HU199899B - Process for production of poliether antibioticum marked as a 80577 and fodder composition containing them - Google Patents

Description

A jelen találmány az A80577 jelű új poliéter antibiotikummal és az új Actinomadura verrucosospora NRRL 18236 törzzsel foglalkozik, amely ezt az antibiotikumot termeli. Az A80577 szerkezeiét az (1) képlet mutatja be.

A jelen találmány tárgya az A80577 antibiotikum előállítására szolgáló eljárás, amely abból áll, hogy Actinomadura verrucosospora NRRL 18236 törzset vagy ennek A80577-et termelő variánsát vagy mutánsát tenyésztjük süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között olyan tápközegben, amely asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat és szervetlen sókat tartalmaz, annyi ideig, amíg A80577 képződik. Az A80577et a fermentációs tenyészléből és a micéliumból szerves oldószerekkel extraháljuk. Az A80577-et elkülönítjük és tovább tisztítjuk megfelelő technikákkal, pl. oszlopkromatográfiával.

Mivel az Actinomadura verrucosospora NRRL 18236 újonnan felfedezett törzs, ez a találmány ennek a mikroorganizmusnak, vagy olyan mutánsának vagy variánsának, amely A80577 antibiotikumot termel, biológiailag tiszta tenyészetét is szolgáltatja.

Az A80577 hasznos antibakteriális szer. Javítja a táplálékhasznosítás hatékonyságát kérődzőkben, és növekedés-serkentőként hat kérődzőkben és egy-gvomrú állatokban. Ezen kívül az A80577-nek paraziticid aktivitása is van, és alkalmas ionofór anyagként. Ennek megfelelően a jelen találmány olyan táplálék-kompozíciókra is vonatkozik, amelyek növelik a tápanyag-hasznosítás hatékonyságát kérődző állatokban, ez a kompozíció állati táplálékból és hatásos mennyiségű A80577 antibiotikumból vagy az A80577nek vagy származékainak sóiból áll. A jelen találmány szerinti vegyület és sói növelik a tápanyaghasznosítás hatékonyságát oly módon, hogy orális úton ezeknek az anyagoknak hatásos mennyiségét adjuk be állatoknak.

A rajzok az alábbi infravörös abszorpciós spektrumokat mutatják kloroformban:

1. ábra: A80577 (Na-só)

2. ábra: A80577 (K-só)

A javított antibiotikumokra folyamatosan van igény az állatorvosi szakterületen. A növekedés elősegítésének fokozása állatokban az ilyen antibiotikumok egyik kívánatos vonása. A növekedés elősegítését úgy érhetjük el, hogy csökkentjük a betegségeket és növeljük a táplálékhasznosítás hatékonyságát. Különösen érdekes a növekedés elősegítése kérődzőkben, pl. szarvasmarhákban.

A kérődzők tápláléka fő tápláló részének (szénhidrátok) hasznosítási mechanizmusa jól ismert. Az állat bendőjében levő mikroorganizmusok lebontják a szénhidrátokat, hogy monoszacharidokat hozzanak létre, majd ezeket a monoszacharidokat alakítják piruvát vegyületekké. A piruvátok metabolizálódnak mikrobiológiai eljárások révén, és acetátok, butirátok vagy propionátok keletkeznek, amelyek együttesen illó zsírsavakként (VFA) ismeretesek.

A VFA hasznosításának relatív hatékonysága kapcsolatban van az összesített hatékonysággal, fgy bár az acetátok és butirátok is hasznosulnak, a propionátok hasznosodnak nagyobb hatékonysággal. A propionát-termelés fermentációs hatékonysága is nagyobb, mint a butiráté vagy az acetáté. Ez még a hasznosítási hatékonyságon felül van. Egy előnyös vegyület tehát ennélfogva arra serkenti az állatokat, hogy a szénhidrátokból nagyobb arányban termeljenek propionátokat, ezáltal megnövekedjék a szénhidrát-hasznosítás hatékonysága.

Az A80577 a poliéter antibiotikumok családjának új tagja. Westley [Westley John W.: Polyether Antibiotics, Naturally Occuring Acid Ionophores, Vol. 2, Chemistry” (Poliéter antibiotikumok: természetben előforduló savak ionofórok, 2. kötet; Kémia), kiadó: Dekker Marcel, New York (1983); Journal of Natural Products, 49 (1), 35 (1986)] a meglevő poliétereket osztály és típus szerint különítette el. Westley rendszerét alkalmazva az A80577 a poliéterek 4. osztályának új tagja. Ez a csoport foglalja magában a tetronomicint, amelyet a J. Antibiotics, 142 (1982) irodalmi helyen írnak le, és az M139603at, amelyet a J. Am. Chem. Comm. 1073 (1981) és 4.279.849. lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás irodalmi helyeken írnak le.

Az A80577 (nátrium-só formájában) a következő jellemzőkkel bír (a nátriumsótól eltérő formákat (kálium-, ill. sav-formaj külön jelezzük):

Állag: fehér kristályok (aceton-vízből); op.: (Na-só) 276-278 ’C, (K-só) 270 - 272 ’C.

Molekulatömeg: 782 mező-deszorpciós tömegspektrometria /field desorption mass spectometry (FDMS)/ szerint: 760 sav formájában.

[u 1 t)^{= -} B9,03 (c = 5, metanol).

Titrálható csoport nincs (66% DMF).

Tapasztalati képlet: C^H^O^Na.

