HU194309B - Process for producing expressive vectors - Google Patents

Process for producing expressive vectors Download PDF

Info

Publication number
HU194309B
HU194309B HU844363A HU436384A HU194309B HU 194309 B HU194309 B HU 194309B HU 844363 A HU844363 A HU 844363A HU 436384 A HU436384 A HU 436384A HU 194309 B HU194309 B HU 194309B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
operon
periii
hindiii
isolated
Prior art date
Application number
HU844363A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT39475A (en
Inventor
Imre Boros
Pal Venetianer
Tamas Lukacsovich
Original Assignee
Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Gedeon Vegyeszet filed Critical Richter Gedeon Vegyeszet
Priority to HU844363A priority Critical patent/HU194309B/hu
Priority to AU50347/85A priority patent/AU5034785A/en
Priority to BE1/011380A priority patent/BE903695A/fr
Priority to SE8505568A priority patent/SE8505568L/
Priority to IL77152A priority patent/IL77152A0/xx
Priority to DK547285A priority patent/DK547285A/da
Priority to FR8517437A priority patent/FR2573773A1/fr
Priority to NL8503257A priority patent/NL8503257A/nl
Priority to DE19853541783 priority patent/DE3541783A1/de
Priority to GB08529127A priority patent/GB2167760A/en
Priority to FI854655A priority patent/FI854655A/fi
Priority to IT22982/85A priority patent/IT1191642B/it
Priority to ZA859033A priority patent/ZA859033B/xx
Priority to JP60263974A priority patent/JPS61166395A/ja
Priority to PL25645385A priority patent/PL256453A1/xx
Publication of HUT39475A publication Critical patent/HUT39475A/hu
Publication of HU194309B publication Critical patent/HU194309B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Az in vitro DNS rekombináció módszereivel tetszőleges eredetű és információtartalmú gének juttathatók be baktériumsejtekbe. Az, hogy az idegen DNS stabilan fennmaradjon a sejtben és az abban kódolt információ kifejeződjön, megfelelő hordozó molekulákkal - expressziós vektorokkal biztosítható. Egy fehérjét kódoló gén expressziójakor a baktérium sejt enzimei előbb a transzkripció során a DNS· ről mRNS-t szintetizálnak, majd erről a transzlációban polipeptidet. Mivel a különböző eredetű génekben eltérő azoknak a részeknek a szerkezete, amelyek az előbbi folyamatokban közreműködő enzimek számára jelzésként szolgálnak és azok működését befolyásolják, tetszőleges eredetű gén hatékony expreszsziója egy gazdasejtben azzal biztosítható, hogy a fehérjét kódoló DNS darabot a kiválasztott gazdában hatékony transzkripciót és transzlációt biztosító szignál szekvenciákhoz kapcsoljuk. Tekintettel arra, hogy a gazdasejtben egy idegen fehérje termelése' nagy mennyiségben hátrányos lehet és a sejt vagy a rekombináns molekula elpusztulásához vezethet, célszerű továbbá olyan szabályozó régióval működtetni az idegen gént, amely csak valamely külső beavatkozás hatására ad utasítást a kódolt peptid termelésére.
Fentiek értelmében tehát optimális esetben egy E. coli gazdasejttel alkalmazható kifejező vektor a következő tulajdonságokkal rendelkezik:
1. Erős E. coli promoter, amely magas intenzitású transzkripciót biztosít.
2. A génkifejlődés szabályozhatósága a transzkripció szintjén.
3. Megfelelő szerkezetű és elhelyezkedésű riboszómakötőhely, amely a transzláció hatékonyságát és pontosságát biztosítja.
A találmányban ismertetett pER expressziós vektorokban ezeket az előnyös tulajdonságokat az E. coli rrn riboszómális RNS operon és a lac operon részeinek összekapcsolásával kialakított hibrid szabályozó régió biztosítja.
A baktériumsejtek önfenntartásának és szaporodásának alapvető feltétele ép, működőképes riboszómák jelenléte. A riboszómák jellegzetes fehérje és RNS molekulákból (rRNS) épülnek fel, az rRNS molekulák pontos szekvenciája a génállományban kódolt. Ezen génszakaszok előtt helyezkedik el a DNS átírását, azaz az rRNS — jelen esetben a végső — képződését szabályozó rész. Ez a szintézis sok más funkcióval szemben nem időszakos és nem esetleges, hanem az élet alapfeltétele így az operon nagy hatékonyságú promotert tartalmaz és a keletkező RNS féléletideje lényegesen nagyobb, mint az aktuális igény szerint keletkező peptidekhez tartozó „messenger RNS-eké. (mRNS). Számszerűen a baktériumok génállományának 0,4-0,6%-a az rRNS-t kódoló szakasz, ugyanakkor a rendkívül aktív promóterműködés eredményeként a de novo RNS szintézisnek közel 50%-a rRNS.
A jól ismert és sokat alkalmazott lac operon részlet a béta-galaktozidáz enzim egy részét kódolja és ennek képződését szabályozza. A szabályozás Indukálható karakterű, így a gén átírása csak a szubsztrát laktóz, vagy analógja jelenlétében indul meg.
Felismerésünk az a meglepő jelenség, hogy a rí boszómális RNS termelés operonja képes arra is, hogy transzlációs lépés beiktatásával peptid molekulák termelését szabályozza, hogy ilyen célra működtetve is megőrzi egyedülállóan előnyös tulajdonságait, végül, hogy az operont kombinálva egy eltérő tulajdonságú szabályozó résszel, a kombinálás során megőrizhető az rRNS operon erős és tartós hatása, e mellett megjeleníthető a kombinációs operon valamely keresett jellege, amilyen pl. a lac operon derepszesszálhatósága, indukálhatósága.
A felismerés hasznosíthatóságához meg kellett oldanunk a következő feladatot:
Ha az rRNS operonját plazmidba építjük és utóbbival baktériumsejtet transzformálunk, az rRNS képződés olyan intenzitású, ami gátolva egyéb fontos funkciókat letális a sejtekre. Minthogy a plazmidban csak az intenzív szabályozást kívántuk kihasználni, az operonból eltávolítottuk a struktúrgén nagy részét, az így lerövidített operont tartalmazó plazmidok illetve utóbbit hordozó baktériumok már korlátlanul fenntarthatók.
