HK1136837B - 促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

提供了一种通式为(I)的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐以及它们的制备方法,其中R1、R2、R3、R4、R5、n1、n2如说明书所定义。还提供了一种含有通式(I)的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐的药物组合物。提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐或含有促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐的药物组合物可在治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病中广泛应用。 R1-R2-(CH2)n1-R3-(CH2)n2-R4-R5 (I)

Description

促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或者能起促红细胞生成素激动作用的促红细胞生成素模拟肽衍生物及可药用盐，具体地说，本发明涉及一种经活性甲氧基聚乙二醇修饰的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其制备方法；还涉及了使用上述模拟肽衍生物及可药用盐治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的方法。

技术背景

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型即α型和β型，其中，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)，广泛用于临床。应用重组DNA技术已经生物合成出促红细胞生成素(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等(986)免疫生物学(1mmunobiol)72：213-224)，其是插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中并且表达的克隆的人促红细胞生成素基因的产物。天然存在的人促红细胞生成素首先翻译成含有166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中用羟肽酶裂解掉166位精氨酸。没有糖基的人EPO的多肽链的分子量是18236Da.在完整的促红细胞生成素分子中，糖基占整个分子量的大约40％(J.Biol.Chem.262：12059)。

促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等均有一定疗效；此外，应用促红细胞生成素还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；促红细胞生成素纠正肾性贫血的疗效几乎100％，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的重组药物占了119亿美元，有巨大的市场容量。

早在1989年，美国FDA就正式批准重组人促红素(EPOGEN)用于肾性贫血的治疗，但直到1992年才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0.25％，其中相当一部分患者最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等其他病人的用药，国内市场容量约12-16亿元甚至更大(病人平均体重按50Kg计算)。自20世纪90年代后期，促红细胞生成素已进入我国重点城市医院畅销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了30％。

促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，促红细胞生成素由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。

在促红细胞生成素诱导红组细胞分化过程中，球蛋白被诱导，这能使细胞吸收更多的铁合成功能性的血红蛋白，这种功能性的血红蛋白可以和成熟的红血球中的氧结合，因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。这一过程是由促红细胞生成素与红组细胞的表面受体之间的相互作用引起的。

当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以刺激促进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。

当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可以由以下原因引起的：过量的辐射、因高纬度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血等等。作为对组织处于缺氧压力的应答，促红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关重要的作用，因此这类激素对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、紊乱和血液学异常情况中的效用提供了基础，这些疾病包括：慢性肾衰竭(CRF)患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI，于：MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素一国际展望(Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective.Marcel Dekker；1990：p301-324)。

促红细胞生成素的部分生物学效应可以通过和细胞膜表面的受体内在作用来调节。起先，使用从小鼠的脾脏里分离出的未成熟的红细胞来研究细胞表面结合的促红细胞生成素蛋白时发现，这种蛋白是由两种多聚肽组成，其分子量大约为85000～100000KD(Sawyer，et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3690-3694)由比较详细的叙述。促红细胞生成素的结合位点的数目也被计算出来了，大约每个细胞膜含有800～1000个位点。在这些结合位点中大约有300个结合位点的Kd水平为90pM，而剩下的结合位点的结合力比较弱，大约有570pM.有研究表明从感染了friend病毒贫血株的小鼠的脾脏红细胞对EPO的响应情况发现，大约有400个结合位点，其中Kd水平高的为100pM，Kd水平低的为800pM。

随后的工作就是两种促红细胞生成素受体被单个基因翻录，这个基因已经被克隆。例如，小鼠和人的促红细胞生成素受体的DNA序列以及编码肽的序列在WO90/08822中已经有叙述。目前的模型表明促红细胞生成素结合到促红细胞生成素受体导致了两个促红细胞生成素受体的活化和二聚，这种二聚进一步导致了信号传导的开始。

促红细胞生成素克隆基因的应用更有助于帮助寻找这些重要受体的激动剂和拮抗剂。某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定和叙述。特别是确定了一组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能刺激促红细胞生成素细胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50却很低，在20nM和250nM之间。因此这些肽在临床应用上受到了较大的限制，为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性更好，生物利用度更高的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐以及它们的制备方法

发明内容

本发明在于提供一种生物活性更好，生物利用度更高的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐以及它们的制备方法。

本发明目的还在于提供一种含上述促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐的药物组合物，用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。

本发明公开了一种通式为(I)的具有体内生物活性的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，

R₁-R₂-(CH₂)_n1-R₃-(CH₂)_n2-R₄-R₅

              (I)

其中R₁、R₅选自具有体内生物学活性的促红细胞生成素模拟肽单体肽及其类似物；n₁、n₂的数目各自独立的选自0～10的整数；R₂、R₄选自-CO、-CH₂；R₃选自O、S、CH₂、N(CH₂)_n3NHR₆、NCO(CH₂)_n4NHR₆、CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆、CHSCON(CH₂)_n5NHR₆或CHNHCON(CH₂)_n5NHR₆；其中n₃的数目选自1～10的整数，n₄的数目选自2～10的整数，n₅的数目选自2～10的整数，R₆选自H或甲氧基聚乙二醇衍生物。

