HK1136836A - 促血管生成素-2特異性結合劑 - Google Patents

促血管生成素-2特異性結合劑 Download PDF

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Jonathon Oliner Daniel
Graham Kevin
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Amgen Inc.
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促血管生成素-2特异性结合剂
本文是美国专利申请10/269,805(申请于2002年10月10日)的部分继续申请，也是PCT申请PCT/US02/32613(申请于2002年10月11日)的部分继续申请，该PCT申请要求对美国临时专利申请60/328,604(申请于2001年10月11日)享有优先权，全部专利均通过引用并入本文。本文也要求对美国临时专利申请60/620,161(申请于2004年10月19日)享有优先权，该文通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及能识别并结合于促血管生成素-2(Ang-2)的特异性结合剂(binding agent)。更具体来说，本发明涉及能特异性结合于Ang-2的多抗、单抗及其片段的生产及诊断应用和治疗应用。
发明背景
血管生成，即从已有血管形成新血管，是许多生理学过程和病理学过程所必需的。通常，血管生成被促血管生成因子和抗血管生成因子所严格调控，但是在疾病状态下，例如癌症、眼内皮生长因子疾病、关节炎和牛皮癣，这个过程会发生偏差。(Folkman，J.，Nat.Med.，1：27-31(1995))
已知许多疾病与血管生成失控和不希望有的血管生成有关。这些疾病包括但不限于眼新生血管疾病，如视网膜病(包括糖尿病视网膜病)、老年黄斑变性、牛皮癣、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化，炎症如类风湿或风湿性炎症，尤其是关节炎(包括类风湿性关节炎)，或其它慢性炎症如慢性哮喘，动脉硬化或移植后动脉硬化、子宫内膜异位，肿瘤如所谓的实体瘤和液体(或血液)瘤(如白血病和淋巴瘤)。其它与血管生成失控和不希望有的血管生成有关的疾病对本领域技术人员是显而易见的。
虽然血管生成调控涉及到许多信号转导系统，但其中鉴定最多最好的系统之一是内皮细胞选择系统，其包括Tie-2受体酪氨酸激酶(即Tie-2或Tie-2R，或者ORK；鼠Tie-2也被称为tek)及其配体----促血管生成素(Gale，N.W.and Yancopoulos，G.D.，Genes Dev.13：1055-1066(1999))。现在已知有4种促血管生成素：促血管生成素-1(Ang-1)到促血管生成素-4(Ang-4)。这些促血管生成素也被称为“Tie-2配体”。(Davis，S.，等，Cell，87：1161-1169(1996)；Grosios，K.，等，Cytogenet Cell Genet，84：118-120(1999)；Holash，J.，等，InvestigativeOphthalmology&Visual Science，42：1617-1625(1999)；Koblizek，T.I.，等，Current Biology，8：529-532(1998)；Lin，P.，等，Proc Natl Acad SciUSA，95：8829-8834(1998)；Maisonpierre，P.C.，等，Science，277：55-60(1997)；Papapetropoulos，A.，等，Lab Invest，79：213-223(1999)；Sato，T.N.，等，Nature，375：70-74(1998)；Shyu，K.G.，等，Circulation，98：2081-2087(1998)；Suri，C.，等，Cell，87：1171-1180(1996)；Suri，C.，等，Science，282：468-471(1998)；Valenzuela，D.M.，等，Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA，96：1904-1909(1999)；Witzenbichler，B.，等，J Biol Chem，273：18514-18521(1998))。尽管在培养的内皮细胞中Ang-1结合于Tie-上会激发受体磷酸化作用，但已经观察到Ang-2既会激活和也会拮抗Tie-2受体磷酸化作用(Davis，S.，等，(1996)，supra；Maisonpierre，P.C.，等，(1997)，supra；Kim，I.，J.H.Kim，等，Oncogene 19(39)：4549-4552(2000)；Teichert-Kuliszewska，K.，P.C.Maisonpierre，等，Cardiovascular Research 49(3)：659-70(2001))。
敲除掉Tie-2的小鼠和敲除掉Ang-1的小鼠表型相似，这提示由Ang-1激发的Tie-2磷酸化作用通过维持内皮细胞-支撑细胞粘着，介导了胚胎血管的重塑和稳化。(Dumont，D.J.，等，Genes&Development，8：1897-1909(1994)；Sato，T.N.，等，Nature in utero，376：70-74(1995)；Suri，C.，等，(1996)，supra)。Ang-1在血管稳化中的作用被认为可以保持到成年，它被广泛并持续的表达(Hanahan，D.，Science，277：48-50(1997)；Zagzag，D.，等，ExperimentalNeurology，159：391-400(1999))。与之相比，Ang-2的表达主要被限制在血管重塑的位点上，在这里Ang-2被认为阻遏了Ang-1的功能，从而诱导血管的可塑状态，有利于血管生成(Hanahan，D.，(1997)，supra；Holash，J.，等，Science，284：1994-1998(1999)；Maisonpierre，P.C.，等，(1997)，supra)。
许多公开的研究证实了在与血管生成相关的疾病状态下的血管选择性的Ang-2表达。这些病理状况包括如牛皮癣、黄斑变性和癌症(Bunone，G.，等，American Journal of Pathology，155：1967-1976(1999)；Etoh，T.，等，Cancer Research，61：2145-2153(2001)；Hangai，M.，等，Investigative Ophthalmology&VisualScience，42：1617-1625(2001)；Holash，J.，等，(1999)supra；Kuroda，K.，等，Journal ofInvestigative Dermatology，116：713-720(2001)；Otani，A.，等，Investigative Ophthalmology&VisualScience，40：1912-1920(1999)；Stratmann，A.，等，American Journal of Pathology，153：1459-1466(1998)；Tanaka，S.，等，J Clin Invest，103：34-345(1999)；Yoshida，Y.，等，International Journal of Oncology，15：1221-1225(1999)；Yuan，K.，等，Journal of Periodontal Research，35：165-171(2000)；Zagzag，D.，等，(1999)supra)。这些研究中的大多数都把注意力集中在癌症上，许多种肿瘤都显示有血管Ang-2的表达。与其病理性血管生成中的表达相比，正常组织中Ang-2的表达受到极大的限制(Maisonpierre，P.C.，等，(1997)，supra；Mezquita，J.，等，Biochemical and BiophysicalResearch Communications，260：492-498(1999))。正常成人中的三个主要血管生成位置是卵巢、胎盘和子宫；这些位置都是可检测到Ang-2mRNA的正常(即非癌症组织)组织中的主要组织。
