E2 transzaktivációs represszor, amely a natív E2 DNS-kötő doménnek (1. számú szekvencia) egy polipeptid fragmentumából áll, az említett fragmentum natív E2 fehérjével inaktív heterodimerek képzésére képes, és az említett inaktív heterodimerek nem képesek kötődni az E2 DNS-kötő helyekhez.
3. Az 1. igénypont szerinti E2 transzaktivációs represszor, amely lényegében egy, a natív E2 kötő doménnel (1. számú szekvencia) homológ aminosav-szekvenciájú polipeptidből áll, az említett polipeptid natív E2 fehérjével inaktív heterodimerek képzésére képes, és az említett inaktív heterodimerek nem képesek kötődni az E2 DNS-kötő helyekhez.
4. A 2. igénypont szerinti E2 transzaktivációs represszor, amely lényegében a natív E2 DNS-kötő dómén (1. számú szekvencia) egy polipeptid fragmentumából áll. az említett fragmentum natív E2 fehérjével inaktív heterodimerek képzésére képes, és az említett inaktív heterodimerek nem képesek kötődni az E2 DNS-kötőhelyekhez.
5. Egy E2 transzaktivációs represszor, amely egy, a 4. számú szekvenciával, 6. számú szekvenciával, 8. számú szekvenciával, 10. számú szekvenciával, 12. számú szekvenciával és a 14. számú szekvenciával definiált aminosav-szekvenciák által alkotott csoportból választott aminosavszekvenciájú polipeptidből áll, az említett polipeptid natív E2 fehérjével inaktív heterodimerek képzésére képes, és az említett inaktív heterodimerek nem képesek kötődni az E2 DNS-kötő helyekhez.
6. Egy E2 transzaktivációs represszor, amely a natív E2 DNS-kötő dómén egy polipeptid fragmentumából áll, az említett fragmentum lényegében a natív E2 fehérje A_33g-AA_41O szekvenciájának (16. számú szekvencia) megfelelő polipeptidből áll, az említett fragmentum natív E2 fehérjével inaktív heterodimerek képzésére képes, és az említett inaktív heterodimerek nem képesek kötődni az E2 DNS-kötő helyekhez.