在本方案中，一个优选实施方案是：R₁、R₅各自独立的选自通式为Y₁X₁X₂X₃GX₄X₅TWX₆X₇Y₂Y₃的具有体内生物学活性的促红细胞生成素模拟肽单体肽及其类似物，其中每个氨基酸均由一个标准单字母表示，R₁、R₅的氨基酸序列可以是一致或不一致，进一步优选R₁、R₅的氨基酸序列是一致的，并且R₁、R₅的N末端被乙酰化；X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、Y₃各自独立的选自20个遗传性编码的L-氨基酸或非天然氨基酸中的任意一个；Y₁、Y₂各自独立的选自20个遗传性编码的L-氨基酸或非天然氨基酸中任意一个或由这些氨基酸所组成的肽段；X₁、X₇选自C、K、D、E、Orn或Hoc。

对上述优选的实施方案进一步优化，R₁、R₅是通过二硫键或酰胺键环化的环肽；其中R₁、R₅如果是通过二硫键环化的环肽，X₁、X₇分别独立的选自C或Hoc；同样，R₁、R₅如果是通过酰胺键环化的环肽，X₁、X₇分别独立的选自K、D、E或Orn。

在本方案中，包括上述优选的实施方案中，Y₃优选自K、H或R，进一步优选Y₃是K。

在本方案中，包括上述优选的实施方案中，R₁、R₅的氨基酸序列长度进一步优化，即优选自13～40个氨基酸，再优选的是22个氨基酸，更优选但不限于具有下述结构的环肽，最优选但不限于NO：1～NO：8环肽，即

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Ac-GGTYSRPQRG-βAla-K-NH2(SEQ ID NO：30)。

在本方案中，有四个优选的实施方案分别是：

【1】n₁，n₂为2，R₂、R₄是-CO，R₃选自CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆，n₅是2，R₆是H或甲氧基聚乙二醇衍生物。

【2】n₁，n₂为1，R₂、R₄是-CO，R₃选自NCO(CH₂)_n4NHR₆，n₄是2，R₆是H或甲氧基聚乙二醇衍生物。

【3】n₁，n₂为2，R₂、R₄是-CH₂，R₃选自CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆，n₅是2，R₆是H或甲氧基聚乙二醇衍生物。

【4】n₁，n₂为1，R₂、R₄是-CH₂，R₃选自选自NCO(CH₂)_n4NHR₆，n₄是2，R₆是H或甲氧基聚乙二醇衍生物。

上述四个优选的实施方案属于并列关系，不存在包含或递进关系。对上述四个优选实施方案，我们可以分别进一步优化，R₆是甲氧基聚乙二醇衍生物，最优选R₆是甲氧基聚乙二醇衍生物，其中甲氧基聚乙二醇衍生物的分子量选自5，000～100,000道尔顿，甲氧基聚乙二醇衍生物的结构选自分枝型或线型。

本方案中，我们可通过进一步综合优选，可分别获得下列四个优选实施方案：

【1】n₁，n₂为2，R₁、R₅选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO、-CH₂，R₃选自CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆，其中n₅选自2～10，优选2；R₆是结构为线型、分子量为20,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物。

【2】n₁，n₂为1，R₁、R₅选自SEQID NO：1～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO、-CH₂，R₃选自NCO(CH₂)_n4NHR₆，其中n₄选自2～10，优选2；R₆是结构为线型、分子量为20,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物。

【3】n₁，n₂为2，R₁、R₅选自SEQID NO：1～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO、-CH₂，R₃选自CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆，其中n₅选自2～10，优选2；R₆是结构为分枝型、分子量为40,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物。

【4】n₁，n₂为1，R₁、R₅选自SEQID NO：1～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO、-CH₂，R₃选自NCO(CH₂)_n4NHR₆，其中n₄选自2～10，优选2；R₆是结构为分枝型、分子量为40,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物。

其中，最终优选的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐的结构选自：

本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物属于两性化合物，所属领域技术人员通过公知技术可使用酸性或碱性化合物与之反应成盐，通常采用的形成酸加成盐的酸为：

盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸；盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、三氟乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、奈-1-磺酸盐、奈-2-磺酸盐、扁桃酸盐等，优选三氟乙酸盐。

碱性物质也可以和促红细胞生成素模拟肽衍生物成盐，这些碱性物质包括铵，碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐、碳酸氢盐，典型的有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾等。

本发明还公开了上述促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐的制备方案，包括以下步骤：

(1)用基因工程或化学合成的方法制备R₁、R₅，R₁、R₅选自有促红细胞生成素生物学功能的模拟肽单体肽及其类似物，

(2)制备通式为(II)的功能小分子

R₇-CO-(CH₂)_n1-Z₂-(CH₂)_n2-CO-R₈

          (II)

其中n₁、n₂的数目各自独立的选自0～10的整数；

R₇、R₈选自OH或H；

Z₂选自O、S、CH₂、N(CH₂)_n6NHR₉、NCO(CH₂)_n7NHR₉、CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉、CHSCON(CH₂)_n8NHR₉或CHNHCON(CH₂)_n8NHR₉，其中n₆的数目选自1～10的整数，n₇的数目选自2～10的整数，n₈的数目选自2～10的整数，R₉选自Boc或Cbz，

