HU200506B

HU200506B - Reagent to the detection of the glucose in biological samples

Info

Publication number: HU200506B
Application number: HU528188A
Authority: HU
Inventors: Feltalalok Nevuek Feltuentet A
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1988-10-13
Filing date: 1988-10-13
Publication date: 1991-09-30

Abstract

A találmány tárgya reagens glükóz biológiai minták- datot tartalmaz. A találmány szerinti reagens kompo- ban történő meghatározására, amely 4-amino-fena- zíció rcaktánsként meta-krezolt tartalmaz vízben zont, nátrium-azidot, enzim katalizátort és pufféról- oldva, 0,5-3,0 mmól/liter koncentrációban. < o 10 o © CM A leírás terjedelme: 6 oldal (1 lap ábra) -1-

Description

A találmány tárgya új reagens glükóz biológiai mintákban történő meghatározására, amely 4-amino-fenazont enzim-katalizátort, puffer-oldatot, konzerválószert, valamint egy új színreaktánst tartalmaz.

Ismert, hogy a klinikai kémiában egyre nagyobb je- 5 lentőségű a biológiai mintákból, előnyösen emberi vérből, ill. vizeletből történő glükóz gyors, pontos mennyiségi meghatározása.

Az ismert módszerek azon alapulnak, hogy minták glükóz-tartalmát glükózoxidáz (GOD) katalízissel 10 oxidálják, a keletkezett hidrogén-peroxidot peroxidáz (POD) katalízissel bontják. Az így létrejött atomos oxigén a reakciókeverékben lévő 4-amino-fenazonnal más - valamely fenolt vagy fenol-származékot tartalmazó - színreaktánssal a minta glükóz-koncentráció- 15 jával arányos színintenzitású terméket hoz létre, melyet fotometriásan egyszerűen mérhetünk.

A 4-amino-fenazon (kémiai nevén: l-fenazol-2,3dimetil-3-amino-pirazolin-5-on) fenollal való reakcióját P. Trinder alkalmazta először a vér glükóz-tartal- 20 mának meghatározására. (Ann. Clin. Biochem. 6, 24 [1969].) Ezt követően az irodalom meglehetősen nagyszámú változatot ismertet a fenol különböző vegyületekkel, elsősorban fenol-származékokkal, hidroxibenzoesav-származékokkal, anilin-származékokkal és 25 szulfonsav-származékokkal való helyettesítéséről.

Ezen módszerek általános hátránya az, hogy a keletkezett szín nem kellően stabil, a mérési határok meglehetősen szűkek vagy a mérést karakterisztika nem mindig lineáris. 30

A legújabb publikációk közül kiemelendő a 188 953 sz. magyar szabadalmi leírás. A leírás szerint reaktánsként timolt használtak. A módszer hátránya elsősorban az, hogy timolt meglehetősen nagy mennyiségű etanolban kell feloldani. 35

A találmány célja tehát olyan reagens kidolgozása, melynek használata egyszerű, gyors, de ugyanakkor kevés és kis koncentrációjú reaktánsokat igényel, lehetőleg oldószermentes, azaz vizes közegben.

Előkísérleteink során igen nagyszámú fenol-szár- 40 mazékot próbáltunk ki színreaktánsként. Különösen a 2-, 3- és 4-helyen szubsztituált fenol-származékok körét vizsgáltuk át részletesen.

Kísérleteinkből megállapítottuk, hogy kiemelkedően kedvező hatás kapható m-krezol használata esetében. Ez a felismerés egyáltalán nem volt előre várható. Bár a korábbi publikációk a sokféle fenol-származékok között a kromofor-csoport kialakíthatósága szempontjából - felsorolásszerűen - említést tesznek a krezolról is (lásd például 4 226 713 sz. szabadalmi leírás 7. hasáb), azonban semmiféle értékelhető számszerű adatot nem tartalmaznak.