UV maximum: semleges etanol, 253 nm (t = 17735), 298 nm (c = 10003); savas 250 nm (f = 14715), 289 nm (< = 7971); bázisos 208 nm (e = 192222), 248 nm (< = 15968), 286 nm (e = 9665).

IR (Na-só, CHCI3): 3018, 2966, 2931, 1750, 1611, 1453, 1439, 1219, 1022 és 1012 cm⁴ (lásd

1. ábra).

IR (K-só, CHCI3): 3023, 3019, 2967, 2964, 2930, 2874, 1750, 1650, 1451, 1437, 1224, 1214, 1210, 1079, 1059, 1022 és 1012 cm⁴ (lásd 2. ábra).

Oldhatóság: nem nagyon oldható vízben, oldható dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, kis szénatomszámú alkoholokban, pl. metanolban, ketonokban, pl. acetonban, észterekben, pl. etil-acetátban, halogénezett szénhidrogénekben, pl. kloroformban, éterekben, pl. dietil-éterben, szénhidrogénekben, pl. benzolban, toluolban és meleg hexánban.

Az A80577 fizikai jellemzőire alapozva úgy véljük, hogy ez az (1) képletben bemutatott szerkezettel rendelkezik. Amint ez szerkezetéből nyilvánvaló: az A80577 molekula képes sókat képezni. Az A80577-nek van négy hidroxilcsoportja, amelyek észterezve lehetnek vagy éter-származékokat képezhetnek.

HU 199899 Β

A valamely A80577 vegyület kifejezést itt úgy használjuk, hogy jelöli az A80577 antibiotikumot ((1) képlet] és az A80577 antibiotikum valamely gyógyászatilag elfogadható bázisos sóját.

Az A80577 antibiotikumot az Actinomadura 5 verrucosospora egy A80577-termelő törzsének, az NRRL 18236 törzsnek a tenyészete termeli, ahogyan ezt itt leírjuk. Az antibiotikum süllyesztett aerob körülmények között keletkezik megfelelő tápközegben; ezt a lápközegből különböző, a szakterületen ismert izolálási és tisztítási módszereket alkalmazva nyerhetjük ki.

Az A80577-termelő organizmus tenyészetét deponáltuk, így részévé váll a Midwest Area Northern Régiónál Research Center, Agriculture Research Service, U.S. Department of Agriculture tenyésztörzs gyűjteményének (1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604), ahol ez a köz számára rendelkezésre áll NRRL 18236 deponálási számon.

Ennek az organizmusnak a taxonómia tanulmányait Mertz P. Frederick (Lilly Research Laboratories) végezte el. Ezekre a tanulmányokra alapozva az organizmus az Actinomadura nemzetséghez tartozik [Lechevalier és Lechevalier,

1970. Prouser H. által szerkesztett könyvben:

The Actinomycetales, kiadó: VEB Gustav Fischer Verlag, Jena (393 - 405. oldal)].

Az International Streptomyces Project (ISP) által ajánlott módszereket követjük a Streptomyces fajok jellemzésére [Shirling E.B. és Gottlieb D.: 'Methods fór Characterization of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacterial. 16(3),313-340(1966)].

A melanoid pigment termelést (kromogenicitást az ISP N^e 1-gyel (tripton-élesztőkivonat tápközeg); ISP N° 6-tal (pcplonélesztőkivonal-vas agar), és ISP N° 7-tel (tirozin agar) határozzuk meg.

A keményítő hidrolízist keményítő jelenlétében vizsgálva határozzuk meg jóddal ISP N° 4 (szervetlen só-keményítő agar) lemezeken.

A morfológiát optikai fénymikroszkópot alkalmazva tanulmányozzuk. Tapogató elektronmikroszkópot (SEM) alkalmazunk a spóra felületi ornamentika tanulmányozásához.

Az ICSS — NBS Centroid Color Charts, 2016. standard mintát (national Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) és a Color Harmony Manual-t (4. kia10 dás, Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) alkalmazzuk, hogy megjelöljük a színek nevét a hátoldalon illetve a légspóra-tömegen.

A diaminopimelinsav (DAP) izomerjeit és a 15 szénhidrátokat a teljes sejtek hidrolizátumaiban Becker és munkatársai kromatográfiás módszereivel [Becker B., Lechevalier Μ. P., Gordon R.E. és Lechevalier H.A.: Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper 20 Chromatography of Whole-cell Hydrolysates, Appl Microbiol. 12, 421-423 (1964)] és Lechevalier módszereivel [Lechevalier M.P. és Lechevalier H.: Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic 25 Actinomycetes Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 435-443 (1970)] határozzuk meg.

Az antibiotikumokra való rezisztenciát ISP N” 2 agar lemezekre oltott tenyészet felületére helyezett antibiotikum érzékenységi korongokkal 30 mérjük.

Tenyésztési jellemzők

Az A80577 tenyészete jól nő mind komplex, mind meghatározott tápközegeken. A légspóratömeg mérsékelten képződik, és fehér színű. A 35 hátoldal sárgásfehér és halványsárga közti színű. Jellegzetes pigmentek nincsenek. Oldható pigmentek nem figyelhetők meg, kivéve egy halvány sárgásbarna pigmentet néhány tápközegben. Ezeket a tenyésztési jellemzőket az I. Táblázatban adjuk meg.