某些功能研究提示Ang-2可能涉及到肿瘤的血管生成。Ahmad等人(Cancer Res.，61：1255-1259(2001))描述了异种移植小鼠模型中的Ang-2过量表达，并称它与肿瘤生长提高有关。也参见上文Etoh等人和Tanaka的报道，称Ang-2的过度表达与肿瘤血管增生相关。但是与之相反，Yu等人(Am.J.Path.，158：563-570(2001))报道称在小鼠转染子中，Lewis肺癌和乳腺癌细胞中Ang-2的过度表达延长了小鼠的寿命。
在过去的几年里，多种公开报道已经指出Ang-1、Ang-2和/或Tie-2可能是抗癌治疗的靶点。例如美国专利No.6,166,185，5,650,490，和5,814,464都公开了抗Tie-2配体抗体和受体抗体的概念。Lin等人(Proc.Natl.Acad.Sci USA，95：8829-8834(1998))将表达可溶性Tie-2的腺病毒注射到小鼠体内；称可溶性Tie-2降低了小鼠肿瘤的数目和大小。在一项相关研究中，Lin等人(J.Clin.Invest.，100：2072-2078(1997))将可溶性Tie-2注射到大鼠体内；据称该化合物减小了大鼠体内的肿瘤大小。Siemeister等人(Cancer Res.，59：3185-3189(1999))制得了表达Tie-2胞外结构域的人黑素瘤细胞系，将这种细胞注射到裸鼠体内，并称可溶性Tie-2引起了对肿瘤生长和肿瘤血管生成的“显著抑制”。考虑到这些信息，并且因为Ang-1、Ang-2都结合于Tie-2，从这些研究中并不能清楚了解Ang-1、Ang-2或Tie-2是否可能是具有吸引力的抗癌治疗靶点。
将特定肽融合于稳定的胞质蛋白(如Ig恒定区)上以提高该分子的半衰期，这方面已经有多种方法，见如美国专利5,480,981；Zheng 等，J.Immunol.，154：5590-5600，(1995)；Fisher 等，N.Engl.J.Med.，334：1697-1702，(1996)；Van Zee，K.等，J.Immunol.，156：2221-2230，(1996)；美国专利5,808,029，授权日：1998年9月15日；Capon 等，Nature，337：525-531，(1989)；Harvill 等，Immunotech.，1：95-105，(1995)；WO 97/23614，公开日：1997年7月3日；PCT/US 97/23183，提交日：1997年12月11日；Linsley，J.Exp.Med.，174：561-569，(1991)；WO 95/21258，公开日：1995年8月10日)。
有效的抗Ang-2治疗可能对大量的癌症患者都有利，因为大多数实体瘤都需要新血管生成以生长到大于1-2mm的直径。这种疗法可能在其它血管生成相关疾病也有广泛应用，例如视网膜病、关节炎和牛皮癣。
现在需要有可特异性识别并结合于Ang-2的新型药物来填补空白。这些药物可能在Ang-2活性相关疾病的诊断筛选和治疗中发挥作用。
因此本发明的目的是提供可特异性结合于Ang-2并调节Ang-2活性的Ang-2结合剂。
发明概述
本发明提供了包含重链和轻链的抗体，其中所述重链包含的重链可变区序列选自526HC(SEQ ID NO：1)；528HC(SEQ ID NO：3)；531HC(SEQ ID NO：5)；533HC(SEQ ID NO：7)；535HC(SEQ ID NO：9)；536HC(SEQ ID NO：11)；537HC(SEQ ID NO：13)；540HC(SEQID NO：15)；543HC(SEQ ID NO：17)；544HC(SEQ ID NO：19)；545HC(SEQ ID NO：21)；546HC(SEQ ID NO：23)；551HC(SEQ ID NO：25)；553HC(SEQ ID NO：27)；555HC(SEQ ID NO：29)；558HC(SEQID NO：31)；559HC(SEQ ID NO：33)；565HC(SEQ ID NO：35)；F1-C6HC(SEQ ID NO：37)；FB1-A7HC(SEQ ID NO：39)；FD-B2HC(SEQID NO：41)；FE-B7HC(SEQ ID NO：43)；FJ-G11HC(SEQ ID NO：45)；FK-E3HC(SEQ ID NO：47)；G1D4HC(SEQ ID NO：49)；GC1E8HC(SEQ ID NO：51)；H1C12HC(SEQ ID NO：53)；IA1-1E7HC(SEQID NO：55)；IF-1C10HC(SEQ ID NO：57)；IK-2E2HC(SEQ ID NO：59)；IP-2C11HC(SEQ ID NO：61)，以及这些序列的抗原结合片段。所述轻链包含的轻链可变区选自526κ(SEQ ID NO：2)；536(THW)κ(SEQ ID NO：12)；536(LQT)κ(SEQ ID NO：210)；543κ(SEQ ID NO：18)；544κ(SEQ ID NO：20)；551κ(SEQ ID NO：26)；553κ(SEQ IDNO：28)；555κ(SEQ ID NO：30)；558κ(SEQ ID NO：32)；565κ(SEQID NO：36)；FE-B7κ(SEQ ID NO：44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO：46)；FK-E3κ(SEQ ID NO：48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO：56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO：62)；528λ(SEQ ID NO：4)；531λ(SEQ ID NO：6)；533λ(SEQ ID NO：8)；535λ(SEQ ID NO：10)；537λ(SEQ ID NO：14)；540λ(SEQ ID NO：16)；545λ(SEQ ID NO：22)；546λ(SEQ ID NO：24)；559λ(SEQ ID NO：34)；F1-C6λ(SEQ ID NO：38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO：40)；FD-B2λ(SEQ ID NO：42)；G1D4λ(SEQ ID NO：50)；GC1E8λ(SEQ ID NO：52)；H1C12λ(SEQ ID NO：54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO：58)；IK-2E2λ(SEQ ID NO：60)，以及这些序列的抗原结合片段。