Az 54 358 sz. európai szabadalmi bejelentés például több mint 100 vegyületet sorol fel szóba jöhető kromofor-csoportot hordozó reagensként (ezek közül 15 vegyületről pH=5;6;6,75; valamint 8-értéken mért színreakció-időtartamot is), azonban semmi jelzés nem található az m-krezol kiváló hatásáról.

Összehasonlító kísérleteinkben majdnem nagyságrendileg kedvezőbb eredményeket kaptunk, ha reaktánsként m-krezolt használtunk o-krezollal, p-krezollal vagy timollal, fenollal, 2,5-dimetü-fenollal, 5-i-propil2-metil-fenollal, 3,5-dimetü-fenolIal összehasonlítva.

Úgy tűnik, hogy a fentiek közül az aromás gyűrű elektron-eloszlása az m-krezol esetében a legkedvezőbb, a kialakult kinoidális gyűrű pedig az igen tartós színhatás elérésében játszik szerepet.

A találmány: reagens biológiai mintákban történő glükóz meghatározására, amely 4-amino-fenazont, enzim-katalizátort, konzerválószert, puffer-oldatot és reaktánsként 0,5-1,5 mmól/liter koncentrációban vízben oldott m-krezolt tartalmaz.

A reagens egy előnyös kiviteli alakjában 0,51,5 mmól/liter 4-amino-fenazont, 10-15 mmól/liter nátrium-azidot, 8-12 U/ml glükóz-oxidázt, 1020 U/ml peroxidázt (ahol U jelentése 1 nemzetközi egység), 0,05-0,5 mmól/liter Na₂HPO₄-KH₂PO₄-tartalmú (pH=7,0-8,0 közötti értéket biztosító) pufferoldatot és 0,5-1,5 mmól/liter m-krezolt tartalmaz.

A találmány szerinti reagens kitűnően alkalmazható diagnosztikai készlet formájában. A diagnosztikai készletet, ill. a vele végzett vizsgálat vázlatos menetét példáinkban ismertetjük.

A találmány szerinti raegens optimális m-krezol koncentrációjának megválasztását az 1. táblázatban mutatjuk be.

A 4-amino-fenazon-koncentráció optimalizálását a

2. táblázat adataiból láthatjuk.

1. táblázat

Az optimális m-krezol koncentráció kiválasztása m-krezol koncentráció a reagens elegyben mmól/1

glükóz oldat koncentráció	0,3	0,4	0,5	0,7	1,0	12	1,5	2
5 mmól/I abszorbancia	0,190	0,200	0,210	0,210	0,210	0,211	0,210	0,210
30 mmól/1 abszorbancia	1,105	1,164	1,246	1,245	1,245	1,245	14245	1245

2. táblázat

A 4 armno-fenazon optimális koncentrációnak kiválasztása

4-amino-fenazon mmól/1
glükóz oldat koncentráció	02	0,4	0,5	0,8	1,0		1,5
5 mmól/1 abszorbancia	0,200	0,210	0,210	0210	0210	0210	0210
30 mmól/1 abszorbancia	0,870	1,080	1240	1244	1,240	1244	1240

HU 200506 A

A méréseket normál és pathológiás tartományban levő glükóz-oldattal és a reagenselegyben lévő

1,2 mmól/l-es koncentrációjú m-krezollal végeztük.

A táblázat adatai jól tükrözik, hogy a 0,5 mmól/l-es

4-amino-fenazon koncentrációi maximális és tovább 5 nem változó abszorbanciát adtak, de biztonsági okokból az 1 mmól/l-es tekinthető optimálisnak.

Linearitás-vizsgálat:

2,5; 5,0; 1.0; 15; 20; 25; 30; 35 mmól/1 koncentrációjú vizes glükóz standard-oldatokat használtunk, minden koncentrációból 5-5 mérést végeztünk (lásd 3. táblázat). Az adatokból látható, hogy a mérési karakterisztika - az adott tartományban (3Ö mmól/l-ig) - lineáris. A karakterisztikákat az 1. ábrán mutatjuk be.

