HRP20141096A2 - Onkoliza virusom newcastleske bolesti soj zg1999hds - Google Patents
Onkoliza virusom newcastleske bolesti soj zg1999hds Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20141096A2 HRP20141096A2 HRP20141096AA HRP20141096A HRP20141096A2 HR P20141096 A2 HRP20141096 A2 HR P20141096A2 HR P20141096A A HRP20141096A A HR P20141096AA HR P20141096 A HRP20141096 A HR P20141096A HR P20141096 A2 HRP20141096 A2 HR P20141096A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- cells
- newcastle disease
- disease virus
- tumor
- strain
- Prior art date
Links
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 61
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 17
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 14
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 12
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 230000001934 delay Effects 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 45
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 9
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000010153 Šidák test Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000615866 Antho Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 201000008197 Laryngitis Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 208000011873 mild conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 230000010304 tumor cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Izum se odnosi na citolitički i onkolitički učinak vlastitog soja virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999-HSD te njegovu moguću primjenu u liječenju tumorskih bolesti ljudi i životinja. Opisani su rezultati predkliničkih istraživanja. Istodobno parenetralno davanje virusa sa tumorskim stanicama samo je jedan od načina davanja virusa no očekuje se djelovanje i u kombinaciji s klasičnim postupcima liječenja tumorskih bolesti.
Description
Područje izuma
Ovom se prijavom patenta izum štiti u slijedećim područjima tehnike, prema Međunarodnoj klasifikaciji patenata:
A 61 K 39/17,
A 61 K 48/00,
A 01 N 63/00
Tehnički problem
Zamisao da se virusi, inače patogeni mikroorganizmi, koriste u liječenju bolesnika s tumorom javila se još na početku prošlog stoljeća, a temeljena je na opažanjima regresije tumora u bolesnika koji su preboljeli neku virusnu zaraznu bolest ili su vakcinirani protiv bolesti uzrokovanih virusom. Tijekom pedesetih godina prošlog stoljeća napravljeni su brojni pokusi koji su pokazali da mnogi virusi mogu učinkovitije zaraziti i lizirati tumorske nego normalne stanice, a krajem prošlog stoljeća ponovno je obnovljen interes za upotrebu virusa u protutumorskoj terapiji.
Virus newcastleske bolesti (NDV, od engl. Newcastle Disease Virus) je ptičji Paramyxovirus iz porodice Paramyxoviridae, slabije patogen za sisavce uključujući i ljude u kojih i jako virulentni sojevi izazivaju samo blagi konjunktivitis i laringitis. Za razliku od skupine genetski modificiranih virusa koji su stekli svojstvo specifičnog razaranja tumorskih stanica tek nakon genetske manipulacije virusnih čestica, NDV se ubraja u skupinu virusa sa tzv. prirođenom sposobnošću selektivnog uništavanja tumorskih stanica. Zahvaljujući navedenim osobinama, različiti sojevi NDV-a istraženi su u pokusima na eksperimentalnim tumorskim modelima na životinjama, a također su objavljeni i rezultati kliničkih studija u kojima je ovaj virus primijenjen kao protutumorsko sredstvo u tretmanu različitih tumora u ljudi. S obzirom na patogenost za prirodnog domaćina (ptice), sojevi NDV-a podjeljeni su na izrazito (velogeni), umjereno (mezogeni) i slabo (lentogeni) patogene sojeve. Među ovim sojevima, najviše su istraživana protutumorska svojstva i mehanizmi protutumorskog učinka umjereno patogenih sojeva NDV, dok su istraživanja vezana za primjenu lentogenih sojeva NDV (npr. LaSota, Hitchner ...) u kontroli tumorskog rasta relativno malo zastupljena, a isto tako mehanizmi djelovanja ovih sojeva NDV nisu još uvijek potpuno objašnjeni.
Stanje tehnike
Do sada provedena su istraživanja učinaka odabranih sojeva NDV na proliferaciju različitih tipova mišjih tumorskih i normalnih stanica, kontrolu rasta tumora i preživljenje životinja na eksperimentalnim modelima mišjih tumora kao i njihov učinak na imunološki sustav miševa s tumorom (Phuangsab i sur., 2001., Lorence i sur., 1994., Sinkovics i Horvath, 2000.).