I. TÁBLÁZAT

Az A80577 tenyésztési jellemzői 30 °C hőmérsékleten 18 napos inkubálás után

ISP N°2	G: Bőséges	G: Közepes R: 92, y fehér Am: Közepes: a fehér Sp: Semmi
R: 88.d.Y Am: Nyom: a fehér Sp: Semmitől l.y Br-ig	Czapek tápközeg
ISP N°3	G: Közepes R: 9..y fehér Am: Közepes: a fehér Sp: Semmi	Paradicsompürézabliszt agar	G: Gyenge R: 88.d.Y Am: Gyenge: a fehér Sp: Semmi
ISP N°4	G:Jó R: 92.y fehér Am: a fehér Sp: Semmi	Burgonya-sárgarépa agar	G: Jó R: 89.p.Y Am: Jó: a fehér Sp: Semmi
ISP N°5	G: Bőséges R: 89.p.Y Am: Jó: a fehér Sp: Semmi	Jensen agar	G: Gyenge R: 92.y fehér Am: Gyenge: a fehér Sp: Semmi

HU 199899 Β

I. TÁBLÁZAT folytatása

ISP N'7	G:Jó R: 90.gy.Y Am: Semmi Sp: Semmi	G lükóz-Aszparagin	G:JÓ R: 89.p.Y Am: Jó: a fehér Sp: Semmi
	F. Jó		G: Csak nyom
ΝΊ72	R: 89.p.Y.	Glicerin-glicin	R: -
	Am: Jó: a fehér		Am: —
	Sp: Semmi		Sp: -
Csapvíz	G: Nem növkszik		G: Bőséges
agar	R: -	Élesztő-glükóz agar	R: 87.m.Y
	Am: -		Am: Közepes: a fehér
	Sp: -		Sp: Semmitől l.y

Br-ig

Emerson G: Bőséges agar R: 87.m.Y

Am: Nyom: a fehér Sp: Semmitől l.y Br-ig

G~ Növekedés; R = Fordított (hátoldal); Am= Légmicélium; Sp = oldható pigment

Morfológiai jellemzők

Az A80577 tenyészet kiterjedt alapmicéliumot termel. Mérsékelten képzett lég-hifák szorosan burkolt rövid láncok csomóit termelik, Rectus- ⁵⁰ Flexibilis (RF) morfológiában elrendezve. Ez a morfológia jellemző az Actinomadura nemzetségre. A spóra alakja gömb, a spóraméret átlaga 0,8 μπι, és a spóra felülete jellegzetes szemcsés megjelenéssel bír. A spóralánc lánconként 10 spóránál kevesebbet tartalmaz.

Fiziológiai jellemzők

A hidrolizált teljes sejtek elemzése mezo-diaminopimelinsav jelenlétét jelzi. Madurózt mutatunk ki a teljes sejt kivonatában. Galaktóz, glü- ⁴⁰ kóz, mannóz és ribóz szintén kimutatható. A sejtfal III. típusú és a cukor-spektrum B típusú.

A galaktóz nem tipikus a B-cukorspektrum típusokra.

Az A80577 a következő szénhidrátokat hasznosítja: adonit, D és L-arabinóz, cellobióz, dulcit, etanol, i-eritrit, D-fruktóz, D-galaktóz, glükóz, glicerin, glikogén, i-inozit, D-mannit, Dmannóz, D-melicitóz, D-melibióz, L-ramnóz, Dribóz, szacharóz, D-trehalóz, D-xilóz és nátriumbutirát. A tenyészet nem képes hasznosítani az alábbiakat: cellulóz, dextrin, inulin, D-laktóz, Dmaltóz, o-metil-D-glükozid, D-raffinóz, szalicin, szorbit, L-szorbóz és xilit. Szénhidrátokat nem ,, tartalmazó kontroll lemezek minimális növekedést tettek csak lehetővé.

Az A80577 tenyészete 15 — 45 °C hőmérséklettartományban nő, az optimális növekedés úgy tűnik, 30 és 37 °C hőmérséklet között van. Az A8O577 4%-ig tűri az NaCl-t, katalázt termel és ⁰⁰ a nitrátokat redukálja. A keményítőt nem hidrolizálja.

Az A80577 rezisztens az alábbiakra: 10 egység bacitracin, 30 pg cefalotin, 2 pg linkomicin, 15 pg oleandomicin, 10 egység penicillin G, 5 pg rifampin és 30 pg tetraciklin. Érzékeny az alábbiakra: 10 pg gentamicin, 30 pg neomicin és 10 pg sztreptomicin, 10 pg tobramicin és 30 pg vankomiéin.

Az A80577 kemotaxonómia tulajdonságai és az általános tenyésztési és morfológiai jellemzői támogatják azt a beosztást, hogy ez a törzs az Aetinomadura nemzetségbe, azon belül a verucosospora fajba tartozik. Ennek megfelelően ezt a törzset Aetinomadura verroeosospora A80577ként osztályozzuk.

Mint más organizmusok esetében, az A80577et termelő Aetinomadura verrucosospora NRRL 18236 tenyészet jellemzői változhatnak. A törzs rekombinánsait, mutánsait vagy variánsait kaphatjuk meg a szakterületen ismert módszerekkel. Így pl. mutánsokat kaphatunk különböző ismert fizikai és kémiai mutagénekkel, pl. ultraibolya fénnyel, röntgensugárzással, gamma sugárzással és vegyi anyagokkal, mint N-metilN’-nitro-N-nitrozo guanidinnel végzett kezeléssel. Ennek az Actinomadura verrucosospora törzsnek az összes természetes variánsa és mutánsa, amely megőrzi az A80577 termelés jellemzőjét, része ennek a találmánynak.