本发明也提供了特异性结合剂，至少包含下列肽的其中之一：SEQID NO：1；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：51；SEQ ID NO：53；SEQ ID NO：55；SEQ ID NO：57；SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：61；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：56；SEQ ID NO：62；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：10；SEQID NO：14；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ IDNO：34；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：50；SEQ ID NO：52；SEQ ID NO：54；SEQ ID NO：58；和SEQ ID NO：60，以及这些序列的片段。
应当认识到所述特异性结合剂可以是如抗体，如多抗、单抗、嵌合抗体、人源化抗体或者完全人类抗体。这种抗体也可以是单链抗体。本发明进一步涉及到产生本发明单抗的杂交瘤。
本发明还涉及到编码特异性结合剂(如抗体)的核酸分子，也涉及到含有这些核酸分子的载体和含有这些载体的宿主细胞。
另外，本发明也提供了制备特异性结合剂的方法，步骤包括(a)用至少一种编码权利要求1特异性结合剂的核酸分子转化宿主细胞；(b)在所述宿主细胞中表达该核酸分子；和(c)分离所述特异性结合剂。本发明还提供了制备抗体的方法，步骤包括：(a)用至少一种编码本发明抗体的核酸分子转化宿主细胞；(b)在所述宿主细胞中表达该核酸分子；和(c)分离所述特异性结合剂。
另外本发明也涉及到通过给予治疗有效剂量的本发明特异性结合剂，来抑制哺乳动物的不希望有的血管生成的方法。本发明也提供了通过给予治疗剂量的本发明特异性结合剂，来治疗哺乳动物癌症的方法。
本发明还涉及到通过给予治疗有效剂量的本发明抗体，来抑制哺乳动物的不希望有的血管生成的方法。本发明也提供了通过给予治疗剂量的本发明抗体，来治疗哺乳动物癌症的方法。
应当理解本发明也涉及到包含有本发明特异性结合剂和药学上可接受的赋形剂(formulation agent)的药用组合物。该药用组合物可包含本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂。
本发明提供了通过给予一种或多种本发明所述特异性结合剂来调节或抑制促血管生成素-2活性的方法。本发明也提供了通过给予本发明所述抗体来调节或抑制促血管生成素-2的方法。
本发明也涉及在哺乳动物体内至少调节血管渗透性和血浆渗漏二者之一的方法，步骤包括给予治疗有效量的本发明所述特异性结合剂。本发明也涉及到对以下哺乳动物疾病的至少一种进行治疗的方法：眼新生血管疾病、肥胖症、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病、炎症、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、肿瘤、骨相关病或牛皮癣，步骤包括给予治疗有效量的本发明所述特异性结合剂。
本发明也涉及到在哺乳动物体内至少调节血管渗透性和血浆渗漏二者之一的方法，步骤包括给予治疗有效量的本发明所述抗体。本发明也涉及到对以下哺乳动物疾病的至少一种进行治疗的方法：眼新生血管疾病、肥胖症、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病、炎症、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、肿瘤、骨相关病或牛皮癣，步骤包括给予治疗有效量的本发明所述抗体。
另外本发明也涉及到治疗哺乳动物癌症的方法，步骤包括给予治疗有效量的本发明所述特异性结合剂和化疗药物。本领域技术人员应当理解所述特异性结合剂和化疗药物并不需要同时给予。
本发明也涉及到治疗哺乳动物癌症的方法，步骤包括给予治疗有效量的本发明所述抗体和化疗药物。所述抗体和化疗药物并不需要同时给予。
本发明也提供包含以下序列中任一项的互补决定区1(CDR1)的特异性结合剂：526HC(SEQ ID NO：1)；528HC(SEQ ID NO：3)；531HC(SEQ ID NO：5)；533HC(SEQ ID NO：7)；535HC(SEQ ID NO：9)；536HC(SEQ ID NO：11)；537HC(SEQ ID NO：13)；540HC(SEQ IDNO：15)；543HC(SEQ ID NO：17)；544HC(SEQ ID NO：19)；545HC(SEQ ID NO：21)；546HC(SEQ ID NO：23)；551HC(SEQ ID NO：25)；553HC(SEQ ID NO：27)；555HC(SEQ ID NO：29)；558HC(SEQID NO：31)；559HC(SEQ ID NO：33)；565HC(SEQ ID NO：35)；F1-C6HC(SEQ ID NO：37)；FB1-A7HC(SEQ ID NO：39)；FD-B2HC(SEQID NO：41)；FE-B7HC(SEQ ID NO：43)；FJ-G11HC(SEQ ID NO：45)；FK-E3HC(SEQ ID NO：47)；G1D4HC(SEQ ID NO：49)；GC1E8HC(SEQ ID NO：51)；H1C12HC(SEQ ID NO：53)；IA1-1E7HC(SEQID NO：55)；IF-1C10HC(SEQ ID NO：57)；IK-2E2HC(SEQ ID NO：59)；IP-2C11HC(SEQ ID NO：61)；526κ(SEQ ID NO：2)；536(THW)κ(SEQ ID NO：12)；536(LQT)κ(SEQ ID NO：210)；543κ(SEQ IDNO：18)；544κ(SEQ ID NO：20)；551κ(SEQ ID NO：26)；553κ(SEQID NO：28)；555κ(SEQ ID NO：30)；558κ(SEQ ID NO：32)；565κ(SEQ ID NO：36)；FE-B7κ(SEQ ID NO：44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO：46)；FK-E3κ(SEQ ID NO：48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO：56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO：62)；528λ(SEQ ID NO：4)；531λ(SEQ ID NO：6)；533λ(SEQ ID NO：8)；535λ(SEQ ID NO：10)；537λ(SEQ ID NO：14)；540λ(SEQ ID NO：16)；545λ(SEQ ID NO：22)；546λ(SEQ ID NO：24)；559λ(SEQ ID NO：34)；F1-C6λ(SEQ ID NO：38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO：40)；FD-B2λ(SEQ ID NO：42)；G1D4λ(SEQ ID NO：50)；GC1E8λ(SEQ ID NO：52)；H1C12λ(SEQ ID NO：54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO：58)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO：60)。
