HU203780B - Process for producing living liophylised vaccine against infecting bursitis - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás a baromfiak fertőzd bursitis betegségének megelőzésére alkalmas liofilizált élő vakcina előállítására.

A fertőző bursitis (más néven Gumborói betegség) a baromfi fertőző betegsége, amelyet egy bimavírus okoz. A vírus nagymértékben károsítja az immunrendszert, a Fabricius-féle tömlőben a B-limfocitákat, ezért a szervezetben súlyos immundeficiens állapot alakul ki. Más vírusokkal szembeni vakcinálásra (baromfipestis, fertőző brochitis, fertőző gége- és légcsőgyulladás) is elégtelen az immunválasz. A beteg szervezet fokozottabban érzékeny más betegségekre (mycoplasmosis, coccidiosis) [Winterfield R. W.: Poultry Sci. 57, 386, (1978); Giambrone J. J.; Am. J. Vet. Rés. 38, 581 (1977); Hirai K.: Av. Dis. 23,950 (1979)].

A betegség főleg 3-6 hetes csirkeállományokban jelentkezik, és gyorsan terjed. Az egyedi megbetegedések egy héten belül lezajlanak. Tipikus esetekben a betegek bágyadtak, étvágytalanok, vízszerű bélsarat ürítenek, nehézkesen mozognak és rövid idő múlva elhullanak. Boncoláskor a legjellegzetesebb elváltozások a bursa Fabriciiben láthatók, amely a betegség heveny szakában duzzadt, ödémás, és üregében fibrines-véres, zavaros nyálka vagy törmelékes anyag található. A nyálkahártyán vérzések láthatók.

A fertőzöttség az egész világon széles körben elterjedt. Magyarországi előfordulásáról a hetvenes évek közepe óta tudunk [Palya V.: Magyar Állatorvosok Lapja 36,75-81 (1981)].

A fertőzésnek kitett állatok védelméről aktív immunizálással kell gondoskodni.

Immunizálásra leginkább a tojásban és szövettenyészetben passzált, gyengített élő vírust tartalmazó liofilizált és maktivált vírust tartalmazó adjuvált vakcina alkalmas. A vakcinákról általános ismertetés található az R. W. Winterfield: Avian Disease 22, 721, (1978) Immuné Response and Pathogenicity of Different Strains of Infections Bursal Disease Vírus Applied as Vaccines irodalmi helyen.

Az élő vakcina használatának előnye, hogy a vírus a szervezetben szaporodik, és az érintetlen felületi antigénjei ellen nagy mennyiségben termelődik ellenanyag. Az adagolása egyszerű, mert ivóvízhez keverve szájon át adható.

Hátránya, hogy ártalmatlansága nem egyértelmű. A forgalomba hozott vakcinák (például az INTERVET által gyártott PBG-98 és D-78, TAD gyártmány) a vírus különféle mértékben attenuált (csökkentett virulenciájú) változatát tartalmazzák. A vakcinában foglalt vírus maradék virulenciáját (bursakárosító hatását) pontosan kell ismerni, mert ettől függ, hogy milyen immunbiológiai állapotban lévő állományokban használható.

Szülőállományok oltása után az utódokban nem alakul ki tartós és egyenletes védettség.

A találmány célja, hogy egyszerű eljárást biztosítson a fertőző bursitis ellen védettséget adó élő vírus-vakcina előállítására.

Az. attenuált vírusok különböző mértékű maradék virulenciával rendelkeznek.

Az erősen attenuált (például többszörösen passzált) vírus nem károsítja a bursa Fabriciit, de matemális ellenanyagok jelenlétében nem immunizál. Az ebből készült vakcina ezért vagy fogékony naposcsibék vagy matemális ellenanyaggal már nem rendelkező állományokban használható.

A mérsékelten attenuált vírusból készült vakcinák bursakárosító hatásuk folytán a velük az élet első heteiben oltott fogékony csibékben immunszupresszív hatásúak. Ezeket ezért magas matemális ellenanyagszinttel bíró állományokban alkalmazzák 3-4 heste korban.