Rezultati istraživanja na staničnim kulturama ukazali su na izrazito citotoksično (citolitičko) djelovanje NDV na tumorskim stanicama, dok su promjene u normalnim stanicama izostale. Iako nije dovela do potpunog nestanka rastućeg tumora, primjena NDV značajno usporava njegov rast, a zabilježen je i stimulacijski učinak virusa na imunološki sustav miševa s tumorom. Rezultati pokusa u kojima je primijenjen kombinirani terapijski pristup, pokazali su da NDV može značajno pojačati antitumorsku aktivnost manjih doza zračenja, čime se znatno smanjuje oštećenje normalnog tkiva zbog primjene visokih doza zračenja. Nadalje, primjena virusa u kombinaciji sa znatno nižim dozama citostatika rezultira statistički signifikantnom odgodom rasta tumora (Čović i sur., 2006.).
Ovim rezultatima potvrđena je mogućnost korištenja lentogenih sojeva NDV u liječenju malignih oboljenja bilo da se koriste pojedinačno ili u kombiniranom pristupu te kao takvi predstavljaju temelj za stvaranje novih, potencijalno klinički primjenjivih, terapijskih modaliteta u liječenju tumorskih bolesti.
Slijedeći strani patenti smatraju se relevantnim stanjem tehnike za predmetnu patentnu prijavu:
Dokument 1. Patent US7,056,689, 06.06.2006., R. M. Lorence, K. W. Reichard: Methods of treating and detecting cancer using viruses.
Dokument 2. Patent US7, 7,736,640, 15.06.2010., R. M. Lorence, K. W. Reichard: Methods of treating and detecting cancer using viruses.
Dokument 3. US Patent app. number: 20100113335, 06.05.2010., Z. Zakay-Rones, A. Panet, E. Greenbaum, E. Galun, A. I. Freeman, L. Rasooly, C. S. Irving: Compositions and methods for treatement of cancer.
Dokumenti 1 i 2 istog podnositelja razotkrivaju metodu liječenja tumora administracijom virusa newcastleske bolesti u kombinaciji s poznatim kemostaticima, imunoadjuvantima itd.
Dokument 3 razotkriva liječenje tumora upotrebom lentogeničnog soja, dakle soja pogodnog da bude cjepni soj, virusa newcastleske bolesti.
Bit izuma
Izdvojen je vlastiti soj virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS te se je dokazalo da pripada skupini lentogenih i imunogenih virusa različitih od poznatih. Virus prema predmetnom izumu je deponiran u COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25 RUE DU DOCTEUR ROUX 75724 PARIS CEDEX 15, FRANCUSKA pod brojem CNCM I-4811. Zbog općenito očekivanog citolitičkog učinka virusa newcastleske bolesti, učinak ovog soja istražen je in vitro na četiri tipa staničnih linija tumorskih stanica i to:
FsaR – mišji fibrosarkom
SCCVII – mišji karcinom pločastih stanica
CT26WT – mišji adenokarcinom debelog crijeva
4T1 – mišji adenokarcinom dojke,
te uspoređen s učinkom na rast normalnih stanica L929 – (mišji fibroblasti).
Na modelima in vivo istražena je dinamika rasta tumora induciranih parenteralnom primjenom tumorskih stanica CT26WT – mišji adenokarcinom debelog crijeva i 4T1 – mišji adenokarcinom dojke. Citolitički učinak virusa ZG1999HDS pokazan je pokusima in vitro na staničnim kulturama tumorskih stanica te jednako i in vivo na miševima, značajno boljim negoli usporedno istražen citolitički učinak soja virusa newcastleskle bolesti.
Primjena
Svrha ovih pokusa je dokazati da soj virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS, može značajno inhibirati razmnožavanje tumorskih stanica i to FsaR – mišjeg fibrosarkoma, stanica SCCVII – mišjeg karcinoma pločastih stanica, stanica CT26WT mišjeg adenokarcinoma debelog crijeva te 4T1 – mišjeg adenokarcinoma dojke u uvjetima in vitro, te odgoditi i inhibirati rast mišjeg adenokarcinoma debelog crijeva CT26WT i mišjeg adenokarcinoma dojke 4T1 u eksperimentalnom tumorskom modelu in vivo. Soj virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS mogao bise, nakon završenih kliničkih istraživanj, primijeniti u liječenju nekih tumorskih bolesti ljudi i životinja, bilo samostalno ili u kombinaciji sa suvremenim metodama liječenja ovih bolesti (zračenje, kemoterapija i drugo).