A találmány szerinti — így konstruált — pER plazmidok és az ezekkel biztosított génexpresszió legfontosabb jellegzetességei az alábbiak:
- a beépített idegen gén transzkripcióját az rm és a lac operonojk promoter régiójából kialakított hibrid „rác szabályozó régió biztosítja;
- a transzkripció az rRNS operon kettős terminátor régióján terminál. Ennek eredménye, hogy az intenzív transzkripció nem okoz zavart a plazmid replikációban;
- a transzkripció eredménye hibrid RNS, ami a beépített idegen génen kívül rrn operonból származó részeket is tartalmaz. Ennek eredménye, hogy az RNS stabilitása megnövekedett, féléletideje nagyobb az átlagosnál;
- a transzkripció intenzitása a lac operátoron át szabályozható és lehetőség van a beépített idegen gén átírásának repressziójára vagy indukációjára;
- a transzláció eredményeként az idegen gén terméke fúziós fehérjeként szintetizálódik. Ez egyrészt nagyobb stabilitást biztosít, másrészt a fúziós partner (0-gaIaktozidáz N-terminális, ún, a-peptid) könnyen detektálható és mérhető, így a génkifejeződés akár kolóniában, akár kivonatban meghatározható,
A pER plazmidok előnyös továbbfejlesztése, ha a lac operon első génjének transzlációs start szignáljait optimális távolságban helyezzük el a transzkripció Iniciációs pontjától, ez teszi ugyanis lehetővé a hatékony transzlációt.
A pER plazmidok további előnyös kivitele, ha
- méretük kicsi, 2800-4000 bp
- ampicillin rezisztenciát biztosító gént tartalmaznak
- a kifejezni kívánt idegen gén beépítésére több különböző hasítási helyet tartalmaznak és ezekbe a gén különböző leolvasási fázisban építhető be. A találmány részletes ismertetésére bemutatott vektorkonstrukció eredményeként létrejött pER plazmidok
- egyedi Clal, EcoRI, BamHI, BglII, Xbal és HindlII restrikciós endonukleáz hasítási helyeket tartalmaznak. A Clal és EcoRI restrikciós endonukleázok hasítási helyeire bármelyik, a többibe egy-egy leolvasási fázisba építhető be az idegen gén,
- teljes nukleotid szekvenciájuk ismert
- replikációjuk Col El típusú, sejtenkénti kópiaszámuk 20-30.
A vektorok konstrukciója a következő fontosabb
194 309 lépésekből áll:
1. Az E. coli rrnB operonjának klónozása pBR322 vektorban.
2. Az operon promotereinek klónozása stabilan, plazmidokban, a strukturális gén nagy részének eltávolításával, a transzkripciós start (promoter) és stop (terminátor) régiók egymáshoz közel helyezése.
3. Az E. coli lac operon elejének összeépítése a lerövidített rrnB operonnal.
4. Hatékony transzlációt biztosító szabályozó régió kialakítása a transzkripciós és transzlációs start pontok közötti távolság változtatásával.
5. Az idegen gén beépítését lehetővé tevő restrikciós hasítási helyek kialakítása a plazmid megfelelő részén.
Az E. coli rrnB riboszómális RNS operon izolálásához kiindulási anyagként szolgálhat az E. coli teljes DNS-e, vagy olyan transzdukáló bakteriofágok DNS-e, amelyek hordozzák az operont. Az rrnB operon izolálása a ίγπΡΙβ transzdukáló bakteriofág DNS-ből Kiss A. és mti. [1978, Gene 4, 137-152], az E. coli kromoszómából pedig Boros I. és mti [1979, Nucl. Acids. Rés. 6, 1817-1830] módszerével történhet. A találmányban leírt pER plazmidok kialakításának első lépése a pBB9 jelzésű plazmid (MNG 00300) konstrukciója volt. (1. ábra) Ebben a pBR322 (MNG 00295) vektor plazmid [Sutcliffe, J. G., 1978, Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Ouant. Bioi. 43, 77-90.] BamHI hasítási helyére a BamHI enzimmel hasított γπί^ΐδ DNS 7.5 kb fragmentumát építettük. A plazmidban a bakteriális eredetű rész a teljes rrnB operont tartalmazza, valamint ehhez egy kb. 400 bp hosszú lambda eredetű rész kapcsolódik. Az rrnB operon szabályozó régiójában a 16S rRNS géntől 180 és 300 nukleotidra két promoter található (Pj és P2) [Csordás Tóth és mti, 1979, Nucl. Acids Rés. 7, 1335—1342].
Az rrnB operont, illetve annak promoter régióját tartalmazó plazmidokon az erős riboszómális promoterekről rendkívül intenzív transkripcíó iniciáció van. Ez oly mértékben igénybe veszi a plazmidot tartalmazó sejt enzimkészletét, hogy gátolja a sejt növekedését. Emiatt az ilyen konstrukciók instabilak. Az instabilitás elkerülésére ezért a pBB9 plazmidból in vitro képzett deléciókkal eltávolítottuk a továbbiak szempontjából nem lényeges részeket. Ehhez a pBB9 DNS-t Hpal restrikciós endonukleázzal hasítottuk és a lineáris molekulát különböző ideig BAL31 nukleázzal kezeltük. Az enzim egy exonukleolitikus degradációhoz hasonlóan, a molekula végeiről indulva, fokozatosan rövidíti a DNS-t mindkét polinukleotid láncon. A BAL31 nukleázzal különböző mértékben rövidített lineáris plazmidokat tartalmazó DNS mintát a tompa végek c szekapcsolására és a molekulák cirkularizálására egyaránt kedvező reakciókörülményeket választva, T4 polinukleotid ligázzal ligáitok és E. coli HB101 sejtekbe transzformáltuk. A plazmidot tartalmazó sejtekből egyedi kiónokat növesztettünk fel és azokból izoláltuk a plazmid DNS-t. Restrikciós endonukleázokkal hasítva gélelektroforézissel meghatároztuk a deléciók kiterjedését a minket érdeklő plazmidok keresésére azzpl az [génnyel, hogy az érett rRNS-ekre jellemző 5 és 3 vég megőrzésével a lerövidített operonon szintetizáló RNS-ek az rRNS-ekre jellemző úton kerüljenek lebomlásra. Ennek a feltételnek megfelelő plazmidokat pBB9A9-val jelöljük, egyikük a pBB9YX9 (2. ábra). Nukleotid szekvencia meghatározás alapján 269 nukleotidot tartalmaz az érett 16S rRNS szekvencia elejéről és a teljes 5S rRNS gént az operon végén. A 16S rRNS eleje és a 23S rRNS gén vége közötti fúziós pont környezetének nukleotid szekvenciája a 3. ábra tartalmazza.
