HU204131B - Method for detecting sial acidcontent adherent to the lipid of the blood - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás a vér - elsősorban az emberi vér - lipidhez kötött sziálsav-tartalmának meghatározására.

A rosszindulatú betegségek (a továbbiakban: rák) idejekorán való felismerése ma a gyógyászat egyik alapvető problémája, amelynek megoldásától nagymértékben függ a betegek gyógyíthatósága. Ebben a vonatkozásban nagy reményeket fűznek a biokémiai módszerek fejlesztéséhez. A rákkal kapcsolatos kutatások kitüntetett iránya olyan testazonos (endogén) anyagok keresése, amelyek koncentrációja rákos folyamatokban jellegzetesen és szignifikánsan megváltozik az emberi testnedvekben (vér, vizélet, gerincveIő-foIyadékstb.).Ezeketaz anyagokat gyűjtőnéven tumor markereknek (IM) nevezik. Mamár több mint 50 IM tulajdonságú anyagot ismerünk; ennek ellenére a szó köznapi értelmében vett rák-teszt - azaz olyan laboratóriumi diagnosztikai eljárás, amely a rák felismerésében teljes biztonsággal adna „igen” - „nem” választ - ma sem áll rendelkezésre. Ennek egyik oka az, hogy a Tm tulajdonságú anyagok nagy részénél a vizsgálatok biológiai alapjai, köztük elsősorban a daganatos állapotésTM tulajdonságú anyagmennyisége közötti összefüggések még nem tisztázottak, illetve az elért eredmények ellentmondásosak; másik oka pedig az, hogy alM tulajdonságú anyagokbonyolnltszerkezetűek, elkülönítésük és meghatározásuk rendkívül nehézkes, az esetek túlnyomó többségében a rutin laboratóriumi eszközparkkal és személyzettel meg sem oldható, következésképpen a vizsgálatok igen költségesek, és rendszerint nem adnak megfelelően megbízható eredményeket.

Asziálsav-kémiainevénN-acetil-neuraminsav-a membránképző glükolipidek, valamint néhány glükoprotein és vércsoportanyag összetevője. A sejtmemb- rán glükoprotein és glükolipíd összetételében fellépő változások vizsgálata során megállapították (Yogoaswaren: „Cellsurfaceglycoproteinsinmalignanttransformations”, Advances in Cancer Research Vol. 38, Academic Press, Inc., 1983; ISBN 0-12-006638-6), ' hogy a ráksejtekben és a sejtek plazmamembránjaiban megnőnek a gangliozid szintek, így a gangliozid szintek változása IM vizsgálatként alkalmazható. A gangliozidok analitikai meghatározására jelenleg rendelkezésre álló eljárások azonban túlságosan bonyo- ^z lultak, munka- és időígényesekahhoz, hogy agyakorló kórházi laboratóriumok tömegesen sorozatelemzésként alkalmazni tudnák azokat.

A szérum sziálsav-tartalma, illetve annak egyik frakciója, a lipidhez kötött sziálsav (lipid-boundsialic £ acid, a továbbiakban: LSA) koncentrációja jól korrelál a gangliozid szintekkel. Ennek a komponensnek a meghatározására egyszerűbben kivitelezhető analitikai módszerek is rendelkezésre állnak. Több kutatócsoportvizsgálta és igazolta az LSA TM tulajdonságú 5 tekbemígy például Katopodis és munkatársai (Cancer Research 42, 5210-5215 Π982Γ) 850 emberi vérszérum-mintáhól határozták meg az LSA koncentrációt; a minták közül 180 egészséges személytől, 670 pedig 6 klinikailag igazolt rákos betegtől származott. A szerzők megállapították, hogy az egészséges, illetve jóindulatú betegségben szenvedő csoportban mért LSAértékek szignifikánsan eltértek a rákos csoportban méri téktől; arákos csoport97%-ábanazLSAértékmeghaladta a 20 mg/100 ml-t (a csoport átlagértéke

26,3 mg/100 ml volt), míg az egészséges, illetve jóindulatú betegségekben szenvedő csoportban

17,6 mg/100 ml átlagértéket mértek. A szerzők a

20 mg/100 ml-t meghaladó LSA koncentrációt tekintetékkórosnak. A szerzők azt is megállapították, hogy azLSAkoncentráciőkmeghatározásaabetegséglefolyásának (gyógyulási, illetve rosszabbodási folyamat) követésére is alkalmas.

