HK1237374B

HK1237374B - Method for counting number of nucleic acid molecules

Info

Publication number: HK1237374B
Application number: HK17111392.2A
Authority: HK
Inventors: 加藤菊也; 久木田洋儿; 的场亮
Original assignee: Dna Chip Research Inc.; Osaka Prefectural Hospital Organization
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2022-01-14

Claims

Méthode permettant de compter très précisément le nombre de molécules d'acide nucléique en détectant les erreurs de lecture qui se produisent lors de la détermination d'une séquence de bases d'acide nucléique, la méthode comprenant :
une étape permettant d'ajouter un groupe d'oligonucléotides de séquences de codes à barres générés aléatoirement à un mélange d'une pluralité de molécules d'acide nucléique, liant ainsi des séquences de codes à barres uniques aux molécules d'acide nucléique aux séquences de bases constituant chacune des molécules d'acide nucléique ;

une étape de détermination des séquences de bases des molécules d'acide nucléique auxquelles les séquences de codes à barres ont été liées ;

une étape de détection d'erreurs de lecture dans les séquences de codes à barres pour lesquelles des séquences de bases ont été déterminées ;

une étape de calcul de la proportion de séquences de codes à barres exemptes d'erreurs de lecture par rapport à l'ensemble des séquences de codes à barres pour lesquelles les séquences de bases ont été déterminées, sur la base du nombre de lectures de séquences de codes à barres pour lesquelles les séquences de bases ont été déterminées, et

une étape de détermination du nombre de molécules d'acide nucléique dans le mélange sur la base du nombre de séquences de codes à barres exemptes d'erreurs de lecture

lesdits oligonucléotides de séquences de codes à barres consistant en un maximum de cinq types de bases A, C, G, T et U, qui sont facultatives au niveau de chaque site de base,
(i) ladite détection d'erreurs de lecture étant effectuée en analysant la longueur de bases de la séquence de codes à barres ; ou (ii) si les oligonucléotides de séquences de codes à barres générés aléatoirement comprennent deux ou trois types de bases indépendamment sélectionnées au niveau de chaque site de base, ladite détection des erreurs de lecture étant déterminée en détectant une base différente de l'un des deux ou trois types de bases utilisées au niveau de ce site de base.
Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de traçage de la proportion calculée pour chaque nombre de lectures des séquences de codes à barres pour lesquelles des séquences de bases ont été déterminées.
Procédé selon la revendication 2, comprenant en outre une étape de suppression des séquences de codes à barres ayant le nombre de lectures égal ou inférieur à une valeur seuil prescrite, sur la base d'un graphique obtenu par l'étape de traçage.
Procédé selon la revendication 1, ladite longueur de l'oligonucléotide générateur de séquence de code à barres étant de 5 à 20 bases.
Procédé selon la revendication 4, ladite longueur de l'oligonucléotide générateur de séquence de code à barres étant de 12 bases.
Procédé selon la revendication 1, une base dans l'oligonucléotide générateur de séquence de code à barres étant choisie parmi deux ou trois types de bases indépendamment pour chaque site de base.
Procédé selon la revendication 1, ladite séquence de code à barres étant liée à une séquence de bases constituant la molécule d'acide nucléique en ajoutant un adaptateur comprenant l'oligonucléotide de séquence de code à barres généré aléatoirement à la séquence de bases constituant la molécule d'acide nucléique, puis en amplifiant la molécule d'acide nucléique ajoutée avec l'adaptateur à l'aide d'une amorce adaptateur et d'une amorce spécifique à la séquence de bases constituant la molécule d'acide nucléique.
Procédé selon la revendication 1, ladite séquence de bases constituant la molécule d'acide nucléique comprenant une extrémité cohésive.
Procédé selon la revendication 1, ladite séquence de bases constituant la molécule d'acide nucléique comprenant une extrémité franche.
Procédé selon la revendication 1, ladite erreur de lecture étant une insertion ou une délétion d'une séquence de bases, ou une substitution de base.
Procédé selon la revendication 1 comprenant en outre :
une étape de détermination d'une séquence consensus de molécules d'acide nucléique présentant la même séquence de code à barres, sur la base de la séquence de code à barres pour laquelle la séquence de bases a été déterminée ;

une étape de détection d'erreurs de lecture dans les séquences de bases des molécules d'acide nucléique pour lesquelles les séquences de bases ont été déterminées, sur la base de la séquence consensus ; et

une étape de suppression des molécules d'acide nucléique comportant les erreurs delecture.
Procédé selon la revendication 11, comprenant en outre une étape permettant de compter le nombre de molécules d'acide nucléique présentant des mutations en détectant des mutations dans les séquences de bases de molécules d'acide nucléique pour lesquelles les séquences de bases ont été déterminées, sur la base de la séquence consensus.