A következő lépésben a plazmidot tovább alakítottuk azzal a céllal, hogy minél kisebb plazmidban legyen a deléciós- operon. A ρΒΒ9Δ9 plazmidot a pBR eredetű részben egy helyen hasító Sáli endonukleázzal linearizáltuk (4. ábra). (Az rrnB operonban lévő két másik Sáli hasítási helyet az előbbi deléció már eltávolította.) Mivel kb. 800 nukleotid a távolság a Sáli hasítási hely és az rrnB operon vége között, a lineáris molekulát addig emésztettük BAL 31 nukleázzal, hogy kb. 1600 nukleotiddal rövidüljön meg. Azzal a céllal, hogy a deléciót az rRNS operonnal ellentétes irányba megnyújtsuk és nem esszenciális vektor részeket is eltávolítsunk, a DNS-t cirkularizálás előtt PvuII-enzimmel is emésztettük. A PvuII tompa véget hoz létre, ami további kezelés nélkül a BAL 31 nukleázzal képzett végekhez kapcsolható. Az előbbihez hasonlóan végeztük a DNS ligálását, a transzformációt és egyedi kiónok fizikai térképezését a további munkánkhoz legjobban megfelelő plazmid kiválasztására. A pBB9b28 jelzésű plazmidban a SalI-BAL31-PvuII enzimekkel képzett deléció 2174 bp. A deléció az érett 5S szekvencia mögött 510 nukleotiddal kezdődik és a pBR322 plazmid PvuII hasítási helyénél - a vektoron alkalmazott számozás szerint 2067 — végződik. A bakteriális és pBR322 eredetű részek csatlakozási pontjának nukleotid szekvenciáját a 3. ábra tartalmazza.
A harmadik deléciót az rRNS operon promoter régiója előtti rész eltávolítására hoztuk létre. A pBB9b28 plazmidot a 16S rRNS gén előtt egy-egy helyen hasító EcoRI és RspII endonukleázokkal emésztettük és izoláltuk a vektort és az rrnB operon részét tartalmazó fragmentumokat (4. ábra) E és F közötti rész. Az EcoRI és FspII hasítására képződött fragmentum végeinek egyesszálú részek az E. coli DNS polimeráz I Klenow szubfragmentumának segítségével tompa végekre egészítettük ki, majd T4 indukált polinukeotid ligázzal összekapcsoltuk. A helyesen feltöltött végek összekapcsolásával a cirkulási molekulában helyreáll az EcoRI és FspII enzimek által felismert 6—6 nukleotídból álló szekvencia részlet:
-GAATTCGAA(-CTTAAGCTT-), tehát a transzformáció után izolált plazmid (p408-5, MNG 00301) mindkét enzimmel linearizálható (5. ábra).
A p408-5 plazmid DNS-t linearizáltuk a Pi promoter Pribnow-box előtt 100 nukleotiddal hasító FspII endonukleázzal és enyhe BAL 31 nukleáz kezeléssel a Pj promoter felé haladó deléciósorozatot képeztünk (5. ábra). A ligálás és transzformáció után izolált plazmid DNS-ekben a BspRI, Mspl és Hhal restrikciós endonukleázok hasítási helyeinek térképezésével és nukleotid szekvencia meghatározással azonosítottuk a deléció végpontjait. A p419•13 jelzésű plazmidban a 164 bp kiterjedésű deléció 25 nukleotiddal a Pi prototer előtt végződik, a p419-10 plazmidban pedig a deléció (197bp) eltávolította a Pj protomotert és a Pj előtt néhány
194 309 nukleotiddal van a vége. A vektorból az ampicillin gén előtt az egyik plazmidból 82, a másikból 110 nukleotidot távolított el a deléció. A pBR322 és rrnB eredetű rész csatlakozási pontjának környezetében a nukleotid szekvenciát a 3. ábra tartalmazza.
A lerövidített rrnB operont összekapcsoltuk az E. coli lac operon első részével. Ezt egy 412 bp hoszszúságú Hindin és EcoRI restrikciós endonuldeázok hasításával képződő fragmentumként izoláltuk a pLBU3 plazmidból [Gentz, R., Langer, A., Chang, A. C. Y„ Cohen, S. N. and Bujard, H. (1981) Cloning and analysis of strong proinoters is made possible by the downstream piacement of a RNA termination signal. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 78, 4936— 40.]. Az izolált fragmentum az EcoRI vég felől a HindHI hely felé haladva a következő részeket tartalmazza: 160 bp ismeretlen eredetű és funkciójú DNS, ami a lac promoter Pribnow-box előtt négy nukleotiddal kapcsolódik a lac operonból származó részhez. Ez utóbbi 240 bp a lac promoter egy része (-10-es régió), a teljes operátor, a mRNSJniciáció helye, a riboszóma kötőhely az mRNS 5 -végének megfelelő részen, az ATG transzláció start szignál és a β-galaktozidáz első hetven aminosavát kódoló rész. A fragmentumon kódolt N-terminális polipeptidnek (α-peptid) önmagában nincs β-galaktozidáz aktivitása, bizonyos típusú, hibás β-galaktozidáz molekulákkal — amelyek önmagukban szintén inaktívak — kölcsönhatva azonban képes részlegesen helyreállítani a funkcióképes enzimet (aakceptor mutánsok).
A p419-10 píazmidot a P2 promoter és T2 terminátor között, a Stul restrikciós endonukleázzal hasítottuk és a lineáris plazmid molekulák tompa végeihez EcoRI linkért kapcsoltunk. A linker-plazmid DNS ligáit elegyet EcoRr enzimmel emésztettük és a plazmid molekulák eirkularizációját elősegítő reakciókörülményeket használva, újra ligáltuk a DNS-t. A transzformáció után izolált p808-2 jelzésű plazmid csupán annyiban tér el a kiindulási plazmidtól, hogy hiányzik belőle a Stul hasítási hely és annak helyén a linker beépítésével egy EcoRI helyet képeztünk (6. ábra). A plB43-ból izolált fragmentumot az EcoRI és HindHI enzimekkel hasított p808-2 plazmid DNS-sel összekapcsoltuk és a ligátummal E. coli sejteket transzformáltunk. A transzformáit sejtekből az indikátort tartalmazó táptalaj felületén 24—36 óra alatt halványkék baktérium kolónák nőttek ki, jelezve, hogy alacsony szintű apeptid expresszió van. Ezekből plazmid DNS-t izoláltunk és restrikciós enzimekkel végzett térképezéssel igazoltuk, hogy a p827-10 (MNG-00307) jelzésű píazmidot tartalmazzák (6. ábra), ami a két fragmentum megfelelő összeépülésével jött létre.
A következő fázisban deléciókat hoztunk létre az rrnB eredetű promoter és a transzlációs startpont között a transzlációs efficiencia növelése céljából. A p827-10 píazmidot EcoRI emésztéssel linearizáltuk, majd bAL31 nukleáz'emésztéssel legfeljebb 400 bpig különböző hosszúságú szakaszt eltávolítottunk és a plaznüdot ligázzal újra körré zártuk. Az így létrejött különböző konstrukciók közül azokat választottuk ki, amelyek indikátorlemezen intenzív a-peptid szintézist mutattak. Az így keletkezett plazmidok egyikében a pERIII-8 plazmidban (MNG 00302) az rrnB promoter egyik fele (az ún. —35 régió) optimális távolságban kapcsolódik a lac promoter másik feléivel (ún. —10 régió, vagy Pribnow-box) és tökéletes hibrid-promotert hoz létre - „rác” promoter - amelyet optimális távolságban követ a transzlációs starthely, közöttük a szabályozhatóságot biztosító lac operátorral. (7. ábra). Más létrejött konstrukciókban a rrnB és lac eredetű részek különböző pontokon kapcsolódnak.
