HK1154635B

HK1154635B - Process for synthesizing nucleic acid

Info

Publication number: HK1154635B
Application number: HK11108686.9A
Authority: HK
Inventors: Tsugunori Notomi; Tetsu Hase
Original assignee: Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 2011-08-17
Publication date: 2013-06-07

Claims

Verfahren zum Amplifizieren einer Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechseln in einer einzelsträngigen Kette verknüpft sind, umfassend die folgenden Schritte:
A) den Schritt der Bereitstellung einer Matrize, die an ihren 3'- und 5'-Enden eine Region bereitstellt, die aus einer Nukleotidsequenz besteht, die komplementär ist zu jeder terminalen Region in der gleichen Kette und die nach dem Anlagern dieser wechselseitig komplementären Nukleotidsequenzen eine Schleife bildet, die dazwischen zur Basenpaarung fähig ist,

B) den Schritt des Durchführens der Synthese der komplementären Kette, worin das 3'-Ende der Matrize, das sich an der gleichen Kette anlagert, als Ursprung für die Synthese dient,

C) den Schritt des Anlagerns eines Oligonukleotids an die Schleifenregion, das an dessen 3'-Ende mit einer zu einer Schleife komplementären Nukleotidsequenz ausgestattet ist, welche innerhalb der Schleifen am 3'-Ende lokalisiert ist, gefolgt von der Synthese einer komplementären Kette mit dem Oligonukleotid als Ausgangspunkt der Synthese durch eine Polymerase, die die Strangverdrängungsreaktion der komplementären Kette katalysiert, um die in Schritt B) synthetisierte komplementäre Kette zu verdrängen, um das 3'-Ende bereit zur Basenpaarung zu machen, und

D) den Schritt, in welchem die Kette mit dem 3'-Ende, die für die Basenpaarung in Schritt C) bereit gemacht wurde, als eine neue Matrize dient.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid in Schritt C) am 5'-Ende mit einer Nukleotidsequenz ausgestattet ist, die komplementär zum 3'-Ende ist, das als der Ausgangspunkt für die Synthese in Schritt B dient.
Verfahren nach Anspruch 2, weiterhin umfassend den Schritt, bei dem eine mit dem Oligonukleotid in Schritt C) als Ausgangspunkt für die Synthese synthetisierte komplementäre Kette als eine Matrize in Schritt A verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Matrize in Schritt A) mit Hilfe des Verfahrens zur Synthese von Nukleinsäure hergestellt wird, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelsträngigen Kette miteinander verknüpft sind, umfassend:
a) den Schritt der Zugabe von Nukleinsäure, welche am 3'-Ende mit einer Region F1 ausgestattet ist, die in der Lage ist, sich an einen Abschnitt F1c in derselben Kette anzulagern und welche nach dem Anlagern der Region F1 an F1c in der Lage ist, eine Schleife zu bilden, die eine zur Basenpaarung fähige Region F2c beinhaltet,

b) den Schritt des Durchführens der Synthese einer komplementären Kette, wobei das 3'-Ende von F1, das sich an F1c anlagert, als Ausgangspunkt für die Synthese dient,

c) den Schritt des Anlagerns eines Oligonukleotids an eine Region F2c, das an dessen 3'-Ende mit F2 ausgestattet ist, die aus einer zu F2c komplementären Sequenz besteht, gefolgt von der Synthese einer komplementären Kette mit dem Oligonukleotid als Ausgangspunkt für die Synthese durch eine Polymerase, die die Strangverdrängungsreaktion zur Synthese der komplementären Kette katalysiert, um die in Schritt b) synthetisierte komplementäre Kette zu verdrängen, und

d) den Schritt des Anlagerns eines Polynukleotids, das am 3'-Ende mit einer Nukleotidsequenz ausgestattet ist, die komplementär zu einer beliebigen Region in der in Schritt c) synthetisierten Kette ist, an die komplementäre Kette, die in Schritt c) verdrängt und bereit zur Basenpaarung gemacht wurde, gefolgt von der Synthese einer komplementären Kette mit dem 3'-Ende als Ausgangspunkt für die Synthese durch eine Polymerase, die die Strangverdrängungsreaktion zur Synthese der komplementären Kette katalysiert, um die in Schritt c) synthetisierte komplementäre Kette zu verdrängen, wobei die Nukleinsäure in Schritt a) eine zweite Nukleinsäure ist, die durch folgende Schritte bereitgestellt wird:
(i) den Schritt des Anlagerns einer Region F2 in dem Oligonukleotid, das aus mindestens zwei unten beschriebenen Regionen F2 und F1c zusammenge setzt ist, und F1 c mit der 5'-Seite von F2 verknüpft ist, an eine Region F2c in der als Matrize dienenden Nukleinsäure, F2: eine Region, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär zu einer beliebigen Region F2c in einer Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz ist, und F1c: eine Region, die im Wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz besitzt wie eine Region F1c, die an der 5'-Seite der Region F2c in einer Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz lokalisiert ist,