Az általunk 1975-ben'nagyüzemi broiler állományból izolált törzs egy mérsékelt virulenciájú törzs. A

8-10 napos embrionált tyúktojásban történt tizenötször! passzálás után a vírust csirkeembrió fibroblaszt szövettenyészethez szoktattuk. A szövettenyészetben a harmadik vakpasszázst követően jellegzetes citopatológiai elváltozás jelentkezett. Ezután a törzset a csiikeembrió fibroblaszt szövettenyészetben végzett háromszori plakkozással tisztítottuk, és az így nyert homogén vírustörzset további passzálásokon vittük át. A reziduális patogenitás meghatározása céljából egynapos és 34 hetes korú SPF csibéket fertőztünk szájon át a vakcina adagjának többszörösével. A bursa kórszövettani vizsgálata alapján 3 hetes kor után a vakcina ártalmatlan.

A vakcinát tárolhatósága érdekében liofilizálni szükséges. A különböző védőanyagokkal (tej, savó, zselatin, szacharóz, kollidon, pepton, tripton) liofilizált vakcinával hőterhelési próbát végeztünk. Megállapítottuk, hogy a megfelelően liofilizált vakcina 5 ’C-on egy évig a vírustartalom csökkenése nélkül tárolható.

A liofilizálást ismert módon végezzük tejjel, előnyösen tehén tejével.

A találmány tárgya közelebbről eljárás a fertőző bursitis ellen megfelelő immunitást biztosító élő liofilizált vakcina előállítására, oly módon, hogy a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem Mikrobiológiai Tanszéki Csoportjánál NCAIM V(P) 001 034 számon 1987. december 15-én letétbe helyezett LIBDC/82 jelű fertőző bursitis vírustörzset 10-12 napos, előnyösen 11 napos csiikeembriókból tripszines emésztéssel készített fibroblaszt tenyészetben 3-5 napig szaporítjuk, majd vírustiter megóvása céljából védőkolloid alkalmazásával - liofilizáljuk.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott vírustörzs citopatogén hatással rendelkezik (ezt az oltástól számított 3-5 napon belül észleljük), emiatt a vírusszaporodás a szövettenyészetben fénymikroszkópos vizsgálattal nyomon követhető.

A vírus a sorozatpasszálások során megtartotta jó antigén hatását, és a bursát károsító hatását a 3 hetesnél idősebb csibékben elveszítette. A vírustörzs csirkeembrió fibroblaszt szövettenyészetben szaporodik, amely bármelyik szövettenyésztő laboratóriumban rendkívül könnyen, rutinszerűen előállítható.

Az adagolás módja igen egyszerű, mert az állatok ivóvízében adható.

A találmányt az alábbi példával világítjuk meg közelebbről:

HU 203 780 Β

Példa

10—11 napos SPF előkeltetett tyúktojás embrióinak 0,07-0,09%-os tripszines emésztésével szóvettenyészetet készítünk.

A sejtek szaporítását 10% TPB (triptóz-foszfát leves)-t, 4% boíjúsavót tartalmazó MEM-H tápfolyadékban végezzük. A palackokban 24-48 órára benőtt sejtkultúrát 100-1000 TCIDjq/O.I ml LIBDV/82 jelű vírus 10 ml-ével oltjuk be. Egy óra adszorbeáltatás után 10% TPB-t, 2% borjúsavót tartalmazó MEM-E fenntartó oldattal a palackokat feltöltjük. A palackokat 37 *C- on tartjuk. 3-5 nap alatt a vírus sejtkárosító hatása teljessé válik, ekkor a felülúszókat összeöntjük. A steril és legalább 10⁶ TCID₅₀/0,1 ml titerű anyagot a további felhasználásig fagyasztva tároljuk, majd 50% arányban steril, sovány (fölözött) tejet keverünk hozzá.

Az anyagot 2 ml-enként 10 ml-es liofilizáló üvegekbe töltjük és liofilizáljuk. A vakcina a kipróbálástól számított egy éven belül használható fel. 2 ml vakcina 500-1000 csibéhez elegendő. 3 hetesnél idősebb csibéknek adjuk.

A példában alkalmazott rövidítések:

SPF: specifikus kórokozóktól mentes állományból származó csirke,

TPB: triptóz-foszfát leves,

MEM-H:¹ Minimál Essential Medium-Hanks,

MEM-H:² Minimál Essential Medium-Earle,

TCID^: Tissue culture infenctive dose, a szövetkultúrát 50%-ban fertőző dózis ¹ összetételét lásd a Hanks, H., Wallace, R. E, Proc. Soc, Exp. Bioi. Med, 71,196 (1943) Eagle, H.: Science 130,433 (1959) irodalmi helyen.

² összetételét lásd az Earle, W. R.: J. Natl. Cancer Inst. 4,165 (1943), Earle, H.: Science 730,433 (1959) irodalmi helyen.

A találmány szerint előállított vakcina hatékonyságát részben az immunizálást követő szerológiai áthangolódás (agargélprecipítációs-, vírusneutralizációs próba) meghatározásával, részben az immunizálást követően különböző időpontban történt vadvírus ráfertőzéssel szembeni védettség mértékében mértük. Egynapos és háromhetes SPF (Specific Pathogen Free) csirkéket vizsgáltunk. Egy-egy csoportban 50 állatot immunizáltunk. Az immunizálást követő második naptól kétnaponként 5-5 állatot vadvírussal ráfertőztünk, illetve

5-5 állatot elvéreztettünk szerológiai vizsgálatok céljára.

Megállapítható volt, hogy a napos korban történt vakcinázás után a 8. naptól alakult ki számottevő védettség, amely a 10. napon már 100%-os volt Ugyanezekben az időpontokban tudtunk először kimutatni ellenanyagokat is a vérben.

hetes korú állatok immunizálása esetén már a vakcinázás utáni 4. naptól teljes védettség alakult ki.

A törzs esetleges meglévő reziduális (maradék) patogenitásának és ártalmatlanságának meghatározása céljából 1 napos és 3-4 hetes csirkéket fertőztünk szájon át 10⁵ TCID_5C/0,2 ml vírussal. Összehasonlítás céljából egy csoport csibét vadvírussal fertőztünk. Kontrollként hasonló korú és létszámú fertőzetlent vizsgáltunk. Egy-egy csoportban 30-30 állatot fertőztünk. A fertőzést követően figyeltük az esetlegesen észlelhető klinikai tüneteket, majd az 5., 10. és 22. napon valamennyi csoportból 10—10 állatot leöltünk. Elvégeztük valamennyi állat kloakális bursá-jának kórszövettani vizsgálatát.

Megállapítható volt, hogy egyetlen vakcinázott csoportban sem jelentkezett megbetegedés vagy elhullás. Kórszövettani vizsgálattal megállapítható volt, hogy a vakcinázás utáni 5. napon enyhének minősíthető elváltozásokat észleltünk: mérsékelt lymphoid necrosist és a lymphoid sejtek részleges kiürülését. Vérzést, ödémát, gyulladást vagy kifejezettebb necrosist sohasem találtunk Ezek a kezdeti elváltozások a későbbi (10. és 22. nap) vizsgálatoknál nyomtalanul regenerálódtak.

Megállapítható tehát, hogy az előállított vakcinának nincs bursa Fabricii károsító hatása.

Claims (2)

1. Eljárás fertőző bursitis elleni élő liofilizált vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a LIBDC/82 jelű, NCAIM V(P) 001 034 számon letétbe helyezett fertőző bursitis vímstörzset csirkeembrió fibroblaszt sejttenyészeten szaporítunk, a maximális vírustiter elérésekor a vírusfolyadékot összegyűjtjük, majd védőkolloid alkalmazásával liofilizáljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy védőkolloidként sovány tejet alkalmazunk.