Az előbbi pontokban tárgyalt konstrukció, a pERIII-8 plazmid már csaknem minden követelménynek megfelel. Lényeges hátránya azonban, hogy idegen gén befogadására csak korlátozott lehetőségeket nyújt. Ezt az α-peptidet kódoló régiókban, illetve az annak a végén elhelyezkedő PvuII, illetve HindHI hasítási helyek teszik lehetővé. A következő átalakítások célja az volt, hogy lehetővé tegyük idegen gének beépítését a legáltalánosabban használt restrikciós endonukleázokkal, mindhárom lehetséges leolvasási fázisban. E célból a pERIII-8 píazmidot az «Zjpeptidet kódoló rész végén levő HindHI hasítási helyen felnyitottuk és beépítettük egy 110 bp hosszúságú ún. polilinker fragmentumot, amelyet a következő úton állítottunk elő: A pHC314 píazmidot (MNG 00280) - és a π vp plazmidok részeiből lett összeépítve 1/35280 közzétételi számú magyar szabadalmi bejelentés) — EcoRI enzimmel emésztettük és újra ligáltuk, transzformáltuk. A nyert ampicillin rezisztens bak^ térium klónokból píazmidot izoláltunk és kiválasztottuk azokat, amelyekbe kétszer épült be a vx eredetű polilinker fragmentum. Ezek közül kiválasztottunk egy olyat, amelyben a két polilinker azonos orientációban (fej-fej) kapcsolódik és ebből HindHI enzimmel emésztve izoláltuk a 110 bp hosszúságú, fragmentumot. Ez a polilinker EcoRI, BamHI, PstI, BglII, Clal és Xbal restrikciós hasítási helyeket tartalmaz és könnyen beépíthető a pERIII-8 plazmid HindHI hasítási helyére. Ebből a konstrukcióból további átalakításokkal négy olyan plaznüdot nyertünk, amelyek mindhárom lehetséges leolvasási fázisban tartalmazzák a Clal és EcoRI helyeket és ezeken kívül két leolvasási fázisban tartalmazzák a Clal és EcoRI helyeket és ezeken kívül két leolvasási fázisban a BamHI helyet és egyben a HindHI, Xbal és BglII helyeket. E konstrukciók leírásához célszerű definiálni a leolvasási fázist. Mivel a szóbanforgó restrikciós enzimek felismerő helye hat bázispár (azaz, két kódtriplet), a követkézőkben 1. fázisnak azt nevezzük, ahol a felismerőhely első bázispáija megegyezik egy kódtriplet első bázispáijával, 2. fázisban a kódtriplet középső, 2. fázisban pedig a kódtriplet utolsó bázispárjával, A polilinker továbbalakításait a különböző leolvasási fázisban elhelyezkedő hasítási helyek kialakítására a 8., 9., 10. 11. ábrák tartalmazzák.
A felsorolt plazmidok a következő egyedi hasítási helyeket tartalmazzák olyan formában, hogy segítségükkel idegen fehérjét kódoló DNS szakasz egyszerűen kapcsolható a β-galaktozidáz N-terminális részét kódoló DNS darabhoz)
194 309
Plazmid 1. fázis 2. fázis 3. fázis
pERIll-8pl HindlII BglII Xbal
(kiindulási) EcoRI GamHI Clal PvuII
pERIIl-Srl HindlII Clal Xbal
(MNG 00303) EcoRI PvuII
PERIH-8r3 HindlII EcoRI
(MNG 00304) BamHI Clal PvuII
PERIlI-8r0 (MNG 00305) HindlII Xbal Clal PvuII
pERHI-8r2 HindlII EcoRI Xbal
(MNG 00306) Clal PvuII
Az alábbiakban ismertetjük a kísérletekben felhasznált anyagokat és módszereket.
Vegyszerek és prepepardtumok
Az általános használt laboratóriumi vegyszerek alt. minőségű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, REANAL, SIGMA és MERCK készítmények voltak.
A [γ'32Ρ]ΑΤΡ és [a-32P]dATP preparátumok (Magyar Izotóp Intézet, Budapest) specifikus aktivitása 100-150 TBq/mMvolt.
A használt BamHI, HapI, Sáli, PvuII, EcoRI, BspRI, Mspl, HindlII, PstI, BglII, Xbal, FspII restrikciós endonukleázokat az MTA, SzBK Biokémiai Intézet Nukleinsav csoportjának munkatársai tisztították a közölt módszerek alapján (RJ. Roberts, 1983), a Clal, Stul, Hhal enzimek pedig New England BioLabs készítményei voltak.
A BAL 31 nukleáz és Klenow-enzim (E. coli DNA-polimerasI Large Fragment) New England Biolabs, a bakteriális alkalikus foszfatáz (BAP) Worthington a pankreász RN-áz és lizozim pedig REANAL készítmény volt.
A T4 indukált polinukleotid ligázt Murray eljárásával tisztítottuk úMurray, N. E. Bruce, S. A. and Murray, K.: Molecular cloning of the· DNA ligásé gene írom bacteriphage T4 J. Mól. Bioi. 132 (1979)493-505.),
Törzsek
Escherichia coli HB101 (pro, leu, thi, lac, strR, r, m‘, endof, recA: Boyer, H. W., Roulland-Dussoix, D. (1969) A complementation analysii, of the restriction and modification of DNA in E. coli. J. Mól. Bioi. 41, 459-472.) MNG 00290
Escherichia coli ED88OO (supE, supF, hsdS-, met-, lacZM15, recA56: Murray, N. E., Brammar, W. J. and Murray, K. (1977) Lambdoid phages that simplify teh recovery of in vitro recombinants. Mól. gén. Génét. 150, 53-61. MNG 00291.
γτϋ^ΐβ [Kirschbaum, J, B. and Konrad, E. B. (1973) Isolation of a specialized lambda transducíng bacteriophage carrying the béta subunit gene fór Escherichia coli. ribonucleic acid polymerase. J. Bacteriol. 116,517-526.].
pBR322 [Bolivár, F., Rodriguez, R. L., Green, P. J., Betlach, M., Heyneker, H. L., Boyer, H. W. Crosa, J. and Falkow, S. (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. Gene 2, 95-113.] pLBU3 [Gentz, R.; Langer A., Chang, A. C. Y., Cohen, S. N. and Bujard, H. (1981) Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the downstream piacement of a RNA termination Ságnál. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4936-40.] pHC314 [Boros, I., Postfai, Gy., Venetianer,
P. (1984) Eljárás nagy kópiaszámú plazmid vektorok előállítására, T/35280 közzétételi magyar szabadalmi bejelentés] MNG 00280.
