HU183590B - Process for the isolation of an active suastance influencing specifically the nutrition centre with a regulative effect on the appetite from human and/or animal blood serum - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás egy specifikusan a táplálkozási központra ható, étvágyszabályozó hatású hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból.

A 178703 sz. magyar szabadalmunk leírásában eljárást ismertettünk egy specifikusan a táplálkozási központra ható, étvágyszabályozó hatású frakció elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból. Az ott leírt eljárás szerint az emberi és/vagy állati vérszérumot egy 50000 molekulasúlyig átengedő membránszűrőn átszűrtük, a szűrletet bepároltuk, a maradékot vízben oldottuk, az oldatot 50000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáltuk, 0,1— 1,0% nátrium-kloridot tartalmazó, semleges kémhatású vizes oldattal eluálva frakcionáltuk, a biológiai aktivitást mutató frakciókat bepároltuk, a maradékot a szükséges mennyiségű vizben oldottuk, az oldatot újból egy 50000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáltuk, vízzel eluálva frakcionáltuk és a biológiai aktivitást mutató frakciókat bepároltuk. Ily módon egy hidrolízissel aminosav- és cukorkomponensekre bontható (összetétele körülbelül 60% aminosav és 10% cukor), glikoproteidnek mutatkozó hatékony frakciót különítettünk el, amely igen hatásos és specifikusan a táplálkozási központra ható, a központi idegrendszerre sem depresszív, sem serkentő hatást nem mutató étvágyszabályozó hatóanyagnak bizonyult.

E találmány továbbfejlesztéseként azt találtuk, hogy a fenti eljárással kapott hatékony frakció az általunk további kutatásaink során kidolgozott és a jelen találmány tárgyát képező új eljárással tovább bontható és ily módon olyan, az idézett módon elkülönített frakciónál mintegy háromszor-négyszer hatékonyabb termék állítható elő, amely kémiai összetétele szempontjából nemcsak lényegesen eltér az említett korábbi eljárással kapott hatékony frakciótól, hanem mind fizikailag, mind kémiailag tiszta, egységes, egyértelműen meghatározott összetételű anyagnak tekinthető.

Felismertük ugyanis, hogy az említett korábbi eljárással elkülönített hatékony frakció fehérje, illetőleg peptid-tartalmának jelentős része kémiailag nem kötött vagy csak lazán kötött alakban, a szatietin-aktivitás szempontjából közömbös komponensként van jelen és megfelelő fehérje-lecsapási műszerekkel eltávolítható a tényleges hatóanyag mellől, ugyanakkor a még ezután is visszamaradó kisebbmolekulájú peptidjellegű és egyéb kísérőanyagok további, részben elektroforézises, részben affinitási kromatográfiai műveletekkel teljesen eltávolíthatók és így a tiszta, kémiailag egységes szatietin-hatóanyagot állíthatjuk elő.

A találmány értelmében tehát az új, a korábban előállított hatékony frakció aktivitását többszörösen felülmúló, szelektíven a táplálkozási központra ható, kémiailag homogén, jói definiálható összetételű étvágyszabályozó hatóanyag, vagyis a tiszta szatietin az alábbi módon nyerhető ki az emberi vagy állati vérszérumból:

Az emberi és/vagy emlős állatoktól származó vérszérumot 50000 dalton molekulasúlyig átengedő membránszűrőn átszűrjük, a szűrletet részlegesen bepároljuk és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt — célszerűen centrifugálással — eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0 °C és +10 °C közötti hőmérsékleten 5—25 súly/tf.%, előnyösen 10—12 súly/tf. % koncentrációig triklórecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket — célszerűen ultracentrifugálással eltávolítjuk, a kapott oldatot 4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 0,5— 1,0%-os nátriumklorid-oldattal vagy 6,0-7,0 pHtartományú pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat liofilizálással koncentráljuk, majd 3000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluálva frakcionáljuk és az így kapott nyers terméket kívánt esetben elektroforézissel tovább tisztítjuk, majd affinitási kromatográfiával a tiszta hatóanyagot elkülönítjük.