Az Actinomadura verroeosospora NRRL 18236 növesztésére alkalmazott tenyésztőközeg egy sor tápközeg bármelyike lehet. A termelésben való gazdaságossága, az optimális kitermelés és a termék izolálásának megkönnyítése érdekében azonban bizonyos tenyésztő tápközegek előnyösek. így pl. a nagy léptékű fermentációhoz előnyös szénhidrát-forrás a glükóz, bár a melasz, keményítő és hasonlók szintén alkalmazhatók.

Előnyös nitrogénforrás az enzimmel hidrolizált kazein, bár más nitrogénforrások szintén hasznosak lehetnek.

-4HU 199899 Β

A szervetlen só tápanyagok között, amelyeket előnyösen be kell építeni a tenyésztő tápközegbe, vannak a szokásos oldható sók, amelyek képesek cink, nátrium, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, nitrát és hasonló ionokat szolgáltatni.

Az organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges esszenciális nyomelemek szintén kell, hogy legyenek a lenyészközegben. Az ilyen nyomelemek általában szennyezések formájában előfordulnak a tápközeg többi alkotórészeiben olyan mennyiségben, amely elegendő az organizmus növekedési szükségleteinek kielégítésére. Ha a habzás gondot jelent, kis mennyiségű habgátló szert, pl. polipropilénglikolt adhatunk a nagyléptékű fermentációhoz.

Az A80577 antibiotikum nagyobb mennyiségeinek termeléséhez süllyesztett aerób fermentáció szükséges fermentorokban. Kis mennyiségű A80577-ei kaphatunk rázott lombikos tenyésztéssel is. Mivel az antibiotikum termelésében általában a nagy fermentoroknak az organizmus spóra formájában végzett inokulálásánál hosszú a lóg fázis, előnyös vegetatív inokulumot alkalmazni. A vegetatív inokulumot úgy készítjük, hogy tenyésztő tápközeg kis térfogatát inok utáljuk az organizmus spóra-formájával vagy miceliális fragmentumaival, hogy az organizmus friss, aktívan növekvő tenyészetét megkapjuk. A vegetatív inokulumot azután nagyobb fermentorba visszük. A vegetatív inokuium tápközege lehet azonos, mint amelyet a nagyobb fermentációknál alkalmazunk, de más tápközeg is lehet megfelelő.

Az A8l)577-et az Actinomadura verrucosospora mintegy 25 °C és 37 °C hőmérséklet között termeli. Az optimális hőmérséklet az A80577 termeléséhez mintegy 30 °C.

Amint ez szokásos a süllyesztett aerób tenyésztési eljárásokban, steril levegőt fúvatunk át a tartályon a fenékről, miközben a lápközeget hagyományos turbina lapátkerékkel kevertetjük. A levegőztetési sebességnek és a keverési sebességnek általában olyannak kell lennie, hogy elegendő legyen az oldott oxigén szintet 30% telítettség fölött tartani.

Az A80577 antibiotikum termelését a fermentáció során a tenyészlé mintáinak vizsgálatával követhetjük antibiotikum-aktivitásra olyan organizmusok ellen, amelyekről ismert, hogy az antibiotikumra érzékenyek. Az egyik teszt organizmus, amely alkalmas az A80577 vizsgálatára, a Bacillus subtilis ATCC 6633. A biológiai vizsgálatot kényelmesen az agar-üreg lemez vizsgálattal végezzük el.

A süllyesztett aerób fermentáció körülményei között végzett termelését követően az A80577-et kinyerjük a fermentációs tápközegből olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek a fermentációs szakterületen. Az A80577-termelő organizmus fermentációja során termelt antibiotikum aktivitás előfordul mind a micéliumban, mind a lenyészlében. Az A80577 maximális kinyerését végrehajthatjuk ennél fogva úgy, hogy először a közeget szűrjük, hogy a tenyészlevet a micélium-tömegtől elkülönítsük. A szűrt tenyészlevet és a micélium-tömeget azután különkülön tisztítjuk, hogy megkapjuk megfelelő A80577 részüket. Sokféle technika alkalmazható ennél a tisztításnál.

A szűrt tenyészlé tisztításához egyik előnyös technika magában foglalja a beállítást mintegy pH 9 értékre, és az extrahálást megfelelő oldószerrel, pl. etil-acetáttal. Az extraháló oldószert azután bepárolhatjuk vákuumban, hogy megkapjuk az A80577 tenyészlének megfelelő részét.

A micélium-tömeg tisztításának előnyös módszere, hogy extraháljuk az elkülönített micélium szűrőpogácsát megfelelő oldószerrel, pl. acetonnal. Az extraháló oldószert azután vákuumban bepároljuk, hogy koncentrált vizes oldatot kapjunk. Ezt a vizes oldatot azután mintegy pH 9-re állítjuk be és megfelelő oldószerrel, pl. etil-acetáttal, extraháljuk. Az extraháló oldószert azután vákuumban koncentráljuk, hogy megkapjuk az A80577 micéliumnak megfelelő részét.

Az A80577 komplex tenyészlé és micélium részeit tovább tisztíthatjuk hasonló eljárásokkal. Az egyik előnyös módszer magában foglalja a szilikagél kromatográfiát.

Az A80577 antibiotikum elkülönítését vékonyrétegkromatográfiával (TLC) vagy nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) követhetjük. Kényelmes szilikagél TLC oldószerrendszerek az etil-acetát; etil-acelát:acetonitrikammónium-hidroxid; és toluokacetonitril: :ecetsav. Előnyös szilikagél oldószer rendszerek az etil-acetát: etil-acetát:acetonitril:ammónia (90:9:1); és toluol:acetonitril:ecetsav (40:59:1). Poliamid lemezek szintén kényelmesen alkalmazhatók aceton:víz:ammónia oldószer rendszerben, előnyösen 30:69:1 arányban. Az antibiotikumot bioautográfiával lehet kimutatni, pl. Vacillus subtilist alkalmazva, vagy más módszerekkel, pl. vanillin-kénsav porlasztott reagenssel.