Az Escherichia coli törzsek növesztésére használt komplett folyadék táptalaj literenként 10 g Bacto-Tryptone-t, 5 g Bacto Yeast Extráét-ot és 5 g NaCl-ot tartalmazott. Szilárd táptalaj készítéséhez a fenti összetételű médiumot literenként 15 g Bacto-agarral egészítettük ki. A β-galaktozidáz enzim N-terminális rész (α-peptid) expressziójának becslésére alkalmas indikátor lemezek összetétele literenként.
g casaminosav g Na2 HP04
3gKH2PO4
0,5 g NaCl gNH4Cl g Bacto-Agár mg X-gal (dimetil-formamidban oldva) mM MgCl2
0,lmMCaCl2 /Haktamáz gént kódoló plazmidot tartalmazó sejteket 100 fJg/ml koncentrációban ampicillint tartalmazó táptalajon növesztettük.
Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó baktérium törszet 100 pg/ml ampicillint tartalmazó táptalajon tenyésztettük és ODz0Qnm 0.7-0.8 elérésekor 170 pg/ml kloramfenikolt adtunk a kultúrához a plazmid amplifikálására. Preparatív méretekben történő plazmid DNS iizoláláskor a Clewell és Helinski által leírt módszerrel clear lizátumot készítettünk [Clewell, D. B. and Helinski, D. R., (1969) Supercolied circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induces conversion to an open circular RNA form. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 62, 1159-1166.], majd a plazmid DNS-t Sephacryl SÍ000 (Pharmacia) oszlopon vagy céziumklorid-ethidiumbromid sűrűség gradiensben ultracentrifugálva tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálására (1.0—1.5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóim és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowich által módosított kálium-acetátos módszert alkalmaztuk [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Láb., New York].
DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England BioLabs által javasolt reakció körülmények között történt.
Egyesszálú végeket tartalmazó DNS fragmentumok tompa végűvé alakítására a restrikciós enzimmel végzett hasítás után a DNS-t alkohollal kicsaptuk, majd 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM dATP, 0.1 mM dCTP, 0.1 mM dGTP, 0.1 mM .TTP összetételű pufferben (végtérfogat 10-20 pl, DNS koncentráció 200150 pg/ml) oldottuk és 1-2 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentummal 15 percet, 37°C-on inkubáltuk.
Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakcióelegy (30—40 pl) 0,5-1,0 pg DNS-t, 66 mM Tris-HCl-t (pH 7.6), 5 mM MgCl2-ot, 5 mM dithiothreitolt, 1 mM ATP-t és 1 egység T4 indukált polinukleotid ligázt tartalmazott. A ligálást 2-3 órán át, 14°C-on végeztük (Maniatis T., Fritsch, E. F„ Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold
194 309
Spring Harbor Láb., New York). Tompa végű fragmentumok összekapcsolása 30-40 pg/ml DNS, 25 mM Tris-HCI pH 7.4, 5 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 0.25 mM spermjdin, 1 mM ÁTP, 10 pg/ml BSA (Sigma, Type V) összetételű pufferben történt. A reakcióelegyhez 4-6 egység T4 indukált polinukleotid ligázt adtunk, és 8-12 órán át 14°€-on inkubáltuk.
DNS minták gélelektroforézisét 0,8-2,0%-os agaróz gélekben (Sigma, Type I), horizontális elektroforézis készülékekben a Helling és mti által leírt (1974) módon végeztük. A poliakrilamid gélelektroforézis —4 és 8%-os, 1 mm vastag, vertikális géleket alkalmazva - a [Maniatis, T., Jeffrey, A. and van de Sange, H. (1975) Chain length determination of small double and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gél electrophoresis. Biochemistry 14, 3787-3794] közölt recept szerint történt.
DNS fragmentumok izolálására agaróz és poliakrilamid gélekből Wingerg G., Hammarskjöld, M. (1980) (Isolation of DNA from agarose gels using DEAE-paper. Application to restriction site mapping of adenovirus type 16 DNA. NAR, 8, 253). DEAE papírt alkalmazó módszerét használtuk.
BAL31 nukleázzal a DNS fragmentumokat 100 pg/pi végkoncentrációban, 600 mM NaCl, 12 mM CaClj, 20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1,0 mM EDTA összetételű reakcióelegyben 30°C-on emésztettük. A megkívánt rövidítés mértékétől függően 1,0 pg DNS-hez 0,4-1,2 egység enzimet adtunk. Minden esetben az adott DNS fragmentummal és a rendelkezésre álló BAL31 enzimpreparátummal teszt reakcióz készítettünk, amelyben különböző idejű inkubálás után vett minták gélelektroforetikus analízisével meghatároztuk a fragmentum megrövidülésének mértékét. Az enzim működését a reakcióelegy fenolos extrakciójával állítottak le és a DNS etanolos kicsapása után a végeket a 3 -végek jelölésére alkalmas reakciókörülmények között Klenow polimerázzal tompa végekre javítottuk [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Láb., New York).
Kompetens sejteket a HB101, C600 és ED8800 baktériumtörzs transzformációjához a Mandel és Higa által közölt [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Láb,, New York] CaCl2-os eljárással készítettünk. ,
DNS fragmentumok 5 -végeinek defoszforilálása. végjelölése polinukleotid kinazzal és [γ- 2 P]ATP-vel és a nukleotid szekvencia meghatározása a Maxam, A. and Gilberg, W. [(1980) Sequencing end-labeled DNA with basespecific Chemical cleavages. Meth. Enzymol. 65, 499-560.] által leírt protokol szerint történik.
Az expressziós vektorok előállításához használt egyéb módszerek és eljárások alkalmazásakor a Maniatis, T„ Fritsch, E. F„ és Sambrook, J. [(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Láb., New York] által leírt útmutatásokat követtük.
Az alábbiakban ismertetjük azoknak az ábráknak a magyarázatait, amelyek abraközi szöveggel nincsenek ellátva.
1. ábra
A pBB9 plazmid szerkezete a, pBR322 vektor eredetű részt kettős vonal, a
XriP18 DNS-bői származó részt vastag vonal jelzi. A körön belül feltüntettük a legfontosabb géneket, illetve szabályozó régiókat. A nyilak a restrikciós endonukleázok hasítási helyeit jelzik.
Jelölések:
amp az ampicillin rezisztenciát biztosító /0-laktamáz gén, tét tetraciklin rezisztencia gén (a BamHI helyre inszertált idegen DNS miatt ez a gén inaktív, .