A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitele során az első tisztítási műveletet, a membránszűrést, (ultraszűrést) például Amicon UM—10 membránon vagy Sartorius membránon, célszerűen 3 atm nyomás alkalmazásával, állandó keveréssel végezzük. A kapott szűrletet vákuum-bepárlással bekoncentráljuk és preparatív centrifugán az oldhatatlan részt elkülönítjük. A kapott zavaros, de csapadékmentes oldatot 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékletre hűtjük és annyi triklórecetsavat adunk hozzá, hogy az elegy triklórecetsav-koncentrációja 5 súly/tf.% és 25 súly/tf.% között, előnyösen 10 súly/tf.% körül legyen. Az igy csapadékossá vált elegyet 0 °C és 5 °C közötti hőmérsékleten legalább egy óra hosszat (előnyösen éjjelen át) állni hagyjuk, majd a kicsapódott fehérjéket ugyanilyen hőmérsékleten történő ultracentrifugálással elkülönítjük, amikoris tiszta, éles sárga színű oldatot kapunk. A triklórecetsavas kezelés eltávolítja az összes nagymolekulasúlyú szérum-fehérjéket, beleértve az albumint is. A nagy szénhidráttartalmú szatietin viszont nem csapódik ki, hanem oldatban marad annak ellenére, hogy kisebb mennyiségű fehérjét még tartalmaz. Ebből következik, hogy ez a fehérjetartalom már kémiailag kötött alakban lehet jelen, a szatietin szénhidrátrészhez kapcsolódva.

A tisztítás következő lépéseként preparatív gélkromatográfiát alkalmazunk 4000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gél-oszlopon. Ezt a kromatográfiás tisztítást előnyösen Sephadex G—15, G—10 vagy G—25 géllel töltött oszlopon végezzük. Az elúcióhoz előnyösen 0,1 mól ammónium-acetát pH 6,6-os puffért használunk, mivel a kísérletek szerint ez biztosította legjobb hatásfokkal a szatietin-aktivitású frakciók elkülönítését és a puffer illékonysága révén gyakorlatilag sómentes terméket lehetett előállítani. A kromatográfiás célszerűen 0,9%-os fiziológiás nátrium-klorid-oldat vagy különféle foszfát pufferek is alkalmazhatók pH 6,0—7,0 tartományban. Az aktív frakció a géloszlop kizárási térfogatánál (V_o, ahol Kd = 0; Ka a vizsgált anyag megoszlási együtthatója) jelenik meg, ami azt jelenti, hogy a termék molekuláinak mérete nagyobb, mint a gélszemcsék belső lyukátmérői, így nem tudnak behatolni a gél belsejébe, azaz kizáródnak a gélből és az eluenssel együtt a géloszlop térfogatának körülbelül egyharmadát jelentő eluens térfogatnál jelennek meg. így Sephadex G—15 gél esetében az 1500-nál nagyobb molekulasúlyú molekulák viselkednek így. A szérumból származó ennél kisebb molakulasúlyú anyagok viszont behatolnak a gél belsejébe és „retardálódnak” (ez esetben Kd>0). Miután az ultraszűrletben jelenlévő kismolekulasúlyú anyagok mennyisége a sókkal együtt összehasonlítha-21

183 590 tatlanul nagyobb, mint a szeparálódott szatietin mennyisége, ebből következően ez a tisztítási lépés nagyságrendekben kifejezhető tisztulást jelent a szatietin javára. A fehérjementesítéshez használt triklórecetsav, mint kisebb molekulájú anyag, retardálódik a géloszlopon és így só- és savmentes hatóanyagot kapunk az oszlop-térfogat 1/3-ának megfelelő elúciós (kizárási) tartományban. Ezeket a frakciókat egyesítjük és liofilizálással bekoncentráljuk.

A következő tisztítási lépés is gélkromatográfia, amelyet azonban 3000 molakulasúly alatti kizárási térfogatú gélen, célszerűen Bio-Gel P—2 oszlopon, desztillált vizes közegben végzünk. E tisztítási lépés eredményeként a termékben még jelenlévő sókat és egyéb kismolekulasúlyú fragmenteket (töredék peptidek stb.) távolítjuk el. A szatietin-aktivitású frakciók jelen esetben is kizáródnak a gélből és az oszlop-térfogat 1/3-ának megfelelő elúciós térfogattal jelennek meg. A hatóanyagot a frakciók egyesítése és liofilizálása után jói kezelhető halványsárgás-fehér por formájában kapjuk. így 1 liter emberi vérszérumból, illetőleg az ebből nyerhető 2/3 liter ultraszűrletből kiindulva 8—10 mg liofilizált terméket kapunk. A fenti eljárással előállított nyers szatietin standard nyersterméknek tekinthető, amely azonban gyakorlati célokra, tehát étvágyszabályozószerként való felhasználásra már ebben az alakban is megfelelő tisztaságú, szatietin-aktivitása 25—50 Sz. E./mg.

A termék szatietin-aktivitását az általunk kidolgozott biológiai értékmérési módszerrel mérjük; 1 szatietin-egységen (Sz. E.) azt a hatóanyag-mennyiséget értjük, amely 96 óra hosszat éheztetett 200—240 g súlyú CFY nőstény patkányoknak intracerebroventrikulárisan beadva a standard tápdugó fogyasztását a táplálékadás első napján az átlagos 24,04±0,76 g-ról 10 g-ra csökkenti.

A fent leírthoz hasonló módon nyerhető ki a nyers szatietin állati (szarvasmarha, ló, nyúl, patkány) vérszérumból is; bár a kapott termék hozama és hatáserőssége eltérő lehet (például szarvasmarha-vérszérumból ugyanezzel az eljárással valamivel több — 1 liter vérszérumból 10—13 mg — a humán eredetű termékkel azonos aktivitású nyers szatietint kapunk), a hatás specifikus jellege és szelektíven a táplálkozási mechanizmusra irányuló volta mindenfajta eredetű terméknél egyaránt megmutatkozik.

A fenti módon kapott, 25—50 Sz. E./mg aktivitású nyers szatietin nátrium-dodecil-szulfát (SDS) poliakrilamid gél-elektroforézissel meghatározva 50—70000 dalion molekulasúlyúnak mutatkozó, sómentes, albumint gyakorlatilag már nem tartalmazó, alacsony (5—25%) fehérjetartalmú, 60—90% szénhidrátot tartalmazó, liofilizált állapotban sárgásfehér porszerű termék, amely szénhidrát-részében 4 számottevő cukorkomponenst, fukózt, mannózt, galaktózt és glükózt tartalmaz.

A hidrolizált termékben számottevő mennyiségű glükóz-amin minden esetben kimutatható volt. A termékben nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel és analitikai izoelektromos fokuszálással vizsgálva 4—6 fehérjefestéssel kimutatható sávot (komponenst vagy alegységet) lehet kimutatni. Középfeszültségű papír-elektroforézissel 6,2 illetőleg 1,6 pH-értékű pufferoldatban vizsgálva a termék még összetett anyagnak mutatkozik; a biológiailag hatásos főkomponens a kiinduló helyzetben marad vagy alig mozdul el a katód irányában. Az elektroforézises futtatás után a hatóanyag ninhidrines vagy perjódsavas Schiff-festéssel egyaránt detektálható, ami szintén az anyag glükoproteid-természetére utal.

A fenti módon kapott nyers szatietin elektroforézises módszerekkel, laboratóriumi méretben célszerűen papír-elektroforézissel tisztítható tovább. A 6,2 pHértékű pufferoldatban lefolytatott papír-elektroforézises szeparálás során 75% körüli hozammal különíthető el a kiindulási helyzetben maradó főtermék (Rr = 0,1), míg két fehérje-jellegű, illetőleg glükoproteid-tartalmú kísérő komponens az anód irányában mozdul el és így teljesen elválasztható a nagy (60—100 Sz. E./mg) aktivitású, ninhidrinre és perjódsavas Schiff-festésre pozitív főterméktől.

Az így elkülönített hatóanyag már nagy tisztaságú, az eddigi vizsgálati módszerekkel, például gél-kromatográfiával vagy grádiens poliakrilamid gél-elektroforézissel vizsgálva egységes viselkedést mutató, 100 SZ. E./mg-ot megközelítő aktivitású, lényegileg glükoproteid-jellegű termék, amely azonban — amint összetétel- és aktivitás-értékeinek némileg ingadozó volta is mutatja — kémiailag még nem tekinthető teljesen egységes, meghatározott állandó összetételű anyagnak. A kémiailag egységes szatietin-hatóanyag tiszta állapotban való elkülönítésére irányuló további vizsgálataink során azt találtuk, hogy ez a feladat is megoldható, ha a fenti módon elkülönített és elektroforézises módszerrel tisztított hatóanyagot a glükoproteidek elválasztására újabban kifejlesztett affinitási kromatográfiai módszerrel [vö. pl. D. M. Swallow, L. Evans, D. A. Hopkinson: Natúré 269, 261—262 (1977)] még egy további elválasztási műveletnek vetjük alá.

Ehhez az affinitási kromatográfiai művelethez adszorbensként az elkülönítendő anyag valamely, az eltávolítandó kísérőanyagokban elő nem forduló csoportját specifikusan megkötni képes anyagot kell alkalmazni; a glükoproteid-jellegűnek bizonyult szatietin esetében tehát a glükoproteidek glükopiranózcsoportjai iránt specifikus affinitást mutató adszorbenst alkalmazunk. A jelenleg ismert ilyen csoportspecifikus adszorbensek közül különösen a „Con-ASepharose” elnevezésű adszorbens-gél bizonyult erre a célra előnyösnek. Ez az adszorbens-gél, amelyben a cián-bromiddal aktivált Sepharose 4B-hez Concavalin A van kapcsolva, megfelelő műveleti körülmények között specifikusan köti meg az alfa-D-mannopiranozil-vagy alfa-D-glükopiranozil-csoportot tartalmazó molekulákat, míg az ilyen csoportokat nem tartalmazó kísérőanyagok (egyéb fehérjék, peptidek stb.) a gélből kizáródnak. Ezek a kizáródott anyagok az eluálás során az „áttörő” frakciókban jelennek meg, a gél-oszlop teljes térfogatának körülbelül egyharmadánál, míg a gélen megkötött glükoproteid-természetű anyagok adott esetben még a kötés természetétől, azaz a vegyület kémiai sajátosságaitól függően tovább is szeparálódhatnak, különösen ha grádiens-elúciót alkalmazunk a gélen megkötött termék eluálására. ,

A találmány szerinti eljárás e lépésének, az affinitási kromatográfiai elválasztásnak a gyakorlati kivitele során az előzetes frakcionálási műveletekkel már messzemenően tisztított szatietin-terméket egy semleges kémhatású induló pufferoldatban oldjuk. Induló pufferként előnyösen 0,02 mól koncentrációjú trisz-hidroklorid (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propándiol-hidroklorid) oldatot alkalmazunk, amely 0,5—1,0 mól/1 nátrium-kloridot és előnyösen kis mennyiségű (1,0 millimól körüli) Ca²⁺ és Mn²⁺ iont is tartalmaz. Az induló pufferoldatban a viszonylag magas sókoncentráció azért szükséges, hogy ne jöhessen létre nemspecifikus fehérje-kötés az adszorbens és a kísérő fehérje-jellegű anyagok között. Az induló pufferoldatban feloldott anyagot azután felvisszük az adszorbens-gél (előnyösen Con-A-Sepharose) oszlopra, amelyet előzőleg egyensúlyba hoztunk az induló pufferoldattal, ami oly módon történhet, hogy az oszlopot saját térfogatának legalább tízszeresét kitevő mennyiségű pufferoldattal mossuk.

A tisztítandó szatietin-terméknek az oszlopra való felvitele után az eluálást alfa-metil-mannozidot emelkedő koncentrációban tartalmazó pufferoldattal végezzük. Célszerűen 0,5 mól/1 koncentrációjú alfa-metil-mannozidot tartalmazó oldatot csepegtetünk folyamatosan az induló pufferoldat összetételével egyező eluáló oldatba és az elegy folyamatos keverésének biztosítjuk a lineáris grádiens-képződést. Az eluáló oldat alfa-metil-mannozid-koncentrációja tehát lineárisan emelkedik az eluálás során; az oldat ion-koncentrációját és pH-értékét az eluálás során nem változtatjuk. A Con A-Sepharose oszlopon végzett affuzitási kromatográfia regisztráló fotométerrel 254 nm hullámhosszon felvett elúció-diagramját a 2. ábra szemléleti; a diagramon az ordinátán az extinkció, az abszcisszán pedig a csőszám van feltüntetve. Amint az ábrán látható, a kísérő anyagokat tartalmazó anyagkeverék az oszlopon áthalad és 1. csúcsként az áttörőfrakciókban jelenik meg, mig az oszlopon megkötődött glükoproteid lényegesen nagyobb retenciós értékkel, a megközelítően szimmetrikus 2. csúcs alakjában eluálódik a grádiens alfa-metil-mannozid-koncentráció növekedésének eredményeként. Az oszlopról így eluált biológiailag aktív hatóanyagot a megfelelő frakciók egyesítése és betöményítése útján kapjuk meg; minthogy az eluátum-frakciókból így kapott anyag még a pufferoldatból származó sókat, alfa-metil-mannozidot és a nagy molekulasúlyú hatóanyagból esetleg leszakadó kis molekulasúlyú fragmenseket is tartalmaz, ebből a termékből a tiszta hatóanyagot egy utolsó gél-kromatografálási művelettel választjuk el. Ezt a műveletet egy 3000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gél-oszlopon, célszerűen „Bio-Gel P—2” gélen végezzük, ionmentes vízzel, E gél-kromatográfiai művelet során az említett sók és egyéb kis molakulasúlyú anyagok kis molakulaméretük folytán belépnek a gél belsejébe és így retardálódnak; a tiszta, sómentes szatietin viszont kizáródik a gél-oszlopon és az oszlop-térfogat egyharmadának megfelelő eluciós térfogattal jelenik meg. A tiszta ionmentes vízzel kapott hatóanyagtartalmú frakciókkal egyesítjük és liofilizáljuk; így fehér por alakjában kapjuk a most már teljesen tiszta és egységes szatietin hatóanyagot.

A szatietin hatóanyagnak az emberi vagy állati vérszérumból kiinduló teljes kinyerési és tisztítási eljárását, az egyes közbenső termékek és a végtermék anyagmennyiségeinek a feltüntetésével, az 1. ábrán vázolt folyamatábra szemlélteti. Amint ebből a folyamatábrából is kitűnik, 1 liter emberi vérszérumból körülbelül 1,5 mg liofilizált szatietin-hatóanyagot lehet elkülöníteni, amelynek biológiai aktivitása 100 Sz. E./mg körül van.