本发明也提供包含以下序列中任一项的互补决定区2(CDR2)的特异性结合剂：526HC(SEQ ID NO：1)；528HC(SEQ ID NO：3)；531HC(SEQ ID NO：5)；533HC(SEQ ID NO：7)；535HC(SEQ ID NO：9)；536HC(SEQ ID NO：11)；537HC(SEQ ID NO：13)；540HC(SEQ IDNO：15)；543HC(SEQ ID NO：17)；544HC(SEQ ID NO：19)；545HC(SEQ ID NO：21)；546HC(SEQ ID NO：23)；551HC(SEQ ID NO：25)；553HC(SEQ ID NO：27)；555HC(SEQ ID NO：29)；558HC(SEQID NO：31)；559HC(SEQ ID NO：33)；565HC(SEQ ID NO：35)；F1-C6HC(SEQ ID NO：37)；FB1-A7HC(SEQ ID NO：39)；FD-B2HC(SEQID NO：41)；FE-B7HC(SEQ ID NO：43)；FJ-G11HC(SEQ ID NO：45)；FK-E3HC(SEQ ID NO：47)；G1D4HC(SEQ ID NO：49)；GC1E8HC(SEQ ID NO：51)；H1C12HC(SEQ ID NO：53)；IA1-1E7HC(SEQID NO：55)；IF-1C10HC(SEQ ID NO：57)；IK-2E2HC(SEQ ID NO：59)；IP-2C11HC(SEQ ID NO：61)；526κ(SEQ ID NO：2)；536(THW)κ(SEQ ID NO：12)；536(LQT)κ(SEQ ID NO：210)；543κ(SEQ IDNO：18)；544κ(SEQ ID NO：20)；551κ(SEQ ID NO：26)；553κ(SEQID NO：28)；555κ(SEQ ID NO：30)；558κ(SEQ ID NO：32)；565κ(SEQ ID NO：36)；FE-B7κ(SEQ ID NO：44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO：46)；FK-E3κ(SEQ ID NO：48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO：56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO：62)；528λ(SEQ ID NO：4)；531λ(SEQ ID NO：6)；533λ(SEQ ID NO：8)；535λ(SEQ ID NO：10)；537λ(SEQ ID NO：14)；540λ(SEQ ID NO：16)；545λ(SEQ ID NO：22)；546λ(SEQ ID NO：24)；559λ(SEQ ID NO：34)；F1-C6λ(SEQ ID NO：38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO：40)；FD-B2λ(SEQ ID NO：42)；G1D4λ(SEQ ID NO：50)；GC1E8λ(SEQ ID NO：52)；H1C12λ(SEQ ID NO：54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO：58)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO：60)。
本发明也提供包含以下序列中任一项的互补决定区3(CDR3)的特异性结合剂：526HC(SEQ ID NO：1)；528HC(SEQ ID NO：3)；531HC(SEQ ID NO：5)；533HC(SEQ ID NO：7)；535HC(SEQ ID NO：9)；536HC(SEQ ID NO：11)；537HC(SEQ ID NO：13)；540HC(SEQ IDNO：15)；543HC(SEQ ID NO：17)；544HC(SEQ ID NO：19)；545HC(SEQ ID NO：21)；546HC(SEQ ID NO：23)；551HC(SEQ ID NO：25)；553HC(SEQ ID NO：27)；555HC(SEQ ID NO：29)；558HC(SEQID NO：31)；559HC(SEQ ID NO：33)；565HC(SEQ ID NO：35)；F1-C6HC(SEQ ID NO：37)；FB1-A7HC(SEQ ID NO：39)；FD-B2HC(SEQID NO：41)；FE-B7HC(SEQ ID NO：43)；FJ-G11HC(SEQ ID NO：45)；FK-E3HC(SEQ ID NO：47)；G1D4HC(SEQ ID NO：49)；GC1E8HC(SEQ ID NO：51)；H1C12HC(SEQ ID NO：53)；IA1-1E7HC(SEQID NO：55)；IF-1C10HC(SEQ ID NO：57)；IK-2E2HC(SEQ ID NO：59)；IP-2C11HC(SEQ ID NO：61)；526κ(SEQ ID NO：2)；536(THW)κ(SEQ ID NO：12)；536(LQT)κ(SEQ ID NO：210)543κ(SEQ IDNO：18)；544κ(SEQ ID NO：20)；551κ(SEQ ID NO：26)；553κ(SEQID NO：28)；555κ(SEQ ID NO：30)；558κ(SEQ ID NO：32)；565κ(SEQ ID NO：36)；FE-B7κ(SEQ ID NO：44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO：46)；FK-E3κ(SEQ ID NO：48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO：56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO：62)；528λ(SEQ ID NO：4)；531λ(SEQ ID NO：6)；533λ(SEQ ID NO：8)；535λ(SEQ ID NO：10)；537λ(SEQ ID NO：14)；540λ(SEQ ID NO：16)；545λ(SEQ ID NO：22)；546λ(SEQ ID NO：24)；559λ(SEQ ID NO：34)；F1-C6λ(SEQ ID NO：38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO：40)；FD-B2λ(SEQ ID NO：42)；G1D4λ(SEQ ID NO：50)；GC1E8λ(SEQ ID NO：52)；H1C12λ(SEQ ID NO：54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO：58)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO：60)。
本发明也提供了编码本发明所述特异性结合剂的核酸分子。
而且，本发明也涉及到检测生物样本中促血管生成素-2的方法，步骤包括(a)使本发明的特异性结合剂与生物样本相接触；和(b)确定该特异性结合剂与该样本的结合程度。本发明也涉及到检测生物样本中促血管生成素-2的方法，步骤包括(a)用本发明的抗体与生物样本相接触；和(b)确定该抗体与该样本的结合程度。
