HK40112928A - 含卤代氧杂蒽的局部抗革兰氏阳性细菌的眼科组合物和方法 - Google Patents

Description

含卤代氧杂蒽的局部抗革兰氏阳性细菌的眼科组合物和方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年12月28日提交的美国申请系列号63/294252的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。

背景技术

角膜疾病是全世界单眼失明的主要原因，尤其影响边缘化的人群。角膜混浊主要由传染性角膜炎造成，是全球失明的第四大原因，在世界上资源最少的国家中，角膜混浊占可避免视力障碍的10％。仅在印度，每年就有约200万人患角膜溃疡。在美国，传染性角膜炎通常与佩戴隐形眼镜相关，但在资源不足的国家，其更常由农业工作期间持续的眼创伤造成(Austin等人，Ophthalmology 124(11):1678–1689(2017))。

一种角膜溃疡，即角膜炎，是角膜上的开放性伤，并且是常见的人类眼睛病况。它可能是由创伤造成的，特别是由植物物质，以及化学伤害、隐形眼镜和感染造成的。其它眼睛病况(诸如睑内翻、双行睫、角膜营养不良和干燥性角膜结膜炎(干眼症))可造成角膜溃疡。

许多微生物造成感染性角膜溃疡。其中包括细菌、真菌、病毒、原生动物和衣原体。

细菌性角膜炎可由多种细菌造成，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠球菌(Enterococci)、假单胞菌(Pseudomonas)、诺卡菌(Nocardia)、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoea)和许多其它细菌。多重耐药性(MDR)革兰氏阳性细菌的出现的增加是主要的公共卫生威胁(Bassetti等人，Annal.Clinic.Microbiol.Antimicrob.12:1-15(2013)；Butler等人，J.Antibiot.66:571-591(2013)；和Woodford等人，J.Infect.59:S4-16(2009))。特别地是，葡萄球菌、肠球菌和链球菌属的MDR菌株对发病率和死亡率有显著影响(Dupont等人，J.Antimicrob.Chemother.66:2379-2385(2011))。

真菌性角膜炎造成深部的和严重的角膜溃疡。其通常由曲霉属(Aspergillussp)、镰孢菌属(Fusarium sp)、念珠菌属(Candida sp.)以及根霉(Rhizopus)、毛霉菌(Mucor)和其它真菌造成。真菌性角膜炎的典型特征是缓慢发作和逐渐进展，其中迹象远多于症状。溃疡周围的小卫星病变是真菌性角膜炎的常见特征，并且观察到涉及眼前房中的炎性细胞的病况(眼前房积脓)。

病毒性角膜炎造成角膜溃疡。其最常见地是由单纯疱疹、带状疱疹和腺病毒造成的。其也可能由冠状病毒和许多其它病毒造成。

疱疹病毒造成树枝状溃疡，所述树枝状溃疡可在个体的一生中复发和重现。单纯疱疹病毒(HSV)角膜炎在美国影响估计500000人，并且在全球影响估计150万人。疱疹病毒是大多数发达国家中单侧感染性角膜失明的最常见的原因(Austin等人，Ophthalmology124(11):1678–1689(2017))。

病毒性角膜炎与细菌性和真菌性角膜炎的不同之处在于病毒性角膜炎可以变成慢性和复发性的。HSV角膜炎除了是一种痛苦的、威胁视力的感染外，即使当患者没有经历活动性感染时，其也会显著影响生活质量。较不常见形式的病毒性角膜炎包括水痘带状疱疹病毒(VZV)角膜炎和巨细胞病毒(CMV)角膜炎(Austin等人，Ophthalmology124(11):1678–1689(2017))。

原生动物(诸如棘阿米巴原虫(Acanthamoeba))感染角膜炎的特征是剧烈疼痛，且与在游泳池中游泳的隐形眼镜使用者有关。

浅表溃疡涉及部分上皮的脱落。深部溃疡延伸到基质中或穿过基质，可导致严重的瘢痕和角膜穿孔。当溃疡延伸穿过基质时，就会发生角膜后弹力层膨出(descemetoceles)。这种类型的溃疡特别危险，如果不及时治疗，会迅速导致角膜穿孔。

溃疡的位置在一定程度上取决于病因。中央溃疡通常是由创伤、干眼症或从面神经麻痹或眼球突出的暴露造成的。睑内翻、严重干眼症和倒睫(睫毛的向后生长)可能造成周围角膜的溃疡。免疫介导的眼病可在角膜和巩膜的边缘导致溃疡。这些免疫病包括类风湿性关节炎、玫瑰痤疮和系统性硬化症，它们会引起一种特殊类型的角膜溃疡，称为蚕蚀性角膜溃疡。蚕蚀性角膜溃疡在角膜边缘内有一个环形凹坑状的角膜凹陷，通常有一个悬垂的边缘。

正确的诊断对最佳治疗至关重要。溃疡(无论是感染性的还是非感染性)的造成原因尚待确定。

细菌性角膜溃疡通常需要大量加强的抗生素疗法来治疗感染。真菌性角膜溃疡需要大量施用局部抗真菌剂。疱疹病毒造成的病毒性角膜溃疡可能对抗病毒剂有反应，例如每天至少局部滴注五次阿昔洛韦软膏。此外，通常会施用止痛药等支持疗法，包括阿托品或后马托品等局部睫状肌麻痹药，以扩张瞳孔，从而停止睫状肌痉挛。

浅表溃疡可能在不到一周的时间内治愈。深部溃疡和角膜后弹力层膨出可能需要结膜移植物或结膜瓣、软性隐形眼镜或角膜移植。通常建议适当的营养，包括蛋白质摄入和维生素C。在角膜软化症的情况下，角膜溃疡是由于维生素A的缺乏引起的，通过口服或肌内途径给予维生素A补充。通常在角膜溃疡中禁用的药物是局部皮质类固醇(Alhassan等人，Cochrane Database Syst Rev.1(1):CD006131(2014))和麻醉剂，这些药物不应用于任何类型的角膜溃疡，因为它们会防止愈合，可能引起真菌和其它细菌的重复感染，并且通常会使病况更加恶化。

“红眼”、“结膜炎”和“角膜溃疡/角膜炎”是常提到的问题。结膜炎是造成结膜血管扩张并导致炎症的常见病况。病毒性和细菌性结膜炎均伴有红眼，并且具有高度传染性。评估应包括检查视力和用手电筒或裂隙灯检查。应将荧光素滴剂滴入结膜囊中，并用裂隙灯的钴蓝光或眼底镜观察眼睛，以排除任何角膜溃疡或感染的迹象。

病毒性结膜炎是造成感染性结膜炎最常见的原因。这种感染在成人中比在儿童中更常见。大多数病例是由腺病毒造成的。有时，单纯疱疹或带状疱疹病毒是造成这种情况的原因。通常可以告知患者病毒性结膜炎是自限性的，因为没有具体的治疗方法。

细菌性结膜炎虽然是结膜炎的较不常见的原因，但细菌性结膜炎在儿童中更常见。最常见的细菌是流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和金黄色葡萄球菌。使用抗生素滴眼液与改善的临床和微生物缓解率有关。通常建议使用广谱局部抗生素。

角膜感染(微生物性角膜炎)是一种眼科急症，需要立即关注，因为其可以迅速发展。角膜感染是处在工作年龄的成年人视力损伤的最常见的原因之一。在美国，每年报告约30000例微生物性角膜炎(Sharma等人，Ocul Surf 15:670-679(2017))。

细菌感染是感染性角膜炎最常见的原因。常见的致病细菌包括金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Teweldmedhin等人，BMC Ophthalmol17:212(2017))。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是隐形眼镜佩戴者中与细菌性角膜炎有关的最常见的微生物。

尽管如下所述，细菌性溃疡通常对可用的局部抗生素滴剂治疗有反应，但北美的抗生素耐药性(诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))感染率的增加已经引起关注。美国疾病控制中心(CDC)估计，每年有200万人感染耐药性微生物。据报道，在美国，大约80％的MRSA的眼部分离株对最常用的抗生素类氟喹诺酮类处方药具有耐药性。(Austin等人，Ophthalmology 124(11):1678–1689(2017))

局部抗生素是目前的主要治疗方法，并且选项包括使用氟喹诺酮类(每小时1-2滴环丙沙星0.3％或氧氟沙星0.3％，持续48小时，然后每4小时一次，直至痊愈)的单一疗法或加强的氨基糖苷类/头孢菌素组合(每小时1-2滴加强的头孢噻啉5％加庆大霉素0.9％，持续48小时，然后根据治疗反应减少频率)。这些方案具有相似的效果，但氟喹诺酮类降低化学性结膜炎的风险和眼部不适。与氧氟沙星相比，环丙沙星增加白色角膜沉淀物的风险。有时，可能需要角膜移植来根除生物体或修复损伤。虽然明显有效，但对于许多患者来说，每小时的滴眼液治疗是一种难以遵循的方案。

氯霉素是用于红眼最常见的一线处方抗生素。有几种商业产品可用，作为滴眼液和眼膏使用。示例性地，含有0.25％和0.5％氯霉素的眼科溶液和含有1％氯霉素的眼膏可从Sandoz Canada Inc.以商品名获得。

眼科溶液的剂量和施用说明书仅规定“每3小时或更频繁(如有必要)向受感染的眼睛滴2滴眼科溶液”。眼膏的剂量和施用说明书规定：“每3小时或更频繁(如有必要)向受感染的眼睛施用少量软膏。”同样，需要高频率重复施用。(处方信息，Sandoz Canada Inc，修订日期：2018年6月14日)。