λ a lambda eredetű rész a Mii 18 transzdukáló fágból származó fragmentumon,
16S az rrnB operon érett riboszómális RNS-nek
23S megfelelő részei,
5S
Pj ,2 az rrnB operon promoterei,
Tj ,2 az rrnB operon terminátorai,
P, Psti, E: EcoRI, H: HindlII, B. BamHI, S: Sáli, Hp: Hpal, pv: Pvull, F: FpsII enzimek hasítóhelyei.
2. ábra:
a ρΒΒ9Δ9 plazmid szerkezete Bevonalazottan jelöltük azt a részt, amelyet a pBB9 plazmidból a BAL31 nukleázzal képzett delécióval eltávolítottunk. A jelölések megegyeznek az
1. ábrán leírtakkal.
4. ábra a pBB9-b28 plazmid szerkezete A jelölések megegyeznek az 1. és 2. ábrán használtakkal. A vastag, vonalazott részek a pBB9 plazmidból két lépésben eltávolított régiókat jelölik.
5. ábra
A p408-5 plazmid szerkezete A jelölések megegyeznek az eddigiekben használtakkal.
6. ábra
Az rrnB és lac operonok részeinek összeépítése a pER plazmi dókban
A pER plazmidok kialakításának egyes lépéseit a p419-10 jelzésű plazmidból és a pLBU3 plazmid EcoRI-HindlII „B ’ fragmentumából részletesen felrajzoltuk. A jelölések: Ap : ampicillin rezisztencia gén, Ro: replikációs origó, Tj és T2 : az rrnB operon terminátorai, P2: az rrnB operon promotere, 16S és 5S:az rrnB operon megmaradt részei,
A kimetszett részek a deléciók helyét jelölik. A jobb felső ábra a pER plazmidcsaládot ábrázolja, melyek tagjai csak a BAL31 nukleázzal eltávolított szakasz nagyságában térnek el egymástól. (A jel körüli egymásba ágyazott „kapuk’ a különféle deléciókat jelölik.)
7. ábra
Az rrnB és lac operon eredetű részek kapcsolódása a pERIII-8-plazmidban
Jelzések:
....... AT-gazdag pré promoter régió az rrnB
P2 promoter előtt
- a rác promoter iraB eredetű -35-ös régiója
- a rác promoter lac eredetű -10-es régiója x a transzkripció iniciáló helye
----a lac eredetű riboszóma kötőhely
A Courier betűvel írt szekvencia az rrnB, a dőlt betűvel irt a lac operon eredetű részt jelöli. A lac operátort és az Orpeptid első aminósavait megjelöltük a szekvenciában.
194 309
8. ábra
EcoRI és Clal restrikciós hasítási helyek kialakítása különböző leolvasási fázisban a pERIII-8rl plazmádban. A pERIU-8pl plazmid polilinker régiójának nukleotid szekvenciája és a kódolt aminosavak a fölső sorban láthatók. Ebből Xbal és EcoRI enzimekkel végzett restrikciós emésztés (a), a végek tompa végekké kiegészítése DNS polimeráz Klenow szubfragmentummal (β) és T4 polinukleotid ligázzal történő összekapcsolásuk után (γ) nyertük az alsó sorban bemutatott pERIII-8rl plazmidot, amelyben az EcoRI hasítási hely 1. és Clal pedig 2. leolvasási fázisban van.
9. ábra
EcoRI és Clal restrikciós hasítási helyek kialakítása különböző leolvasási fázisban a pERIII-8r3 plazmidban. A felső sor a pERIII-8sp plazmid polilinker régiójának nukleotid sorrendje és a kódolt aminosavak. Az ebből Xbal és BamHI restrikciós endonukleázokkel végzett emésztéssel (a) éa végek tompa végekké alakításával (β) és összekapcsolásával T4 polinukleotid ligázzal (γ) kialakított pERIll-8r3 plazmádban a Clal hasítási hely 1., az EcoRI pedig 3. leolvasási fázisban van. A restrikciós endonukleázok hasítási helyeit aláhúzásokkal jelöltük.
10. ábra
Clal restrikciós endonukleáz hasítási hely kialakítása 3. leolvasási fázisban a pERIII-8r0 plazmid bán. A pERIII-8rl plazmidot EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítottuk (a), a végeket DNS polimeráz Klenow szubfragmentummal tompa végekké alakítottuk (β), majd T4 polinukleotid ligázzal összekapcsoltuk a molekulát. Az így előállított pERIII-8r0. plazmid polilinker régiójában a Call hasítási hely az előbbihez képest egy nukleotiddal el van csúsztatva.
11. ábra
EcoRI és Clal restrikciós hasítási helyek kialakítása különböző leolvasási fázisban a pERIII-8r2 plazmidban. A pERIII-8pl plazmidot a polilinker régióban BglII és BamHI restrikciós enzimekkel hasítotuk (a), a végeket tompa végekké alakítottuk (β), majd polinukleotid ligázzal összekapcsoltuk a plazmidot (γ). Az így kialakított polilinker régióban a Clal hely 1., az EcoRI 2. leolvasási fázisban van.
12. ábra
A pERIH-8 plazmidok általános szerkezete kiemelve a HindlII-HindlII hasítási helyek közötti polilinker régiókat. A nukleotid szekvenciában bekereteztük a felírt restrikciós enzimek felismerési helyeit és a szekvencia fölött megjelöltük és alfa-peptidnek megfelelő leolvasási fázist.

Claims (4)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás expressziós vektor konstruálására, azzal jellemezve, hogy az E. coli riboszomális operonját (rrn operon) egy hordozó vektorba építjük, majd a hordozó vektorba beépített rrn operon sttruktúragénjeinek jelentős részét eltávolítjuk, vagy a hordozó vektorba beépített rrn operon vagy annak deléciókkal rövidített származéka mellé egy fehérjét szintetizáló oepron alkalmas részét építjük be, és kívánt esetben a létrehozott szabályozó részbe beépítjük a kifejezni kívánt struktúragént.
    2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett rRNS-eknek megfelelő szekvenciákon belül végződő deléciót tartalmazó rrn operont használunk.
    3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozó vektorként pBR322 plazmidot alkalmazunk.
    4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pBR hordozó vektor nem esszenciális (max. 4250-4363-ig és 4363-2450-ig) régióit emésztési lépésekkel eltávolítjuk.
    5. Az 1-4. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hibrid szabályozó régiót az rrn és a lac operon részeiből hozzuk létre és a különböző eredetű részek között deléciókat kialakítva vektorsorozatot képzünk, amelyből célszerűen a magas lac aktivitást mutató konstrukciókat emeljük ki.
    6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy BAL31 nukleázzal végzett emésztéssel legföljebb olyan nagyságú deléciókat alakítunk ki, amelyekkel hibrid promotert hozunk létre az rrn és a lac operon promotereinek részleteiből.