本发明也涉及到抑制哺乳动物体内不希望有的血管生成的方法，步骤包括给予治疗有效量的本文所述多肽或组合物。本发明也涉及到调节哺乳动物体内血管生成的方法，步骤包括给予治疗有效量的本文所述多肽或组合物。本发明也涉及到抑制哺乳动物体内特征为不希望有的血管生成的肿瘤的方法，步骤包括给予治疗有效量的本文所述多肽或组合物。另外，本发明也涉及到治疗哺乳动物癌症的方法，步骤包括给予治疗有效量的本文所述多肽或组合物，以及化疗药物。在一个优选的实施方案中，化疗药物至少包括5-Fu、CPT-11和泰索帝(Taxotere)。当然也可使用其它合适的化疗药物和其它癌症疗法。
当然本发明的特异性结合剂可用来治疗多种与血管生成失调或与不希望有的血管生成相关的疾病。这些疾病包括(但不仅限于)眼新生血管如视网膜病(包括糖尿病视网膜病)，牛皮癣，成血管细胞瘤，血管瘤，动脉硬化，炎症如风湿症或风湿性炎症，尤其是关节炎(包括风湿性关节炎)，或其它慢性炎症如慢性哮喘，动脉硬化或移植后动脉硬化，子宫内膜异位，肿瘤如所谓的实体瘤和液体瘤(如白血病)。本领域技术人员将明了其它可通过给予本发明的特异性结合剂来进行治疗的疾病。这些疾病包括(但不仅限于)肥胖症、血管通透性疾病、血浆渗漏、骨相关病包括骨质疏松。因此本发明也涉及到治疗这些与血管生成失调或与不希望有的血管生成相关的疾病的方法。
通过本文的阐述将会很容易理解本发明的其它实施方案。
附图简述
图1为肿瘤大小(Y轴)对时间(X轴)作图，其中小鼠体内的肿瘤用本发明的抗Ang-2抗体(533、537或544克隆)、对照抗体或磷酸盐缓冲液(PBS)进行处理。细节描述见实施例部分。
图2A、2B和2C为本发明肽体(peptibody)TN8-Con4-C、L1-7-N和12-9-3-C，以及对照肽体、Tie2-Fc、C2B8或5B12分别与全长人Ang-2(hAng-2)、hAng-2的N-末端、hAng-2的C-末端结合的表位作图数据(O.D.370)。详见实施例。
发明详述
本节中所用标题目的仅为组织行文，而不是对相关内容进行任何限定。
可使用标准方法来进行重组DNA、重组蛋白、制备抗体、组织培养和细胞转化的操作。酶促反应和纯化方法主要根据产品使用说明书进行，或者根据本领域常规方法进行，例如文献Sambrook等(分子克隆：实验指南，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))中所列的方法，或者根据本文中所列方法进行。如果没有特别指明，本文中的相关术语、分析化学实验方法和技术、有机合成和医药化学相关内容均为相关领域中熟知和常用内容。可使用标准方法来进行化学合成、化学分析、药物的制备、制剂和给予，以及治疗患者。
定义
如果没有特别指明，当以下概念在本文中使用时，含义均遵照下文所述：
“Ang-2”指美国专利No.6,166,185图6中所列多肽(“Tie-2配体-2”)或者其片段，也指相关多肽包括等位基因变异体、接合变异体、衍生物、取代/删除和/或插入变异体、融合肽和多肽，以及中间同源体。根据制备方法不同，所述Ang-2多肽可以包括或不包括附加末端残基，如前导序列、导向序列、靶向序列、氨基末端蛋氨酸、氨基末端蛋氨酸和赖氨酸残基，和/或标签或融合蛋白序列。
当“生物活性”用来指Ang-2或Ang-2特异性结合剂时，意为具有至少一种Ang-2或Ang-2特异性结合剂特征活性的肽或多肽。当提到Ang-2的至少一种生物活性时，Ang-2特异性结合剂可具有激动剂、拮抗剂、中和或阻遏活性。
“特异性结合剂”指一个分子，优选是蛋白分子，它结合于Ang-2(以及本文定义的其变异体和衍生物)并且亲和力远高于对其它促血管生成素的亲和力。特异性结合剂可以是蛋白、肽、核酸、糖、脂类，或者是可优先结合于Ang-2的小分子化合物。在一个优选的实施方案中，本发明的特异性结合剂为抗体，例如单抗、多抗(mAb)、嵌合抗体、CDR-移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化抗体、人源化抗体、人抗体、抗独特型抗体(anti-Id)，和可以可溶形式或固定形式被标记的抗体，以及上述分子的片段、变异体或衍生物，它们可以单独使用也可以与其它氨基酸序列联合使用，只要技术已知。这些技术包括(但不仅限于)酶裂解、化学裂解、肽合成或重组技术。本发明的抗Ang-2特异性结合剂能够结合于Ang-2上可调节(如抑制或促进)Ang-2生物活性和/或其它Ang-2相关活性的部分。
“多抗”指异种抗体的混合物，它能识别并结合于同一抗原的不同表位上。可从天然血清制备物得到多抗，或者使用如抗原亲和层析或A蛋白/G蛋白亲和层析的方法来纯化得到多抗。
“单抗”指由同一核酸分子编码的抗体的集合，该核酸任选由单杂交瘤或其它细胞系或转基因动物产生，这样每种单抗将典型识别抗原上的同一表位。这里“单抗”可得自多种不同方法和多种不同动物，如小鼠、大鼠等。
“嵌合抗体”指一个抗体中重链和/或轻链的一部分，与某一种动物来源抗体或某一种类(或亚种)抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与另一种动物来源抗体或另一种类(或亚种)抗体的相应序列相同或同源。同时也包括这种抗体的片段，它具有所需的生物活性(即特异性结合Ang-2的能力)。参见美国专利No.4,816,567和Morrison 等，Proc Natl Acad Sci(USA)，81：6851-6855(1985)。
“CDR抑制抗体”指某一种类或同型抗体的CDR被重组插入到另一相同或不同种类(或同型抗体)抗体的架构区中。
“多特异性抗体”指抗体的可变区可识别一种或多种抗原上的多个表位。这种抗体的一个亚种是“双特异性抗体”，它识别同一抗原或不同抗原上的两种不同表位。
“催化抗体”指一种具毒性或催化活性的抗体，其中在靶结合剂上连接一个或多个细胞毒素基团或者(更常见)一个或多个生物活性基团。
“人源化抗体”指一类特殊的CDR移植抗体，其中的架构区来源于人，但每个CDR都被其它来源CDR所替换，如鼠CDR。“CDR”在下文定义。
“完全人类”抗体指一个抗体的CDR和架构区都来自一种或多种人DNA分子。
“抗独特型抗体”指任何能够结合于其它可识别抗原的抗体的抗体。可使用本文所述的任何Ang-2特异性结合抗体制备方法来制备抗独特型抗体，以下情况除外：通过使用Ang-2特异性抗体或其Ang-2结合片段免疫动物(而不是使用Ang-2多肽本身或其片段)来得到的这些抗体。
本文所用的“变异体”包括在天然存在(或至少在已知)氨基酸序列上发生残基插入、删除和/或替换的结合剂多肽。本发明的变异体包括下文描述的融合蛋白。
“衍生物”包括那些进行了化学修饰的结合剂，这些修饰方法与插入、删除或替换的变异体不同。
“特异性结合于Ang-2”指本发明的特异性结合剂(例如抗体或其片段)识别并结合于成熟全长(或部分长度)的人Ang-2多肽(或其直系同源物)的能力，其亲和力(通过如本文所述的Affinity ELISA orBIAcore检测所确定)或其中和能力(通过如本文所述的中和ELISA或类似方法所确定)是对其它血管生成蛋白或其它肽(多肽)相应作用的至少10倍，或任选为50倍、100倍、250倍、500倍，或至少为1000倍。
“抗原结合结构域”或“抗原结合区”指特异性结合剂的一部分：它包含了与抗原相互作用的氨基酸残基(或其它基团)并赋予结合剂以对抗原的特异性和亲和力。在抗体中抗原结合剂结构域通常指“互补决定区”或“CDR”。