POKUS 1. Istraživanje in vitro citotoksične aktivnosti soja virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS i usporedno virusa newcastleske bolesti soja LaSota, na kulturama tumorskih i normalnih stanica
Cilj pokusa je dokazati citotoksičke učinke različitih doza soja virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS na tumorskim i normalnim stanicama te usporediti citotoksični potencijal ovog soja s aktivnošću komercijalno dostupnog lentogenog LaSota soja virusa newcastleske bolesti.
Stanične linije
Istraživanje je provedeno na četiri vrste tumorskih stanica i to: mišjem fibrosarkomu FsaR, mišjem karcinomu pločastih stanica SCCVII, mišjem adenokarcinomu debelog crijeva CT26WT i mišjem adenokarcinomu dojke 4T1, te kao negativna kontrola, na normalnim stanicama mišjih fibroblasta L929.
Virusi
Korišten je pripravak soja virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS te komercijalni vakcinalni pripravak virusa newcastleske bolesti od soja LaSota (PESTIKAL®Pliva, Zagreb, Hrvatska).
Virusi su uzgojeni na korioalantoisnoj membrani desetodnevnih kokošjih SPF (SPF, engl. specific pathogen free, slobodni od specifičnih patogena) zametaka (VALO-SPF, Lohmann, Cuxhaven, Njemačka). Nakon zaražavanja, jaja su inkubirana pri 37oC tijekom 72 sata, a potom je iz jaja izolirana alantoisna tekućina obogaćena virusom te je određena 50%-tna infektivna doza za kokošji zametak, EID50 (engl. EID50 - Embryo-Infective Dose50). Korišteni su pripravci virusa koji su sadržavali najmanje 109 EID50 virusa po bočici.
Uzgoj stanica i izlaganje staničnih kultura djelovanju virusa
Dva dana (48 sati) prije početka pokusa tumorske i zdrave stanice su izvađene iz tekućeg dušika i odmrznute. Nakon centrifugiranja, stanice su resuspendirane u mediju za uzgoj stanica RPMI-1640 (Sigma, SAD) u koji se prethodno dodalo 10% fetalnog telećeg seruma FCS (FCS, engl. Foetal Calf Serum; Sigma, SAD), a zatim su nasađene u plastične bočice za uzgoj stanica od 250 ml (Greiner, Njemačka) te ostavljene u inkubatoru (Heraeus 6000, Njemačka) pri standardnim uvjetima (5% CO2 u vlažnoj atmosferi pri 37oC) kako bi se prilagodile za rast u uvjetima in vitro. Kada su stanice prekrile dno boce u kojoj su rasle, supernatant je odliven, a u bočicu je dodan 1 ml tripsina kako bi se stanice odlijepile od podloge. Nakon dodavanja medija stanice su centrifugirane 5 minuta pri 150 x g, a zatim je određen broj i viabilnost stanica bojenjem s tripanskim modrilom.
Izlaganje stanica virusima izvedeno je u mikropločama za uzgoj stanica s 96 bunarića (Greiner, Njemačka). U svaki je bunarić dodano približno 104 stanica u 100µl medija RPMI-1640 s dodatkom 10% FCS, a zatim su stanice inkubirane u standardnim uvjetima kako bi se dobila jednoslojna stanična kultura. Kada su stanice prekrile dno bunarića (za 24 sata), stari medij je odbačen i zamjenjen novim (225µl), a zatim je dodano 25µl uzorka virusa koncentracije 20 odnosno 200 EID50/stanici. Kontrolnim skupinama stanica dodano je 25µl medija RPMI-1640 bez virusa. Stanice su inkubirane u prisutnosti virusa pri standardnim uvjetima tijekom 48 sati, a zatim je određen citotoksički učinak određivanjem stupnja preživljenja stanica probom citotoksičnosti s kristal violetom.
Procjena stupnja preživljenja stanica testom citotoksičnosti s kristal violetom
Po završetku izlaganja stanica djelovanju virusa, stanice su fiksirane tijekom 15 minuta s 3%-tnom otopinom formalina. Zatim su stanice isprane u redestiliranoj vodi te ostavljene na zraku da se osuše. Tako fiksirane stanice obojene su dodavanjem 0,1%-tne otopine kristal violeta tijekom 20 minuta, isprane više puta redestiliranom vodom te ostavljene preko noći da se osuše. Boja vezana u stanicama ekstrahirana je pomoću 10%-tne otopine octene kiseline, a zatim je pomoću fotometra (Anthos Microplate Reader HT3) izmjerena apsorbancija na 540nm. Vrijednost apsorbancije proporcionalna je broju preživjelih stanica. Dobiveni rezultati prikazani su crtežom kao srednje vrijednosti s pripadajućim standardnim devijacijama.
