HK1237374B - Method for counting number of nucleic acid molecules - Google Patents

Claims (12)

1. Verfahren zum hochgenauen Zählen der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen durch Erfassen der Lesefehler, die auftreten, wenn eine Nukleinsäurebasensequenz bestimmt wird, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

   einen Schritt zum Hinzufügen eines Pools von zufällig erzeugten Strichcodesequenz-Oligonukleotiden zu einer Mischung aus einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, wodurch für die Nukleinsäuremoleküle einmalige Strichcodesequenzen mit den Basensequenzen verknüpft werden, die jedes der Nukleinsäuremoleküle darstellen;

   einen Schritt zum Bestimmen der Basensequenzen der Nukleinsäuremoleküle, mit denen die Strichcodesequenzen verknüpft worden sind;

   einen Schritt zum Erfassen von Lesefehlern in den Strichcodesequenzen, für die Basensequenzen bestimmt worden sind;

   einen Schritt zum Berechnen des Anteils an Strichcodesequenzen, die frei von Lesefehlern sind, zu allen der Strichcodesequenzen, für welche die Basissequenzen bestimmt worden sind, auf der Grundlage der Anzahl von Lesungen von Strichcodesequenzen, für welche die Basissequenzen bestimmt worden sind, und

   einen Schritt zum Bestimmen der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen in der Mischung basierend auf der Anzahl von Strichcodesequenzen, die frei von Lesefehlern sind,

   wobei die Strichcodesequenz-Oligonukleotide aus maximal fünf Arten von Basen A, C, G, T und U bestehen, die an jeder Basenstelle optional sind,

   wobei (i) die Erfassung von Lesefehlern durch Analysieren der Basislänge der Strichcodesequenz durchgeführt wird; oder (ii) wenn die zufällig erzeugten Strichcodesequenz-Oligonukleotide zwei oder drei Arten von Basen umfassen, die unabhängig an jeder Basenstelle ausgewählt werden, die Erfassung von Lesefehlern bestimmt wird, indem eine andere Base als eine der zwei oder drei Basenarten erfasst wird, die an dieser Basenstelle verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend einen Schritt zum Darstellen des berechneten Anteils für jede Anzahl von Lesungen der Strichcodesequenzen, für die Basensequenzen bestimmt worden sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, ferner umfassend einen Schritt zum Entfernen von Strichcodesequenzen, welche die Anzahl von Lesungen aufweisen, die gleich einem oder kleiner als ein vorgeschriebener Schwellenwert ist, auf der Grundlage eines Graphen, der durch den Darstellungsschritt erhalten wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Länge des Strichcodesequenz erzeugenden Oligonukleotids 5-20 Basen ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Länge des Strichcodesequenz erzeugenden Oligonukleotids 12 Basen ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Base in dem Strichcodesequenz erzeugenden Oligonukleotid aus zwei oder drei Basenarten unabhängig für jede Basenstelle ausgewählt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Strichcodesequenz mit einer Basensequenz verknüpft wird, die das Nukleinsäuremolekül darstellt, indem ein Adapter, der das zufällig erzeugte Strichcodesequenz-Oligonukleotid umfasst, zu der Basensequenz hinzugefügt wird, die das Nukleinsäuremolekül darstellt, und dann das Nukleinsäuremolekül, das mit dem Adapter hinzugefügt wird, unter Verwendung eines Adapterprimers und eines Primers amplifiziert wird, der spezifisch für die Basensequenz ist, die das Nukleinsäuremolekül darstellt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Basensequenz, die das Nukleinsäuremolekül darstellt, ein klebriges Ende umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Basensequenz, die das Nukleinsäuremolekül darstellt, ein stumpfes Ende umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Lesefehler eine Insertion oder eine Deletion einer Basensequenz oder eine Basensubstitution ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend:

    einen Schritt zum Bestimmen einer Konsensussequenz von Nukleinsäuremolekülen, welche die gleiche Strichcodesequenz aufweisen, auf der Grundlage der Strichcodesequenz, für die Basensequenz bestimmt worden ist;

    einen Schritt zum Erfassen von Lesefehlern in den Basensequenzen der Nukleinsäuremoleküle, für welche die Basensequenzen bestimmt worden sind, auf der Grundlage der Konsensussequenz; und

    einen Schritt zum Entfernen von Nukleinsäuremolekülen, welche die Lesefehler aufweisen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, ferner umfassend einen Schritt zum Zählen der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen, welche Mutationen aufweisen, durch Erfassen von Mutationen in den Basensequenzen von Nukleinsäuremolekülen, für welche die Basensequenzen bestimmt worden sind, auf der Grundlage der Konsensussequenz.