HK1154635B - Process for synthesizing nucleic acid - Google Patents

Claims (12)

1. Procédé d'amplification d'un acide nucléique ayant des séquences nucléotidiques complémentaires liées en alternance dans une chaîne simple-brin par réalisation répétée des étapes suivantes :

   A) l'étape consistant à fournir une matrice qui est dotée à ses extrémités 3' et 5' d'une région consistant en une séquence nucléotidique complémentaire de chaque région terminale dans la même chaîne et qui, lors de l'hybridation de ces séquences nucléotidiques mutuellement complémentaires, forme une boucle capable d'un appariement de bases entre elles,

   B) l'étape consistant à réaliser une synthèse d'une chaîne complémentaire dans laquelle l'extrémité 3' de ladite matrice hybridée à la même chaîne sert d'origine de synthèse,

   C) l'étape consistant à hybrider, à la partie formant boucle, un oligonucléotide doté à son extrémité 3' d'une séquence nucléotidique complémentaire d'une boucle qui parmi lesdites boucles, se trouve au niveau du site 3'-terminal, suivie de la synthèse, avec l'oligonucléotide en tant qu'origine de synthèse, d'une chaîne complémentaire par une polymérase catalysant la réaction de synthèse d'une chaîne complémentaire, par déplacement de brin, pour déplacer la chaîne complémentaire synthétisée dans l'étape B) afin de rendre son extrémité 3' prête pour un appariement de bases, et

   D) l'étape dans laquelle la chaîne avec l'extrémité 3' rendue prête pour un appariement de bases dans l'étape C) sert de nouvelle matrice.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'oligonucléotide dans l'étape C) est doté à son extrémité 5' d'une séquence nucléotidique complémentaire de l'extrémité 3' servant d'origine de synthèse dans l'étape B).
3. Procédé selon la revendication 2, comprenant en outre l'étape dans laquelle une chaîne complémentaire synthétisée avec l'oligonucléotide dans l'étape C) en tant qu'origine de synthèse est utilisée comme matrice dans l'étape A).
4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la matrice dans l'étape A) est synthétisée par le procédé de synthèse d'un acide nucléique ayant des séquences nucléotidiques complémentaires liées en alternance dans une chaîne simple-brin, comprenant :

   a) l'étape consistant à fournir un acide nucléique qui est doté à son extrémité 3' d'une région F1 apte à s'hybrider à une partie F1c dans la même chaîne et qui, lors de l'hybridation de la région F1 à F1c, est apte à former une boucle contenant une région F2c capable d'un appariement de bases,

   b) l'étape consistant à réaliser une synthèse d'une chaîne complémentaire dans laquelle l'extrémité 3' de F1 s'étant hybridée à F1c sert d'origine de synthèse,

   c) l'étape consistant à hybrider, à une région F2c, un oligonucléotide doté à son extrémité 3' d'une F2 consistant en une séquence complémentaire de la région F2c, suivie de la synthèse, avec ledit oligonucléotide en tant qu'origine de synthèse, d'une chaîne complémentaire par une polymérase catalysant la réaction de synthèse d'une chaîne complémentaire, par déplacement de brin, pour déplacer la chaîne complémentaire synthétisée dans l'étape b), et

   d) l'étape consistant à hybrider, à la chaîne complémentaire déplacée dans l'étape c) pour être prête pour un appariement de bases, un polynucléotide doté à son extrémité 3' d'une séquence complémentaire d'une région arbitraire dans ladite chaîne synthétisée dans l'étape c), suivie de la synthèse, avec ladite extrémité 3' en tant qu'origine de synthèse, d'une chaîne complémentaire par une polymérase catalysant la réaction de synthèse d'une chaîne complémentaire, par déplacement de brin, pour déplacer la chaîne complémentaire synthétisée dans l'étape c),

   dans lequel l'acide nucléique dans l'étape a) est un second acide nucléique fourni par les étapes suivantes :