3. táblázat Linearitásvizsgálat

Glükózkoncentráció (mmől/l)
	2,5	5,0	10,0	20	25	30	35
X	0,118	0,201	0,400	0,795	1,01	1,195	1,345
X	0,120	0,200	0,400	,· 0,800	1,00	1,200	1,400
d%	-1,6	+0,5	0,0	0,0	+0,1	-0,17	-4,28

X ; a mért abszorbancia átlagai

X : a kalibrációs egyenes egyenletéből számított abszorbanciák d% : a mért és a számított abszorbanciák %-os különbsége %) (100% a számított)

A regressziós egyenes egyenlete: y - 0,0387 x+0,0180 Korrelációs együttható: r - 0,9994

Összefoglalva a találmány szerinti reagens előnyeit megállapíthatjuk, hogy

a) az m-krezol reaktáns alkalmazásával kapott színes termék abszorpciós maximuma 480-520 nm hullámhossz között van, itt jól végezhetők a fotometriás, ill. spektrofotometriás mérések,

b) a találmány szerinti reagens által létrehozott színreakció pH-optimuma 7,0-8,0 közötti érték és ez előnyös, mivel pH-7,8 körül a legkedvezőbb az alfaD-glükóz mutarotációja béta-helyzetűvé,

c) a korábban ismert reagenseknél (például a 188953 sz. magyar szabadalmi leírás) a fehérjementesítést legfeljebb 3 tömeg%-os triklórecetsavas oldattal lehet végezni (fehérjementesítésre a mintákban jelen levő fehérjék és bilirubin zavaró hatásának kiküszöbölése céljából van szükség), találmányunk szerinti reagens esetében a hatékonyabb 5-6 t%-os triklórecetsav oldat is használható,

d) a találmány szerinti reagens által létrehozott fotometriálható szín abszorbanciája még 24 óra után is változatlan,

e) a mérés során létrehozott reakcióelegyben a reaktáns végkoncentrációja jóval alacsonyabb, mint az eddigi módszereknél (összehasonlításul a Trinder-módszernél a fenol 10 mmól/1, a 188 953 sz. magyar szabadalmi leírás szerinti módszernél a timol 2,3-2,7 mmól/1 körüli koncentrációjú, míg találmányunk esetében az m-krezol végkoncentrációja 1,2 mmól/1 körüli, de legfeljebb

1,5 mmól/1 érték),

f) a találmány szerinti reagens igen jól kezelhető vizes oldat, a színreagenset tartalmazó „B”-komponens 2-3 évig is tárolható, bomlás nélkül.

A találmány alapján kidolgozott diagnosztikai készlet és annak használatát az alábbi példán mutatjuk be:

Elv: A B-O-glükózt a GOD enzim glükonsawá H₂O₂-vé oxidálja.

A POD a keletkezett H₂O₂-vel arányos színes, jól fotometrálható kinoidális terméket képez az m-krezol és 4-amino-antipirinből.

Reagensek alap (kezdő) koncentrációi:

1. Színképző I	foszfát (Na2HPO4 X 2H2O+KH 2PO4)puffer	ló0mmól/i pH-7,8
4-amino-fenazon	1 mmól/1
(,Λ’’-komponens)	nátrium-azid	12,0 mmól/1
2. Enzimek	GOD >	lOU/ml
POD	> 15U/ml
3. Színképző II	(,B”-komponens) -mkrezol vizes oldata	25,5 mmól/1
4. Standard	10 mmól/1 glükóz-oldat

A teszt kiszerelése:

4x1 flakon 4x1 literre

000 GOB ^{4 X} 10 000 POD (liofilizált) x 100 ml színképző II. 1 x 10 ml standard.

Tárolás:

+2 - +8 °C-on. A készlet falhasználható a dobozon feltüntetett időpontig.