Osim toga, izračunat je postotak inhibicije staničnog rasta u odnosu na kontrolu prema slijedećoj formuli: inhibicija staničnog rasta (%) = (K-T/K) x100,
gdje T označava srednju vrijednost apsorbancije u tretiranim stanicama (stanice izložene djelovanju virusa), a K označava srednju vrijednost apsorbancije u kontrolnim stanicama (stanice koje nisu izložene virusima).
Rezultati
Stanice mišjeg karcinoma SCCVII, fibrosarkoma FsaR, adenokarcinoma debelog crijeva CT26WT, adenokarcinoma 4T1 te fibroblasta L929 izložene su tijekom 48 sati u uvjetima in vitro djelovanju 20 odnosno 200 EID50/stanici soja virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS odnosno soja LaSota. Praćen je stupanj preživljenja stanica u ovisnosti o soju i koncentraciji virusa.
Na Slikama 1-5 prikazani su učinci virusa newcastleske bolesti sojeva ZG1999HDS i LaSota na stupanj preživljenja istraživanih stanica nakon 48 sati inkubacije stanica u prisustvu virusa, dok je u tablicama 1-5 preživljenje iskazano relativno kao postotak inhibicije u odnosu na kontrolu.
Oba istraživana soja virusa newcastleske bolesti značajno su smanjila broj preživjelih tumorskih stanica u odnosu na preživljenje stanica u kontrolnoj skupini, s tim da je u istoj dozi, soj ZG1999HDS pokazao statistički značajno veći % inhibicije u odnosu na soj LaSota. Učinak je bio dozno ovisan (200 EID50/stanici > 20 EID50/stanici), a osjetljivost stanica prema virusima opadala je u slijedećem nizu: FsaR>CT26WT>SCCVII>4T1. Primjena virusa na fibroblastima L929 također je u određenoj mjeri reducirala preživljenje ovih stanica, s tim da je intenzitet inhibicije bio znatno manji u odnosu na stanice fibrosarkoma.
POKUS 2. Učinak soja virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS i usporedno virusa newcastleske bolesti soja LaSota na rast mišjeg adenokarcinoma debelog crijeva CT26WT i mišjeg adenokarcinoma dojke 4T1
Cilj pokusa je istražiti učinak soja virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999HDS na rast mišjeg adenokarcinoma debelog crijeva CT26WT i mišjeg adenokarcinoma dojke 4T1 u eksperimentalnom tumorskom modelu in vivo te usporediti antitumorski potencijal ovog soja sa komercijalno dostupnim lentogenim sojem virusa newcastleske bolesti, LaSotom.
Pokusne životinje
Korišteni su miševi soja BALB/c, starosti između 3 i 4 mjeseca i tjelesne mase 20-23 g. Miševi su hranjene standardnom hranom za laboratorijske miševe (4 RF 21 GLP Mucedola srl, Italija) i pili vodu iz gradskog vodovoda. Pristup hrani i vodi je bio slobodan (ad libitum). Temperatura u pokusnoj prostoriji bila je 22oC, a vlažnost zraka iznosila je 55%. Ritam osvjetljenja bio je 12 sati svjetla i 12 sati tame. Pokus je vođen u skladu s hrvatskim Zakonom o dobrobiti životinja (NN 19/99).
Presađivanje tumora i primjena virusa
Viabilnost tumorskih stanica prethodno je provjerena pomoću testa isključivanja boje tripanskog modrila i iznosila je >95%. Osušak virusa je prije upotrebe bio pohranjen u hladnjaku pri 4oC. Neposredno prije ubrizgavanja, virus je suspendiran u RPMI-160 i pomješan s medijem u kojem su se nalazile stanice tako da je konačna doza virusa bila 200 EID50/stanici. Zatim je po 200µl suspenzije koja je sadržavala 106 tumorskih stanica i 200 EID50/stanici virusa newcastlske bolesti soja oznake ZG1999HDS odnosno soja LaSote ubrizgano potkožno u obrijano desno bedro miša, pomoću tuberkulinske igle i brizgalice. Kontrolni miševi su istodobno i na istovjetni način, primili po 200 µl RPMI-160.
Praćenje protutumorskog učinka
Tumori su mjereni 3., 5., 7., 10. i 13. dana pokusa, s pomoću kalipera (Lange Skinfold Caliper, Cambridge Scientific Industry, USA). Izmjerena su tri međusobno okomita promjera tumora: duljina (A), širina (B) i debljina (C). Za izračun volumena tumora korištena je sljedeća jednadžba: Volumen tumora (mm3) = π/6 x (A x B x C).
Statistička obrada podataka
Postignuti rezultati izraženi su kao srednje vrijednosti s pripadajućom standardnom devijacijom. Testiranje razlika između skupina provedeno je pomoću testa ANOVA u kombinaciji s Holm-Sidakovim post hoc testom višestrukih usporedbi, u slučaju kad je usporedba rađena za više od dvije skupine, dok je za usporedbu dviju skupina korišten Studentov t-test za nezavisne uzorke. Rezultati su obrađeni računalnim programom SigmaStat 3.5. Statistički značajnim smatrane su vrijednosti p<0,05.
Rezultati
U pokusu in vivo, potkožno je aplicirana suspenzija tumorskih stanica i virusa newcastlske bolesti soja oznake ZG1999HDS odnosno LaSote miševima BALB/c, te je praćen njihov učinak na vrijeme odgode pojave tumora kao i na inhibiciju tumorskog rasta nakon pojave tumora.
Krivulja rasta adenokarcinoma debelog crijeva CT26WT u miševima BALB/c nakon istodobne primjene stanica i virusa prikazana je Crtežom 6. Rast tumora u skupini koja je istodobno s tumorskim stanicama dobila virus newcastlske bolesti soj oznake ZG1999HDS u cjelosti je odgođen kod svih mišeav sve do 10. dana od ubrizgavanja stanica i virusa. Nakon toga zabilježena je pojava tumora, a prosječni volumen tumora u ovoj skupini 13. dana bio statistički značajno manji u odnosu na kontrolnu te skupinu koja je primila soj LaSota (p<0,05; Holm-Sidakov test). U skupini koja je primila virus newcastlske bolesti soj LaSota, rast tumora je bio odgođen do 5. dana kod svih miševa. Sedmog dana nakon ubrizgavanja tumorskih stanica zabilježen je rast kod 2 miša, a 13. dana tumori su izrasli u svih miševa ove skupine (Slika 6).
Rast adenokarcinoma 4T1 u miševima BALB/c nakon istodobne primjene tumorskih stanica i virusa prikazan je Slikom 7. Soj ZG1999HDS odgodio je u cjelosti rast tumora sve do 10. dana nakon ubrizgavanja tumorskih stanica. U ovoj skupini rast tumora zabilježen je u svih miševa 13. dana pokusa, ali je volumen tumora bio značajno manji u usporedbi kontrolom i skupinom koja je dobila soj LaSotu (p<0,05; Holm-Sidakov test). Rast tumora bio je odgođen za 5 dana u miševa koji su primili soj LaSotu istodobno s tumorskim stanicama. Nakon toga uočen je postupni rast tumora kod svih jedinki s tim da su, volumeni tumora u svim mjernim točkama, bili značajno manji u odnosu na kontrolu (p<0,05; Studentov t-test).
Zaključci
Soj virusa newcastleske bolesti deponiran u Collection nationale de cultures de microorganismes (cncm), Institut Pasteur, 25 Rue du docteur roux 75724 Paris Cedex 15, Francuska pod brojem CNCM I-4811, interne oznake ZG1999-HSD se može koristiti u liječenju tumorskih bolesti i to bilo samostalno ili u kombinaciji s drugim priznatim postupcima liječenja tumorskih bolesti ljudi i životinja. Poglavito, soj virusa prema predmetnom izumu, pokazuje iznimnu učinkovitost pri liječenju fibrosarkoma, karcinoma pločastih stanica, adenokarcinoma debelog crijeva, adenokarcinoma dojke. Preciznije rečeno, soj prema predmetnom izumu lizira (razgrađuje) tumorske stanice fibrosarkoma, karcinoma pločastih stanica, adenokarcinoma debelog crijeva i stanice adenokarcinoma dojke. Povrh navedenog djelovanja soj virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999-HSD ima naglašeno onkolitoičko djelovanje na način da odgađa rast tumora kao npr. fibrosarkoma, karcinoma pločastih stanica, adenokarcinoma debelog crijeva i stanica adenokarcinoma dojke.
Soj virusa newcastleske bolesti oznake ZG1999-HSD, u usporedbi s LaSota sojem virusa ewcastleske bolesti, ima naglašenije citolitičko i onkolitičko djelovanje na način da statistički značajno brže ubija tumorske stanice in vitro te također statistički značajno usporava rast tumora potaknutih sa četiri različitih vrsta tumorskih stanica.
Kratak opis slika i tablica
Slika 1. Citotoksički učinak NDV soja oznake ZG1999HDS i NDV soja LaSote na stanicama mišjeg karcinoma pločastih stanica SCCVII nakon 48 sati inkubacije stanica u prisustvu 20 i 200 EID50/stanici virusa.
Slika 2. Citotoksični učinak NDV soja oznake ZG1999HDS i NDV soja LaSote na stanicama mišjeg fibrosarkoma FsaR nakon 48 sati inkubacije stanica u prisustvu 20 i 200 EID50/stanici virusa.
Slika 3. Citotoksični učinak NDV soja oznake ZG1999HDS i NDV soja LaSote na stanicama mišjeg adenokarcinoma debelog crijeva CT26WT nakon 48 sati inkubacije stanica u prisustvu 20 i 200 EID50/stanici virusa.
Slika 4. Citotoksični učinak NDV soja oznake ZG1999HDS i NDV soja LaSote na stanicama mišjeg adenokarcinoma dojke 4T1 nakon 48 sati inkubacije stanica u prisustvu 20 i 200 EID50/stanici virusa.
Slika 5. Citotoksični učinak NDV soja oznake ZG1999HDS i NDV soja LaSote na stanicama mišjih fibroblasta L929 nakon 48 sati inkubacije stanica u prisustvu 20 i 200 EID50/stanici virusa.
Slika 6. Rast adenokarcinoma debelog crijeva CT26WT u miševima BALB/c nakon istodobne primjene suspenzije 106 tumorskih stanica CT26WT i 200 EID50/stanici virusa newcastlske bolesti soja oznake ZG1999HDS odnosno LaSota.
Slika 7. Rast adenokarcinoma sise 4T1 u miševima BALB/c nakon istodobne primjene suspenzije 106 tumorskih stanica 4T1 i 200 EID50/stanici virusa newcastlske bolesti soja oznake ZG1999HDS odnosno LaSota.
Tablica 1. Srednje vrijednosti apsorbancije pri 595nm (A595) i inhibicija staničnog rasta izražena kao % od kontrole na stanicama SCCVII.
Tablica 2. Srednje vrijednosti apsorbancije pri 595 nm (A595) i inhibicija staničnog rasta izražena kao % od kontrole na stanicama FsaR.
Tablica 3. Srednje vrijednosti apsorbancije pri 595nm (A595) i inhibicija staničnog rasta izražena kao % od kontrole na stanicama CT26WT.
Tablica 4. Srednje vrijednosti apsorbancije pri 595nm (A595) i inhibicija staničnog rasta izražena kao % od kontrole na stanicama 4T1.
Tablica 5. Srednje vrijednosti apsorbancije pri 595nm (A595) i inhibicija staničnog rasta izražena kao % od kontrole na fibroblastima L929.
Zvjezdica (*) u tablicama označava statistički značajnu razliku u inhibiciji između ZG1999HDS-20 i LaSota-20, a znak (#) između ZG1999HDS-200 i LaSota-200 (p<0,05; Student-ov t-test).
Claims (6)
1. Soj virusa newcastleske bolesti deponiran u Collection nationale de cultures de microorganismes (cncm), Institut Pasteur, 25 Rue du docteur roux 75724 Paris Cedex 15, Francuska pod brojem CNCM I-4811, interne oznake ZG1999-HSD, naznačen time da se koristiti u liječenju tumorskih bolesti i to bilo samostalno ili u kombinaciji s drugim priznatim postupcima liječenja tumorskih bolesti ljudi i životinja.