(3)将R₁、R₅与通式为(II)的功能小分子进行衍生，制备得通式(III)化合物；

R₁-R₂-(CH₂)_n1-Z₂-(CH₂)_n2-R₄-R₅

          (III)，

其中R₂、R₄各自独立地选自-CO或-CH₂，

(4)脱去Boc或Cbz后，与活性甲氧基聚乙二醇通过共价键连接。

本发明还涉及了一种的药物组合物，包含：

(1)治疗量的上述的一种通式为(I)的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐；

(2)药学可接受的药物载体。

本发明还公开了药物用途方案，即使用含有上述任意的治疗量的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。特别是治疗下述疾病：末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴有异常红细胞产生的肿瘤疾病。

本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐能够明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成，同时还能够大大延长偶联物在体内的半衰期。促红细胞生成素模拟肽衍生物和促红细胞生成素蛋白对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响，对外周血白细胞计数液没有明显影响。

促红细胞生成素模拟肽单体肽的合成采用的是固相合成技术，其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复(缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中缩合和去保护反应步骤的中间控制采取的是茚三酮检测的方法，即当树脂肽链上有游离的氨基时，经茚三酮试剂检测会显蓝色，没有游离氨基时不显色(茚三酮试剂本身为黄色)。因此在进行缩合反应完毕后，通过茚三酮检测，如果显黄色(茚三酮试剂本身的颜色)，则说明本步偶合完毕可以进行下一个氨基酸的偶合前的脱保护操作，如果显蓝色，则证明肽链上还有些游离氨基，需进一步的重复偶合或改变现有的缩合剂直至树脂肽经茚三酮检测为黄色。

单体肽的环化方法是本领域技术人员所熟知的，二硫键的环化主要是通过氧化剂使得单体肽中氨基酸侧链巯基氧化成二硫键，具体的方法有将单体肽放置于DMSO溶液中，或者放置于浓度为5％的碳酸氢胺溶液中自动氧化，或者加入I₂在醋酸溶液中氧化，优选加入I₂在醋酸溶液中氧化。酰胺键的环化主要是通过单体肽中氨基酸侧链的羧基和氨基在缩合剂存在的情况下形成酰胺键，加入的缩合剂为本领域技术人员所公知，通常有DIC、EDC、HATU、Pybop等。

二聚肽的合成主要是通过促红细胞生成素模拟肽单体肽氨基酸残基侧链上的氨基与功能小分子形成-NH-CH₂-键或者-NH-CO-键的形式连接，本领域的技术人员可以很容易合成功能小分子，并将其与单体肽环肽通过已知的技术连接。

将二聚肽与活性甲氧基聚乙二醇衍生物进行衍生，反应体系可以选择在有机溶剂或可利用的缓冲体系里进行，在有机溶剂里进行二聚肽的聚乙二醇化反应时，可以加入但并不限于以下适量的碱，如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、2，4，6三甲基吡啶。在缓冲体系里进行聚乙二醇化衍生反应时，缓冲体系可以选择已知的可利用的各种缓冲液，优选pH7.7磷酸盐缓冲液。

通过本领域公知的各种测试可以测定促红细胞生成素或本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐的生物学活性。体内活性的测试通过小鼠皮下注射促红细胞生成素及本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，连续三天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数采用全自动血球计数仪计数。对猕猴静脉注射进行药效学研究，单次给药剂量1.35mg/kg，作为对比药物使用的促红细胞生成素蛋白给药剂量为240μ/kg，每周三次，连续给药六周，采集血样进行相关血液学指标分析。

本发明中使用到的代号与结构对应表：

附图说明

图1：促红细胞生成素模拟肽衍生物(HH-EPO-018)对猕猴血细胞压积的影响。

图2：促红细胞生成素模拟肽衍生物(HH-EPO-018)对猕猴血红蛋白含量的影响。

具体实施方式

为了更详细地说明本发明，给出下列实例。但本发明的范围并非限定于此。

实施例一：促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽的合成

促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽的合成采用的是固相多肽合成的方法，这类多肽合成方法在许多文献中都有报道，可参见stewart，J.M.，and Young，J.D.，solidphase peptide synthesis 2d edition，novabiochem peptide synthesis notes.本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽采用手工合成的方法，树脂为rink amindresin，所用的氨基酸衍生物的α氨基由Fmoc(芴甲酰羰基)保护，半胱氨酸侧链巯基、谷胺酰胺侧链氨基、组氨酸侧链咪唑基由Trt(三苯甲基)保护、精氨酸侧链胍基由Pbf(2，2，4，6，7-五甲基二氢化苯并呋喃-5-磺酰基)保护，色氨酸侧链吲哚基、赖氨酸侧链氨基由Boc(叔丁氧羰基)保护，苏氨酸侧链羟基、酪氨酸侧链苯酚基、丝氨酸侧链羟基由tBu(叔丁基)保护。将所要合成促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽肽链的C末端氨基酸的羧基以共价键的结构同高分子的不溶性树脂(rink amind resin)相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过20％六氢吡啶/DMF溶液脱去氨基保护基，然后和过量的氨基酸衍生物反应，接长肽链。重复(缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后用三氟乙酸∶水∶乙二硫醇、三异丙基硅烷＝92.5∶2.5∶2.5∶2.5混合溶液将肽链从树脂上裂解下来，经乙醚沉降得到促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽粗品，单体肽粗品使用C18反相制备柱分离纯化，即得所要的促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽。其中缩合和去保护反应步骤的中间控制采取的是茚三酮检测的方法，即当树脂肽链上有游离的氨基时，经茚三酮试剂检测会显蓝色，没有游离氨基时不显色(茚三酮试剂本身为黄色)。因此在进行缩合反应完毕后，通过茚三酮检测，如果显黄色(茚三酮试剂本身的颜色)，则说明本步偶合完毕可以进行下一个氨基酸的偶合前的脱保护操作，如果显蓝色，则证明肽链上还有些游离氨基，需进一步的重复偶合或改变现有的缩合剂直至树脂肽经茚三酮检测为黄色。