Egy másik módszer szerint a tenyészet szilárd részeit, beleértve a tápközeg alkotórészeket és micéliumot, alkalmazhatjuk extrahálás vagy elkülönítés nélkül, de előnyösen a víz eltávolítása után, az A80577 forrásaként. így pl. A80577 termelése után a teljes fermentációs tenyészlevet meg lehet szárítani liofilezéssel, dob-szárítással vagy azeotróp desztillációval és szárítással. A szárított tenyészlevet közvetlenül be lehet keverni a takarmány-premixbe.

Az A80577 sói használhatók az antibiotikumok elkülönítéséhez és tisztításához. A gyógyászatilag elfogadható sók különösen hasznosak. Sókra példák az A80577-nek alkáli-fém és aikáli-földfém sói.

Az A80577 megfelelő alkáli-fém és alkáli- földfém sóinak képviselői között találjuk a nátrium-, kálium-, lítium-, cézium-, rubidium-, bárium·, kalcium- és magnéziumsókat.

Az állatorvosi gyógyászat területén jól ismert, hogy egy antibiotikum formája általában nem nagy fontosságú, amikor egy állatot az antibiotikummal kezelünk. Legtöbb esetben az állaton belüli körülmények megváltoztatják a gyógyszert

HU 199899 Β más formára, mint ahogyan azt beadtuk. A sóforma, amelyben ezt beadhatjuk, nem nagy fontosságú. A só-formát azonban választhatjuk gazdasági, kényelmi és toxicitási okokból.

Az A80577 alkáli-fém és alkáli-földfém katio- 5 nos sóit a kationos sók készítésénél közönségesen alkalmazott eljárások szerint készítjük. így pl. az A80577 szabad sav formáját megfelelő oldószerben, pl. acétonban feloldjuk; mintegy 1/2 térfogat vizet adunk hozzá, és ezt az oldatot pH 9- 10-re állítjuk be a kívánt kationos só bázisával (pl. NaOH, KOH). Az így képzett sók rutinmódszerekkel, pl. szűréssel vagy az oldószer bepárlásával izolálhatjuk.

A sóképzés egyik előnyös módszere szerint A80577-et (savas forma) feloldunk valamely oldószerben, pl. tetrahidrofuránban, hozzáadunk azonos térfogatú vizet, a keverék pH-ját 10-re állítjuk be a megfelelő bázissal (pl. KOH, NaOH stb.), és vízzel nem elegyedő oldószerrel, pl. di10

II. Táblázat

A80577 (Na-só) antibakteriális aktivitása etil-éterrel vagy etil-acetáttal extraháljuk. Az elkülönített szerves fázist vízzel mossuk és száraz állapotig koncentráljuk. A maradékot dioxánböl liofilezzük. A sót megfelelő oldószerből, pl. acetonból kikristályosíthatjuk.

Bár a szokásos reakció feldolgozási eljárások néha elégségesek, további tisztítás is szükséges lehet, hogy a jelen találmány szerinti vegyületeket megkapjuk. Az ilyen tisztításokat jól ismert módszerekkel hajthatjuk végre, pl. oszlopkromatográfiával, vékonyrétegkromatográfiával, frakcionált kristályosítással és hasonlókkal.

Az A80577 vegyületek gátolják az állati életre patogén baktériumok növekedését. így pl. a II. Táblázat bemutatja azt a minimális gátló koncentrációt (MIC), amelynél az A80577 bizonyos mikroorganizmusokat gátol. A II. Táblázatban levő MIC értékeket hagyományos agar-hígításos vizsgálattal határozzuk meg.

Vizsgált organizmus	MIC (mcg/ml)
Staphylococcus aureus XI.1	0,5
Staphylococcus aureus V41	0,5
Staphylococcus aureus X400	0,5
Staphylococcus aureus S13E	0,5
Staphylococcus epidermidis EP11	0,5
Staphylococcus epidermidis 222	0,5
Staphylococcus pyogenes C203	0,125
Staphylococcus pneumoniae Park 1	0,12
Staphylococcus pneumoniae ŰX66	0,5
Staphylococcus pneumoniae 2041	0,5
Haemophylus influenzáé	32-128
Más vizsgált Gram-negatív baktériumok Állatorvosi gyakorlatban ismert organizmusok	>128
Staphylococcus sp.	<0,05
Streptococcus sp.	<0,05
Pasteurella múltoddá	1,56
Pasteruella hemolytica	>50
Bordetella bronchiseptica	>50
Nycoplasma gallisepticum	0,78
Mycoplasma Hypopneumoniae	1,56
Escherichia coli	>50
Salmonella typhimurium	>50

Az A80577 vegyületek aktívak anareób baktériumok ellen is. A III. Táblázat bemutatja azokat a MIC értékeket, amelyeknél az A80577 gátolja a különböző anaerób baktériumokat, amint ezt standard agar-hígításos vizsgálattal meghatároz' zuk. A végpontokat 24 órás inkubálás után olvas55 suk le.

HU 199899 Β

Hl. Táblázat

Anarerób baktérium-izolátumok érzékenysége A80577-re (Na-só)

Anaerób baktérium	MIC (mcg/ml)
Clostridium difficile 2994	<0,5
Clostridium perfringers 81	<0,5
Clostridium septicum 1128	<0,5
Eubacterium aerofaciens 1235	<0,5
Pcptococcus asaccharolyticus 1302	<0,5
Peptococcus prevoti 1281	<0,5
Peptostreptococcus anaerobius 1428	<0,5
Peptostreptococcus intermediüs 1624	<0,5
Propionibacterium acnes 79	<0,5
Bacteroides fragilis 111	>128
Bacteroides fragilis 1877	>128
Bacteroides fragilis 1936B	>128
Bacteroides thetaiotaomicron 1438	4
Bacteroides melaninogenicus 1856/28	1,0
Bacteroides maleninogenicus 2736	16
Bacteroiides vilgalis 1211	4
Bacteroides corrodens 1874	>128
Fusobacterium symbiosum 1470	<0,5
Fusobacterium necrophorum 60541	<0,5

Az A8Ö577 akut toxicitása, amikor intraperitoneális injekcióval adjuk be, és CD₅₀-ként fejezzük ki, 53,3 mg/kg. 30

Az A80577-nek másik fontos tulajdonsága az a képessége, hogy javítja a takarmány-hasznosítás hatékonyságát állatokban. így pl. az A80577 vegyületek javítják a takarmányhasznosítás hatékonyságát kérődzőkben, amelyeknek kifejlett 35 bendő-tevékenysége van.

A takarmányfelhasználás hatékonyságát úgy követhetjük, hogy megfigyeljük a propionát vegyületek termelését és koncentrációját a bendőben, a Raun Art húr P. által leírt módszert alkalmazva (3.794.732. lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, lásd főleg az

5. példát). A IV. Táblázat az A80577 vegyület hatását mutatja be kérődzők takarmány-hasznosítási hatékonyságára. A IVA. Táblázat a kapcsolatot mutatja be az A80577 adagolása és a propionát-termelés között. A IVB. Táblázat az illózsírsav (VFA) koncentráció arányát mutatja be az A80577-tel kezelt lombikokban a kontroll lombikokban levő koncentrációkhoz viszonyítva ebben a vizsgálatban.

IV. Táblázat

Az A80577 (Na-só) hatása a kérődzők takarmányhasznosítási hatékonyságára

A, Propionát-termelés, mM/1

Adag, ppm	Megfigyelések száma	Átlag	Standard eltérés
0	26	9,6	1,4
0,04	14	14,3	1,7
0,2	14	14,8	1.4
1,0	14	22,3	3,4
5,0	14	21,8	2,7

+

B. A kezelt és kontroll értékek aránya

Adag mcg/ml	Propionát mólarány	Acetát mólarány	Butirát mólarány	Összes VFA mmól/I
1,0	1,532	0,845	0,754	0,858
2,5	1,459	0,851	0,827	0,823
5,0	1,562	0,799	0,839	0,773
10,0	1,709	0,772	0,728	0,851

HU 194899 Β

LSD: két-l'arkú l-leszt; szignifikáns P<0,01 .zinten; C₃ > 99%, felső konfidencia-halár.

Az A8O577 vegyületek tipikusan hatásosak a propionát növelésére, és ezáltal javítják a takarmányhasznosílás hatékonyságát, amikor szájon át kérődzőknek adják ezeket 0,01 mg/kg/nap és 1,0 mg/kg/nap közti mennyiségben. A beadás előnyös mennyisége 0,06 mg/kg/nap és 0,35 mg/kg/nap között van. A beadás előnyös módszere az, hogy a vegyületet összekeverjük az állat takarmányával. A kérődző állatokban takarmányhasznosítás növelésére kialakított takarmánykompozíciók tipikusan 0,5 — 50 g A80577 vegyületet tartalmaznak 1 tonna takarmányban, előnyösen 2-15 grammot tonnánként.

Amint lentebb leírtuk, az A80577 vegyületek aktívak anaerob baktériumok ellen, beleértve a Clostridium perfringenst is. Az A80577 vegyületek ezért előnyösek lehetnek enteritis kezelésében (és megelőzésében is) csirkékben, sertésben, szarvasmarhában és juhban. Az A80577 vegyületek hasznosak lehetnek az enterotoxéma kezelésében is kérődzőkben.

Az A80577 vegyületeket állatoknak orálisan vagy parenterálisan lehet beadni. Az A80577 vegyületek beadásának legpraktikusabb módja a kiszerelés a takarmányadagban. A legkülönbözőbb takarmányokat, beleértve a közönséges száraz takarmányokat, folyékony takarmányokat és szemcsézett takarmányokat, lehet alkalmazni. Bár a beadás előnyös módja a bekeverés az állatok takarmányába, be lehet adni ezeket más módon is, pl. tabletták, folyadékok, pirulák vagy kapszulák formájában. Az egyedi dózis egységek pl. olyan mennyiségű A80577 vegyületet tartalmazzanak, amely a kezelendő állat alkalmas napi dózisának közvetlenül megfelelnek.

A gyógyszerek kiszerelésének módszerei az állati takarmányokban jól ismertek. Előnyös módszer koncentrált gyógyszer-premixet készíteni, amelyet viszont a gyógyszerrel ellátott takarmányok kiszerelésére lehet alkalmazni. A tipikus premixek 1 - 200 gramm gyógyszert tartalmaznak 1 font ( 453,6 g) premixre számítva. A premixek lehetnek folyékony vagy szilárd készítmények.

Az állatoknak való takarmány végső kiszerelése függ a beadni kívánt gyógyszer mennyiségétől. A kiszerelés, keverés és szemcsézés általános módszereit alkalmazhatjuk az A80577 vegyületet tartalmazó takarmányok készítéséhez.

Az A80577 vegyületeket kiszerelhetjük parenterális beadáshoz is az állatgyógyászati szakterületen megismert módszerekkel. Az A80577 vegyületeket tartalmazó hatékony injektálható kompozíciók lehetnek vagy szuszpenzió, vagy oldott formájúnk. Az oldat formában az A80577 vegyületet fiziológiailag elfogadható hordozóban oldjuk fel. Az ilyen hordozók megfelelő oldószert, konzerválószereket, pl. benzil-alkoholt, ha szükséges, és pufferokat tartalmaznak. A hasznos oldószerek közt találjuk pl. az alkoholokat, glikolokat, vagy semleges olajokat, pl. étolajokat vagy nagy mértékben finomított ásványolajokat.

Az injektálható szuszpenziós kompozíciókat úgy készítjük el, hogy hordozóként a vegyületet nem oldó anyagot alkalmazunk megfelelő adjuvánssal együtt. A nem-oldó anyag lehet pl. víz vagy glikol, pl. polietilénglikol.

Megfelelő, fiziológiailag elfogadható adjuvánsok szükségesek, hogy a vegyületet a szuszpenziós kompozíciókban szuszpendálva tartsuk. Az adjuvánsokat a sűrítő anyagok közül választhatjuk ki, ilyenek pl. a karboximetil-cellulóz, polivinil-pirrolidon, zselatin és az alginátok. Több felületaktív anyag is hasznos a vegyületek szuszpendálására. Lecitin, alkil-fenol-polietilén-oxid adduktok, naftalinszulfonátok, alkil-benzolszulfonátok, es a polioxietilén-szorbitán-észterek hasznos szuszpendáló szerek a folyékony nemoldó anyagokban való szuszpendáláshoz.

Több vegyület, amely hat a nem-oldó folyadék hidrofilitására, sűrűségére és felületi feszültségére, segíthet az injektálható szuszpenziók készítésében egyes esetekben. így pl. szilikon habgátlók, glikolok, szorbit, és cukrok hasznos szuszpendáló szerek lehetnek.

Abból a célból, hogy teljesebben bemutassuk a jelen találmány szerinti műveleteket, a következő példákat adjuk meg.

1. példa

A80577 antibiotikum előállítása Actinomadura verrucosospora törzset alkalmazva

A. Actinomadura verrucosospora rázott lombikos fermentációja

Actinomadura verrucosospora NRRL 18236 tenyészetét vagy liofilizett szemcseként vagy folyékony nitrogénben fenntartott szuszpenzióként alkalmazzuk vegetatív tápközeg beoltására; ennek a tápközegnek az összetétele a következő:

Vegetatív vagy oltó tápközeg Alkotórész_Mennyiség (g/1)

Glükóz	10,0
Oldható keményítő Enzimmel hidrolizált	20,0
kazein*	5,0
Élesztőkivonat	5,0
CaCO3	1,0
Ionmentesített víz	1 literre

*N — Z Amine A, Humko-Sheffield Chemical, Norwich, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok.

Ferde agarokat vagy lemezeket készítünk 2,5% agar hozzáadásával az ohó tápközeghez. Az inokulált ferde agart 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, mintegy 10 — 14 napon át, az érett ferde tenyészetet steril kaccsal lekaparjuk, hogy a spórákat meglazítsuk, és a micéliumfonatot felaprítsuk. Az így kapott meglazított spóra-micélium keverék mintegy l/4-ét használjuk 50 ml első stádiumú olló tápközeg beoltásához.

Az inokulált első stádiumú tápközeget 250 ml-es Erlenmeyer lombikban inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten mintegy 72 órán át olyan rázógépen, amely 5,08 cm-es körben tér ki, 250 fordulal/perccel.

Ezt az inkubált első stádiumú tápközeget (1,00 ml) alkalmazzuk 50 ml termelő tápközeg beoltására; a termelő tápközeg összetétele az

HU 199899 Β

alábbi. Alkotórész	Mennyiség (g/l)
Glükóz	25,0
Melasz	15,0
Élesztőkívonat	5,0
Enzimmel hirolizált
kazein*	3,0
MgSO4 (vízmentes)	1,0
CaCO3	2,0
Csapvíz	1 literre

*N — Z Amine A

Az inokulált termelő tápközeget 250 ml-es szélesszájú Erlenmeyer lombikban inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 8 — 10 napon át olyan rázógépen, amely 5,08 cm-es körben tér ki, 250 fordulat/perccel.

B. Actinomadura verrucosospora fermentoros fermentációja

Abból a célból, hogy nagy térfogatú inokulumhoz jussunk, 10 ml inkubált első stádiumú tápközegei, amelyet az A részben leírtak szerint készítettünk el, alkalmazunk 400 ml második stádiumú növesztő tápközeg beoltására, amelynek ugyanaz az összetétele, mint az első stádiumú tápközegé, azt a második stádiumú vegetatív tápközegei két literes, széles szájú Erlenmeyer lombikban inkubáljuk mintegy 48 órán át 30 °C hőmérsékleten olyan rázógépen, amely 5,08 cmes körben tér ki, 250 fordulat/perccel.