R.S. Schamberger (J. Clin. Chem. Biochem. 22,647651 /1984/) 160 rákos betegen és 134 egészséges, illetve jóindulatú betegségben szenvedőn vizsgálta a sziérumLSAkoncentrációját. AzLSAkoncentráció a rákos betegek 94%-ánál kóroson emelkedett volt. A rá► kos betegcsoporton belül a 63 metasztázisos betegen mért LSA koncentráció szignifikánsan meghaladja a metasztázis-mentes betegeken mért értékeket, ami azt jelzi,hogy korreláció van a tumor stádiuma, tömege és a sziálsav koncentrációja között. 10 igazoltan rákos betegnél a szerző összehasonlította a közismert CEA (carcino-embrionalis antigén) és LSA mérések eredményeit. A CEA érték csak 4 betegnél volt kórosan magas, míg az LSA érték mind a 10 esetben kórosan emelkedett volt. A szerző megállapította azt is, hogy néhány gyulladásos megbetegedésben (arthritis, psoriasis, fekély stb.) előfordul emelkedett sziálsav-szinL

AM Dnistrian és munkatársai (CUn. Chem. 27/10, 1737-1739 /1981/; Cancer 50, 1815-1819 /19820 mellrákos betegeken vizsgálták az LSA szinteket Megállapították, hogy az LSA szintek szignifikánsan meghaladták az egészséges személyeken észlelteket. A szerzők vizsgálták az LSA szintek változását a különböző módszerekkel kezelt betegeknél, és megállapították, hogy összefüggés áll fenn a kórlefolyás és az LSA szint változása között. A szerzők összehasonlították a CEA szint és az LSA szint alakulását 125 bizonyítottan rákos személynél, és azt tapasztalták, hogy a betegek 78%-ánál mutatható ki kórosan emelkedett LSA szint, míg a CEA szint csak a betegek 35%-ánál voltkórosanmagas.

A közelményekból megállapítható, hogy az LSA szint vizsgálata jól alkalmazható a rákos megbetegedések kimutatására, a tumor tömegének és stádiumának értékelésére, továbbá a beteg állapotának követésére.

Az emberi vér lipidhez kötött sziálsav-tartalmának meghatározására alkalmas, viszonylag egyszerű, és ezért átlagos klinika laboratóriumi körülmények között sorozatelemzésre is alkalmazható módszert mindeddig csak egy közlemény, a4 342567 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmileírás ismertetett. Az ott ismertetett eljárás lényege az, hogy a szérumot desztillált vízzel hígítják, a hígított szérumból kloroform és metanol elegyével kivonják a lipoidoldható frakciót, majd a vízes-metanolos fázist foszfor-wolf2

HU 204131 Β ramsawal kezelik, a kivált csapadékot vízben oldják, az oldatban sósavat, réz(II)-sót és rezorcint adnak, és a kialakuló színreakció alapjánfotometriásan meghatározzák a szérum sziálsav-tartalmát.

A szabadalmazott eljárás előrírásait pontosan betartva megkíséreltük a módszert reprodukálni. Ennek során három különböző személytől származó szérummintákból 30-30 párhuzamos elemzést végeztünk, és az elemzést négy egymást követő napon megismételtük. Azt tapasztaltuk, hogy az azonos szérummintákból végzett 30 párhuzamos meghatározás eredményei a klinikai kémiában elfogadhatatlanul nag.y 25-30%os szórást mutattak. Ennek megfelelően a vizsgálati napok közötti reprodukálhatóság is elégtelen volt; az átlagértékeknapokközötti szórása meghaladta a20%ot. Ameghatározás további hibája, bogy az abszorbancia - koncentráció görbe iránytangense kritikusan alacsony. Ennek következtében az egységnyi LSA koncentráció-változásra jutó abszorbancia-változást a kórházi laboratórumokban használt, átlagosan 0,0005 Au pontosságú fotométereken csak nagy hibával lehet mérni. A szérumminták helyett desztillált vizet tartalmazó úgynevezett „vakminták” mérése azt mutatta, bogy a hasznos jel/zaj viszony - különösen a 20 mgLSA/100 ml koncentráció alatt - mérhetőségi kritériumnak elfogadott 3:1 arány körül van vagy annál kisebb. Feltehetőleg ezek a körülmények vezettek ahhoz, hogy ezt az ismert módszert tudomásunk szerint a gyakorlatban sehol sem alkalmazzák.

Célul tűztük ki az ismert meghatározási módszer hibáinak kiküszöbölésével olyan új eljárás kidolgozását, amellyel a vér - elsősorban az emberi vér - lipidhez kötött sziálsav-tartalma igen nagy pontossággal, reprodukálhatóan és független módszerrel ellenőrzihetően meghatározható.

A 4 342 567 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás egyes műveleteinek részletes vizsgálata során megállapítottuk, hogy a mérés pontosságát alapvetően meghatározza a sziálsav-tartalmú frakció kicsapásának milyensége. A 4 342 567 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint kicsapó reagensként alkalmazott foszfor-wolframsav a sziálsav-tartalmú frakció szelektív kicsapását nem teszi lehetővé. A célfrakció mellett egyéb zavaró fehérjefrakciók is leválnak és egyben denaturálódnak. Ezt igazolja az is, hogy a szabadalmi leírásban közöltek szerint sem lehet a kicsapott fehérjefrakciót teljes tömegében újraoldani. A zavaró fehérjefrakciók mennyisége és minősége nem szabályozható; azok ellenőrizhetetlenül torzítják a mérés eredményét. Elvi hibája a 4 342 567 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módszernek, hogy nem közli, hogy az emberi szérumban jelenlevő igen sok komponensű, bonyolult és változó összetételű fehérjefrakcióból melyik frakció(k) elkülönítése a cél. így nem ellenőrizhető az alkalmazott kicsapási módszer független eljárással.

Munkánk során először független módszerrel - ultracentrifugás eljárással - meghatároztuk a vizsgálandó febérjefrakció jellemzőit. Az általunk kidolgozott ultracentrif ugás elkülönítési módszer vizsgálati körülményei a következők voltak:

hőmérséklet: 20 °C, preparatív csőtérfogat: 11,5 ml, gradiensek: f ölérétegezett 0,9 tömeg %-os NaQ oldat 8,5 ml, alárétegezett szérum (d = 1,3 g/ml) 3 ml, sebesség: 50.000 fordulat/perc, forgatási idő: 120 perc,

K’faktor: 68,7.

Az ultracentrifugálás során az egyes protein- és lipoprotein-frakciókhidratáltsűrűségüknekmegfelelően különböző sebességgel flótáinak, és jól definiált, önálló sávokban elkülönülnek egymástól. Az LSA meghatározására szolgáló frakció a meniszkusztól számított negyedik elkülönült sávban helyezkedik el. Ez a sáv a preparatív csőből fecskendővel kvantitatíve elkülöníthető és tovább vizsgálható volt. Az LSA meghatározására szolgáló frakció mennyisége tehát ultracentrifugálással rendkívül pontosan meghatározható. Az elkülönített frakció jellemző adatai a következők:

sűrűség: 1,125-1,210 g/ml, molekulatömeg: (3,86-1,86) χ 10⁵ dalton, lipid/protein arány: 52/48.

Az ultracentrifugálásos eljárást - ami költségessége, eszközigényessége és hosszadalmas volta miatt sorozatelemzésre alkalmatlan, de ugyanakkor igen pontos - referencia-módszerként alkalmaztuk a kémiai kicsapás megbízhatóságának ellenőrzésére.

Ezt követően kísérleteink az LSA-tartabnú frakció szelektív kicsapására irányultak. Azt tapasztaltuk, bogy az LSA-tar talmú frakció

a) 15-35 g/100 ml koncentrációjú dextrán-szulfát oldattal (móltömeg: 10.000-20.000) 5,8 és 7,5 közötti pH-értéken, vagy

b) 15-55 g/100 ml koncentrációjú poli(etilén-glikol) oldattal (móltömeg: 4000-10.000) 9 és 11 közötti pH-értéken, vagy

c) 8,7-13 g/100 mlMh²⁺ionnakmegfelelő koncentrációjú vízben oldható mangán(II)-só oldattal 5,5 és

7,5 közötti pH-értken szelektíven és kvantitatíve, és az így leválasztott frakció sziálsav-tartalma a 4 342 567 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett színreakcióval igen nagy pontossággal és reprodukálhatóan határozható meg. A mérés pontosságát növelhetjük, ha a leválasztott frakció újraoldására 7 és 9 közötti pH-értékű vizes puff eroldatot használunk.

A találmány tárgya tehát eljárás vér - elsősorban emberi vér - lipidhez kötött sziálsav-tartalmának meghatározására, amelynek során a vízzel hígított szérumból vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel vagy oldószer-eleggyel végzett extrakcióval eltávolítjuk a neutrális lipideket, a vizes fázisból kicsapjuk a lipidhez kötött sziálsav-tartalmú lipoprotein frakciót, a kicsapott lipoprotein frakciót újraoldjuk, az oldathoz szervetlen savat, réz(H)-sót és rezorcint adunk, és a rezorcinnal kiváltott színreakció alapján kiszámítjuk a szérum lipidhez kötött sziálsav-tartalmát. A találmány szerbit

a) kicsapószerként 10.000 és 20.000 közötti mőltöme3

HU 204131 Β gü dextrán-szulfátot használunk 15-35 mg/100 ml koncentrációjú oldatban, és a kicsapást 5,8 és 7,5 közóttipH-értéken végezzük, vagy

h) kicsapószerként 4000 és 10.000közötti móltomegü poli(etílén-glikol)-t használunk 15-55 g/100 ml koncentrációjú oldatban, és akicsapást 9 és 11 közötti pH-értéken végezzük, vagy

c) kicsapószerként vízben oldható mangán(EQ-sőt használunk 8,7-13 g/100 ml Mn²⁺ kationnak megfelelőkoncentrációjúoldatban, és akicsapást5,5 és

7,5 közötti pH-értéken végezzük.

A találmány értelmében a kicsapást lípoprotein frakció újraoldásához célszerűen 7és 9 közötti pH-értékűvizespufferoldatothasználunk.

Kicsapószerként különösen előnyösen használhatunk vízben oldható mangán(II)-sókat, például mangén(H)-szulfátot,_ mangán(B)-nitrátot, mangán(ü)kloridot, mangán(H)-bromidot vagy mangán(H)-jodidot, amelyek közül kiemelkedően előnyös a mangán(II)-klorid. Ezt a sót 20-30 g/100 ml, célszerűen 22-27 g/100 ml koncentrációjú oldatban használjuk fel, és a kicsapást célszerűen 6,0 ±0,1 pH értéken végezzük.

Az újraoldáshoz vizes pufferoldatként különösen előnyösen alkalmazhatunk 10 mmól/1 koncentrációjú trisz(hidroxi-metil)-amino-metán pufferoldatot, amelynekpH-ja 8,6.

Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy -20 ’Con tárolva a vérszérumot azLSAkoncentráció hathónapon át nem változik. Megállapítottuk azt Is, hogy a rezorcinnal képezett színes komplex szmintenzítása (amely arányos az LSA koncentrációval) szobahőfokon 6 órán belülnem változik. Ez a tény asorozatelemzés kivitelezhetősége szempontjából alapvetően fontos.

A találmány szerinti eljárást elsődlegesen a humán rákszűrésekre és a rákos betegségek gyógyulási folyamatának nyomonkövetésére, ezáltal az alkalmazott terápia értékelésére. Az eljárást azonban a rákkutatásban is felhasználhatjuk farmakológiai vizsgálatokban, pl. rákellenes gyógyszerkészítmények hatásának értékeléséhez.

A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási változatait az alábbipéldában ismertetjük. ²

Példa

Emberi vér lipidhez kötött sziálsav-tartalmának meghatározása

A vizsgálatokhoz vénás vérthasználunk. A vérvételt £ követően a vérmintát 15percig4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, majd 0,6 ml szérummintát lefagyasztunk. A-20 ’C-on tároltmíntaLSAkoncentrációja 6 hónapig változatlan marad.

A mérés megkezdésekor megfelelő számú kémcső- 5 vet metanollal alaposan átöblítünk, szárítunk, majd hűtőszekrényben előhűtjük. A kémcsövekbe 0,2 ml szérumot és 0,2 ml kétszer desztillált vizet mérünk be, Vortex kémcsőkeverővel 15 másodpercig keverjük, majd 0 ’C-os jeges vízfürdőbe helyezzük. Minden vizsgálati, illetve konstroll szérumból 2-2 párhuzamos mintátkészítünk.

Ezután minden kémcsőbe hűtőszekrényben előhűtött 3-3 ml2:l térfogatarányú klorofomrunetanolele5 gyet mérünk be. Akémcsövek tartalmát Vortex keverővei 30 másodpercig keverjük, majd a kémcsöveket visszahelyezzük a jeges vízfürdőbe. A kémcsövekbe 0,5-0,5 ml +4 ’C-ra előhűtött kétszer desztillált vizet pipettázuhk, Vortex keverővei 15 másodpercig alapo10 san keverjük, majd szobahőmérsékleten 5 percig állni hagyjuk. Ezt követően a mintákat 10 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felső fázisból óvatosan 1-1 ml-t előre beszámozott centrifugacsövekbe töltünk, hozzáadunk 0,1-0,1 ml mangán(H)1 δ klorid oldatot (az oldatkészítés során 25 g vízmentes mangán(II)-kloridot 80 ml kétszer desztillált vízben oldunk, az oldat pH-ját 0,1 n vizes nátrium-hidroxid oldattal, illetve 0,1 n vizes sósavoldattal 6,0±0,l-re állítjuk he, majd az oldat térfogatát kétszer desztillált vízzel 100 ml-re egészítjük ki), és az elegyet Vortex keverővei összekeverjük, majd 5 percig állni hagyjuk.

Egy másik kicsapási kísérletsorozatban kicsapószerként dextrán-szulfát oldatot használunk. Az oldatkészítés során 20 mg dextrán-szulfátot (móltöme26 ge: 15.000) 100 ml 0,9 tömeg%-os vizes nátrium-klorid oldatban oldunk. A kicsapószer 1 ml-ét adjuk az 1 ml felülúszóhoz, majd az elegyet Vortex keverővd összekeverjük, és 5 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk.

Egy további kicsapási kísérletsorozatban kicsapószerként polí(etilén-glikol)-t használunk. Az oldatkészítés során 20 mg poli(etilén-glikol)-t (móltömege; 6000) 80 ml 0,2 mól/lkoncentrációjú glicin pufferben oldunk, az oldat pH-ját 0,1 n vizes sósavoldattal vagy

0,1 nvizes nátrium-hidroxid oldattal 10,0 ±0,1 értékre állítjuk, majd az oldat térfogatát kétszer desztillált vízzel 100 ml-re egészítjük ki. A kicsapószer 1 ml-ét adjuk az 1 ml felülúszóhoz, majd az elegyet Vortex keverővei összekeverjük, és 5 percig szohahőmérsék10 létén állni hagyjuk.

Az állásidő leteltével az elegyet 15 percig 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, és a felülúszót maradéktalanul leöntjük a csapadékról.

Az így kapott csapadékhoz minden kémcsőbe 15 l ml triszt-pufferoldatot töltünk (az oldatkészítés során 10 mmóltrisz-(hidroxi-mtil)-amino-metánt 1 liter . kétszer desztillált vízben oldunk, és az oldat pH-ját

8,6-ra állítjuk), és ígyacsapadékotújraoldjuk.

A fotometriás mérésekhez standardokat készítünk 0 a következő módon: 50 mg analitikai tisztaságú sziálsavat 100 mlkétszer desztillált vízben oldunk, és ebből azoldatbólminttörzsoldatbólkétszerdesztilláltvízzel végzett hígítással 25 mg/100 ml és 12,5 mg/100 koncentrációjúoldatokatkészítünk.Astandard oldatokat 5 +4 ’C-on tároljuk. Ahárom különböző koncentrációjú standard oldatból 0,2-0,2 ml-t mérünk be egy-egy centrifugacsőbe, majd az oldat térfogatát kétszer desztillált vízzel 1 ml-re egészítjük ki. Vakmintaként mlkétszer desztilláltvizet használunk.

Minden egyes kémcsőhöz (standard, vak, kontroll

HU 204131 Β és vizsgálati mintát tartalmazó kémcsövek) 1-1 ml rezorcin reagens oldatot adunk. (A rezorcin reagens oldatot a következőképpen készítjük: 2 g analitikai tisztaságú rezorcint 100 ml kétszer desztillált vízben oldunk. 2,49 g vízmentes réz(H)-szulfátot 100 ml kétszer desztillált vízben oldunk. Ezután 10 ml rezorcin oldatot 0,25 ml réz(H)-szulfát oldattal és 9,75 ml kétszer desztillált vízzel keverünk össze, és az oldathoz 100 ml analitikai tisztaságú tömény vizes sósavoldatot adunk.) A kémcsöveket pontosan 10 percre 100 ’C-os vízfürdőbe helyezzük. Ezután valamennyi kémcsövet azonnal 0 ’C-os jeges vízfürdőbehelyezzük, és 10 percig itt tartjuk. Ezután minden egyes kémcsőbe 2-2 ml 85:15 térfogatarányú butil-acetátm-butanol elegyet mérünk be, Vortex keverővei 5 percig keverjük, majd állni hagyjuk, állás közben időközönként megkeverjük, végül 10 percig 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felső kék színű folyadékfázist mérőküvettába töltjük. A kialakult kék szín intenzitása 6 órán belül nem változik

A fotometriás mérést 580 nm hullámhosszon végezzük. A fotométert kétszer desztillált vízre nullázzuk Az alkalmazott fotométer-típustól függően (egy vagy két utas) a méréseket a vak mintával szemben végezzük, vagy utólag a mért extinkció-értékekből levonjuk a vak minta extinkció ját:

E(korr) = E(mért) -E(vak)

Az LSA-tartalom kiszámítására kétféle módszer alkalmazhatunk:

Az első módszer szerint az ismert koncentrációjú standard sziálsav minták mérési eredményeiből grafikusan vagy számítással meghatározzuk az extinkció koncentráció görbét. Az eredeti koncentrációkat a hígítás miatt át kell számolni a következőképpen:

Eredetikon	Mért kon-	Extinkció
centráció	centráció
(mg/100 ml)	pg/200ml)
50	100	0,508
25	50	0,252
12,5	25	0,127

A kalibrációs görbéről leolvassuk a kivett 1 ml felülúszó sziálsav-tartalmát ^g-ban (”A”). A végső koncentrációt a következő képlettel számítjuk ki:

LSA (mg/100 ml) =, A” x 0,72 ahol, A” az 1 ml felülúszóban levő sziálsavmennyisége ^g-ban, és a 0,72-es szorzófaktor Összevonva tartalmazza a hígítási fokot és a μg - mg átszámítási tényezőt.

A másik számítási módszer szerint ismert LSA koncentrációjú kontroll szérum mintákat alkalmazunk. Meghatározzuk több párhuzamos mérésből az

F=C(kontr.)/E(kontr.) faktort, ahol C(kontr.) a kontroll szérum LSA koncentrációja mg/100 ml-ben, és E(kontr.) a kontroll szérum extinkciója. A meghatározandó szérumminta LSAkoncentrációját az alábbi képlettel számítjuk ki:

LSA (mg/100 ml) =E(m) xF aholE(m) a meghatározandó minta extinkciója.

A mérés megbízhatóságát a korábbiakban ismertetett ultracentrifugálásos módszerrel ellenőrizzük. 15 különböző személytől származó szérumminta lipidhez kötött sziálsav-tartalmát ultracentrifugálással (UC), mangán(II)-kloridos kicsapással (MnCl^, dextránszulf átos kicsapással (DS), poli(etilén-glikol)-os kicsapással (PEG), illetve a 4 342 567 sz, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással (ismert módszer) mértük. A mérési eredményeket az I. táblázatban közöljük.

I. táblázat

A minta sorszáma	uc	MnC12	LSA-tartalom mg/100 ml DS	PEG	Ismert módszer
1.	14,9	15,1	14,7	15,3	12,5
2.	19,0	18,8	19,1	19,5	21,8
3.	16,9	16,6	16,5	17,1	19,1
4.	21,0	22,0	23,1	20,1	26,5
5.	19,5	19,0	18,4	21,0	15,1
6.	30,8	31,3	32,1	29,1	24,2
7.	25,6	25,0	24,2	27,1	18,2
8.	26,9	27,1	25,6 .	28,0	20,2
9.	14,9	14,3	16,0	15,5	17,9
10.	23,5	21,6	22,4	23,7	18,7
11.	20,3	19,6	18,7	21,6	24,4
12.	16,1	16,4	18,0	17,3	12,8
13.	18,3	18,3	16,7	17,1	23,5
14.	28,5	29,3	31,2	26,9	21,8
15.	44,3	42,8	41,2	46,3	28,7

Az I. táblázat adataiból megállapítható, hogy a referenciaként használt, abszolút pontos eredményeket szolgáltató ultracentrifugás meghatározás eredményei igen jó összhangban vannak a találmány szerinti mérési eljárás eredményeivel. A legjobb eredményeket mangán(H)-ldoridos kicsapás esetén kaptuk; ekkor a korrelációs együttható 0,995 volt. Ezzel szemben az ismert módszerrel végzett mérés eredményei igen

Ηϋ 204131 Β nagy mértékben eltértek a referencia-eljárással meghatározottaktól.

A találmány szerinti eljárás laboratóriumon belüli reprodukálhatóságának vizsgálatára 30 különböző vizsgálati napon meghatároztuk a Hyíand normál 5 kontrollszérumLSAkoncentrációját. Az eredmények statisztikaifeldolgozása aztmutatta, hogy a vizsgálati szériák közötti reprodukálhatóság ±10% alatt van, tehátmegfelelő.

A laboratóriumok közötti reprodukálhatóságot 10 vizsgálva többszáz szérum-mintát elemeztettühk két különböző laboratóriumban. A vizsgálat minden lényeges eleme (a vizsgálatotvégző személyek, az alkalmazott eszközök típusa stb.) eltérő volt. A vizsgálati eredményeket összevetve megállapítottuk, hogy a la- 15 boratóriumok közötti reprodukálhatóság - azonos kontroll szérumokat alkalmazva - ± 10%-os pontossággal biztosítható.

Többszáz LSA-meghatározás tapasztalai alapján megállapítottuk, hogy egy gyakorlati laboratóriumi 20 asszisztens egy munkanap alatt teljesen manuális módon legalább 80-100 meghatározást tud elvégezni, a módszer tehát sorozatelemzésre munka- és időigény szempontjából alkalmas.

A találmány szerinti eljárást valós klinikai esetek 25 vizsgálatában alkalmaztuk. A vizsgálati eredmények élettani megítélése a következő volt:

mg/100 ml alatt

10-20 mg/100 ml mg/100 mlfelett normál tartomány: nonnál-kóros határ: kóros tartomány: l)Altalános alkalmazások:

115 egészséges személynél, illetve nemrosszindulatú. betegségben szenvedő betegnél elvégzett LSAmeghatározások 95%-ban 20 mg/100 ml alatti értéket mutattak. Öt kezelés alatt álló pneumoniás betegnél az LSA érték 20-25 mg/100 ml tartományba esett (ez összhangban van az irodalomban közölt megfigyelésekkel). 94 betegnél, akikkülönböző típusú rosszindulatú betegségben szenvedtek (tüdő-, bél-, gyomor-, here-, mell-, gégerák), vizsgáltuk az LSA koncentrációkat, és egyidejűleg más TM anyagot (neopterín, poliamin stb.). A betegek egyik csoportját (30 fő) azok alkották, akiknél a vizsgálat a betegség klinikailag igazolt, aktív szakaszában történt. Acsoportban egyetlen előrehaladott májrákos beteg kivételével valamennyi esetben azLSAkórosanmagas értékeitméríük.

A másik csoportba tartozó betegeknél (64 fő) a tumor műtéti eltávolítása évekkelkorábban megtörtént. Itt a vizsgálatok célja a tumormentesség igazolása, illetve az esetleges recidivák jelzése volt. A csoport 20%-ában (13 fő) azLSAés egyéb IM-ek értékei egységesen rosszindulatú folyamatra, illetve ennek aktivizálódására mutattak. Ezeknél a betegeknél „nagy valószínűséggel aktív tumoros folyamat” értékelést adtunk Abetegektovábbi 25%-ában (16 fő) azLSAés az egyéb IM-ek értékei ellentmondásos képet mutattak: egyes értékekkórosan emelkedettek, mások anormál tartományon belül voltak Ezeket a betegeket „gyanú alatt állók”-nak minősítettük és kezelőorvosuknak javasoltuk a szokásosnál gyakoribb ellenőrzést és más diagnosztikai eljárás igénybevételét, illetve felhívtuk a figyelmet a számbajöhető egyéb, nem rosszindulatú betegségek (pl. gyulladás) lehetőségére. A csoport 55%-ában (35 fő) mind az LSA, mind a többi TM érték normál volt; így ezeknél„nagy valószíuűséeggel tumormentes állapot” értékelést adtunk 2) Egy ráktípus célzott vizsgálata:

A rosszindulatú nőgyógyászati daganatok közül a petefészek-rákot vizsgáltuk Az LSA-nak, mint tumor markemek a reális megítélését biztosította, hogy a vizsgálatba bevont betegekteljes és részletes kortörténete (szövettan, műtés, terápiás beavatkozásokformája és ideje stb.) rendelkezésre állt.

142 szövettanilag igazolt petefészek-rákos betegnél határoztuk meg az LSA koncentrációt a műtét előtt, majd ezt követően a különböző terpápiás beavatkozásokhoz kapcsolódva átlagosan 5-7 alkalommal. Az egyidejűleg vizsgált laboratóriumi paraméterek közül a CA-125 jelzésű monoklonális antigén értékeket vetettük össze az LSA megfelelő értékeivel, mivel jelenleg az epithelialis petefészek-rák jelzésére és követésére a CA-125 a nemzetközileg elfogadott legérzékenyebb tumor marker.

Az eredmények a következőkben foglalhatók össze:

a) A kezelés előtti állapotban (műtét előtt) mért LSA értékek 95%-ban nagyobb arányban kórosan emelkedettek voltak, ugyanitt a kőris CA-125 értékek aránya 95% alatt volt.

b) A tumor sikeres, teljes műtéti eltávolítását követően az LSA értékek átlagosan 45 nap alatt normalizálódtak, ez gyakorlatilag azonos a CA-125 tízszeres felezési idejével (45-50 nap).

c) Az LSA a CA-125-tel gyakorlatilag azonos érzékenységgel követte a betegség alakulását. A propagálót 100% biztonsággal jelezte. Akezelés hatására bekövetkezett kedvező irányú változásokat, javulásokat jelezte, de a CA-125-höz viszonyítva a csökkenés sebessége és értéke kisebb volt.

d) Arecidivák kialakulását aldinikai tünetekmegjelenése előtt 80%-ban előre jelezte.

e) Akialakult, klinikailag igazolt recidiváknál műiden esetben az LSA értékkórosan magas volt.

f) A petefészek-rákok statisztikailag mintegy 20%-át kitevő, nem epithelialis daganatokban (csírasejtes stb.) a CA-125 nem alkalmazható megbízható jelzésre. Nagyon lényeges, hogy az ilyen típuső rákok vizsgálatában az LSA változatlan érzékenységű tumormarkemekbizonyult,

g) A jó- és rosszindulatú daganatok differenciál diagnosztikájában való felhasználhatóság megítélésére 25 miómás és 12 jóindulatú petefészek-cisztás betegnél végeztük el az LSA meghatározást. Egyetlen esetben sem taáltunkkórosan magas értékeket.

A találmány gyakorlati alkalmazásának lehetőségei és előnyei akövetkezők 1) Laboratórium szempontok:

a) A módszer átlagos laboratóriumi ismeretekkel alkalmazható, speciális szakértelmet nem igényel.

b) Átlagos kórházi laboratóriumi műszerparkkal megoldható, járulékos eszközbeszerzést, beruházást

HU 204131 Β nem igényel.

c) A módszer leírása a gyakorlati kivitelezhetőség szempontjából minden szükséges információt részletesen tartalmaz, különös tekintettel azokra a tényezőkre (hőmérséklet, idő stb.), amelyek pontos betartása biztosítja a különböző laboratóriumokban végzett meghatározások megbízhatóságát.

d) A munka- és időigény alapján az eljárás sorozatelemzésként alkalmazható nagyszámú vizsgálati igény kielégítésére.

e) A felhasznált vegyszerek, anyagok költsége lényegesen kisebb (mintegy tizede) a gyakorlatban ma használt tumor marker vizsgálatok (CEA, CA-125, AFP stb.) költségeinek.

f) Az eljárásra könnyen kifejleszthető egy tömegesen forgalmazható vizsgálati egységcsomag (test kit). Ez a forma általánosan elterjedt a kórházi laboratóriumi gyakorlatban; a vizsgálati anyagok döntő többségét ilyen speciális egységcsomagokban szerzik be.