天然存在的和合成的染料已被用作抗菌剂或抗原生动物剂(Zheng等人，BMCMicrobiol 20(2020))。例如，亚甲基蓝和氯苯吩嗪仍被认为是重要的孤儿药(Ginimuge等人，J.Anaesthesiol.Clin.Pharmacol.26:517-520(2010)；和Ammerman等人，J.Antimicrob.Chemother.72:455-461(2017))。

玫瑰红(RB)是一种明亮的玫瑰红色的氧杂蒽衍生物化合物，其于19世纪首次合成用作羊毛染料，随后在日本用作食品染料(食品红105号)(Mizutani等人，J.Environ.Public Health.2009,953952)。更具体地，RB是氧杂蒽化合物荧光素的衍生物。与荧光素相比，RB具有两种类型的额外的卤素：四个氯化物取代基和四个碘化物取代基。

1914年首次描述了使用RB进行人类眼表损伤的视觉诊断(通过眼部滴注)(Feenstra等人，Ophthalmology 99:606–617(1992))。RB后来被引入作为一种静脉内施用的相对快速的诊断辅助手段，用于评估单次100mg剂量后的人类肝脏的功能能力(Wachter等人，Lasers Surg Med.32:101-110(2003))。1971年，¹³¹I RB(玫瑰红钠¹³¹I注射液USP)被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于确定肝功能的诊断辅助手段(Baroyan等人，Eksperimental'naya Meditsina(Riga)20:74-78(1985)；和Mincev等人，Folia Medica(Plovdiv)16:35-41(1974))。

2009年，由于出现了更新的肝脏成像方法，诸如计算机断层扫描，Robengatope的制造商Bracco Diagnostics Inc.正式从美国市场撤回了RB诊断产品。1974年，Barnes-Hind Pharmaceuticals Inc.(Barnes-Hind)推出了在水溶液中1％RB的医疗器械产品，用于披露角膜损伤、诊断角膜炎、角膜结膜炎和干燥综合征以及检测眼睛中的异物(Gilger等人，Vet.Ophthalmol.16:192–197(2013))。1981年，Barnes-Hind推出了用于相同适应症的相同浓度的眼用试纸条。虽然这两种诊断产品都获得了美国食品和药物管理局(FDA)的上市许可，但因为它们的上市时间早于FDA的正式审查和批准，因此溶液和试纸条器械及其各自的声明均未获得批准。

商业级RB(市售染料含量可在80％至95％RB之间变化，包括总污染物和物质相关杂质)是使用Gnehm在19世纪80年代开发的历史工艺制造的。据认为，用于诊断应用的RB是一种含有一些杂质的商业级RB(Paczkowski等人，Free Radic.Biol.Med.1:341–351(1985))。美国药典(USP)先前将RB列为分析标准品。RB于2019年从USP中移除。因此，商业级RB在现代诊断和治疗环境中缺乏关联性。因此，批准将RB应用于治疗人类疾病存在重大的监管挑战。

Singer等人的美国专利号8,530,675、9,273,022和9,422,260描述并要求合成高度纯化的玫瑰红，以及类似地纯化的类似化合物，所述化合物含有不同的卤素取代基和不同数量的卤素取代基，以及它们的内酯形式。这些化合物在本文中统称为“卤代氧杂蒽”。

玫瑰红(RB)染料(4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘荧光素)已被临床研究用于治疗黑色素瘤和其它实体癌(Maker等人，J.Clin.Cell.Immunol.6:343-349(2015；Liu等人，Oncotarget.7:37893-37905(2016)；Patel等人，J.Clin.Oncol.38:3143(2020)；Kim等人，J.Control.Release.156:315-322(2011)；和Qin等人，Cell Death Dis.8:e2584(2017))。RB的光动力抗菌特性已有零星报道(Pérez-Laguna等人，PhotodiagnosisPhotodyn.Ther.21:211-216(2018)；Uekubo等人，Laser Ther.25:299-308(2016)；Anju等人，Photodiagnosis Photodyn.Ther.24:300-310(2018)；Gavara等人，Front.Med.8:494(2021)；Joanna等人，Front.Microbiol.9:1949(2018)；Hirose等人，Arch.Oral Biol.122:105024(2021)；Dai等人，Photodiag.Photodyn.Ther.6:170-188(2009)；Ghorbani等人，Laser Ther.27:293-302(2018)；Kim等人，J.Food Sci.73:C540-545(2008)；Manoi等人，J.Photochem.Photobiol.B.162:258-265(2016)；Nakonieczna等人，Front.Microbiol.9:1949(2018)；Sabbhi等人，Appl.Water Sci.8:56(2018)；Santos等人，Antibiotics 8:211(2019)；和Worzella等人，In Cancer Cell Culture；Humana Press:Totowa,NJ,USA,285–291.(2011))。

例如，Dees等人的美国专利号8,974,363教导了将10μM-100μM(即10μg/mL至100μg/mL)的RB局部制剂与500nm-600nm波段的绿光照射结合使用，以对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性抗生素耐药性细菌，且对光源、其强度或照射持续时间没有具体要求。

Naranjo等人，Am J Ophthalmol 208:387-396(2019)报道了对18例对标准疗法无反应的进行性感染性角膜炎患者的眼睛使用玫瑰红光动力抗微生物疗法(RB-PDAT)。将含有0.1％或0.2％玫瑰红(RB)的组合物应用于去上皮化的角膜30分钟，然后用来自LED源的5.4J/cm²的绿光照射15分钟。棘阿米巴原虫(一种阿米巴原虫)是最常见的微生物(10/17；59％)，其次是镰孢菌属(一种真菌；4/17；24％)、铜绿假单胞菌(一种革兰氏阴性细菌；2/17；12％)和弯孢菌属(Curvularia spp.)(一种真菌；1/17；6％)，以及一名具有没有确诊的微生物学诊断的患者。据报道，在72％的病例中成功实现了RB-PDAT(避免治疗性角膜移植术)，RB-PDAT后平均临床消退(通过再上皮化和浸润物消退减轻疼痛和炎症)时间为46.9±26.4天。

Amescua等人，Cornea 36(9):1141-1144(2017)教导了在375nm或518nm照射15分钟后，约0.1％的玫瑰红(RB)被光激活，可以在体外抑制多重耐药性角膜镰刀菌(Fusariumkeratoplasticum)的真菌生长。在多次连续的抗真菌药物治疗后，使用上述浓度的RB滴在人类患者的镰刀菌感染的清创的角膜上皮30分钟，然后使用518nm的光进行照射以提供0.9J/cm²的总能量来进行研究。照射后36小时注意到疼痛消退，并且角膜浸润物在接下来的两周内缩小。治疗后四天，浸润物在所有方向上都小了大约1mm。

在照射治疗后第13天，浸润物几乎消退，并进行了第二次玫瑰红RB照射治疗(1.8J/cm²)。在局部皮质类固醇治疗后，到第一次RB治疗后的第246天，患者表现出治疗的眼的健康且稳定的眼表以及清晰的角膜。Martinez等人，Cornea 37(10):e46-e48(2018)报道了对治疗的患者的眼睛的随访研究。

Halili等人，Am J Ophthalmol 166:194-202(2016)报道了对在琼脂上的从患者分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)进行的体外研究：使用在黑暗中以0.1％和0.03％溶解在高纯度水中的RB，在环境室内光下照射30分钟，和在LED绿光下照射34分钟，以提供5.4J/cm²。然后将样品在培养箱中在避光的盒子中生长72小时。以下均显示出对两种MRSA菌株的完全生长抑制：(1)在环境和绿色LED照射下的两种玫瑰红浓度，和(2)在黑暗中的0.1％的玫瑰红浓度。在黑暗条件下，0.03％的玫瑰红显示出对菌株2的完全抑制，但对菌株1的抑制不完全。

Arboleda等人，Am J Ophthalmol 158(1):64-70(2014)特别报道了在照射(518nm；5.4J/cm²)和黑暗条件下使用RB然后孵育三天对真菌性角膜炎患者分离株的体外生长抑制。研究了腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和白色念珠菌(Candida albicans)的分离株。下表汇总了该研究的数据。

如下文所公开的，本发明根据需要提供温和且更容易使用的治疗。此外，该治疗设想在基本没有光的情况下(例如当治疗的受试者闭着眼睛睡觉时)使用，当光与物质(光化光)相互作用时，所述光会产生可识别或可测量的改变。

发明内容

在一个方面，本发明设想了一种光化光不透过的容器的眼科系统，所述容器含有卤代氧杂蒽(荧光素)诸如玫瑰红或其药学上可接受的盐或酯的局部眼科组合物，所述卤代氧杂蒽(荧光素)或其药学上可接受的盐或酯溶解或分散在水性眼科运载体中，并且以约0.2μg/mL至约50μg/mL(或约0.00002wt.％至约0.005wt.％)的治疗细菌性角膜炎有效浓度存在于所述组合物中。在优选的实践中，所述组合物具有约6.5至约7.6的pH值且优选地约7.0至约7.4的pH值(正常泪液的pH值)。设想的组合物优选地进一步包括增稠剂和电解质。更优选地，还存在透明质酸。

在本发明的另一个方面中，用上述局部眼科组合物治疗有需要的哺乳动物受试者，通过在基本上不存在光化光的情况下将治疗角膜炎有效量的所述组合物放置在受试者的微生物感染的眼睛的角膜表面上(诸如每只眼睛一滴或两滴)，然后使这样治疗的受试者在不存在光化光的情况下保持约3小时至约12小时的时间段。治疗通常在哺乳动物受试者入睡之前实施。这种治疗方案通常重复多次，直到微生物感染被克服。

如本文所用，短语“光化光”表示可造成局部眼科组合物的成分中的一种或多种的光化学反应的光。根据该定义，所述光化光的波长被组合物的受体分子吸收，并且存在足够的所吸收的波长的光子通量以引起在吸收受体卤代荧光素分子中或由吸收受体卤代荧光素分子诱导的可检测化学反应。举例说明性化学反应包括分解和光敏化。

术语“基本上不存在光化光”在本文中用于表示在施用于受感染的眼睛后，组合物经受环境光约两分钟或更短的时间段。因此，在施用后，闭合眼睑，在经治疗的眼睛上放置遮光眼罩，关闭环境光等。类似地，吸收的波长的光子通量不足以引起在吸收受体卤代荧光素分子中或由吸收受体卤代荧光素分子诱导的可检测化学反应。

感染的微生物源可以是细菌、病毒、真菌或阿米巴。优选地，感染源是细菌性的，并且感染性细菌优选地是革兰氏阳性细菌。

具体实施方式

在一个方面，本发明设想了一种光化光不透过的容器的眼科系统，所述容器含有卤代氧杂蒽(荧光素)诸如玫瑰红或其药学上可接受的盐或酯的局部眼科组合物，所述卤代氧杂蒽(荧光素)或其药学上可接受的盐或酯溶解或分散在水性眼科运载体中，并且以约0.2μg/mL至约50μg/mL(或约0.00002wt.％至约0.005wt.％)的治疗细菌性角膜炎有效浓度存在于所述局部眼科组合物中。优选地，卤代荧光素(氧杂蒽)的浓度为约0.5μg/mL至约20μg/mL。在优选的实践中，所述组合物具有约6.5至约7.6的pH值，更优选地约7.0至约7.4的pH值(正常泪液的pH值)。设想的组合物优选地进一步包括增稠剂和电解质。

值得注意的是，与之前讨论的Naranjo等人、Amescua等人、Martinez等人、Halili等人和Arboleda等人的论文中使用的玫瑰红的浓度相比，设想的组合物含有该浓度约十分之一至约千分之一的卤代氧杂蒽。

更优选地，还存在透明质酸，所述透明质酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成的二糖聚合物，所述二糖聚合物通过交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键连接。透明质酸为组合物提供一些增稠效果、缓冲和张力，并有助于维持施用的组合物的水与眼睛表面接触。

在本发明的另一方面，用上述局部眼科组合物治疗有需要的哺乳动物受试者：通过在不存在额外提供的光化光的情况下将治疗角膜炎有效量的所述组合物放置在受试者的微生物感染的眼睛的表面上(诸如每只眼睛一滴或两滴)，然后使这样治疗的受试者在不存在光化光的情况下保持约3小时至约12小时的时间段。所述治疗通常在哺乳动物受试者入睡之前实施。当治疗的受试者在施用后处在存在光化光的情况或预期处在存在光化光的情况时，也可以在施用后使用光化光不透过的眼罩覆盖经治疗的眼。该治疗方案通常重复多次，直到微生物感染被克服。

局部眼科药物组合物

水性眼科运载体

设想的组合物主要是(按重量计)水性眼科运载体，其它成分溶解或分散在水性眼科运载体中。所述组合物的主成分是无菌水，诸如USP注射用无菌水。

设想的组合物具有至少一种助强剂(builder)或增稠剂，所述助强剂或增稠剂以提供以下粘度的含量存在：约10cps至约300cps，优选地约30cps至约120cps，更优选地约50cps至约80cps。尽管诸如甘油和丙二醇等溶剂也可以为组合物提供一些增稠作用，但典型的增稠剂是聚合物。

甘油和丙二醇单独或一起可占组合物的0重量％至约2.5重量％。更优选地，一种或两者一起以约0.4重量％至约2重量％存在。甘油和丙二醇均可与水混溶。

提供了含有一种或多种溶解的溶质的设想的局部眼科组合物，所述溶解的溶质足以为药物组合物提供约270mOsm/kg至约340mOsm/kg的渗透压(Osm)，并且优选地渗透压为约300mOsm/kg至325mOsm/kg，其大致为人泪液展现的渗透压的范围。

通过水溶性的钠、钾、钙和镁的氯化物、磷酸盐和硝酸盐的存在，可以获得至少部分渗透压。钠，诸如氯化钠的形式，由于其固有的生理相容性，是作为电解质的优选的实施方案。优选这种电解质以约0.1％至约2％的浓度、并且更优选地以约0.5％至约1.5％的浓度、更优选地以约0.8％至约1.2％的浓度、并且最优选地以约0.9％的浓度存在于组合物中。水性0.9N氯化钠的渗透压为308mOsmol/升。

当需要治疗的受试者出现角膜肿胀时，可以使用含有约2％至约5％氯化钠的高渗组合物来减轻角膜肿胀同时治疗感染。含有2％和5％氯化钠的眼睛治疗组合物的渗透压分别计算为684mOsm和1711mOsm(Yorek等人，Invest Ophthalmol Vis Sci.57:2412–2419(2016))。这些举例说明性产品由Bausch&Lomb(Bridgewater,New Jersey)以Muro商标销售。

低分子量聚(乙二醇)(PEG)诸如PEG 400或PEG 1000可以为组合物提供润滑和对干眼症状的一些缓解。由于这些聚合物缺乏离子电荷，这些聚合物还增加相对少量的渗透压。取决于设想的组合物中存在的其它溶质，低分子量PEG可能不存在或以约1mg/mL至约10mg/mL存在。

右旋糖酐是一种具有糖苷键的复杂的含支链的非离子带电的微生物来源的聚α-d-葡萄糖苷，所述糖苷键主要为C-1→C-6，具有α-1,3键形成的支链。右旋糖酐链的长度不同(从约3千道尔顿至约2000千道尔顿)。鉴于其分子量为约40000kDa和70000kDa，因此两种常用的右旋糖酐被分别称为右旋糖酐40和右旋糖酐70。

糊精是由α-1,4或α-1,6键连接的水溶性的直链聚葡萄糖。糊精是由淀粉和糖原的水解产生的混合物，且不含离子电荷。其特征性分支将右旋糖酐与糊精区分开来，糊精是由α-1,4或α-1,6键连接的直链葡萄糖聚合物。

类似于PEG，存在于设想的组合物中的右旋糖酐和糊精不带电荷，不会极大地改变组合物的渗透压。右旋糖酐可以为眼睛提供一些润滑，并且可以不存在，或者以约0.5mg/mL至约2mg/mL存在。

通常作为聚维酮在商业上销售的聚(乙烯基吡咯烷酮)是另一种非离子电荷聚合物，类似于右旋糖酐，其已被用作血液增量剂用于静脉内应用，用在眼科药物中，并且存在时不会明显改变设想的组合物的渗透压。当存在时，聚维酮以约1mg/mL至约2mg/mL存在，并且更优选地以约7mg/mL至约15mg/mL存在。

另一种有用的非离子聚合物是羟丙基甲基纤维素(HPMC)，也作为羟丙甲纤维素(Hypromellose)在商业上销售。美国专利号5,679,713教导在药物组合物中可以使用与治疗干眼症的活性剂胆碱能化合物一起使用的羟丙甲纤维素、甲基纤维素、聚乙烯醇或透明质酸。上述专利的无结果实例使用了0.5重量％至1重量％的甲基纤维素和1.4重量％的聚乙烯醇。

另一种水溶性的非离子聚合物增稠剂是羟乙基纤维素(HEC)。这种材料有几种分子量可用，每种分子量提供不同量的增稠作用/存在的wt％。以Natrosol^TM250的名称出售的HEC的一个来源是Covington,KY的Ashland Specialty Chemicals。

以商品名和Relieva^TM出售的市售干眼症药物均含有0.5％的阴离子羧甲基纤维素钠作为活性成分，而Relieva^TM产品也含有0.9％的甘油作为活性成分。活性成分与溶解在纯化水中的许多非活性成分一起存在。这些产品由Allergan,Inc.(AbVie公司，North Chicago,IL)销售。

透明质酸(HA)是一种阴离子、非硫酸化糖胺聚糖，广泛分布于结缔组织、上皮组织和神经组织中。所述透明质酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成的重复单元的聚合物，通过交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键连接。它在糖胺聚糖中是独特的，因为它是非硫酸化的，并且分子量可以达到数百万道尔顿。因为它是阴离子的，并且每个分子通常含有几个羧基，所以HA可以对设想的组合物的渗透压具有相对大的影响。

另一种阴离子增稠聚合物是部分中和的水分散性羧甲基纤维素。这种材料可以以不同分子量从许多供应商那里获得，以提供水中的每给定重量百分比的不同粘度。

短语“部分中和”与含羧基的聚合物结合使用，所述含羧基的聚合物的羧基官能团与碱反应形成带阴离子电荷的羧酸基，并有助于为聚合物提供水溶性或分散性。

还可以使用其它阴离子增稠剂，诸如部分中和的交联丙烯酸、甲基丙烯酸和共聚物，诸如美国专利号3,074,852、3,330,729和4,226,848的一项或多项的水溶性的交联丙烯酸酯聚合物，例如Lubrizol Corp.(Wickliffe,Ohio)以934P NF或974P NF商标出售的材料。这些材料是与聚烯基聚醚(诸如烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇)交联的丙烯酸均聚物，每个交联剂平均每个分子含有至少三个烯丙基。据报道，这两种聚合物都是水溶性的，并且当以0.5重量％存在时，在pH值为7.5时提供粘度。934P NF在苯中聚合，而974PNF在作为溶剂的乙酸乙酯中聚合。

另一类有用的增稠剂是一种水溶胀性但不溶于水的交联丙烯酸聚合物，所述交联丙烯酸聚合物在美国专利号3,202,577和4,615,697中有描述，并且在文献中常被称为聚卡波非和作为生物粘附剂。这些聚合物可以定义为至少80重量％的单烯不饱和羧基官能单体和约0.05重量％至约1.5重量％的交联剂(即3,4-二羟基-1,5-己二烯或2,5-二甲基-1,5-己二烯)共聚的反应产物。该聚合物的羧基在组合物的pH值下也是至少部分中和的。

这些生物粘附聚合物不含前面讨论的聚烯基聚醚交联物。下面讨论可以存在以构成100重量％的单体的剩余单体。

除了上述两种成分外，生物粘附聚合物也可以包括聚合的单烯不饱和重复单元，诸如上述一种或多种的酸的C₁-C₆烷基酯(诸如丙烯酸己酯、甲基丙烯酸丁酯和巴豆酸甲酯)；上述酸的羟基亚烷基官能酯平均每个分子含有1至约4个含2-3个碳原子的氧化烯基，诸如甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯和四乙二醇单丙烯酸酯；甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺及其C₁-C₆单烷基和二烷基衍生物，诸如N-甲基丙烯酰胺、N-丁基甲基丙烯酰胺和N,N-二甲基丙烯酰胺；苯乙烯；以及本领域已知的可与上述含羧基官能团的单体和交联剂共聚的类似物。生物粘附聚合物最优选地仅由单烯不饱和羧基官能单体和交联剂制备。

本文中使用的生物粘附剂可以通过使用引发剂诸如过氧化苯甲酰、偶氮二异丁腈等的常规自由基聚合技术制备，并且也可以在水性介质中聚合，并且不通过蒸汽作用聚集。最近的上文段落中提到的两项专利提供了有用的生物粘附剂的示例性制备，该专利的公开内容通过引用并入本文。

如前所述，所述生物粘附剂可以在水性介质中聚合。在优选的实践中，水性介质是碱土金属盐(诸如硫酸镁)的饱和溶液。

碱土金属盐具有至少两种功能。第一，它增加了聚合介质的密度，使得聚合的生物粘附剂漂浮在水性介质的表面上，并且可以容易地从中除去。第二，特别是硫酸镁的使用减少了生物粘附剂在水性介质中的膨胀，从而促使了聚合和回收。经过几次水冲洗聚合物后，生物粘附剂通常含有约0.5％至约1％的碱土金属离子。

美国专利号5,221,722教导了被称作增强型聚卡波非的制备。该聚合物在适合的引发剂和二乙烯乙二醇交联剂(诸如3,4-二羟基-1,5-己二烯)的存在下，在选自丙酮和烷基乙酸酯(烷基中含有1至6个碳原子)的溶剂中制备。据说以这种方式制备的聚卡波非具有生物粘附的特性，并且当在水中测量其1重量％的粘液时，其粒径小而不需研磨，并且粘度超过20000cPs。

为了防止聚合物在聚合中胶凝并推进离散颗粒的形成，至少一部分羧基被教导用氢氧化物、氧化物或碳酸盐等形式的IA族金属化合物中和。这些的例子包括钠、钾等，以及与氨和某些胺类(包括吗啉、单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；单丙醇胺；以及部分聚合物的盐不易溶于反应介质的其它胺)的反应。优选地，单体上大于0.1重量％的羧基被中和或形成上文所列的材料的盐。更优选地，在聚合前中和大于1重量％和多至约10重量％(尤其是小于约5％)的羧基或将其转化为等效盐。

据报道，上述合成提供了平均粒径小于10μm的聚合物，使得颗粒将通过635号网(ASTM-E11)。上述一家商业供应商是Lubrizol Corporation，该公司以AA-1(聚卡波非，USP)的名称销售该聚合物以用于医药用途。

任何上述聚合物的具体的量与聚合物作为增稠剂和/或生物粘附剂的作用无关。因此，所用聚合物的量通常彼此不同，因为它们具有不同的增稠和生物粘附能力。通常来说，使用增稠有效量和/或生物粘附有效量。

卤代氧杂蒽(荧光素)

设想的局部眼科组合物的卤代氧杂蒽(荧光素)化合物可以是下式1的化合物，其中R₁独立地是F、Cl、Br、I、H或C₁-C₄烷基；R₂、R₃、R₄和R₅独立地是Cl、H或I，其中至少一个选自R₂、R₃、R₄、R₅的取代基是I；并且R₆独立地是H或C₁-C₄烷基；R₁₁是H或C₁-C₄烷基；R₁₂是H或C₁-C₇酰基；和所有(a)互变异构形式；(b)阻转异构体，(c)如式2(下文)所示的封闭内酯形式，(d)如式2所示的内酯形式的对映异构体，和(e)其药学上可接受的盐。

由于荧光素是氧杂蒽的衍生物，因此人们更相信设想的卤代氧杂蒽被更准确地称为卤代荧光素。在优选的实践中，上述式1和2的卤代荧光素的每个R₁是氯取代基或溴取代基，而这些式的R₂、R₃、R₄和R₅中的每个是碘取代基，如以下式I和II所示。在下式中，X是氧或氮，“n”是0或1，使得当X是氧时，n是0并且不存在R⁷，而当X是氮时，n是1并且存在R⁷。当X是氧时，R⁷选自由以下组成的组：氢(H)、M⁺(其是药学上可接受的阳离子)，C₁-C₄烷基和本文下文定义的含芳环的取代基。当X是氮时，R⁷和R⁸相同或不同，并且选自由以下组成的组：氢、C₁-C₄烷基、含芳环的取代基，或R⁷和R⁸与酰胺氮原子一起形成5元环或6元环，以及含芳环的取代基。含芳环的取代基是含有5或6个成员的单环、或5,6或6,6稠合的芳环系统，所述单芳环或稠合芳环系统含有0、1或2个杂环原子，所述杂环原子独立地是氮、氧或硫。

为了便于描述，芳香酯或芳酰胺统称为芳香族衍生物。因此，这些衍生物由具有单个5元或6元芳环或5,6-或6,6-稠合的芳环系统的醇或胺(优选单取代的)形成。

示例性芳环取代基的结构式如下所示：

其中是分别提供酯或单取代酰胺。

玫瑰红(RB)是本文使用的优选的化合物，并且其二钠盐(即，玫瑰红二钠(RBD))是最优选的RB化合物。这些化合物在本文中举例说明性地用于RB化合物的组。

玫瑰红的化学名称是4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘荧光素。一种优选形式的玫瑰红二钠(RBD)具有以下结构式Ia：

美国专利号8,530,675、9,273,022和9,422,260讨论了高度纯化的卤代荧光素分子(诸如玫瑰红(上面的式Ia)和四溴-四碘类似物(上面的式IIb))的制备。美国专利号5,998,597、6,331,286、6,493,570、7,390,668和8,974,363公开了RBD在光化学诱导的治疗中的应用。优选地，上面的结构式中的阳离子M⁺是钠(Na⁺)或钾(K⁺)。

各种语法形式的术语“生理上可接受的盐”和“药学上可接受的盐”是指制药工业中常用的任何无毒的阳离子，诸如碱金属、碱土金属和铵盐，包括钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵和鱼精蛋白锌盐，它们可以通过本领域已知的方法制备。这些盐可以通过使用碱金属、碱土金属或氢氧化铵中和设想的卤代荧光素的酸形式或通过与氢氧化物形式的离子交换树脂混合而有用地制备。如此形成的阳离子卤代荧光素盐优选地可溶于最终配制的局部眼科组合物。

设想的阳离子提供了可溶于组合物的氧杂蒽(荧光素或fluorescienate)盐。优选地，盐是单取代或二取代盐形式的钠、钾、钙和铵盐。读者可参考Berge,J.Pharm.Sci.197768(1):1-19列出的常用的生理上(或药学上)可接受的酸和碱，所述酸和碱与药物化合物形成生理上可接受的盐。

卤代荧光素以治疗角膜炎有效浓度存在于组合物中。在通常的实践中，治疗角膜炎有效浓度在局部眼科组合物中为约50μg/mL至约3000μg/mL，优选地约100μg/mL至约2000μg/mL，更优选地约500μg/mL至约1500μg/mL，以DRB测量。

因此，如果使用除DRB以外的卤代荧光素，则使用量基于DRB的分子量(为1017.6g/摩尔)计算。例如，如果四个氯取代基被四个溴取代基取代，则分子量将为1195.2克/摩尔。分子量差异为约17.45％。因此，与给定的DRB量相比，待使用的四溴四碘荧光素的当量将增加约17.45％。

设想的卤代荧光素化合物诸如玫瑰红是二取代盐，具有2.52和1.81的pKa值。几种设想的卤代荧光素的pKa值确定可以在Batsitela等人，Spectrochim Acta Part A 79(5):889-897(2011年9月)中找到。

卤代氧杂蒽(荧光素)药物组合物的pH值可以通过本领域技术人员已知的任何合适手段进行调控或调节。可以通过添加酸或碱等来缓冲组合物或调节pH值。由于卤代氧杂蒽(荧光素)或其生理上可接受的盐是弱酸(取决于卤代黄嘌呤(荧光素)浓度和/或电解质浓度)，组合物的pH值可能不需要使用缓冲液和/或pH值调节剂。然而，特别优选的是，该组合物不被缓冲，以允许组合物一旦施用就顺应生物环境，例如泪液。

Abelson等人，Arch Ophthalmol 99(2):301(1981)报道了测量44名正常受试者的下盲囊的泪液的pH值，并且发现pH值为约6.5至约7.7，平均值为约7.0。因此，设想的组合物优选地具有约6.5至约7.6且优选约7.0至约7.4的pH值。

还优选的是药物组合物不包括任何防腐剂，许多防腐剂可以有害地干扰药物组合物或其制剂，或者可以与卤代氧杂蒽组合物活性成分复合或以其它方式相互作用或干扰卤代氧杂蒽组合物活性成分的递送。就使用防腐剂的程度而言，咪唑烷基脲是优选的防腐剂，因为它在药物组合物中或施用时不与卤代氧杂蒽相互作用。

一种设想的治疗方法用于治疗有需要的哺乳动物受试者。“有需要的哺乳动物”是出现眼睛感染(诸如细菌、病毒、真菌或阿米巴感染)的哺乳动物。这种感染通常是细菌感染，并且感染细菌通常是革兰氏阳性细菌。

举例说明性的经治疗的革兰氏阳性细菌包括药物敏感和耐药性的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.epidermis)、粪肠球菌(E.faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)中的一种或多种，以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和唾液链球菌(Streptococcus salivarius)中的一种或多种。当治疗(接触细胞)受感染的眼睛时，革兰氏阳性细菌存在于眼睛的哺乳动物细胞内或细胞上。

一些革兰氏阳性细菌菌株在本文中被称为“抗性”或“耐药性”或抗性的其它语法变体。这里的“抗性”是指细菌对一种或多种抗菌药物产品的治疗的抗性/耐药性，所述抗菌药物产品通常被认为在已知浓度和细菌细胞密度下对该类型细菌具有杀菌作用。因此，既有“药物敏感”菌株，也有“耐药性”菌株，诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermis)、粪肠球菌(E.faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)。几种常见细菌菌株已经产生耐药性的举例说明性药物包括万古霉素、甲氧西林和庆大霉素。

还设想了类似的方法来治疗革兰氏阴性细菌，所述革兰氏阴性细菌优选地是伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、沙门氏菌(Salmonella)和变形杆菌(Proteus)中的一种或多种。在这里，上述RB化合物以约10μg/mL至约100μg/mL的浓度，并且优选以约20μg/mL至约50μg/mL的浓度溶解或分散存在于水性药物组合物中。

如本文所用，词语“施用”用于意指治疗方案的开始，其中将组合物应用于感染的眼的外表面。因此，施用通常需要将一定剂量的本文所述的眼科组合物放置在眼睛表面上，或通过拉下下眼睑放入形成的口袋或囊中，然后闭合眼睑以使眼科组合物分布在治疗的眼球的外表面上。

治疗方法

设想的治疗方法包括使有需要的受试者的角膜表面与含有抗革兰氏阳性细菌量的卤代荧光素化合物的组合物接触。使用玫瑰红作为此类化合物的示例，将抗革兰氏阳性杀菌有效量的RB施用于有需要的哺乳动物受试者，并且可以使用增稠的水性液体、凝胶或如前所述的其它形式进行配制。

此后，使治疗的眼睛在基本上不存在光化光的情况下保持约3小时至约12小时的时间段。因此，例如，在施用后，闭合眼睑、在经治疗的眼睛上放置遮光眼罩、关闭环境光等。也许最容易的是，在受试者晚上入睡前对眼睛进行治疗。

在一个实施方案中，革兰氏阳性细菌细胞存在于受试哺乳动物上或体内(例如感染)。举例说明性地，受试哺乳动物可以具有皮肤病学革兰氏阳性细菌感染，诸如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)感染，或者特别是在局部治疗开放性伤口的情况下，作为目前感染的治疗和对随后的革兰氏阳性细菌感染的预防。

治疗的受试哺乳动物可以是灵长类动物(诸如人)、猿(诸如黑猩猩或大猩猩)、猴(诸如食蟹猴或猕猴)、实验动物(诸如大鼠、小鼠或兔)、伴侣动物(诸如狗、猫、马)、或食用动物(诸如牛或公牛、羊、羔羊、猪、山羊、美洲驼)等。

通常重复每次设想的组合物的施用，直到治疗的细菌疾病(感染)减少到所需程度，诸如不可检测。因此，根据医师的指导，对有需要的受试哺乳动物的施用可以在一天内、每天、每周、每月或几个月至几年的时间内进行多次。

按照参与治疗的医务人员的指导，可以在施用设想的组合物之前对感染(例如角膜溃疡)周围区域的角膜上皮进行清创，以获得去上皮的区域从而增加玫瑰红的吸收。

结果

医药级玫瑰红(RB)

Provectus Biopharmaceuticals,Inc.(Knoxville,TN)(Provectus)使用商业级RB，并寻求一种制造工艺来制备纯形式的RB作为药物。然而，由于在染料制造过程中发生的商业级反应以及其它失去一个或多个碘化物取代基的副产物，在RB的纯化中发现了一些挑战。

得出的结论是，商业级RB不能有效产出足够数量的医药级材料，不足以支持FDA和其它全球药物监管机构的临床开发和注册。Provectus(Singer等人，美国专利号8,530,675、美国专利号9,273,022和美国专利号9,422,260)建立了一种合成和制造RB的新型多步骤方法。这项工作的一个关键因素是消除引起形成关键的历史性杂质的条件。

这些合成和纯化方法已应用于良好生产规范(GMP)，生产出医药级RB。这种RB，是可从Provectus获得的无菌的在0.9％水性盐水(生理盐水)中的10％玫瑰红二钠(RBD)溶液，所述PV-是在人用药品技术要求国际协调理事会(The InternationalCouncil for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals forHuman Use，ICH)的指导下制造的，并且设计为作为可注射药物施用。医药级RBD也存在于不同配制的局部药物中(美国专利号9,422,260；Innamarato等人，BMC Cancer 21:756(2021)；Thompson等人，Melanoma Res.31:232-241(2021)；和Swift等人，Onco TargetsTher.12:1293-1307(2019))，被称为两种制剂均使用玫瑰红二钠(RBD)作为活性成分，其结构式如前所述。因为除了二钠盐外还可以使用许多玫瑰红的可溶性盐，所以本文使用“RB”作为任何药学上可接受的玫瑰红盐的名称，而名称“RBD”专门指玫瑰红二钠。

微生物

感染的微生物源可以是细菌、病毒、真菌或阿米巴。在通常的实践中，感染源是细菌，并且感染细菌优选地是革兰氏阳性细菌。

几个研究小组已经通过光动力方法研究了RB的抗菌活性(参见Kurosu等人，Molecules 27:322(2022)及其引用)。RB的光动力疗法的应用不仅限于皮肤感染，包括蜂窝织炎、丹毒、脓疱病、毛囊炎以及疖和痈。然而，RB的活性谱、杀伤率和生物膜根除活性已有零星报道。

如上述Kurosu等人重新研究了医药级RB在不同光源(荧光、LED和阳光)和黑暗条件下对包括革兰氏阳性、革兰氏阴性需氧细菌(包括分枝杆菌属(Mycobacterium spp.))的一系列微生物的杀菌活性。有趣的是，尽管用光化光照射表现出更大的即时功效，但RB在黑暗中也表现出抗菌活性。

本发明使用本发明的药物组合物在黑暗中的抗菌活性。因此，需要治疗的哺乳动物受试者，诸如患有细菌性眼睛感染的人，在休息并闭上她/他/他们的眼睛之前的0至约5分钟内施用抗菌有效量的设想的药物组合物。

使用上述Kurosu等人的论文中所述的在黑暗条件下覆盖铝箔的96孔板，通过培养液稀释法和琼脂稀释法在暗室中24小时(h)时间段获得的最小抑制浓度(MIC，以μg/mL为单位)汇总在以下表1中。表1中使用的RB是由Provectus Biopharmaceuticals，Inc.(Knoxville,TN,美国)提供的的稀释的形式(Singer等人，美国专利号8,530,675、9,273,022和9,422,260)。

表1

通过培养液稀释法确定的一系列真菌、革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的MIC

对表1中具有不同SCCmec类型的一组7种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)(条目5-11)检验了RB的杀菌活性(Zuo等人，Sci.Rep.11:Article 5447(2021))。在荧光或LED灯下，表1中测试的所有MRSA菌株均被浓度为0.78μg/mL-3.1μg/mL的RB杀死。进一步针对4种耐万古霉素金黄色葡萄球菌菌株(条目12-16)检验RB；在任一光照条件下，所有耐万古霉素的菌株在低于1.0μg/mL的浓度下被杀死。

表皮葡萄球菌是一种厌氧细菌，但在有氧条件下生长良好。它在有氧条件下被RB有效杀死(条目16)。RB杀死了药物敏感和耐药性粪肠球菌(包括耐万古霉素的菌株)(条目17-21)。唾液链球菌对RB敏感(条目23)，而肺炎链球菌对RB显示出耐受性(条目24)。目前尚不清楚这种耐受性的缘由。

因此，在黑暗条件下，RB在25.0μg/mL-100μg/mL浓度下对条目1-23(表1)中列出的所有革兰氏阳性细菌显示出抗菌活性。在黑暗条件下，已知RB在高浓度下展示抗菌活性。表1中测定的所有革兰氏阴性细菌在黑暗条件下对RB不敏感。这些数据支持RB具有一种或多种未知机制(而不是通过三重态氧的激发机制，产生细胞毒性活性氧)来抑制细菌生长的想法。

检验了RB对5种分枝杆菌属的抗菌活性(条目25-29)。有趣的是，在黑暗条件下，这些分枝杆菌被杀死的MIC与在光照条件下观察到MIC的相似。RB在黑暗条件下以(比抑制细菌)更高的浓度抑制酿酒酵母的生长(条目30)。

通过琼脂稀释法确定的RB的MIC值不同于通过培养液稀释法确定的MIC值(表1)。通过琼脂稀释法确定的MIC值的选择的实例总结在表2中，该表2通过对测定的微生物重新编号而显示。

表2

通过琼脂稀释法确定的一系列革兰氏阳性细菌的MIC和分枝杆菌的MIC

条目编号	微生物	MIC(μg/mL)
			1	枯草芽孢杆菌ATCC6051	125
2	<![CDATA[蜡样芽孢杆菌13061<sup>TM</sup>]]>	125
			3	<![CDATA[金黄色葡萄球菌6538<sup>TM</sup>]]>	25.0
4	<![CDATA[金黄色葡萄球菌金黄色亚种BAA-44<sup>TM</sup>(MRSA菌株)]]>	50.0
			5	<![CDATA[耻垢分枝杆菌607<sup>TM</sup>]]>	50.0

革兰氏阳性细菌诸如枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长在约25μg/mL至约125μg/mL浓度下被抑制(表2中的条目1-4)，所述浓度大于通过培养液稀释法确定的MIC值。耻垢分枝杆菌(ATCC607^TM)在比培养液稀释法较低浓度的含药物的琼脂平板(或孔)上被杀死(条目29，表1；条目5，表2)(Lelovic等人，J.Antibiot 73:780-789(2020))。

在黑暗条件下，通过琼脂稀释法确定的RB的MIC与培养液稀释法中测量的值展现出良好的一致性。RB对选择的细菌的最小杀菌浓度(MBC)也总结在上面的表2中。

用于治疗和杀伤的示例性革兰氏阳性细菌包括药物敏感和耐药性金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌中的一种或多种，以及枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和唾液链球菌中的一种或多种。

医药级RB(HP-RBf)的抗生物膜活性

在前节中观察到的RB的抗菌特性鼓励评估RB在革兰氏阳性细菌中的抗生物膜功效。上文总结的数据表明RB对革兰氏阳性细菌具有显著的药物亲和力或渗透性(渗透到其上或其内)。

已经在生物膜条件下用光敏剂研究了抗微生物和抗真菌光动力疗法；然而，仅用RB检验了有限数量的细菌生物膜(Pérez-Laguna等人，PhotodiagnosisPhotodyn.Ther.21:211-216(2018))。

在这里，在荧光和黑暗条件下研究了RB对药物敏感金黄色葡萄球菌6508^TM、耐药性金黄色葡萄球菌71080(VRS8)和屎肠球菌NR-32065的生物膜的功效。雷奈佐利不是根除革兰氏阳性细菌的生物膜的有效药物，但在预防生物膜形成方面具有有益作用(Reiter等人，J.Med.Microbiol.62:394-399(2013))，并且所述雷奈佐利被用作对照。

在Kurosu等人，Molecules 27:322(2022)中报道的生物膜测定中，雷奈佐利作为阳性对照，其浓度非常高，为600μg/mL(浮游细胞>100xMIC)。这些作者报道了，他们证实，所有测试的菌株都在聚苯乙烯孔板上形成了强大的生物膜。在荧光灯下，RB可以根除金黄色葡萄球菌6508^TM的生物膜，且在30.0μg/mL(38xMIC)浓度下减少7个对数，这表明与雷奈佐利(600μg/mL)观察到的功效水平相同(Kurosu等人，出处同上，图3)。

RB在光照和黑暗条件下均显示出剂量依赖性方式的生物膜根除活性。尽管需要更高的浓度，但RB在黑暗条件下仍显示出生物膜根除活性。在50.0μg/mL(黑暗下2xMIC)浓度下，RB显著减少了活细菌的数量。在500μg/mL(20xMIC)浓度下，仅观察到约110CFU/mL至约150CFU/mL。在1000μg/mL浓度下没有出现活细菌(N.D.)。使用低得多的RB浓度，在耐药性金黄色葡萄球菌71080(VRS8)和屎肠球菌NR-32065的生物膜中观察到类似的趋势。

RB的抗菌机制

几篇文章报道了RB的抗菌光动力疗法。RB通过渗透细菌细胞壁并且与细胞膜结合，然后产生活性氧，可能是光照条件下的杀菌机制(Nsubuga等人，Nanoscale Adv.3:1375(2021)；和Lamber等人，Photochem.Photobiol.66:15-25(1997))。虽然需要相对高的浓度，但RB在黑暗条件下仍杀死大多数革兰氏阳性细菌，包括分枝杆菌属。它还有效地根除革兰氏阳性细菌的生物膜(上文)。RB在黑暗条件下的抗菌活性仍远未完全了解(Nakonechny等人，Int.J.Mol.Sci.29:3196(2019)；和Kim等人，J.Enzyme.Inhibit.Med.Chem.35:1414-1421(2020))。

RB在光照条件下以12.5mg/mL-25.0mg/mL杀死分枝杆菌属，在黑暗条件下以25.0mg/mL-50.0mg/mL杀死分枝杆菌属(表1)。在两种条件下，RB杀死五种分枝杆菌的速度比杀死革兰氏阳性细菌慢。RB似乎具有对分枝杆菌细胞壁的低渗透性。由于甚至在黑暗条件下RB对革兰氏阳性细菌也具有快速杀菌作用，因此产生革兰氏阳性细菌的耐RB突变体是一项极其困难的任务。

我们成功产生了耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的耐RB突变体，其MIC值为200mg/mL(Lelovic等人，J.Antibiot.73:780-789(2020))。耐RB菌株对大多数TB药物(阿米卡星、卷曲霉素、利福平、氨基尿苷基苯氧哌啶基苯甲基丁酰胺(aminouridylphenoxypiperidinylbenzyl butanamide，APPB)和乙硫异烟胺)敏感(以下的表3)。

表3

RB和抗分枝杆菌剂对耻垢分枝杆菌及其PV-10耐药性菌株的MIC^a

^a在黑暗条件下确定MIC值。所有研究一式三份。

^b分枝菌酸合成的抑制剂。

^cAPPB＝氨基尿苷基苯氧哌啶基苯甲基丁酰胺，一种MraY/WecA抑制剂。

然而，其显示出对异烟肼(INH)的交叉耐受性。INH是一种需要通过属于过氧化氢酶-过氧化物酶家族的KatG酶进行氧化活化的前药。KatG氧化INH以形成亲电子物质，即异烟酰基自由基分子，其与NADH依赖性烯酰基-ACP(酰基运载体蛋白)还原酶反应，所述还原酶是参与分枝杆菌的分枝菌酸的生物合成(方案1，下文)的酶(Vilchèze等人，Microbiol.Spectr.2:MGM2-0014-2013(2014)；和Morlock等人，Antimicrob.AgentsChemother 47:3799-3805(2003))。

方案1

耐RB耻垢分枝杆菌菌株获得中度INH耐受性，但未显示对乙硫那酰胺(ETH)的耐受性。INH耐受性的主要机制是katG中的突变，而ETH被单加氧酶EthA激活(Laborde等人，Org.Biomol.Chem.14:8848-8858(2016))。这些观察结果可能意味着RB的抗菌机制共享一种或多种INH代谢酶以形成杀菌物。

为了阐明潜在的作用机制，使用下一代DNA测序技术对耐RB耻垢分枝杆菌ATCC607菌株进行了全基因组测序分析(Lei等人，Microbiol.Resour.Announc.8:e00551(2019))。一个鉴定的插入突变分别发生在抗sigma E因子基因(rseA：表现为TG:104相对于T:0)和水通道蛋白家族蛋白基因(表现为GCACCCT:71相对于G:0)中。

因此，与其亲本菌株相比，这些插入突变导致相应蛋白质中的阅读框变化，并产生了截短的蛋白质。据报道，RseA在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中起着特定的抗sigma E因子的作用，并且所述sigma E因子(SigE)使分枝杆菌生物体能够耐受多种应激反应(Boldrin等人，Sci.Rep.9:17643(2019)；和Wu等人，J.Bacteriol.179:2922-2929(1997))。因此，耐RB突变体中的非功能性RseA的表达可能会影响SigE的活性，增加细菌对RB的耐受性。另一方面，水通道蛋白家族蛋白存在于各种生物体中，并在水和不带电的溶质的跨细胞膜的双向流动中起关键作用。

据报道，链球菌水通道蛋白同源物的无效突变增加了细胞内H₂O₂滞留，表明水通道蛋白介导了链球菌中H₂O₂的运输(Tong等人，J.Biol.Chem.294:4583-4595(2019))。因此，我们假设RB可能抑制水通道蛋白功能，引起H₂O₂在细菌细胞内的积累。有趣的是，在耐RB菌株的亚钼嘌呤(molybdopterin)依赖性氧化还原酶(表现为T:74相对于TC:0)中观察到造成移码突变的单核苷酸缺失。

氧化还原酶系统可以通过还原分子氧来形成超氧化物或通过还原无机硝酸盐来形成NO。RB可以作为氧化还原酶的氧化还原中的单电子受体，所述氧化还原酶的氧化还原产生自由基阴离子(RB^·-)或RB三重态，与氧发生电子转移反应。因此，通过在黑暗条件下激发RB，提出了亚钼嘌呤依赖性氧化还原酶参与活性氧或氮物质的产生(以下的方案2)。方案2中的氧化还原酶是亚钼嘌呤依赖性氧化还原酶黄嘌呤脱氢酶家族蛋白。方案2中的“.OH+OH^-”是活性氧物质(ROS)或活性氮物质。

方案2

在耐RB菌株中，katG基因是完好的。因此，仍然难以推测赋予对INH交叉耐受性的机制。然而，观察到耐RB菌株的几种转录调节因子中的突变可能影响KatG的表达水平，抑制INH活化。其通过H₂O₂的芬顿反应产生羟基自由基(活性氧物质)。需要相对高浓度的RB来展现对革兰氏阳性细菌(包括分枝杆菌属)的杀菌活性可能意味着RB与过氧化氢酶的亲和力是中等的。类似地，可以解释RB在哺乳动物细胞中的细胞毒性机制。如以下的方案3所示。

方案3

RB用于诊断眼睛和肝脏疾病已有50多年。其通常可用作用于诊断某些医学问题(诸如结膜和眼睑病症)的染色剂(见上文)。在这些应用中，使用了0.1％-2.0％(即1000μg/mL-20000μg/mL)的RB。

在自然光和人工光下，浓度低于2.0％的RB被认为是安全的(Whitcher等人，Am.J.Ophthalmol.149:405-415(2010))。选择健康的细胞系Vero(非洲绿猴的肾脏)细胞来确定RB在荧光下的体外细胞毒性。

已经产生了对Vero细胞的抗菌剂和抗癌剂的细胞毒性的大量数据集，以允许比较新分子的毒性水平(Siricilla等人，J.Med.Chem.60:2869-2878(2017)；和Siricilla等人，J.Antibiot.68:271-278(2015))。在黑暗条件下的24小时研究中，RB显示出对Vero细胞的IC₅₀值为300μM(292μg/mL)。

RB的治疗浓度可能为约0.1μM至约10μM。因此，这些体外细胞毒性测试意味着可以用RB治疗皮肤感染，而不会在光照条件下造成宿主细胞的细胞毒性。

结论

Provectus已经建立了医药级RB的制造和纯化工艺，所述工艺同时满足cGMP和ICH的要求。我们已经评估了医药级RB配制的产品作为示例性RB化合物在光照和黑暗条件下的抗菌活性和细胞毒性。这里总结的通过生理盐水稀释的关于RB的综合MIC数据表明，除肺炎链球菌外，RB非常有效地杀死大多数革兰氏阳性细菌(MIC 0.39μg/mL-3.1μg/mL)。

肺炎链球菌是极少数对抗革兰氏阴性药物粘菌素(多粘菌素E)敏感的革兰氏阳性细菌之一。我们已经研究了革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌中的RB杀菌作用与粘菌素耐药性之间的关系。肺炎链球菌对RB的耐药机制将在其它地方报道。

我们证实RB是根除革兰氏阳性细菌(包括耐药性菌株)的生物膜的优秀药物。在荧光和黑暗条件下，RB以浓度依赖性方式显著减少了金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的耐药性菌株的许多活细胞。这些研究表明，RB是在任何生长阶段杀死耐药性细菌的潜在抗菌剂。

材料和方法

抗生素

所有抗生素(阿米卡星二硫酸盐(Sigma-Aldrich，A1774-1G)、硫酸卷曲霉素(Sigma-Aldrich，C4142-1G)、盐酸环丙沙星一水合物(TCI，C2227)、乙硫异烟胺(TCI，E0695)、异烟肼(Sigma-Aldrich，I3377-5G)、雷奈佐利(Chem-Impex，29723)，美洛培南三水合物(Ark Pharm，AK161987)，利福平(Sigma-Aldrich，R3501-1G))均购自商业来源，除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。根据报道的程序合成APPB(氨基尿苷基苯氧哌啶基苯甲基丁酰胺)(Mitachi等人，ACS Omega 2018,3:1726-1739；和Mitachi等人，MethodsX2019,6:2305-2321)。

生理盐水中医药级玫瑰红的制剂

玫瑰红二钠盐是根据Provectus的专有程序合成的。详细程序如美国专利号8,530,675、9,273,022和9,422,260中所述。

获取细菌

该计划中使用的药物敏感细菌和酵母购自ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas,VA)。耐药性菌株获自BEI资源(NIAID)。

对数期细菌培养物

所有液体细菌培养均使用带有空气过滤器的锥形瓶进行。细菌菌株的单个菌落根据ATCC推荐的条件生长。使用ATCC推荐的培养基获得细菌的种子培养物和较大的培养物。耻垢分枝杆菌(ATCC 607)在0.5％80Middlebrook 7H10营养琼脂(0.4％甘油)(46)上培养。在振荡培养箱中在37℃以200rpm的振荡速度，将培养瓶中的耻垢分枝杆菌(ATCC607)孵育3-4天，结核分枝杆菌H₃₇Rv孵育10-12天，并培养至对数中期(光密度–0.5)。使用96孔酶标仪在600nm处监测光密度。

MIC测定

所有测试均遵循美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的指南(“Determininglaboratory reference intervals:CLSI guideline makes the task manageable,”Lab.Med.40:75-76(2009).)。通过培养液稀释微型板块拉马尔蓝测定(broth dilutionmicroplate alamar blue assay)或通过OD测量确定最小抑制浓度(MIC)。将所有化合物储存在DMSO或盐水中(1mg/100μL浓度)。该浓度用作所有MIC研究的储备溶液。将来自储备溶液的每种化合物置于无菌96孔板的第一孔中，并用培养液(总体积为10μL)进行连续稀释。将对数期的细菌悬浮液(190μL)添加到每个孔中(总体积为200μL)，并在37℃下孵育24小时，向每个孔中加入20μL刃天青(0.02％)并孵育4小时，(美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)方法(粉红色＝生长，蓝色＝无可见生长))。在进行比色测定之前，对所有实验进行OD测量。还通过UV-Vis在570nm和600nm处测量每个孔的吸光度。

最小杀菌浓度(MBC)测定

将特定细菌的单个菌落(在琼脂平板上生长)接种到培养液中。将细菌培养物生长过夜(约18小时)，然后在生长支持液中稀释至1x10⁵ CFU/mL和1x10⁹ CFU/mL的浓度。基于MIC值，制备含有药物(MIC，2xMIC-20xMIC)的琼脂平板。将等体积的特定细菌接种在一系列含药物的琼脂平板上。将琼脂平板在适当的温度和持续时间下孵育。进行CFU/mL计数。通过减少>99.9％的细菌来确定MBC值。

哺乳动物细胞系和培养

Vero细胞(ATCC^TMCCL-81)购自ATCC。HEK细胞(SCCE020)购自MilliporeSigma。按照供应商的建议，将细胞系培养并维持在培养基中。

将Vero细胞在补充有10％FBS、1％青霉素-链霉素溶液(30-002-CI)、1％HyClone^TMMEM非必需氨基酸溶液(100X)(GE Healthcare Life Sciences，SH30238.01)和1％ HyClone^TM丙酮酸钠100mM溶液(GE Healthcare Life Sciences，SH30239.01)的Eagle极限必需培养基(MEM)(10-009-CV)中培养，并在37℃、100％湿度和5％ CO₂的培养箱中孵育。每2天对培养物更换新鲜培养基，直到培养物达到100％汇合度，这需要大约5天的时间(取决于增殖速率)。

将新生儿人表皮角质形成细胞(目录号#SCCE020)在EpiGRO^TM人表皮角质形成细胞完全培养基试剂盒(SCMK001)中培养，并在37℃、100％湿度和5％ CO₂的培养箱中孵育。2天后更换新鲜培养基，每周三次，直到培养物达到100％汇合度。

用Vero细胞进行细胞毒性测定

所有测试均遵循美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的指南，稍作修改。PV-10的细胞毒性测定在24孔板中进行。向每个孔(1mL培养基/孔)中加入1μL的药物浓缩物。在室温(r.t.)下在光照下孵育1h、2h、3h和4h后，除去培养基，并用PBS洗涤(x3)细胞。在加入培养基(1mL/孔)后，加入10μl的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)溶液(在PBS中5mg/mL)，并在37℃(5％CO₂)下再孵育3h。除去培养基，并加入DMSO(1mL/孔)。基于MTT向紫色甲产物的细胞转化来评估活力。通过BioTek Synergy^TMHT分光光度计在570nm处测量有色甲产物的吸光度(Mitachi等人，J.Med.Chem.63:10855-10878(2020))。

将Vero细胞(5×10⁴个细胞/孔(在196μL的培养基中))铺在96孔板中，并将细胞培养物孵育4天以形成单层(100％汇合度)。向每个孔中加入RB(0mM-300mM)。

使用活细胞成像系统(Essen BioScience,Ann Arbor,MI)每小时获得图像。使用计算的度量相位对象汇合(metric phase object confluence)(POC)对细胞增殖进行定量，所述度量相位对象汇合是对细胞覆盖的视野面积的测量。

耻垢分枝杆菌菌株的全基因组测序

根据先前报道的程序制备耐RB耻垢分枝杆菌(ATCC607^TM)菌株(Kaser等人，ColdSpring Harb Protoc.(2010))。为了鉴定可能促成细菌对RB耐受性的单核苷酸多态性(SNP)，根据先前报道的程序，从耐RB突变体及其亲本对照耻垢分枝杆菌607^TM的静置培养物中纯化基因组DNA(Lelovic等人，J.Antibiot.73:780-789(2020))。

将纯化的基因组DNA提交给明尼苏达大学基因组中心(UMGC)，以使用先进的Illumina MiSeq^TMDNA-seq技术进行质量控制分析、文库制备和DNA测序。使用FastQC评估来自突变体和对照的序列读数的质量。用Trimmomatic去除低质量的尾和衔接子(Lei等人，Methods Mol.Biol.2069:125-138(2020))。以耻垢分枝杆菌菌株FDAARGOS_679的全基因组序列作为参照，并且使用生物信息学工具Snippy(https://github.com/tseemann/snippy)判断SNP或其它变体，诸如缺失和插入。

本文引用的专利、专利申请和文章各自均通过引用并入本文。本文中的冠词“一个”和“一种”是指该冠词的语法宾语中的一个(一种)或多于一个(多于一种)(即至少一个(至少一种))。

上述描述和实例旨在举例说明，不应被理解为限制。在本发明的精神和范围内的其它变化也是可行的，并且将容易地呈现给本领域技术人员。

Claims (20)

1.一种用于治疗有需要的哺乳动物的眼睛的革兰氏阳性细菌感染的局部眼科系统，所述局部眼科系统包含眼科组合物，所述眼科组合物含有溶解或分散在水性眼科运载体中的卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯，并且所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯以约0.2μg/mL至约50μg/mL的治疗细菌性角膜炎有效浓度存在于所述组合物中，所述组合物具有约6.5至约7.6的pH值，约10cps至约300cps的粘度，约270mOsm/kg至约340mOsm/kg的渗透压，并且所述组合物存在于光化光不透过的容器中。

2.根据权利要求1所述的眼科系统，其中所述组合物还含有多至共占组合物2.5重量％的甘油或丙二醇或甘油和丙二醇两者。

3.根据权利要求1所述的眼科系统，其中至少一些所述渗透压由一种或多种水溶性的钠、钾、钙和镁的氯化物、磷酸盐和硝酸盐的存在而提供。

4.根据权利要求1所述的眼科系统，其中所述粘度至少部分由在组合物的pH值下不带离子电荷的一种或多种聚合物提供。

5.根据权利要求4所述的眼科系统，其中在组合物的pH值下不带离子电荷的所述聚合物选自由以下一种或多种组成的组：PEG400，PEG1000，右旋糖酐，糊精，聚(乙烯基吡咯烷酮)，羟丙甲纤维素，甲基纤维素，羟乙基纤维素和聚(乙烯醇)。

6.根据权利要求1所述的眼科系统，其中所述粘度至少部分由在组合物的pH值下带有阴离子电荷的一种或多种聚合物提供。

7.根据权利要求6所述的眼科系统，其中在组合物的pH值下带有阴离子电荷的所述聚合物选自由以下一种或多种组成的组：a)透明质酸，b)水溶性的部分中和的交联丙烯酸、甲基丙烯酸和共聚物，其与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联，其中每个交联剂平均每个分子含有至少三个烯丙基，c)至少80重量％的单烯基不饱和羧基官能单体和约0.05重量％至约1.5重量％的交联剂共聚的水溶胀性但不溶于水的部分中和的反应产物，所述交联剂是3,4-二羟基-1,5-己二烯或2,5-二甲基-1,5-己二烯，和d)部分中和的羧甲基纤维素。

8.根据权利要求1所述的眼科系统，其中所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯具有式1和/或式2的一种或两种的化学式：

其中R₁独立地是F、Cl、Br、I、H或C₁-C₄烷基；

R₂、R₃、R₄和R₅独立地是Cl、H或I，其中至少一个选自R₂、R₃、R₄、R₅的取代基是I；并且

R₆独立地是H或C₁-C₄烷基；R₁₁是H或C₁-C₄烷基；R₁₂是H或C₁-C₇酰基；和

所有(a)互变异构形式；(b)阻转异构体，(d)式2所示的内酯形式的对映异构体，和(e)其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求8所述的眼科系统，其中上述式1和式2的所述卤代荧光素中的R₁是氯取代基或溴取代基，而这些式中的R₂、R₃、R₄和R₅中的每一个都是碘取代基，所述碘取代基如以下式I和式II所示，X是氧或氮，“n”是0或1，使得当X是氧时，n是0并且R⁷不存在，从而形成芳香酯，而当X是氮时，n是1并且R⁷存在，从而形成芳酰胺；

当X是氧时，R⁷选自由以下组成的组：氢(H)，药学上可接受的阳离子M⁺，C₁-C₄烷基和含芳环的取代基；

其中所述含芳环的取代基是含有5个或6个成员的单环、或5,6-或6,6-稠合芳环系统，其中单芳环或稠合芳环系统含有0、1或2个杂环原子，所述杂环原子独立地是氮、氧或硫；

当X为氮时，R⁷和R⁸相同或不同，并且选自由以下组成的组：氢，C₁-C₄烷基，含芳环的取代基，或R⁷和R⁸与酰胺氮原子一起形成5元或6元环；

10.根据权利要求9所述的眼科系统，其中所述芳香酯或芳酰胺的所述含芳环的取代基没有被取代，并且选自由以下组成的组：

其中是分别提供酯或当R⁸基团是氢时形成单取代酰胺。

11.根据权利要求1所述的眼科系统，其中所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯具有式Ia和/或式IIb的一种或两种的化学式：

其中M⁺是药学上可接受的阳离子。

12.根据权利要求1所述的眼科系统，其中所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯是玫瑰红二钠。

13.一种治疗具有表现为角膜炎的革兰氏阳性细菌感染的眼睛的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

通过向微生物感染的眼睛施用治疗角膜炎有效量的眼科组合物来治疗所述微生物感染的眼睛，所述眼科组合物含有溶解或分散在水性眼科运载体中的卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯，并且所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯以约0.2μg/mL至约50μg/mL的治疗细菌性角膜炎有效浓度存在于所述组合物中，所述眼科组合物具有约6.5至约7.6的pH值，约10cps至约300cps的粘度，约270mOsm/kg至约340mOsm/kg的渗透压，并且

使所述治疗的眼睛在基本上不存在光化光的情况下保持约3小时至约12小时的时间段。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述治疗是在基本上不存在光化光的情况下进行的。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述眼科组合物在所述施用之前保持在光化光不透过的容器中。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯具有式1和/或式2的一种或两种的化学式：

其中R₁独立地是F、Cl、Br、I、H或C₁-C₄烷基；

R₂、R₃、R₄和R₅独立地是Cl、H或I，其中至少一个选自R₂、R₃、R₄、R₅的取代基为I；并且

R₆独立地是H或C₁-C₄烷基；R₁₁是H或C₁-C₄烷基；R₁₂是H或C₁-C₇酰基；和

所有(a)互变异构形式；(b)阻转异构体，(d)式2所示的内酯形式的对映异构体，和(e)其药学上可接受的盐。

17.根据权利要求16所述的方法，其中上述式1和式2的所述卤代荧光素中的R₁是氯取代基或溴取代基，而这些式中的R₂、R₃、R₄和R₅中的每一个都是碘取代基，所述碘取代基如以下式I和式II所示，X是氧或氮，“n”是0或1，使得当X是氧时，n是0并且R⁷不存在，从而形成芳香酯，而当X是氮时，n是1并且R⁷存在，从而形成芳酰胺；

当X是氧时，R⁷选自由以下组成的组：氢(H)，药学上可接受的阳离子M⁺，C₁-C₄烷基和含芳环的取代基；

其中所述含芳环的取代基是含有5个或6个成员的单环、或5,6-或6,6-稠合芳环系统，其中单芳环或稠合芳环系统含有0、1或2个杂环原子，所述杂环原子独立地是氮、氧或硫；

当X为氮时，R⁷和R⁸相同或不同，并且选自由以下组成的组：氢，C₁-C₄烷基，含芳环的取代基，或R⁷和R⁸与酰胺氮原子一起形成5元或6元环；

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述芳香酯或芳酰胺的所述含芳环的取代基没有被取代，并且选自由以下组成的组：

其中是分别提供酯或当R⁸基团是氢时形成单取代酰胺。

19.根据权利要求13所述的方法，其中所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯具有式Ia和/或式IIb的一种或两种的化学式：

其中M⁺是药学上可接受的阳离子。

20.根据权利要求13所述的方法，其中所述卤代荧光素或其药学上可接受的盐或酯是玫瑰红二钠。