ii) den Schritt der Synthese einer ersten Nukleinsäure mit einer zur Matrize komplementären Sequenz, wobei F2 im Oligonukleotid als Ausgangspunkt für die Synthese dient,

iii) den Schritt der Bereitstellung einer beliebigen Region in der im Schritt ii) zur Basenpaarung bereitgemachten synthetisierten ersten Nukleinsäure, wobei der Schritt durch eine Strangverdrängungssynthese einer komplementären Kette durch eine die Strangverdrängungsreaktion katalysierende Polymerase durchgeführt wird, wobei ein äußerer Primer, der sich an der 3'-Seite von F2c in der Matrize anlagert, als Ausgangspunkt für die Synthese dient, und

iv) den Schritt des Anlagerns eines Oligonukleotids mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Region ist, die in der ersten Nukleinsäure in Schritt iii) zur Basenpaarung bereit gemacht wurde, gefolgt von der Synthese der zweiten Nukleinsäure mit dem Oligonukleotid als Ausgangspunkt für die Synthese und dem bereit machen von F1 am 3'-Ende desselben zur Basenpaarung, wobei die Region, die die Basenpaarung in Schritt iii) ermöglicht, R2c ist, und das Oligonukleotid in Schritt iv) das Oligonukleotid ist, das aus mindestens zwei unten beschriebenen Regionen R2 und R1c zusammengesetzt ist, und R1c mit der 5'-Seite mit R2 verknüpft ist, R2: eine Region, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär zu einer beliebigen Region R2c in der Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz ist, und R1c: eine Region, die größtenteils dieselbe Nukleotidsequenz besitzt wie eine Region R1 c hat, die sich auf der 5'-Seite der Region R2c in der Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz befindet,

v) den Schritt des Bereitmachens einer beliebigen Region in der im Schritt iv) hergestellten zweiten Nukleinsäure zur Basenpaarung, wobei der Schritt durch eine Strangverdrängungssynthese einer komplementären Kette durch eine Polymerase, die die Strangverdrängungsreaktion katalysiert, durchgeführt wird, wobei ein äußerer Primer, der sich an die 3'-Seite von R2 der Matrize anlagert, als Ausgangspunkt für die Synthese dient.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Strangverdrängungsreaktion zur Synthese der komplementären Kette in der Gegenwart eines Schmelztemperatur-Regulators durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Schmelztemperatur-Regulator Betain ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei 0,2 bis 3,0 M Betain in der Reaktionslösung vorhanden sein können.
Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleotidsequenz in einer Probe, welches das Durchführen eines Amplifikationsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und die Beobachtung umfasst, ob ein Produkt in der Amplifikationsreaktion hergestellt wurde oder nicht.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei dem Reaktionsprodukt der Amplfikation eine Sonde hinzugefügt wird mit einer Nukleotidsequenz, die zur Schleife komplementär ist, innerhalb derer Hybridisierung beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Sonde auf Partikeln markiert ist und eine Aggregationsreaktion in Folge einer Hybridisierung beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei ein Amplifikationsverfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beschrieben, in der Gegenwart eines Detektors von Nukleinsäuren durchgeführt wird, und ob ein Produkt der Vervielfältigungsreaktion hergestellt ist oder nicht, auf der Basis einer Veränderung im Signal eines Detektors beobachtet wird.
Verfahren zum Nachweis einer Mutation in einer Zielnukleotidsequenz durch das Nachweisverfahren nach Anspruch 11, wobei eine Mutation in einer Nukleotidsequenz, die Gegenstand der Vervielfältigung ist, die Synthese einer der komplementären Ketten, die das Amplifikationsverfahren ausmachen, unterbindet.