“表位”指任意分子中能够被特异性结合剂(如抗体)在一个或多个结合剂抗原结合区上所识别并结合的部分。表位通常由分子的化学活性表面基团所组成，例如氨基酸或糖基侧链，表位具有特异的三维结构特征和特异的电荷特征。本文所指的表位可以为连续的或不连续的。而且由于具有与用来产生抗体的表位相同的三维结构，可以模拟表位，模拟表位中不含有(或仅含一些)用来引发抗体免疫反应的Ang-2的氨基酸残基。
“抑制和/或中和表位”的特征为：在体内、体外或原位被特异性结合剂(如抗体)结合上时，能引起包含该表位的分子、细胞或生物体的生物活性发生丧失(或至少降低)。本文中，中和表位定位在Ang-2的生物活性区内，或者与该区相连。或者，“活化表位”指这样一种表位：被本发明的特异性结合剂(如抗体)结合上时，能活化Ang-2，或至少维持Ang-2的生物活性构象。
“抗体片段”指包含完整抗体部分序列的肽或多肽。完整抗体包含两个功能独立的部分或片段：抗原结合片段“Fab”和C-末端可结晶片段---″Fc″片段。Fab片段包括重链和轻链的第一恒定区(CH1和CL1)，以及重链和轻链的可变区(与特异性抗原结合)。重链和轻链的可变区都包含三个互补决定区(CDR)和分开单个CDR的架构区氨基酸残基。Fc区包括重链的第二和第三恒定区(CH2和CH3)，它涉及到效应器功能，如互补活化和噬菌细胞的攻击。一些抗体中Fc和Fab区被抗体“铰链区”所隔开，根据全长抗体被如何酶解分裂，铰链区可连接到Fab或Fc片段上。例如用木瓜蛋白酶裂解抗体会使铰链区连接在所得Fc片段上，而用胃蛋白酶裂解则所得片段中铰链同时连接在两个Fab上。因为在胃蛋白酶裂解后两个Fab片段实际上共价连接在一起，所得片段被命名为F(ab’)2片段。
Fc结构域具有相对长的血清半衰期，而Fab寿命较短。(Capon 等，Nature，337：525-31(1989))。当作为融合蛋白的一部分被表达时，Fc结构域可赋予所融合蛋白更长的寿命，或者使融合蛋白具有如Fc受体结合、A蛋白结合、补体结合(complement fixation)、甚至可能是胎盘转移(placental transfer)的功能。所述Fc区域可以是天然Fc区域，也可以是某些特性被修饰或改善后的Fc，例如治疗特性或循环时间。
“可变区”或“可变结构域”指抗体轻链和/或重链的一部分，典型包括重链氨基末端的约120-130个氨基酸残基，和轻链氨基末端约100-110个氨基酸残基。即使同类抗体的可变区在氨基酸序列上也有很大不同。抗体的可变区决定了每个特定抗体对其特定抗原的结合特性和特异性。序列的可变性集中在互补决定区(CDR)内，而可变结构域中的高度保守区域则被称作架构区(FR)。轻链和重链的CDR区内包含了对抗体与抗原直接相互作用起主要作用的氨基酸，不过FR区内的氨基酸也可对抗原结合/识别发生显著影响，如下文所述。
抗体的“轻链”是两个不同类型轻链的统称，根据恒定区氨基酸序列分别称作κ(k)或λ(l)。
抗体的“重链”是5个不同类型重链的统称，根据重链恒定区氨基酸序列分别称作α、δ、ε、γ和μ。已知重链和轻链的组合形成5种抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，IgG包含4个亚种，称作IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
当用“天然存在”来形容生物材料(例如核酸分子、多肽、宿主细胞等)时，指这些材料都是天然形式而未经人工修饰。
当用“分离的”修饰Ang-2或其特异性结合剂时，指一种物质至少不含有一种在其天然环境中所发现的污染多肽或污染化合物，优选实质上不含有任何其它可能干扰该物质治疗或诊断用途的污染哺乳动物多肽。
当用“成熟”形容Ang-2、抗Ang-2抗体或任何其它Ang-2的特异性结合蛋白分子时，指肽或多肽没有前导或信号序列。当本发明的结合剂被表达时(例如在原核宿主细胞中)，“成熟”肽或多肽也可包含附加氨基酸残基(但仍没有前导序列)，例如氨基末端蛋氨酸，或一个或多个蛋氨酸和赖氨酸残疾。以这种方式制备的肽或多肽在使用时，可包含或不含这些已被去掉的氨基酸残基。
当用“有效剂量”或“治疗有效量”形容Ang-2的特异性结合剂时，指特异性结合剂的量可有效或足以支持使Ang-2的一种或多种生物活性水平发生可测性改变。这种Ang-2的生物活性水平改变可以是增强也可以是减弱。优选的，这种改变是Ang-2活性的减弱。
特异性结合剂和抗体
本文所用的“特异性结合剂”指可特异识别并结合所述Ang-2的分子。合适的特异性结合剂包括(但不仅限于)抗体及其衍生物、多肽和小分子。合适的特异性结合剂可使用本领域已知方法进行制备。本发明的多肽Ang-2特异性结合剂能够结合于Ang-2多肽的特定部分上，并优选可调节Ang-2多肽的活性或功能。
特异性结合剂例如可特异性结合于Ang-2多肽的抗体和抗体片段包含在本发明的范围之内。所述抗体可以是多抗包括单特异性多抗，单抗(mAb)、重组体、嵌合抗体、人源化抗体例如CDR移植抗体、人抗体、单链抗体、催化抗体、多特异性抗体和/或双特异性抗体以及它们的片段，还包括它们的变异体和/或衍生物。
通常多次皮下或腹膜内向动物(如兔、仓鼠、山羊、绵羊、马、猪、大鼠、沙鼠、豚鼠、小鼠，或其它任何合适的哺乳动物，和其它非哺乳动物)注射Ang-2多肽或其片段(使用或不使用佐剂)，来制备针对Ang-2的多抗。所述佐剂包括(但不仅限于)弗氏完全/不完全佐剂、矿物胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳液(oil emulsions)、匙孔血蓝蛋白和二硝基酚。BCG(卡介苗)和厌氧棒状杆菌特别适用于人体佐剂。在抗原上偶联一个载体蛋白，而该载体蛋白对待免疫动物具有免疫原性，这可能是有效方法，这种载体蛋白例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺蛋白、大豆胰岛素抑制剂。也可使用絮凝剂(aggregating agents)如明矾来提高免疫反应。免疫后取动物血液，并对血清进行抗Ang-2多肽抗体滴度测试，可使用“实施例”一节中所描述的方法。可将多抗与在其中检测到该多抗的血清联用，或者可使用抗原亲和层析或蛋白A或G亲和层析等方法从血清中纯化多抗。
可使用如(但不仅限于)传统的杂交瘤方法或更新的噬菌体展示技术来制备针对Ang-2多肽的单抗。例如可参照文献Kohler 等.，Nature256：495(1975)；Kosbor 等.，Immunol Today 4：72(1983)(人B细胞杂交瘤技术)；Cote 等，Proc Natl Acad Sci(USA)80：2026-2030(1983)；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987))和Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss Inc，NewYork N.Y.，pp 77-96，(1985)(EBV杂交瘤技术)。本发明也提供了可产生具有Ang-2多肽反应活性的单抗的杂交瘤细胞系。
可在杂交瘤技术中使用骨髓瘤细胞系。这种细胞系不产生抗体，具有高融合效率，并且缺乏一些酶，使得它不能在某些选择性培养基中生长(只有所需的融合细胞(杂交瘤)才能够生长)，因而适合用在杂交瘤融合方法中。例如在小鼠融合操作中使用的细胞系为Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/u、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；在大鼠融合操作中使用的细胞系为R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。其它在细胞融合中使用的细胞系为U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。杂交瘤和其它能够产生单抗的细胞系就是本发明所考虑的新型组合物。
也可使用噬菌体展示技术来制备任意种类的单抗。优选使用该技术来制备完全人类单抗，其中在噬菌体颗粒表面上使编码单Fab或Fv抗体片段的多核苷酸进行表达。(Hoogenboom 等，J Mol Biol 227：381(1991)；Marks 等，J Mol Biol 222：581(1991)；也参见美国专利No.5,885,793))。可使用本文描述的结合实验来对每个噬菌体进行“筛选”，以鉴别出具有Ang-2亲和作用的抗体片段。因此，通过将抗体片段库展示在噬菌体丝状(filamentous)表面上，并随后根据对Ang-2的结合作用对噬菌体加以选择，这些方法模拟了免疫选择作用。在PCT申请No.PCT/US98/17364(申请人Adams等)中即描述了一种这样的方法，文中通过这样的途径为MPL和msk受体纯化了具有高亲和力和拮抗功能的抗体片段。在这种方法中，可按上文所述从外周血淋巴细胞中克隆出天然重排的人类V基因，以此制备人类抗体基因的完整文库(Mullinax 等，Proc Natl Acad Sci(USA)87：8095-8099(1990))。
一旦鉴别出某多核苷酸序列编码了本发明全长单抗的每条链(或编码了单抗的Fab或Fv片段)，即可按照本领域熟知并常规进行的重组技术，使用真核或原核宿主细胞来表达单抗多核苷酸。或者可将编码特异性结合剂的多核苷酸，以允许编码单抗或其它特异性结合剂的多核苷酸得以表达的方式，导入受体动物的基因组中来构建转基因动物，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、或母牛。一方面可将编码单抗或其它特异性结合剂的多核苷酸连接到乳腺特异性调控序列上，并可将嵌合多核苷酸给予目标动物的种系。所得转基因动物即可在其奶中产生所需抗体(Pollock 等，J Immunol Meth 231：147-157(1999)；Little 等，Immunol Today 8：364-370(2000))。另外，也可通过使用合适的编码单抗或其它特异性结合剂的多核苷酸来转染植物，使植物表达并产生Ang-2特异性结合剂(例如多抗)。
在本发明的另一实施方案中，非人类来源的单抗或多抗(或它们的片段)可以被“人源化”或“嵌合”。对非人类来源抗体进行人源化的操作方法在本领域中是熟知的。(见美国专利No.5,859,205，5,585,089，和5,693,762)。可使用如本领域文献(Jones 等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann 等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))所述的方法，通过至少将部分互补决定区(如啮齿类动物)用人类抗体的相应区域加以替换。本文也提供了这些人类抗体的变异体和衍生物，如文中讨论(并且在本领域中所熟知)。
本发明也涉及到可结合Ang-2多肽的完全人类抗体，及其片段、变异体和/或衍生物。可使用上文所述的噬菌体展示技术来制备这些抗体。或者可使用转基因动物(如小鼠)来产生这些抗体，前提是这种转基因动物在无内生性免疫球蛋白产生时能够生成人类抗体库。这可通过使用Ang-2抗原或其片段(当Ang-2片段含有Ang-2的独特氨基酸序列时)来免疫动物而实现。这些免疫原可任选与载体偶联。参见如Jakobovits 等，Proc Natl Acad Sci(USA)，90：2551-2555(1993)；Jakobovits 等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann 等，Year inImmuno，7：33(1993)。在一种制备转基因动物的方法中，使该动物的内生性免疫原重链和轻链编码基因座失活，然后在该动物的基因组中插入人类重链和轻链蛋白的编码基因座。部分修饰动物是那些没有进行完全这些修饰的动物，对其进行杂交以获得包含全部所需免疫系统修饰的动物。当给予免疫原时，这些转基因动物能够产生含有人类可变区域的抗体，这些抗体包含人类(而非如鼠类)氨基酸序列，具有对所需抗原的免疫特异性。参见PCT申请PCT/US96/05928和PCT/US93/06926。其它方法见美国专利5,545,807、PCT申请No.PCT/US91/245、PCT/GB89/01207、EP 546073B1和EP 546073A1。也可通过在宿主细胞或杂交瘤中表达重组DNA来产生人类抗体，如文中所述。
可通过多种不同方法完成转基因操作。参见如Bruggeman 等，Immunol Today 17：391-7(1996)。在一种方法中，构建微小基因座以通过人工方式使得种系构造中的基因片段互相靠近。由于长度有限(即通常小于30kb)，所得微基因座所含的不同基因片段数目有限，但仍能够产生一个大抗体库。微基因座仅含有人类DNA序列(包括启动子和增强子)，在转基因动物体内具有完整功能。
当需要在转基因动物体内含有大量基因片段时，可使用酵母人工染色体(YAC)。YAC长度从几百kb到1Mb不等，通过直接微注射入卵子导入小鼠体内(或其它合适的动物)，或者将YAC转移到胚胎干细胞系内。通常使用纯化DNA进行脂转染将YAC给予ES细胞，或者通过酵母原生质体融合进行，这时纯化DNA被小鼠细胞所携带，融合方法类似于杂交瘤融合法。DNA转移之后的所需ES细胞选择可通过YAC上本领域已知的任何选择性标记来进行。
另一可选方法是，在大肠杆菌宿主中扩增P1噬菌体载体。由于这些载体所携带的DNA通常小于YAC内插入的DNA，因此可更容易的得到足够量的克隆，以对小鼠卵子进行直接微注射。已表明，混合使用多种P1载体将得到更高水平的同源重组。
使用本领域已知的任何方法(如ELISA)检测循环抗体的血清水平，一旦鉴别出合适的转基因小鼠(或其它合适的动物)，使该转基因动物与内生性Ig基因座被破坏的小鼠进行杂交。所得后代的所有B细胞基本上都表达人类抗体。
另一可选方法是，使用人类Ig基因座替换动物的整个基因座，所得动物仅表达人类抗体。在另一方法中，所述动物的部分基因座被相应的特异性人类基因座所取代。在一些情况下，根据小鼠Ig基因座的替换特征不同，这种方法所得动物可以表达嵌合抗体(与完全人类抗体相对)。
也可在体外将人脾细胞(B或T细胞)暴露于抗原下，然后在免疫减弱小鼠(如SCID或nod/SCID)体内重建暴露细胞来制备人类抗体。见Brams 等，J Immunol，160：2051-2058(1998)；Carballido 等，NatMed，6：103-106(2000)。在一种方法中，将人类胚胎细胞给予SCID小鼠(SCID-hu)中，会引起长效造血作用和人类T细胞发展(McCune等，Science 241：1532-1639(1988)；Ifversen 等，Sem Immunol 8：243-248(1996))。这些嵌合动物体内的任何体液免疫反应都完全依赖于T细胞的协同发展(Martensson 等，Immunol 83：1271-179(1994))。在另一可选方法中，将人类外周血淋巴细胞腹(膜)腔内(或其它方式)给予SCID小鼠体内(Mosier 等，Nature 335：256-259(1988))。当导入的细胞被中性球致活物(例如葡萄球菌肠毒素A(SEA))处理(Martensson等，Immunol 84：224-230(1995))，或被抗人CD40单抗处理时(Murphy等，Blood 86：1946-1953(1995))，可以检测到更高水平的B细胞。