Az így készített, inkubált második stádiumú vegetatív tápközeget (400 ml) alkalmazzuk 1011 steril termelő tápközeg inokulálására; ezt a tápközeget úgy készítjük, amint ezt az A részben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy P —2000 (0,1 ml/1) és Ság 471 (0,2 gd) habgátló szereket is adunk hozzá. Az inokulált termelő tápközeget hagyjuk fermentálódni 165 literes kevert fermentorban 4 — 5 napon át 30 °C hőmérsékleten. A levegőáramlást (0,5-0,6 térfogat/térfogat/m) a kevert (200-250 fordulat/perc) tartályban úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje a 30%-os levegő telítettség fölött maradjon.

2. példa

A80577-nátrium-só izolálása

Két 100 literes fermentációból származó egyesített fermentációs tenyészlevet (187 liter) szűrünk 3% Hyflo Supercel segítségével. A miceliális szűrőpogácsát kétszer extraháljuk 40 liter acetonnal. Az acetonos extraktumokat egyesítjük és vákuumban koncentráljuk, hogy az acetont eltávolítsuk. A koncentrátumot (20 liter) egyesítjük a tenyészlé szűrlettel (162 liter), az oldat pH-ját 9,0-re állítjuk be 50% NaOH-val, és extraháljuk 125 liter etil-acetáttal. Az etil-acetátos extraktumot vákuumban koncentráljuk olyan maradékig, amely 5 °C hőmérsékleten álláskor kikristályosodik. A kristályokat egymás után mossuk pentánnal, acetonitrillel, és dietil-éterrcl, és vákuumban szárítjuk. 36,4 gramm fehér, kristályos A80577-nátrium-sót (op. 275 — 278 ’C) kapunk kitermelésként.

A kristályokat átkristályosítjuk olyan módon, hogy 1,0 g-ot feloldunk 100 ml acetonban, hozzáadunk 100 ml HiO-t, és állni hagyjuk 5 °C hőmérsékleten 72 órán át, hogy kristályosodjék. A kristályosodást további 100 ml víz.aceton (3:1) hozzáadásával tesszük teljessé. A kristályokat kiszűrjük és szárítjuk; kitermelés 788 mg (op.: 276-278 °C).

Az A80577-nátrium-só további kinyerését a fenti egyesített mosófolyadékokból és anyalúgokból úgy érjük el, hogy az oldatot szárazra koncentráljuk, feloldjuk 250 ml toluolban és toluollal készített 2 I szilikagélt (Grace Grade 62) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 101 toluollal mossuk, majd kifejlesztjük egymás után 10 1 toluohetanollal (98:2) és 10 1 toluoketanollal (96:4), 1 literes frakciókat gyűjtve. Az eluálást TLC és biológiai mérés követi, Bacillus subtilist alkalmazva. A 13—18. frakciókat, amelyek az A80577-et tartalmazzák, egyesítjük és vákuumban koncentráljuk, a kapott maradékot dietiléterrel mossuk és szárítjuk, így kitermelésként

2,3 g amorf A80577-Na-t kapunk.

3. példa

A80577 szabad sav előállítása

A80577 nátrium sót (lg) feloldunk 100 ml acetonban és 0,1 n HCl-t (100 ml) adunk hozzá. Az oldatot 15 percig kevertetjük. Az oldatot kétszer extraháljuk 100 -100 ml etil-acetáttal. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük és vákuumban koncentráljuk olajos maradékig. A maradékot 50 ml dioxánban eloldjuk és fagyasztva szárítjuk, így kitermelésként 0,9 g A80577 savat kapunk. A terméket nátrium-sójaként azonosítjuk (az azonosítási adatok megfelelnek a leírás első részében közölteknek).

4, példa

A80557 kálium só előállítása

100 mg sav formájú A80577-et feloldunk 20 ml tetrahidrofuránban. 3 ml vizet és 6 ml 2 n KOH-t adunk hozzá és a keveréket 15 percen át kevertetjük. 30 ml vizet adunk hozzá és az oldatot kétszer extraháljuk 60 - 60 ml dietil-éterrel. Az egyesített extraktumokat dioxánban feloldjuk, és fagyasztva szárítjuk, így kitermelésként 100 mg A80577-et kapunk kálium-só formájában (op.: 270-272 °C).

Claims (7)

1. Eljárás az (1) képletű A80577 antibiotikum és bázisos sói előállítására, azzal jellemezve, hogy az Actinomadura verrucosospora NRRL 18236 törzset, vagy ennek valamely A80577-termelő variánsát vagy mutánsát asszimilálható szén-, nitrogén-forrást és szervetlen sókat tartalmazó tenyésztő tápközegben süllyesztett, aerob fermentációs körülmények közt tenyésztünk, majd kívánt esetben a kapott antibiotikumot bázisos sóvá alakítjuk, és kívánt esetben a kapott antibiotikumot vagy bázisos sóját a tenyésztő közegből elkülönítjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A80577 antibiotikumot a tenyésztő tápközegből elkülönítjük.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal

HU 199899 Β jellemezve, hogy az Actinomadura verrucosospora NRRL 18236 törzset tenyésztjük.

4. Az 1 — 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás bázisos só előállítására, azzal jellemezve, hogy az A80577 antibiotikumot valamely kationos bázissal reagáltatjuk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos bázisként nátrium-hidroxidot alkalmazunk.

6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos bázisként nátrium-hidroxidot alkalmazunk.

7. Eljárás takarmány-kompozíció előállításá5 ra, azzal jellemezve, hogy állati takarmányt és hatékony mennyiségű, az 1 — 6. igénypontok bármelyike szerint előállított A80577 antibiotikumot vagy abból képzett bázisos sót keverünk őszsze.