实施例二：功能小分子(LG-1)的制备

第一步：LG-1-A的制备

将亚胺基二乙酸二乙酯(10.0g，52.8mmol)，Boc-β-丙氨酸(10.0g，52.8mmol)，溶于100mL二氯甲烷中，加入DIC(8.0mL，52.8mmol)，室温搅拌过夜，过滤反应液，滤液依次用100ml饱和NaHCO₃，50ml0.5N的HCl溶液，100ml饱和食盐水洗涤，分出有机层，有机层用无水MgSO₄干燥。过滤有机层，浓缩，得无色油状液体LG-1-A：17g。

第二步：LG-1-B的制备

将17克LG-1-A溶于100mLMeOH∶THF＝1∶1混合液，再加入25mL水，5g NaOH(125mmol)。室温搅拌2h后用6N HCl溶液调pH值到1。用乙酸乙酯萃取反应液4次。有机层用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到白色半固体。产物用50mL二氯甲烷溶解，加入300mL正己烷，溶液呈白色浆状。减压浓缩得白色固体LG-1-B：14g(收率约90％)。

第三步：LG-1-C的制备

将7gLG-1-B(23mmol)溶解在80ml四氢呋喃中，搅拌下加入4.6g N，N-甲氧基甲基胺盐酸盐(46mmol)和5.1g三乙胺(51mmol)，再加入4.4g DIC(32mmol)，4.7g HOBT(32mmol)，室温搅拌反应过夜。次日，反应液倒入水中，350ml乙酸乙酯提取，有机层依次用200ml 2N HCl水溶液，200ml饱和碳酸氢钠溶液，100ml饱和食盐水洗涤，分出有机层，有机层用无水硫酸镁干燥2小时后过滤，滤液经减压浓缩得油状物.再经柱层析，收集目标产物LG-1-C：4.2g，收率：70％。

第四步：LG-1的制备

将4.0gLG-1-C(10.2mmol)加入60ml四氢呋喃中溶解，冰盐浴冷却至零度，加入LiAlH4(340mg，8.9mmol)，在零度反应30分钟后，依次加入水4ml，15％NaOH水溶液4ml，过滤反应液，滤饼用四氢呋喃洗涤，浓缩至干，硅胶柱层析得LG-I：1.63g(6mmol，收率：58.8％)

实施例三：功能小分子(LG-2)的制备

将4g LG-1-B(13mmol)溶于100mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入羟基琥珀酰亚胺(3.1g，21mmol)，DIC(4mL，26mmol)和DMAP(4-二甲基氨基吡啶)(12mg，0.08mmol)。搅拌过夜，减压浓缩反应液。残余物溶于80ml乙酸乙酯，滤去不溶物。有机相依次用40ml饱和碳酸氢钠溶液，40ml饱和食盐水，40ml 0.5N的HCl溶液，40ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机层并用无水硫酸镁干燥。过滤有机层，滤液减压浓缩，得白色固体LG-2：4.4g(收率约为68％)。

实施例四：功能小分子(LG-3)的制备

第一步：LG-3-A的制备

7.0g戊酮庚二酸(0.04mol)溶解在100ml甲醇中，搅拌下加入5％CsCO3甲醇溶液，控制加入的量使得反应液的pH为8.5左右(精密pH试纸测定)，加毕后搅拌30分钟，然后过滤反应液，滤液真空浓缩得油状物，将油状物用约100ml的DMSO，升温至60℃，加入14g(0.08mol)溴苄，反应8小时后，过滤反应液，固体用少量乙醚洗涤，母液中加入400ml乙醚，用200ml饱和食盐水洗涤三次，分出有机层并用无水硫酸镁干燥2小时后过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/5时，置于-20度冰柜中析晶过夜。次日，滤出固体，干燥，得白色固体LG-3-A：10.5g。(收率74％)

第二步：LG-3-B的制备

将2g LG-3-A(0.0056mol)溶于20ml四氢呋喃中，溶液保持内温在小于-10度，搅拌加入626mgNaBH₄(0.0168mol)，反应1h后.加入200ml冷冻乙醚，随后加入150ml饱和碳酸氢钠水溶液终止反应.静止分层，有机层用饱和食盐水洗涤一次后用无水Na₂SO4干燥2小时后过滤，滤液减压浓缩，得LG-3-B：1.9g(收率：94.6％)。

第三步：LG-3-C的制备

将3.2g LG-3-B(0.009mol)溶解在50ml二氯甲烷中，零度以下搅拌加入4.34g三乙胺(0.043mol)。将1.33g(0.0045mol)三光气溶解在25ml二氯甲烷中，然后滴加到上述溶液中，1小时后加入2.8g叔丁氧羰基乙二胺。反应3h后，用冰乙酸将反应液调至中性，此时有沉淀生成，滤去沉淀，滤液经减压浓缩至干后加入乙醚溶解，再用50ml水洗涤三次，50ml饱和食盐水洗涤一次。分出有机层并用无水硫酸镁干燥2小时后过滤，滤液减压浓缩得油.油状物经硅胶柱层析纯化(流动相：石油醚∶乙酸乙脂＝10∶1)。合并收集目标产物，浓缩得白色固体LG-3-C：1.5g(收率38.8％)。

第四步：LG-3-D的制备

将13g LG-3-C(0.031mol)溶解在8ml甲醇中，搅拌下加入约200mg10％钯碳，常压通入H₂反应4h后，滤去活性碳，滤液经浓缩后得油状物LG-3-D：8.28g(收率：96.7％)。

第五步：LG-3的制备

将5g LG-3-D(0.018mol)溶解在10mlTHF中，加入4.7g对硝基苯酚(0.043mol)，搅拌下加入DIC 4.2g(0.043)溶液。搅拌反应过夜。次日，滤出产生的沉淀，滤饼用少量乙酸乙酯洗涤，滤液经减压浓缩至干，向残余物中加入100ml乙酸乙酯并使其溶解，再用50ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机层并用无水硫酸镁干燥2小时后过滤，滤液减压浓缩得油状物.油状物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯20∶1＝10∶1).合并收集目标产物，减压浓缩至干得白色固体LG-3：3.5g(收率：32％)。

实施例五：功能小分子(LG-4)的制备

第一步：LG-4-A的制备

将5g LG-3-D(0.018mol)溶解在60mlTHF中，搅拌下加入3.51g N，N-甲氧基甲基胺盐酸盐(0.036mol)和4.0g三乙胺(0.04mol)，再加入3.4g DIC(0.027mol)和3.65g HOBT(0.027mol)，室温搅拌反应过夜。次日，将反应液冲入200ml水中，用乙酸乙酯提取二次，每次200ml。合并有机层并依次用50ml 2N HCl溶液、100ml饱和NaHCO₃溶液，100ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机层并用无水硫酸镁干燥2小时后过滤，滤液减压浓缩得油状物.油状物经柱层析纯化(洗脱剂∶正己烷/乙酸乙酯10∶1).合并目标组分并将减压浓缩得白色固体LG-4-A：6.24g(收率：80％)。

第二步：LG-4的制备

将4.0g LG-4-A(9mmol)加入50ml四氢呋喃中溶解，冰盐浴冷却至零度下加入300mg LiAlH4(7.9mmol)，保持零度反应30分钟后，向反应液中依次加入0.3ml水，0.9ml 15％NaOH溶液，0.3ml水，此时产生沉淀，过滤出沉淀物，滤饼用20ml四氢呋喃洗涤一次，合并滤液并经减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化得1.65g LG-4(收率：55.5％)。

实施例六：HH-EPO-005的制备

第一步：SEQ ID NO：5环肽的制备

将9g促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽SEQID NO：5(按照实施例给出的方法合成)溶于3000ml 20％冰醋酸中，然后缓慢滴加5％碘甲醇溶液，直到黄色不消失为止。反应液直接进行制备纯化，采用反相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP183.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥得SEQID NO：5环肽3.0g(收率：15.6％)

第二步：HH-EPO-005的制备

将SEQID NO：5环肽3.0g(1.22mmol)，溶解在150ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺147mg(1.46mmol)，368mg功能小分子(LG-3)(0.61mmol)，室温搅拌反应6小时后减压浓缩出部分N，N-二甲基甲酰胺，向残余物中加入200ml乙醚，冰箱放置2小时后离心，真空干燥得白色固体，再将此白色固体溶解在50ml 20％三氟乙酸/二氯甲烷溶液中，室温搅拌30分钟后减压浓缩出部分溶剂，残余物加入200ml的乙醚，冰箱放置2小时后离心，经干燥得白色固体，白色固体经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(WatersSymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-005：1.0g(收率约33％)。

实施例七：HH-EPO-006的制备

第一步：SEQ ID NO：6环肽的制备

将9g促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽SEQ ID NO：6(按照实施例给出的方法合成)溶于3000ml 20％冰醋酸中，然后缓慢滴加5％碘甲醇溶液，直到黄色不消失为止。反应液直接进行制备纯化，采用反相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥得SEQ ID NO：6环肽3.0g(收率：15.3％)

第二步：HH-EPO-006的制备

将SEQID NO：6环肽3.0g(1.23mmol)，溶解在150mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺147mg(1.46mmol)，368mg功能小分子(LG-3)(0.61mmol)，室温搅拌反应6小时后减压浓缩出部分DMF，向残余物中加入200ml乙醚，冰箱放置2小时后离心，真空干燥得白色固体，再将此白色固体溶解在50ml 20％三氟乙酸/二氯甲烷溶液中，室温搅拌30分钟后减压浓缩出部分溶剂，残余物加入200ml的乙醚，冰箱放置2小时后离心，经干燥得白色固体，白色固体经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP183.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-006：0.98g(收率约32.7％)。

实施例八：HH-EPO-007的制备

第一步：SEQ ID NO：7环肽的制备

将9g促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽SEQID NO：7(按照实施例一给出的方法合成)溶于3000ml 20％冰醋酸中，然后缓慢滴加5％碘甲醇溶液，直到黄色不消失为止。反应液直接进行制备纯化，采用反相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥得SEQ ID NO：7环肽3.15g(收率：16.4％)

第二步：HH-EPO-007的制备

将SEQ ID NO：7环肽3.0g(1.22mmol)，溶解在150mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺147mg(1.46mmol)，368mg功能小分子(LG-3)(0.61mmol)，室温搅拌反应6小时后减压浓缩出部分N，N-二甲基甲酰胺，向残余物中加入200ml乙醚，冰箱放置2小时后离心，真空干燥得白色固体，再将此白色固体溶解在50ml 20％三氟乙酸/二氯甲烷溶液中，室温搅拌30分钟后减压浓缩出部分溶剂，残余物加入200ml的乙醚，冰箱放置2小时后离心，经干燥得白色固体，白色固体经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(WatersSymmetryShield^TM RP183.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-007：1.0g(收率约33％)。

实施例九：HH-EPO-008的制备

第一步：SEQ ID NO：8环肽的制备

将27g促红细胞生成素模拟肽衍生物单体肽SEQ ID NO：8(按照实施例一给出的方法合成)溶于3000ml 20％冰醋酸中，然后缓慢滴加5％碘甲醇溶液，直到黄色不消失为止。反应液直接进行制备纯化，采用反相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥得SEQ ID NO：8环肽9.3g(收率：15.7％)

第二步：HH-EPO-008的制备

将SEQ ID NO：8环肽3.0g(1.22mmol)，溶解在150mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺147mg(1.46mmol)，368mg功能小分子(LG-3)(0.61mmol)，室温搅拌反应6小时后减压浓缩出部分N，N-二甲基甲酰胺，向残余物中加入200ml乙醚，冰箱放置2小时后离心，真空干燥得白色固体，再将此白色固体溶解在50ml 20％三氟乙酸/二氯甲烷溶液中，室温搅拌30分钟后减压浓缩出部分溶剂，残余物加入200ml的乙醚，冰箱放置2小时后离心，经干燥得白色固体，白色固体经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(WatersSymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-008：1.12g(收率约33％)。

实施例十：HH-EP0-008A的制备

将SEQ ID NO：8环肽3.0g(1.22mmol)，溶解在150ml 20mmol乙酸缓冲液(pH5.0)中，再加入201mg功能小分子(LG-4)(0.61mmol)和10ml乙腈，室温搅拌反应30分钟后，反应液经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-008A：0.75g(收率约25％)。

实施例十一：HH-EPO-008B的制备

将SEQ ID NO：8环肽3.0g(1.22mmol)，溶解在150mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺147mg(1.46mmol)，322mg功能小分子(LG-2)(0.61mmol)，室温搅拌反应6小时后减压浓缩出部分N，N-二甲基甲酰胺，向残余物中加入200ml乙醚，冰箱放置2小时后离心，真空干燥得白色固体，再将此白色固体溶解在50ml 20％三氟乙酸/二氯甲烷溶液中，室温搅拌30分钟后减压浓缩出部分溶剂，残余物加入200ml的乙醚，冰箱放置2小时后离心，经干燥得白色固体，白色固体经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(WatersSymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-008：1.3g(收率约43％)。

实施例十二：HH-EPO-008C的制备

将SEQ ID NO：8环肽3.0g(1.22mmol)，溶解在150ml 20mmol乙酸缓冲液(pH5.0)中，再加入165mg功能小分子(LG-1)(0.61mmol)和10ml乙腈，室温搅拌反应30分钟后，反应液经反相色谱法制备纯化，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-008C：0.8g(收率约27％)。

实施例十三：HH-EPO-018的制备

将0.5g HH-EPO-008(0.98mmol)溶解在100mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入39.6mg三乙胺(0.196mmol)，3.8g mPEG₂-OSU(40K)(0.96mmol)，室温搅拌6小时。将反应液直接冲析入600ml冷乙醚中，析出固体，冰箱放置2小时后离心，经干燥得HH-EPO-018粗品。采用反相色谱法纯化HH-EPO-018粗品，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM  RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-018：1.8g(收率约47％)。

实施例十四：HH-EPO-018A的制备

将0.5g HH-EPO-008(0.98mmol)溶解在100mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入39.6mg三乙胺(0.196mmol)，3.8g mPEG₂-OSU(40K)(0.96mmol)，室温搅拌6小时。将反应液直接冲析入600ml冷乙醚中，析出固体，冰箱放置2小时后离心，经干燥得HH-EPO-018粗品。采用反相色谱法纯化HH-EPO-018粗品，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-018A：1.5g(收率约39％)。

实施例十五：HH-EPO-018B的制备

将0.5g HH-EPO-008(0.98mmol)溶解在100mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入39.6mg三乙胺(0.196mmol)，3.8g mPEG₂-OSU(40K)(0.96mmol)，室温搅拌6小时。将反应液直接冲析入600ml冷乙醚中，析出固体，冰箱放置2小时后离心，经干燥得HH-EPO-018粗品。采用反相色谱法纯化HH-EPO-018粗品，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-018：1.7g(收率约45％)。

实施例十六：HH-EPO-018C的制备

将0.5gHH-EPO-008(0.98mmol)溶解在100mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入39.6mg三乙胺(0.196mmol)，3.8g mPEG₂-OSU(40K)(0.96mmol)，室温搅拌6小时。将反应液直接冲析入600ml冷乙醚中，析出固体，冰箱放置2小时后离心，经干燥得HH-EPO-018粗品。采用反相色谱法纯化HH-EPO-018粗品，用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂(Waters SymmetryShield^TM  RP18 3.5μm，4.6*100mm)，柱温60℃，检测波长为214nm；以水(含0.05％的三氟乙酸)和乙腈(含0.05％的三氟乙酸)的不同比例为流动相，合并收集目标组分，减压蒸出大部分乙腈后经冷冻干燥HH-EPO-018：1.4g(收率约37％)。

实施例十七：促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠的作用

实验目的：

评价并比较促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白对小鼠红细胞生成的影响。

材料及方法：

促红细胞生成素模拟肽衍生物HH-EPO-001、HH-EPO-002、HH-EPO-003、HH-EPO-004、HH-EPO-005、HH-EPO-006、HH-EPO-007、HH-EPO-008、HH-EPO-015、HH-EPO-016、HH-EPO-017、HH-EPO-018由江苏豪森药业股份有限公司提供；EPO：购自沈阳三生制药有限责任公司；昆明种小鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25～30g，♀，各组动物数：10只。

小鼠皮下注射促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白，连续三天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数。

结果与讨论：

按照目前的给药方案，促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白均能明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成(见表一)。促红细胞生成素模拟肽衍生物和促红细胞生成素蛋白对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响(见表二)，对外周血白细胞计数液没有明显影响(见表三)。

表一、促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠网织红细胞生成的影响

表二、促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠红细胞生成、血细胞压积、血红蛋白含量的影响

表三、促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠血小板、白细胞生成的影响

实施例十八：促红细胞生成素模拟肽衍生物对猕猴的作用

实验目的：

评价促红细胞生成素模拟肽衍生物对猕猴红细胞生成的影响。

材料及方法：

促红细胞生成素模拟肽衍生物HH-EPO-018，由江苏豪森药业股份有限公司提供；

促红细胞生成素：购自沈阳三生制药有限责任公司。使用前以含0.1％BSA的生理盐水稀释。

猕猴，体重5.5～8.5kg，雌雄不限，购自苏州西山中科实验动物中心。猕猴根据基础血红蛋白分组，每组三只。HH-EPO-0181.35mg/kg，静脉注射一次；EPO 240μ/kg，三次/周，连续给药五周，每周测1～2次血液学指标。

结果及讨论：

HH-EPO-018单次静脉注射导致猕猴外周血血红蛋白含量上升，血细胞压积升高，说明HH-EPO-018刺激血红蛋白生成，该刺激作用在给药35天后达到顶峰，随后缓慢下降，对血红蛋白的刺激作用大约为33％。阳性对照促红细胞生成素同样升高猕猴外周血血红蛋白含量，升高血细胞压积，其作用在停药后缓慢减弱。按照目前的给药方案，HH-EPO-018和促红细胞生成素对猕猴血红蛋白生成的刺激作用相当(见附图1、2)。

实施例十九：评价并比较促红细胞生成素模拟肽衍生物HH-EPO-015、HH-EPO-018、HH-EPO-018B与阳性对照AF37702对小鼠生成作用的影响

材料及方法：HH-EPO-015、HH-EPO-018、HH-EPO-018B、AF37702，均由江苏豪森药业股份有限公司提供。其中AF37702也是促红细胞生成素模拟肽衍生物，为Affymax公司产品(商品名：Hematide)。样品使用前以含0.1％BSA的生理盐配制。昆明种小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心，体重25±2g，♀，各组动物数：10只。动物经适应后，皮下注射HH-EPO-015、HH-EPO-018、HH-EPO-018B、AF37702，第1次给药后第6天处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数。血细胞计数用ADVIA全自动血球计数仪计数。

结果与讨论：HH-EPO-015、HH-EPO-018、HH-EPO-018B、AF37702单次皮下注射均明显升高小鼠外周血网织红细胞百分比及计数；其中HH-EPO-018B作用相对较强；HH-EPO-018、AF37702作用次之；HH-EPO-015作用最弱；HH-EPO-018、AF37702作用基本相当(见表四)。HH-EPO-015、HH-EPO-018、HH-EPO-018B、AF37702升高小鼠外周血血细胞压积和血红蛋白含量，它们作用基本相当，但对小鼠外周血红细胞计数均没有明显影响(见表五)。

表四：HH-EPO-015、HH-EPO-018、HH-EPO-018B、AF37702对小鼠外周血网织红细胞生成的影响

**P＜0.01 vs control

表五：HH-EPO-015、HH-EPO-018、HH-EPO-018B、AF37702对小鼠外周血红细胞生成、血细胞压积、血红蛋白含量的影响

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Claims (25)

1.一种通式为(I)的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，

R₁-R₂-(CH₂)_n1-R₃-(CH₂)_n2-R₄-R₅

(I)

其中R₁、R₅各自独立的选自通式为Y₁X₁X₂X₃GX₄X₅TWX₆X₇Y₂Y₃的促红细胞生成素模拟肽单体肽，其中每个氨基酸均由一个标准单字母表示；X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、Y₃各自独立的选自20个遗传性编码的L-氨基酸或非天然氨基酸中的任意一个；Y₁、Y₂各自独立的选自20个遗传性编码的L-氨基酸或非天然氨基酸中任意一个或由这些氨基酸所组成的肽段；X₁、X₇选自C、K、D、E、Orn或Hoc；n₁、n₂各自独立地选自0～10的整数；R₂、R₄各自独立地选自-CO或-CH₂；R₃选自NCO(CH₂)_n4NHR₆、CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆或CHSCON(CH₂)_n5NHR₆，其中n₄选自2～10的整数，n₅选自2～10的整数，R₆选自H或甲氧基聚乙二醇衍生物。

2.根据权利要求1所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₁、R₅的氨基酸序列是一致的或不一致的。

3.根据权利要求1所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₁、R₅的N末端被乙酰化。

4.根据权利要求1所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在在于R₁、R₅为形成二硫键的环肽。

5.根据权利要求1所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于Y₃选自K、H或R。

6.根据权利要求1所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于Y₃是K。

7.根据权利要求1所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₁、R₅的氨基酸序列的长度为13～40个氨基酸。

8.根据权利要求7所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₁、R₅的氨基酸序列的长度为22个氨基酸。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₁、R₅选自具有如下序列SEQ ID NO：1-NO：30结构的环肽： 

10.根据权利要求1～8任意一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₁、R₅各自独立的选自具有如下序列SEQ ID NO：1-NO：8结构的环肽.

11.根据权利要求1～8任意一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物选自下列肽，其中

n₁，n₂是2，R₂、R₄是-CO，R₃是CHOCONH(CH₂)_n5NHR₅，n₅是2；

n₁，n₂是1，R₂、R₄是-CO，R₃是NCO(CH₂)_n4NHR₆，n₄是2；

n₁，n₂是2，R₂、R₄是-CH₂，R₃是CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆，n₅是2；或者

n₁，n₂是1，R₂、R₄是-CH₂，R₃是NCO(CH₂)_n4NHR₆，n₄是2。

12.根据权利要求11所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₆是H。

13.根据权利要求11所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于R₆是甲氧基聚乙二醇衍生物。

14.根据权利要求13所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于所述甲氧基聚乙二醇衍生物分子量为5,000～100,000道尔顿。

15.根据权利要求13所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于所述的甲氧基聚乙二醇衍生物的结构为分枝型或线型。

16.根据权利要求15所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于所述的甲氧基聚乙二醇衍生物的结构为线型、分子量为20,000道尔顿，或者甲氧基聚乙二醇衍生物的结构为分枝型、分子量为40,000道尔顿。

17.根据权利要求1～8任意一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物选自下列肽，其中

n₁，n₂是2，R₁、R₅选自序列SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO或-CH₂，R₃是CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆，其中n₅选自2～10的整数；R₆是结构为线型、分子量为20,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物；

n₁，n₂是1，R₁、R₅选自序列SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO或-CH₂，R₃是NCO(CH₂)_n4NHR₆，其中n₄选自2～10的整数；R₆是结构为线型、分子量为20,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物；

n₁，n₂是2，R₁、R₅选自序列SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO或-CH₂，R₃是CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆，其中n₅选自2～10的整数；R₆是结构 为分枝型、分子量为40,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物；或者

n₁，n₂是1，R₁、R₅选自序列SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8，R₂、R₄选自-CO或-CH₂，R₃是NCO(CH₂)_n4NHR₆，其中n₄选自2～10的整数；R₆是结构为分枝型、分子量为40,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇衍生物。

18.根据权利要求1～8任意一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，其特征在于所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐为

19.一种制备权利要求1～18任意一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐的方法，包括以下步骤：

(1)制备R₁H、R₅H，其中R₁、R₅选自在权利要求1～18任一项中限定的促红细胞生成素模拟肽单体肽，

(2)制备通式为(II)的功能小分子

R₇-CO-(CH₂)_n1-Z₂-(CH₂)_n2-CO-R₈

(II)

其中n₁、n₂各自独立地选自0～10的整数；

R₇、R₈选自OH或H；

Z₂选自O、S、CH₂、N(CH₂)_n6NHR₉、NCO(CH₂)_n7NHR₉、CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉、CHSCON(CH₂)_n8NHR₉或CHNHCON(CH₂)_n8NHR₉，其中n₆为选自1～10的整数，n₇ 为选自2～10的整数，n₈为选自2～10的整数，R₉选自Boc或Cbz，

(3)将R₁、R₅与通式为(II)的功能小分子进行酰胺化反应或还原胺化反应，制备得通式(III)化合物，

R₁-R₂-(CH₂)_n1-Z₂-(CH₂)_n2-R₄-R₅

(III)，

其中R₂、R₄各自独立地选自-CO或-CH₂，

(4)脱去Boc或Cbz后，与活性甲氧基聚乙二醇衍生物进行酰胺化反应。

20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于所述的通式(II)中，

n₁、n₂是1或2，R₇、R₈选自OH，Z₂选自NCO(CH₂)_n7NHR₉或CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉，n₇选自2～10的整数，n₈选自2～10的整数，R₉是Boc；或者

n₁、n₂是1或2，R₇、R₈选自H，Z₂选自NCO(CH₂)_n7NHR₉或CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉，n₇选自2～10的整数，n₈选自2～10的整数，R₉是Boc。

21.一种药物组合物，包含：

(1)治疗量的如权利要求1～18任一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐，和

(2)药学可接受的药物载体。

22.根据权利要求1～18中任一项所述的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐在制备用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。

23.根据权利要求21所述的药物组合物在制备用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于所述缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病是末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血。

25.根据权利要求23所述的用途，其特征在于所述缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病是衰老和伴有异常红细胞产生的肿瘤疾病。