2. Soj virusa newcastleske bolesti prema zahtjevu 1, naznačen time da se koristi za liječenje ljudi i životinja od fibrosarkoma, karcinoma pločastih stanica, adenokarcinoma debelog crijeva, adenokarcinoma dojke.
3. Soj virusa newcastleske bolesti prema zahtjevima 1 ili 2, naznačen time da lizira tumorske stanice.
4. Soj virusa newcastleske bolesti prema zahtjevu 3, naznačen time da lizira stanice fibrosarkoma, karcinoma pločastih stanica, adenokarcinoma debelog crijeva i stanice adenokarcinoma dojke.
5. Soj virusa newcastleske bolesti prema zahtjevima 1 ili 2, naznačen time da ima naglašeno onkolitoičko djelovanje te odgađa rast tumora.
6. Soj virusa newcastleske bolesti prema zahtjevu 5, naznačen time da onkolitički djeluje i odgađa rast fibrosarkoma, karcinoma pločastih stanica, adenokarcinoma debelog crijeva i stanica adenokarcinoma dojke.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HRP20141096AA HRP20141096A2 (hr) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Onkoliza virusom newcastleske bolesti soj zg1999hds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HRP20141096AA HRP20141096A2 (hr) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Onkoliza virusom newcastleske bolesti soj zg1999hds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20141096A2 true HRP20141096A2 (hr) | 2016-05-20 |
Family
ID=56007681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HRP20141096AA HRP20141096A2 (hr) | 2014-11-11 | 2014-11-11 | Onkoliza virusom newcastleske bolesti soj zg1999hds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HR (1) | HRP20141096A2 (hr) |
-
2014
- 2014-11-11 HR HRP20141096AA patent/HRP20141096A2/hr not_active Application Discontinuation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0696326B1 (en) | Use of NDV in the manufacture of a medicament for treating cancer | |
| Lorence et al. | Complete regression of human neuroblastoma xenografts in athymic mice after local Newcastle disease virus therapy | |
| Reichard et al. | Newcastle disease virus selectively kills human tumor cells | |
| CA2782189C (en) | New clone of newcastle disease virus, its manufacture and its application in the medical treatment of cancer | |
| US7118740B1 (en) | Method for limiting the growth of cancer cells using an attenuated measles virus | |
| AU9603898A (en) | Treatment of neoplasms with viruses | |
| Wu et al. | Recombinant Newcastle disease virus Anhinga strain (NDV/Anh-EGFP) for hepatoma therapy | |
| HU194496B (en) | Process for preparing a living vaccine against marek disease | |
| He et al. | Newcastle disease virus chimeras expressing the hemagglutinin-neuraminidase protein of mesogenic strain exhibits an enhanced anti-hepatoma efficacy | |
| HRP20141096A2 (hr) | Onkoliza virusom newcastleske bolesti soj zg1999hds | |
| RU2562115C1 (ru) | Штамм вируса болезни ньюкасла для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса для создания прототипного противоопухолевого препарата | |
| WO2017071379A1 (zh) | 一种用于治疗胃癌的肿瘤疫苗及其制备方法 | |
| CN106591248B (zh) | 重组溶瘤流感病毒制备方法和应用 | |
| Fathy et al. | Assessment of antiviral activity for ethanolic chlorella vulgaris extract against Newcastle Disease Virus (NDV) infection in Sasso chicken | |
| CN104771753B (zh) | 一种布氏菌病治疗制剂 | |
| RU2644676C1 (ru) | Штамм вируса болезни Ньюкасла NDVH-2 для изучения возможности разработки на его основе вирусного онколитического препарата | |
| Mehrabanpour et al. | Plaque formation of lasota strain of newcastle disease virus adapted in chick embryo fibroblast cells | |
| TR201809382T4 (tr) | Antineoplastik etkiye sahip immünostimülatör ve söz konusu immünostimulatörün üretilmesine yönelik usul. | |
| Storozynsky | Investigating Radiation in Combination with Oncolytic Vaccinia Virus to Improve the Treatment of Glioblastoma | |
| Addisu Demeke et al. | Current advancements on the significance of oncolytic viruses in the treatment of tumor cells. | |
| Ismail | Local And Systemic Effects Of Injection Of Lytic And Non-lytic Strains Of Newcastle Disease Virus On Regression Of Cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| NPPZ | Continued processing | ||
| NPPU | Continued processing adopted | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20171127 Year of fee payment: 4 |
|
| ODBI | Application refused |