2) Klinikai szempontok:

Az emberi vérszérum lipidhezkötött sziálsav tartalma mint információ a rosszindulatú betegségek gyógyításában a következő területeken alkalmazható:

a) Szűrés, korai felismerés, diagnózis támogatása:

Az LSA érték a rosszindulatú folyamat típusától és előrehaladottságától függően 70-93%-os valószínűséggel jelzi a betegség gyanúját. Az eljárást olcsó, viszonylag egyszerű kivitelezhetősége alkalmassá teszi nagyszámú populáció szűrésére. Általános bevezetése jelentős többletköltséget, beruházást, berendezést nem igényel. Hangsúlyozni kell, hogy az LSA meghatározás természetesen önmagában nem oldja meg a rák felismerését, csak egy jól szervezett diagnosztikai rendszer elemeként alkalmazható megfelelően. Jelentősége a szűrőprogramokban az, hogy alkalmas egy nagyobb populációból a gyanús személyek kiemelésére, , akiknél már reális lehetőség van a bonyolultabb, speciális (következésképpen költséges) diagnosztikai eljárások alkalmazására, amelyek kapacitása technikai és anyagi szempontból már eleve korlázotott. Egy ilyen többlépcsős szűrőviszgálat a betegség felismerését a jelenlegi gyakorlathoz képest lényegesen hatékonyabbá tenné.

b) Rosszindulatú daganatos betegek állapotának követése, a terápiás beavatkozások hatásának ellenőrzése:

A dagantos betegek állapotának folyamatos követése a gyógyíthatóság esélyeit illetően legalább olyan fontos, mint a lehető legkoraibb felismerés. Az LSA meghatározás értékes eleme lehet (más laboratóriumi és diagnosztikai módszerekkel együtt) egy objektív követő, ellenőrző rendszernek. Ebben az alkalmazási formában az LSA értékek időbeli változása fontos információ a tumormentes, illetve progresszió állapotok elkülönítésében, továbbá a terápiás beavatkozásokhatásának ellenőrzésében.

Claims (5)

1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK

   1. Eljárás vér - elsősorban emberi vér - lipidhez kötött sziálsav-tartalmának meghatározására, amelynek során a vízzel hígított szérumból vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel vagy oldószer-eleggyel végzett extrakcióval eltávolítjuk a neutrális lipideket, a vizes fázisból kicsapjuk a lipidhez kötött sziálsav-tartalmú lipoprotein frakciót, a kicsapott lipoprotein frakciót újraoldjuk, az oldathoz szervetlen savat, réz(D)-sót és rezorcint adunk, és a rezorcinnal kiváltott színreakció alapján kiszámítjuk a szérum lipidhez kötött sziálsavtartalmát, azzal jel lemezve, hogy

   a) kicsapószerként 10.000 és 20.000 közötti móltömegű dextrán-szulfátot használunk 15-35 g/100 ml koncentrációjú oldatban, és a kicsapást 5,8 és 7,5 közötti pH-értéken végezzük, vagy

   b) kicsapószerként 4000 és 10.000 közötti móltömegű poli(etilén-glikol)-t használunk 15-55 g/100 ml koncentrációjú oldatban, és a kiesapást 9 és 11 közötti pH-értéken végezzük, vagy

   c) kicsapószerként vízben oldható mangán(II)-sót használunk 8,7-13 g/100 ml Mh²⁺ kationnak megfelelő koncentrációjú oldatban, és a kicsapást 5,5 és

   7,5 közötti pH-értéken végezzük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti c) eljárás, azzal jellemezve, hogy kicsapószerként mangán(D)-kloridot használunk 20-30 g/100 mikoncentrációjú oldatban.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kicsapott lipoprotein frakció újraoldásához 7 és 9 közötti pH-értékű vizes pufferoldatot használunk.
4. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kicsapószerként mangán(Il)-kloridot használunk 22-27 g6100 ml koncentrációjú oldatban, és a kicsapás 6,0 ± 0,1 pH értéken végezzük.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alipoprotein-frakció újraoldásához vizes pufferoldatként 10 mmól/1 koncentrációjú trisz(hidroxi-metil)-amino-metán pufferoldatot használunk.