    7. Az 1-6. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a lac eredetű rész végére az idegen gén inszertálására alkalmas polilinker fragmentumot építünk.
    8. Az 1. igénypont szerinti eljárás pERIU-8 plazmid (MNGOO3O2), amely tartalmazza a pBR322 plazmid 2068-tól 4278 bp-ig terjedő részét, ami ainpicillin rezisztenciát és Col El típusú replikádét biztosít: tartalmazza az rrnB operon első részét a -294-től -189 bp-ig, valamint 78-tól 270 bp-ig, ami összekapcsolva a lac operon -14-től +243 bp-ig terjedő részével hibrid szabályozó régiót képez és a bétagalaktozidáz N terminális 70 aminosavát kódolja; tartalmazza az rrnB operon terminátor régióját a 4965tól 5508 bp-ig, ez a lac operon végéhez és a pBR rész 2068-ik nukleotidjához kapcsolódik — ahol a számozásban a 16S rRNS génben az érett 16S rRNS első nukleotidjának megfelelő pontot tekintjük a +1 pontnak, a lac régióban ugyanez a lac mRNS első nukleotidja és a plazmidot a HindlII enzim egy helyen, a lac operon eredetű rész vége és az rrnB terminátor régió között hasítja, előállítására, azzal jellemezve, hogy rrnB riboszomális RNS operont izolálunk Xrif018 bakteriofág DNS-ből, a Arii 18 DNS 7,5 kb-s fragmentumát pBR322 plazmid BamHI hasítási helyére építjük be, a pBB9 plazmidot alakítva ki, ezt Hpal-gyel hasítjuk, és az így kialakult lineáris molekulát BAL31 nukleázzal részlegesen emésztjük, a rövidített lineáris plazmidok keverékét T4 polinukleotid ligázzal ligáivá cirularizáljuk, a ligálási keveréket E. coli HB101 sejtekbe transzformáljuk, a transzformánsokból plazmidokat izolálunk, és restrikciós enzimes elemzés alapján a lerövidített operonnal rendelkező plazmidokat kiválasztjuk, és ezek közül a 2. ábra szerinti ρΒΒ9Δ9 plazmidot izoláljuk, ezt a plazmidot Sall-gyel hasítva linearizáljuk, a lineáris plazmidot BAL31 nukleázzal részlegesen emésztve mintegy 1600 nukleotiddal rövidítjük, az így létrejött terméket PvuII-vel emésztjük, majd recirkularizáljuk, és az így keletkezett plazmidok közül a pBB9-b28 plazmidot kiválasztjuk, ezt a plazmidot EcoRI-gyel és FspII-vel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompává alakítjuk és a végeket összekapcsolva cirkularizáljuk, és a keletkezett plazmi-71
    194 309 dók közül a p408-5 plazmidot izoláljuk, ezt a plazmidot FspII-vel és részlegesen BAL31-gyel kezeljük, és a különböző mértékű deléciókon átment plazmidok közül BspRI-gyel, Mspl-gyel és Hhal-gyel végzett térképezés alapján a 6a. ábra szerinti p419-10 plazmidot kiválasztjuk, ezt Stul-gyel hasítjuk, a hasított termék végeihez EcoRI linkért kapcsolunk, az így kapott terméket EcoRl-gyel emésztjük, és az így kapott DNS-t cirkularizáljuk, és a 6b. ábra szerinti p8O8-2 plazmidot izoláljuk, ezt EcoRl-gyel és HindlII-mal hasítjuk, és a hasítási termékhez pLBU3 plazmid 412 bp-s HindlII-EcoRI fragmenseit ligáljuk, a ligátummal E. coli sejteket transzformálunk, a transzformánsokból plazmidokat izolálunk, a plazmidok közül restrikciós enzimes emésztés alapján a 6c. ábra szerinti p827-10 plazmidot izoláljuk, ezt EcoRI emésztéssel ljnearizáljuk, majd maximum 400 bp-t BAL31 nukleázzal eltávolítunk, a plazmidot ligázzal körré zárjuk, és az a-peptid szintézis, valamint restrikciós enzimes emésztés alapján a pERIII-8 plazmidot (MNGOO302) kiválasztjuk.
    9. Az 1. igénypont szerinti eljárás
    a) pERIII-8rl plazmid (MNGOO303) - amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 40 nukleotid hosszúságú inszertet tartalmaz, utóbbin HindlII és EcoRI hasítási hely van l es, Clal 2-es és Xbal valamint PvuII 3-as leolvasási fázisban_
    b) pERII-8r3 plazmid (MNGOO304) — amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 54 nukleotid hosszúságú inszertet tartalmaz, utóbbin HindlII, Clal és BamHI hasítási hely van 1-es és EcoRI, valamint PvuII 3-as leolvasási fázisban
    c) pERIIT-8r0 plazmid (MNGoo305) — amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 44 nukleotid hosszúságú inszertet tartalmaz, utóbbin HindlII hasítási hely van 1-es, Xbal, Clal és PvuII hasítási hely van 3-as levolvasási fázisban
    d) pERIII-8r2 plazmid (MNGOO306) — amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 59 nukleotid hosszúságú inszertet tar5 talmaz, utóbbin HindlII és Clal hasítási hely van 1-es, EcoRI 2-es és Xbal, valamint PvuII 3-as leolvasási fázisban -, előállítására, azzal jellemezve, hogypHC314 plazmidot (MNGOO280) EcoRl-gyel emésztjük, újra ligáljuk, a ligátumot É. coliba transzformáljuk, a
    10 transzformánsokból plazmidokat izolálunk, és a plazmidok közül két vx-eredetű poliiinkert azonos orientációban tartalmazó fragmentummal rendelkező plazmidot kiválasztjuk és ezt HindlII-mal emésztjük, és a 110 bp-os polilinker fragmentumot izoláljuk, . és ezt a fragmentumot HindlII-mal linearizált pERIII-8 • * plazmidba ligáljuk, így alakítjuk ki a pERIll-8pl plazmidot, és
    1) a pERIII-8rl plazmid előállítására a pERIII-8pl plazmidot Xbal-gyel és EcoRl-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé emésztjük, a λλ végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük, és T4 polinukleotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERIII-8rl plazmidot (MNG000303) izoláljuk, vagy
  2. 2) a pERIII-8r3 plazmid előállítására a pERIII-8pl plazmidot Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük és
    25 T4 polinukleotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERIII8r3 plazmidot (MNGOO304) izoláljuk, vagy
  3. 3) a pERIII-8rO plazmid előállítására a pERIII-8pl plazmidot EcoRl-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük, és T4 polinukleotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERIII-8r0 plazmidot
    30 (MNG00305) izoláljuk, vagy
  4. 4) a pERIII-8r2 plazmid előállítására a pERIII-8pl plazmidot BglII-vel és BamHI-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük, és T4 polinukleotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERlII-8r2 plazmidot (MNG00305) izoláljuk.