Reagensek készítése „A. -komponens:

Az 1. sz flakon (Színképző I.) tartalmát feloldjuk

HU 200 506 A

1000 ml-re desztillált vízzel, majd ebben az oldatban oldjuk a 2. sz. üveg (Enzimek) tartalmát.

Az oldat +2 - +8 ’C-on három hónapig eltartható.

„B”-komponens

A 3. sz. üveg (Színképző Π.). Használatra kész. Korlátlan ideig eltartható.

Színreagens:

A napi vizsgálati számnak megfelelően 20 rész, A”komponenst elegyítsük 1 rész „Β’’-komponenssel. Jól összekeverjük. Színreagens komponenseinek összetétele a reakcióelegyben:

Foszfát puffer: 150 mmól/1 (pH=7,8)

4-amino-fenazon: 0,94 GOD: 9E/ml

POD: 14E/ml nátrium-azid: 11,3 mmól/1 m-krezol: 1,2 mmól/1

Minta:

A vizsgálatot elvégezhetjük szérumból, plazmából, fehérjementesített vérmintából és vizeletből. Fehérjementesítőként 3-6%-os triklór-ecetsav-oldat (TCA) használható. ,

A magas bilirubin tartalmú szérumot célszerű fehérjementesíteni.

A vizsgálat menete szérum használata esetén: a vénából nyert megalvadt vért 1 órán belül centrifugáljuk, és a mérést 2 órán belül elvégezzük.

A vizsgálat menete:

	Reagensvak	Standard	Minta
Standard oldat	-	0,02 ml	-
Minta	-	-	0,Ó2ml
Színreagens	2,5 ml	2,5 ml	2,5 ml

Összekeverjük, majd szobahőmérsékleten 30 percig vagy 37 ’C-on 15 percig inkubál juk.

Leolvasás: A standard és a minták fényelnyelését 492 nm vagy Hg 546 nm, a spektrofotométeren 500 nm-en vagy 480-520 nm közötti színszűrővel, reagens vakkal szemben mérjük le, 1 cm fényutas küvettában, öt órán belül.

Számolás: a .

Glükóz mmól/1- — xlO ^Standard ahol, A” - mért extinkció mmól/1 érték felett a mintát kétszeresére hígítjuk desztillált vízzel vagy fiziológiás sóoldattal és a mérést megismételjük. Az eredményt kettővel megszorozzuk.

Eljárás fehérjementesített mintából:

Minta előkészítése:

1,0 ml 3-6%-os TCA-oldatba bemérünk 0,1 ml vért, összekeverjük, majd 10 perc állás után lecentrifugáljuk. A továbbiakban a tiszta felülúszót használjuk a vizsgálathoz.

Standard hígítás:

1,0 ml 3 -6%-os TCA oldathoz 0,1 ml standard oldatot adunk. Jól összekevrjük. A vizsgálat menete:

	Reagensvak	Standard	Minta
Desztillált víz	02 ml	-	-
Standard keverék	-	0,2 ml	-
Minta felülúszó	-	-	0,2 ml
Színreagens	2,5 ml	2,5 ml	2,5 ml

Összekeverés, inkubálás, valamint a mérés menete egyezik a szérumnál leírtakkal.

Normál érték:

Szérum: 3,35-5,55 mmól/1

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Reagens glükóz biológiai mintákban történő meg30 határozására, amely 4-amino-fenazont, nátrium-azidot, enzim-katalizátort és puffer-oldatot tartalmaz, azzal jellemezve, hogy reaktánsként vízben oldott meta-krezol 10,5-1,5 mmól/liter koncentrációban tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti reagens, azzal jellemez35 ve, hogy

0,5-1,5 mmól/liter 4-amino-fenazont,

10-15 mmól/liter nátrium-azidot,

8-12 U/ml glükóz-oxidázt,

10-20 U/ml pcroxidázt,

40 0,05-0,5 mmól/liter Na₂HPO₄-KH₂PO₄ tartalmú puffer-oldatot és

1-1,5 mmól/liter meta-krezolt tartalmaz.