   i) l'étape consistant à hybrider, à une région F2c dans l'acide nucléique servant de matrice, une région F2 dans l'oligonucléotide composé d'au moins deux régions F2 et F1c ci-dessous, et F1c est lié au côté 5' de F2, F2 : une région ayant une séquence nucléotidique complémentaire d'une région arbitraire F2c dans un acide nucléique ayant une séquence nucléotidique spécifique, et F1c: une région ayant essentiellement la même séquence nucléotidique que celle de la région F1c se trouvant du côté 5' de la région F2c dans un acide nucléique ayant une séquence nucléotidique spécifique,

   ii) l'étape consistant à synthétiser un premier acide nucléique ayant une séquence nucléotidique complémentaire de la matrice, où F2 dans l'oligonucléotide sert d'origine de synthèse,

   iii) l'étape consistant à rendre une région arbitraire dans le premier acide nucléique synthétisé dans l'étape ii) prête pour un appariement de bases, où l'étape est effectuée par synthèse d'une chaîne complémentaire par déplacement de brin, par une polymérase catalysant la réaction de déplacement de brin, où une amorce externe s'hybridant au côté 3' de F2c dans la matrice sert d'origine de synthèse, et

   iv) l'étape consistant à hybrider un oligonucléotide ayant une séquence nucléotidique complémentaire de la région rendue prête pour un appariement de bases dans le premier acide nucléique dans l'étape iii), puis à synthétiser un second acide nucléique avec ledit oligonucléotide en tant qu'origine de synthèse et à rendre F1 au niveau de son extrémité 3' prête pour un appariement de bases, où la région permettant l'appariement de bases dans l'étape iii) est R2c, et l'oligonucléotide dans l'étape iv) est l'oligonucléotide composé d'au moins deux régions R2 et R1c ci-dessous, et R1c est lié au côté 5' de R2, R2 : une région ayant une séquence nucléotidique complémentaire d'une région arbitraire R2c dans un acide nucléique ayant une séquence nucléotidique spécifique, et R1c : une région ayant essentiellement la même séquence nucléotidique que celle de la région R1c se trouvant du côté 5' de la région R2c dans un acide nucléique ayant une séquence nucléotidique spécifique,

   v) l'étape consistant à rendre une région arbitraire dans le second acide nucléique synthétisé dans l'étape iv) prête pour un appariement de bases, où l'étape est effectuée par synthèse d'une chaîne complémentaire par déplacement de brin, par une polymérase catalysant la réaction de déplacement de brin, où une amorce externe s'hybridant au côté 3' de R2 dans la matrice sert d'origine de synthèse.
5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la réaction de synthèse d'une chaîne complémentaire par déplacement de brin est effectuée en présence d'un régulateur de température de fusion.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le régulateur de température de fusion est la bétaïne.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on laisse 0,2 à 3,0 M de bétaïne présente dans la solution réactionnelle.
8. Procédé de détection d'une séquence nucléotidique cible dans un échantillon, qui comprend l'exécution d'un procédé d'amplification décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 et l'observation si oui ou non un produit de la réaction d'amplification est généré.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel une sonde contenant une séquence nucléotidique complémentaire de la boucle est ajoutée au produit de la réaction d'amplification et une hybridation entre eux est observée.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la sonde est marquée sur des particules et une réaction d'agrégation survenant lors de l'hybridation est observée.
11. Procédé selon la revendication 8, dans lequel un procédé d'amplification décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 est effectué en présence d'un détecteur d'acide nucléique, et on observe si oui ou non un produit de la réaction d'amplification est généré, d'après un changement dans le signal du détecteur.
12. Procédé de détection d'une mutation dans une séquence nucléotidique cible par le procédé de détection décrit dans la revendication 11, dans lequel une mutation dans une séquence nucléotidique faisant l'objet d'une amplification empêche la synthèse de l'une quelconque des chaînes complémentaires constituant le procédé d'amplification.