HU844363A 1984-11-26 1984-11-26 Process for producing expressive vectors HU194309B (en)

Priority Applications (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU844363A HU194309B (en) 1984-11-26 1984-11-26 Process for producing expressive vectors
AU50347/85A AU5034785A (en) 1984-11-26 1985-11-22 Expression vectors with e. coli rrna operon
BE1/011380A BE903695A (fr) 1984-11-26 1985-11-22 Vecteurs de replication et leur procede de production.
SE8505568A SE8505568L (sv) 1984-11-26 1985-11-25 Expressionvektor och forfarande for framstellning derav
IL77152A IL77152A0 (en) 1984-11-26 1985-11-26 Expression vectors for protein production in e.coli and their production
DK547285A DK547285A (da) 1984-11-26 1985-11-26 Ekspressionsvektorer
FR8517437A FR2573773A1 (fr) 1984-11-26 1985-11-26 Vecteurs de replication et leur procede de production
NL8503257A NL8503257A (nl) 1984-11-26 1985-11-26 Expressievectoren en werkwijze voor de bereiding ervan.
DE19853541783 DE3541783A1 (de) 1984-11-26 1985-11-26 Merkmaluebertraeger sowie verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
GB08529127A GB2167760A (en) 1984-11-26 1985-11-26 Expression vectors and method for their production
FI854655A FI854655A (fi) 1984-11-26 1985-11-26 Expressionsvektorer och foerfarande foer framstaellning daerav.
IT22982/85A IT1191642B (it) 1984-11-26 1985-11-26 Vettori di espressione e metodo per la loro produzione
ZA859033A ZA859033B (en) 1984-11-26 1985-11-26 Expression vectors and method for their production
JP60263974A JPS61166395A (ja) 1984-11-26 1985-11-26 発現ベクタ−及びその製造方法
PL25645385A PL256453A1 (en) 1984-11-26 1985-11-26 Method of producing expressive vectors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU844363A HU194309B (en) 1984-11-26 1984-11-26 Process for producing expressive vectors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT39475A HUT39475A (en) 1986-09-29
HU194309B true HU194309B (en) 1988-01-28

Family

ID=10967756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU844363A HU194309B (en) 1984-11-26 1984-11-26 Process for producing expressive vectors

Country Status (15)

Country Link
JP (1) JPS61166395A (hu)
AU (1) AU5034785A (hu)
BE (1) BE903695A (hu)
DE (1) DE3541783A1 (hu)
DK (1) DK547285A (hu)
FI (1) FI854655A (hu)
FR (1) FR2573773A1 (hu)
GB (1) GB2167760A (hu)
HU (1) HU194309B (hu)
IL (1) IL77152A0 (hu)
IT (1) IT1191642B (hu)
NL (1) NL8503257A (hu)
PL (1) PL256453A1 (hu)
SE (1) SE8505568L (hu)
ZA (1) ZA859033B (hu)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2592541Y2 (ja) * 1991-02-15 1999-03-24 愛知機械工業株式会社 手動変速機の潤滑構造

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5756495A (en) * 1980-09-24 1982-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel dna-introduction vector and recombinant dna
IL65775A (en) * 1981-05-18 1985-05-31 Genentech Inc Microbial hybrid promotors and plasmids and e.coli comprising them
GB2135678B (en) * 1983-02-17 1986-08-28 Univ New York State Res Found Ribosomal rna operon and method of incorporating same in plasmids and bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
SE8505568D0 (sv) 1985-11-25
JPS61166395A (ja) 1986-07-28
DE3541783A1 (de) 1986-06-12
FI854655A (fi) 1986-05-27
SE8505568L (sv) 1986-05-27
NL8503257A (nl) 1986-06-16
FR2573773A1 (fr) 1986-05-30
IL77152A0 (en) 1986-04-29
HUT39475A (en) 1986-09-29
AU5034785A (en) 1986-06-05
FI854655A0 (fi) 1985-11-26
GB2167760A (en) 1986-06-04
DK547285D0 (da) 1985-11-26
IT8522982A0 (it) 1985-11-26
IT1191642B (it) 1988-03-23
GB8529127D0 (en) 1986-01-02
PL256453A1 (en) 1986-12-30
DK547285A (da) 1986-05-27
ZA859033B (en) 1986-08-27
BE903695A (fr) 1986-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fayer et al. Suppression of the Escherichia coli dnaA46 mutation by amplification of the groES and groEL genes
Old et al. Principles of gene manipulation: an introduction to genetic engineering
Balbás et al. Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives—a review
Waring et al. The Tetrahymena rRNA intron self-splices in E. coli: in vivo evidence for the importance of key base-paired regions of RNA for RNA enzyme function
US5922583A (en) Methods for production of recombinant plasmids
Carter-Muenchau et al. Growth-rate-dependent regulation of 6-phosphogluconate dehydrogenase level mediated by an anti-Shine-Dalgarno sequence located within the Escherichia coli gnd structural gene.
Roy et al. The cya locus of Escherichia coli K12: organization and gene products
Huber et al. Site-specific DNA inversion is enhanced by a DNA sequence element in cis
Linder et al. An essential replication gene, repA, of plasmid pSC101 is autoregulated
Stoner et al. The araE low affinity L-arabinose transport promoter: cloning, sequence, transcription start site and DNA binding sites of regulatory proteins
Kim et al. Copy-number of broad host-range plasmid R1162 is regulated by a small RNA
US5024943A (en) Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
Joyce et al. Identification of two genes immediately downstream from the polA gene of Escherichia coli
US4987078A (en) Plasmid vectors for expression in Escherichia coli and/or Bacillus subtilis
Tran et al. Chromosomal organization and expression of Escherichia coli pabA
Kim et al. Copy number of the broad host-range plasmid R1162 is determined by the amounts of essential plasmid-encoded proteins
Schoemaker et al. Identification of the gene lon (capR) product as a 94-kilodalton polypeptide by cloning and deletion analysis
EP0206757A1 (en) Stabilization of unstably inherited plasmids II
HU197937B (en) Process for producing new cloning carriers usable for the expression of polypeptides in microbiological host cells
van Meeteren et al. Transcription of bacteriophage Mu: II. Transcription of the repressor gene
HU194309B (en) Process for producing expressive vectors
FI79552C (fi) Plasmidvektorer och foerfarande foer framstaellning daerav.
CA1315718C (en) Expression vectors and method for their construction
US4845031A (en) Recombinant DNA process for producing useful polypeptides
Seiki et al. Structure and function of the region of the replication origin of the Bacillus subtilis chromosome: II. Identification of the essential regions for inhibitory functions shown by the DNA segment containing the replication origin

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee