HU176104B - Üj eljárás (+)13B-alkiI-3-metoxi-17-oxo-gonaének mikrobiológiai előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás (+) 133-alkil-3-metoxi-17-oxo-gonaének előállítására 1 általános képletű racém gonaének — ahol R jelentése etil- vagy metilcsoport, Z jelentése pedig II, III vagy IV képletű csoport — sztereoszelektív mikrobiológiai oxidációjával.

A találmány szerinti mikrobiológiai eljárással előállított vegyületek az optikailag aktív norszteroidok totálszintézisének fontos intermedierjei.

Az optikai antipódok racém elegyböl történő szétválasztására szolgáló módszerek két csoportba sorolhatók. Az egyik a kémiai út, amikor optikailag aktív vegyülettel előállítható származék ad lehetőséget a két antipód szelektív elkülönítésre. A másik módszer szerint enzimreakciót használnak a feladat megoldására.

Ez esetben az enzim a racemát egyik antipódjának ké- 15 miai átalakulását katalizálja; az így átalakított termék és az át nem alakult vegyület viszont már könnyen szétválasztható.

Racém vegyületek enzimreakció segítségével való rezolválása Pasteur alapvető munkái óta ismert és gyakran alkalmazott módszerré vált. Ezen belül mikrobiális enzimek alkalmazása igen elterjedt a gyakorlatban olcsóságuk és az alkalmazási technológia egyszerűsége miatt. Norszteroidok szétválasztására Wettstein alkal- 25 mazta először (Experientia 12. 50. 1956), nevezetesen dl-ösztronból élesztővel d-ösztradiolt állított elő, míg az 1-ösztron változatlanul megmaradt. A mikrobiológiai redukción kívül a dehidrogénezés és a hidroxilezés is sok esetben sztereospecifikus, ami azt jelenti, hogy a re176104 zolváláshoz eredményesen használhatók ezen aktivitással rendelkező enzimek is.

A módszer sikeres alkalmazásának előfeltételeként gondos vizsgálattal kell kiválasztani az adott racemát 5 szétválasztására legalkalmasabb enzimet, illetve enzimforrást.

A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amely szerves szintézissel előállított, az élővilágban elő nem forduló racém gonaének antipódokra való szétválasztá10 sát biztosítja rövid fermentációs idő alatt, könnyen kivitelezhető módszerek alkalmazásával.

Esetünkben amikor a természetben elő nem forduló racemátot kell optikai antipódjaira szétválasztani, számos mikroorganizmus biológiai aktivitását kell megvizsgálnunk, amíg a legelőnyösebbet ki tudjuk választani. Smith és mtsai (J. A. C. S. 58. 3120, 1976) racém ösztron 13 Ö-alkil homológjainak rezoválására Aspergillus ochraceus tenyészetét használták, mivel ezen mikroorganizmus hidroxilező aktivitása nagy mértékben 20 sztereospecifikus. Greenspan és mtsai (J. Org. Chem. 31. 2512, 1966) Corynebacterium törzs tenyészetét használták fel a racém 12[l-etil-gonén származékok rezolválására. Nevezetesen a dl-13f)-etil-17[ö-hidroxi-4-gonén-3-onból Corynebacterium simplex felhasználásával nyerték a d-13 P-etil-3-hidroxi-l ,3,5(10)-gonatrién- 17-on-t, mivel ez esetben az aromatizálás volt sztereospecifikus.

A találmány alapja az a felismerés,hogy kiválasztható olyan baktérium, amely megfelelő sztereospecificitású hidroxiszteroid-oxidoreduktáz enzimaktivitással rendel30 kezik, a szteroid alapvázat nem károsítja, viszont sejt176104 fala áthatolható a természetes forrásban elő nem forduló, szubsztrátumként adott rac-13j3-aIkil-3-metoxi-17 3-hidroxi-gonaének számára. Ez a baktérium a kiindulási vegyületből az egyik antipód oxidált termékét állítja elő, miközben a másik változatlanul visszamarad a fermentlében, amiből a két antipód szétválasztása önmagában ismert módszerek felhasználásával könnyen kivitelezhető.

Az általunk kiválasztott mikroorganizmus a norszteroid molekula 17-hidroxi csoportjának sztereoszelektív oxidációjára képes nemcsak a természetes ösztradiol, hanem ennek szintetikus homológjai esetében is. Sőt amint azt az 1. példa mutatja, a norszteroid szintézis egy korábbi intermedierjének a, d-13(3-etil-3-metoxi-gona-l,3,5(10)8-tetraén-173-ol-nak a sztereoszelektív előállítására is alkalmas, amire ezideig mikrobiológiai eljárás nem ismeretes.

A fentiek alapján a találmány tárgya új eljárás (+) 13J3-alkil-3-metoxi-17-oxo-gonaének előállítására I általános képletű racém gonaének — ahol R jelentése metilvagy etil-csoport, Z jelentése pedig II, III vagy IV képletű csoport — sztereoszelektív mikrobiológiai oxidációjával. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy az I általános képletű racém gonaén származékokat — ahol R és Z jelentése a fenti — Mycobacterium sp. MP—2 (MNG 167) jelű mutáns törzs süllyesztett, levegőztetett és kevert tenyészetével vizes közegben kezeljük, és a képződő jobbraforgató 17-oxo-vegyületeket ismert módon elkülönítjük.

A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy Mycobacterium sp. MP—2 jelű mutáns törzs növényi eredetű fehérjét és szénhidrátot, célszerűen burgonyakivonatot és glükózt tartalmazó agar-táptalajon 5—10 nap alatt 30—40 C°-on, célszerűen 37 C°-on kifejlődött tenyészetének steril desztillált vízzel készült szuszpenziójával olyan 121 C°-on 30 percig sterilezett folyékony táptalajt oltunk, amely 1—4% koncentrációban növényi és állati eredetű fehérjét, ezen belül előnyösen 2% kukoricalekvárt, 0,6% peptont, 0,2% húskivonatot, 0,1% élesztőkivonatot és 1—3% szénhidrátot, előnyösen 1% glicerint tartalmaz. A tenyésztést 30—40 C° között, előnyösen 37 C° hőmérsékleten végezzük Erlenmeyer lombikban, szitarázógépen. Az etanolban oldott szubsztrátumot célszerűen 48 óra növekedés után adjuk a tenyészethez, de adagolható ez időpont előtt vagy ez után is, A tenyésztéssel azonos körülmények között végzett inkubálás alatt a fenti enzimatikus átalakítás 1—2 nap alatt befejeződik. A biokémiai reakció előrehaladását rétegkromatográfiás módszerrel vizsgáljuk, vagy pedig a képződött 17-oxo-származék mennyiségét — 2,4-dinitrofenilhidrazinnal reagáltatva, a keletkező hidrazon szín intenzitását mérve — határozzuk meg. A természetes konfigurációjú származék 80—90%-ának dehidrogénezése után a reakcióelegyet szupercell segítségével szűrjük, a kiszűrt sejttömeget és az ezzel együtt kiszűrt szteroid-származékokat (az át nem alakult enantiomer és az oxidált antipód elegye) szárítjuk, majd vízzel elegyedő oldószerrel, célszerűen acetonnal az utóbbiakat leoldjuk. A sejtmentesre szűrt acetonos oldat bepárlásával nyert szárazmaradékot klórozott szénhidrogénben, célszerűen kloroformban oldjuk, majd vízmentesítés után szárazra pároljuk. A szárazmaradékból optikailag tiszta termékhez több úton juthatunk. Az egyik módszer szerint a szárazmaradékot szilikagélen megkötjük, majd etilacetát-ciklohexán rendszerrel eluáljuk a 17-oxo-származékot, amit végül metanolban átkrístályosítunk. A másik módszer szerint a szétválasztást származékképzésen keresztül valósíthatjuk meg, célszerűen a 17-oxo-származék szemikarbazonját előállítva. A képződött, majd elkülönített szemikarbazont megbontva, az optikailag tiszta 17-oxo-13p-alkil-3-metoxi-gonán-származékot kapjuk.

A találmány szerinti eljárásban szubsztrátumként használt I általános képletű — ahol R és 2 jelentése a fenti — racém 13 fi-alkiI-3-metoxi-l 7 [3-hidroxi-gonaének rezolválására kémiai út is ismeretes. Ilyet ismertet például a 3 418 326 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, azonban mégis előnyösebb a mikrobiológiai út használata, mert az átalakítást végző enzim nagyfokú specificitása rövid fermentációs idő alatt biztosítja az optikailag tiszta végtermék előállíthatóságát.

A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg:

1. példa

Mycobacterium sp. MP—2 (MNG 127 sz. alatt deponálva) törzs 0,8% burgonyakivonatot, 2% glükózt és 1,5% agart tartalmazó táptalajon 37 C°-on nőtt 10-napos tenyészetét steril desztillált vízben szuszpendáltuk. A sejtszuszpenzió 1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikba bemért 1% kukoricalekvárt, 0,6% peptont, 0,4% húskivonatot és 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó 100 ml táptalajt oltottunk, majd 37 C°-on szitarázógépen percenként 300 fordulattal 2,5 cm átmérőjű kör kerületén mozgatva levegőztettük, 48 óra növekedés után 1 ml forró etilalkoholban oldva (50 mg/ml koncentrációban) adagoltuk hozzá a táblázatban feltüntetett szubsztrátumot. A tenyésztést tovább folytattuk mindaddig, amíg az egyik antipód (a természetes sorbeli) oxidálódott. A reakció előrehaladását, a lombik tartalmát metfiénkloriddal extrahálva, rétegkromatográfiás félkvantitatív módszerrel követtük. A kapott eredményeket táblázatban foglaltuk össze.

2. példa

Mycobacterium sp. MP—2 (MNG 127) ferdeagar tenyészetével 5 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 0,2% ammónium-dihidrogén-foszfát-ot, 0,2% kálium-dihidrogén-foszfát-ot és 0,5% élesztőkivonatot tartalmazó, 121 C°-on, 30 percig sterilezett 100—100 ml táptalajt oltottunk, majd 37 C°-on szitarázógépen 300 fordulat/perc (2,5 cm átmérő) rázási sebességgel levegőztettük. 48 óra növekedés után a fenti lombikokban kinőtt 0,5 liter tenyészettel 10 literes üvegfermentorban sterilezett 5 liter térfogatú táptalajt oltottunk, ami 1,5% kukoricalekvárt, 0,6% peptont, 0,4% húskivonatot, 0,2% élesztőkivonatot és 0,01% polipropilénglikolt (MS 2000) tartalmazott. A baktériumsejteket 37 C°-on növesztettük, miközben a táptalajt 2,5 liter levegő átfúvása mellett 450 fordulattal kevertük. 30 órás növekedés után 100 ml etanolban oldva 10 g (± )13 fi-etil-3-metoxi-l,3,5(10)-gonatrién-17p-olt adagoltunk, és az inkubálást folytattuk, hat óránként mérve a képződött oxo-származék mennyiségét. Egy és fél nap inkubálás után 85%os konverziót értünk el, ekkor a fermentor tartalmát 30 g szupercell segítségével szűrtük. A szteroid tartalmú

Táblázat

Kiindulási vegyidet ! 36 óra fermentáció után a fermentiében kimutat! ható vegyületek aránya | 17-hidroxi-szár- | 17-oxo-szárma- ! 17-acetát j mazék(°/_o) zék(%) ; származék (%)

( + )133-etil-3-metoxi-gona-l,3,5(10),8-tetraén-17p-ol	60	40	—
(+) 13 β-et i l-3-metoxi-gona-1,3,5(10),8-tetraén-17 β-οΐ	20	80	—
(-)13 β-et il-3-metoxi-gona-1,3,5( 10),8-tetraén-17 β-οΐ	92	! 2	5
(+)13 β-et i 1-3 -metoxi-gona-1,3,5(10),8-tet raén-17 β-οΐ. acetát	65	i 30	5
(+)13[3-etil-3-metoxi-gona-l,3,5(10),8-tetraén-178-ol.hemiszukcinát	í 70	! 30 j	—
(+) 13 β-eti 1-3-metoxi-gona-1,3,5( 10)-trien-17 β-οΐ	! 56	43	1—2
(+)13 8-etil-3-metoxi-gona-1,3,5( 10)-trien-l 7 β-οΐ	' 10	80	5
(-)13 β-et il-3-metoxi-gona-1,3,5(10)-trien-17 β-οΐ	i 95	2	3
(±) 13 β-εΟίΑ-ηιεΙοχί^οπα-1,3,5(10)-trien-17 β-ol. acetát	61	37 [	2
(+ )13 8-etil-3-metoxi-gona-2,5(10)-dién-17 β-οΐ	10	90 i	—
( — )13 8-etil-3-metoxi-gona-2,5(10)-dicn-17 8-ol	96	4	—
(±)ösztradiol-3-metiléter	45	55	—
(+)ösztradiol-3-metiIétei'	; 5	ί 95 í	—

kiszűrt sejtet szobahőmérsékleten szárítva, kétszer 500 ml acetonnal extraháltuk. Az acetonos oldatot sejtmentesre szűrtük, vákuumban szárazra pároltuk,

A szárazmaradékot 300 ml etanolban oldottuk, és 3 g szemikarbazid-hidroklorid és 10 ml ecetsav jelenlétében forraltuk 16 órán keresztül. Az oldatot lehűtve, a kristályokat szűrtük. így 4,5 g (+)-13fj-etil-3-metoxi-l,3,5(10)-gonatrién-17-on szemikarbazont kaptunk. A terméket ezután 260 ml dioxánban oldottuk, majd 51 ml 15%-os vizes titán-III-klorid oldat és 26 ml pH = 5,6 -os ecetsav-nátriumacetát puffer oldat jelenlétében forraltuk 10 órán keresztül. Az oldatból kidesztillálva a dioxánt, a maradék vizes oldatot kétszer 100 ml kloroformmal extraháltuk. A szerves fázist vízzel semlegesre mosva, nátriumszuífáton szárítottuk, szűrtük, majd szárazra pároltuk. A szárazmaradékot metanolból kristályosítottuk. így 3,3 g (+)13p-etil-3-metoxi-l,3,5(10)-gonatrién-17-ont kaptunk. Metanolból átkristályosítva op,: 149—151 C°, [x]_D=+98,2° (c=l, kloroform).

3. példa

A baktérium tenyésztés, a szteroid intermedier mikrobiológiai átalakításának körülményei, valamint a reakcióelegy szteroid tartalmának kinyerése megegyezik a

2. példában ismertetettel, a kloroformos oldat szárazra párolt maradékát azonban ez esetben kromatografálással tisztítottuk. A szárazmaradékot 600 g szilikagélt tartalmazó oszlopon kromatografáltuk. Először 1000 ml ciklohexánnal, majd 1000 ml — 10% etilacetátot tartalmazó — ciklohexánnal eluáltuk az oszlopot. Az utóbbi frakciót szárazra párolva, a szárazmaradékot éterből átkristályosítottuk. így 2,5 g ( + )13p-etil-3-metoxi30 -l,3,5(10)-gonatrién-17-ont nyertünk. Metanolból átkristályosítva fizikai állandói megegyeztek a 2. példában előállított anyagéval.

Claims (1)

1. Szabadalmi igénypont

   Eljárás (+)13p-alkil-3-metoxi-17-oxo-gonaének előállítására I általános képletű racém gonaének — ahol

   40 R jelentése metil- vagy etil-csoport, Z jelentése pedig II, III vagy IV képletű csoport — sztereoszelektív mikrobiológiai oxidációjával, azzal jellemezve, hogy az I általános képletű racém gonaén származékokat — ahol R és Z jelentése a fenti — Mycobacterium sp. MP—2

   45 (MNG 167) jelű mutáns törzs süllyesztett, levegőztetett és kevert tenyészetével vizes közegben kezeljük, és a képződő jobbraforgató 17-oxo-vegyületeket ismert módon elkülönítjük.