A találmány szerinti eljárással elkülönített tiszta szatietin-hatóanyag SDS-gél-elektroforézises módszerrel meghatározott molekulasúlya a 60000—70000 dalton tartományába esik; az anyag poliakrilamidgélben, 5—7 illetőleg 7—9 pH-értékű amfolin jelenlétében történő futtatással, azaz izoelektromos fókuszálással meghatározott izoelektromos pontja pl = 7,0—7,1-nek adódott; a termék savas hidrolizátumának analízise az alábbi összetételt mutatta:

fehérjetartalom 25% szénhidráttartalom 60% kötött víztartalom 5—10%

A 25% fehérjetartalom aminosav-analizise:

Asp 2%, Thr 0,85%, Ser 0,97%, Glu 1,49%, Gly 0,32%, Ala 1,15%, Val 0,30%, Tyr 2,19%, Lys 9,50%; összes aminosav: 18,77%; glükózamin: 6,15%.

A 60% szénhidráttartalom megoszlása: fukóz 12%, mannóz 13%, galaktóz 11%, glükóz 24%.

Tekintettel arra, hogy a fenti elemzési adatok liofilizált termékre vonatkoznak, a készítmény víztartalma a liofilizálás körülményeiből függően változó lehet és a fenti kötött víztartalom mellett változó mennyiségű szabad víz is lehet a liofilizált termékben.

A szatietin-termék nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél-elektroforézis, grádiens poliakrilamid gélelektroforézis és affinitás! kromatográfiai szeparálás, valamint analitikai izoelektromos fókuszálás során mutatott viselkedése egyaránt az anyag kémiai homogenitását mutatja.

A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példa szemlélteti.

Példa

a) 3000 ml humán szérumot Amicon UM—10 membránon állandó keverés közben, 3—4 atm. nyomás alkalmazásával átszűrtünk. A kapott, mintegy 2000 ml ultraszűrletet vákuumban 60 ml térfogatra betöményítjük. A csapadékos koncentrátumot 9000 g-vel 30 percig centifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot elkülönítjük, keverés és hűtés közben cseppenként hozzáadunk 12 ml 55%-os triklórecetsavat és az elegyet 5—10 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk. A kicsapódott fehérjék eltávolítása végett az elegyet 5 °C körüli hőmérsékleten 30000 g-vel ultracentrifugáljuk, míg optikailag teljesen tiszta szupernatáns folyadékot nem kapunk. Ezt a folyadékot egy 5,90 cm méretű Sephadex G—15 oszlopon kromatografáljuk, majd 0,1 mólos ammónium-acetát-pufferoldattal (pH = 6,6) eluálunk. Az 500 és 600 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált maradékot 10 ml desztillált vízben oldjuk és egy 2,5-90 cm méretű Bio-Gel P—2 gél-oszlopra visszük. Az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk és a 130 és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 25—30 mg nyers, sómentes szatietint kapunk, sárgásfehér por alakjában.

b) 30 mg fenti módon kapott nyers termékből desztillált vízzel 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készt-41

183 590 tünk, ezt az oldatot 2 cm széles és 30 cm hosszú sávba felcsepegtetjük egy Whatman 3M papírra, a papírt megszáritjuk, majd 6,2 pH-értékű elektród-pufferrel (10 tf./tf.% piridin, 0,5 tf./tf.% ecetsav) egyenletesen megnedvesítjük és a futtatást folyamatosan hűtött horizontális készülékben 20 V/cm feszültség-grádienssel végezzük 4 órán át. Az elektroforézis befejezése után a papírt megszárítjuk és egy 1 cm-es csíkot ninhidrinnel, illetve esetenként perjódsavas Schiff reagenssel megfestünk a szeparálódott komponensek detektálása céljából. A papírt ezután feldaraboljuk és az elkülönített részekből a hatóanyagot desztillált vízzel kioldjuk. Liofilizálás után mintegy 20—23 mg 50—100 Sz. E./mg aktivitású tisztított terméket kapunk.

c) A fenti módon kapott és elektroforézissel tisztított termék 20 mg-ját 4 ml 7,0 pH-értékű induló pufferoldatban (összetétele: 0,02 ml/1 trisz-hidroklorid, 0,5 mól/ml nátrium-klorid, 0,001 mól/1 kalcium-klorid és 0,001 mól/1 mangán-klorid) oldjuk és az oldatot felvisszük egy 1,7 cm átmérőjű és 37 cm hosszú, ConA-Sepharose adszorbenssel töltött és a fenti induló pufferoldat közepes oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségével átmosott oszlopra. A grádiens-eluálást 100 ml fenti összetételű induló pufferoldattal indítjuk meg és ehhez állandó keverés közben hozzácsepegtetünk 100 ml ugyanilyen összetételű, de 0,5 mól/1 alfametil-mannozidot is tartalmazó pufferoldatot. így az eluáló-oldat alfa-metil-mannozid tartalma az eluálás folyamán 0 mól/l-ről fokozatosan 0,5 mól/l-ig emelkedik. Az eluálást 254 nm-nél folyamatosan regisztráló UV monitorral ellenőrizzük; 2,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk össze és a kívánt terméket tartalmazó, 75 ml és 100 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizálással 10 ml térfogatra besűrítjük.

Az így kapott koncentrált folyadékot az oldatban jelenlevő sók és egyéb kismolekulájú szennyezések eltávolítása céljából egy 2,5 cm átmérőjű, 90 cm hosszú Bio-Gel P—2 oszlopra visszük, majd az oszlopot ionmentes vízzel eluáljuk, a 140 ml és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 5—6 mg hófehér, sómentes, homogén, 100 Sz. E./mg aktivitású szatietint kapunk.

Claims (2)

1. Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból 50000 molekulasúlyig átengedő membránszűrőn való átszűrés, a szűrlet bepárlása és gél-kromatográfiás továbbfeldolgozása útján, azzal jellemezve, hogy az emberi és/vagy állati vérszérum membránszűrőn történő átszűrése út5 ján kapott szűrletet részlegesen bepároljuk és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt — célszerűen centrifugálással — eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten 5—25 súly/tf.%, célszerűen 10—12 súly/tf.% koncentrá¹⁰ cióig triklórecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket — célszerűen ultracentrifugálással — eltávolítjuk, a kapott oldatot 4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 0,5—1,0%-os, előnyösen 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal vagy 6,0—7,0 pH15 tartományú foszfát-pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat liofilizálással koncentráljuk, majd 3000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluálva frakcionáljuk, az aktív frakciókat liofilizáljuk és a kapott nyers termé20 két kívánt esetben további, célszerűen elektroforézises tisztításnak vetjük alá. (Elsőbbség: 1981. 09. 28.)

2. Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatóanyag elkülönítésére em25 béri és/vagy állati vérszérumból 50000 molekulasúlyig átengedő membránszűrőn való átszűrés, a szűrlet bepárlása és gél-kromatográfiás továbbfeldolgozása útján, azzal jellemezve, hogy az emberi és/vagy állati vérszérum membránszűrőn történő átszűrése út30 ján kapott szűrletet részlegesen bepároljuk és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt — célszerűen centrifugálással — eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten 5—25 súly/tf.%, célszerűen 10—12 súly/tf.% koncentrá35 cióig triklórecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket — célszerűen ultracentrifugálással — eltávolítjuk, a kapott oldatot 4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 0,5—1,0%-os, előnyösen 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal vagy 6,0—7,0 pH40 tartományú foszfát-pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat liofilizálással koncentráljuk, majd 3000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluálva frakcionáljuk, az aktív frakciókat liofilizáljuk, a kapott nyers terméket

45 6,0-6,5 pH-értékű pufferoldatban elektroforézises szeparálással tisztítjuk, a kiindulási helyzetben maradó főterméket elkülönítjük és a glükopiranóz és/vagy mannopiranóz-csoportok iránt specifikus affinitást mutató adszorbens gél alkalmazásával affinitási kro50 matográfiai elválasztásnak vetjük alá.