另一可选方法是，通过将每个人VH片段与随机核苷酸的D片段以及人J片段组合起来，从未重排V基因中制备完全合成的人类重链库(Hoogenboom 等，JMol Biol 227：381-388(1992))。同样将每个人V片段与J片段组合起来制备轻链库(Griffiths 等，EMBO J 13：3245-3260(1994))。将编码完整抗体(即重链和轻链)的核苷酸与单链Fv片段连接，再将此多核苷酸与编码丝状噬菌体微包被蛋白的核苷酸相连接。当此融合蛋白在该噬菌体表面被表达时，即使用固定抗原进行选择以鉴别编码同样小抗体的多核苷酸。
在另一可选方法中，通过将一条链融合于噬菌体蛋白，而另一条被分泌到细菌周质中，抗体片段被组装成两个Fab片段(Hoogenboom等，NuclAcids Res 19：4133-4137(1991)；Barbas 等，Proc NatlAcadSci(USA)88：7978-7982(1991))。
大量生产嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体和完全人类抗体(或它们的片段)的典型方法是重组技术。可使用本文所述的材料和方法，将编码每种抗体重链和轻链(或它们的片段)的多核苷酸分子导入到宿主细胞中并进行表达。在一个优选的实施方案中，在哺乳动物宿主细胞中生产抗体，例如CHO细胞。此法细节将在下文描述。
特异性结合剂的融合对象
在本发明的另一实施方案中，可将含有Ang-2抗体可变区(例如具有本文所述氨基酸序列的重链可变区或具有本文所述氨基酸序列的轻链可变区)氨基酸序列的多肽融合于人IgG Fc区域的一个或多个结构域中(N端或C端)。当与治疗蛋白(例如Ang-2特异性抗体的Fab)共同形成构建体时，Fc结构域可使融合蛋白具有更长的寿命，或者向融合蛋白提供诸如Fc受体结合、蛋白A结合、补体结合，甚至可能是胎盘转运的功能。(Capon 等，Nature，337：525-531(1989))。
在一个实例中，可使用本领域已知方法将抗体铰链区、CH2和CH3区域融合于特异性结合剂多肽(如从噬菌体展示文库所获得的抗Ang-2Fab或Fv片段)的N末端或C末端。可使用A蛋白或G蛋白亲和层析柱来纯化所得的融合蛋白。已经发现融合于Fc区域的肽和蛋白在体内比未融合的相同分子具有更足够长的寿命。融合于Fc区域也允许融合多肽发生二聚化/多聚化作用。所述Fc区域可以是天然Fc区域，或者可被修饰以改善某些性质，例如治疗特性、循环时间、减少聚集问题等。本领域已知的其它例子包括，将Fc区域(可以为人类或其它种类来源，或者为合成)融合于CD30L的N末端以治疗Hodgkin′s症、退行发育性淋巴瘤和T-cell白血病(美国专利No.5,480,981)，将Fc区域融合于TNF受体，以治疗感染性休克(Fisher等，N EnglJ Med，334：1697-1702(1996))，将Fc区域融合于Cd4受体，以治疗AIDS(Capon 等，Nature，337：525-31(1989))。
催化抗体是另一种融合分子，在特异性结合剂(抗体)上连接一个或多个细胞毒素基团或者(更常见)一个或多个生物活性基团。参见如(Rader 等，Chem Eur J 12：2091-2095(2000))。这种类型的细胞毒性剂可提高抗体介导的细胞毒性，并包含这类直接或间接引起细胞死亡的细胞因子、放射性同位素、化疗药物(包括前药)、细菌毒素(如假单胞菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(如蓖麻毒素、多花白树毒蛋白等)、化学缀合物(conjugates)(如maytansinoid毒素、calechaemicin等)、放射缀合物(conjugates)、酶耦合物(enzyme conjugates)(RNase耦合物、抗体导向酶-前体药物疗法(antibody-directed enzyme/prodrugtherapy)(ADEPT))等的部分。一种方法是，可通过将细胞毒性剂结合于抗体可选抗原识别位点中的一个上，来将细胞毒性剂连接到双特异性或多特异性抗体的一个部分上。另一方法是，可将编码毒素的多核苷酸连接到编码结合剂的多核苷酸上并进行表达，蛋白细胞毒素即作为与特异性结合剂的融合蛋白而被表达。在另一可选方法中，可对特异性结合剂进行共价修饰以包含进所需细胞毒素。
这种融合蛋白的例子包括免疫多肽、具有长循环半衰期的蛋白(例如免疫球蛋白恒定区)、标记蛋白、有利于所需特异性结合剂多肽纯化的蛋白或多肽，以及促进多聚体蛋白(例如有利于聚合物形成和稳定的亮氨酸拉链基序)形成的多肽。
通常在这种插入性变异体中，全部天然分子或实质性部分(substantial portion)的N-末端或C-末端连接在第二种多肽或其部分上。例如，融合蛋白通常使用其它种类的前导序列，以允许在异种宿主中表达重组体。其它有用的融合蛋白包括添加免疫球蛋白活性结构域(例如抗体表位)，以促进该纯化蛋白的纯化。在融合连接位点或其附近包含进一个裂解位点，可有利于在纯化后除去外来多肽。其它有用的融合包括连接上功能性结构域，例如酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶点信号或跨膜区域。
本发明中可使用多种商品化的融合蛋白表达系统。特别有效的系统包括(但不仅限于)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)系统(Pharmacia)，麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverley，MA)，FLAG系统(IBI，New Haven，CT)和6xHis系统(Qiagen，Chatsworth，CA)。这些系统能够产生仅携带小数量额外氨基酸的重组多肽，这些额外氨基酸不可能影响重组多肽的抗原活性。例如FLAG系统和6xHis系统仅添加短序列，这两种系统的添加序列已知都几乎无抗原性，并且不影响多肽折叠成其天然构象。另一种被考虑的有效融合是在蛋白或肽的N末端融合Met-Lys二肽。这种融合可产生蛋白表达或活性的有利提高。
将特异性结合剂融合于半抗原上以提高特异性结合剂融合构建体(它有利于例如本发明的抗独特型抗体的产生)的免疫原性，这可能是一种特别有效的融合构建体。本领域已知这种提高免疫原性的融合方式，例如将特异性结合剂与辅抗原(例如hsp70)融合，或与如白喉毒素或细胞因子(如I1-2)融合，将有利于引发免疫反应。在另一实施方案中，可进行融合以提高抗原结合组合物对特异位点或细胞的靶定位活性。
其它被考虑的融合构建体包括融合具有所需特性的异种多肽(如Ig恒定区)以延长血清半衰期，或融合抗体(或其片段)以改善靶定位活性。还有其它融合系统产生杂种多肽，它需要从所需多肽上切除融合伴侣。在一个实施方案中，这种融合伴侣连接在重组特异性结合剂多肽上，其中连接肽序列含有蛋白酶的特异性识别序列。合适的蛋白酶例如烟草蚀纹病毒蛋白酶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)或Xa因子(New England Biolabs，Beverley，MA)。
本发明也提供了包含Ang-2抗体全部或部分可变区的融合多肽，例如具有本文所述氨基酸序列的重链(或轻链)可变区连接在截短组织因子(tTF)上，它是一种血管靶分子，由切除了部分序列的人诱血凝蛋白(coagulation-inducing protein)(肿瘤血管凝结剂)组成。将tTF融合于抗Ang-2抗体(或其片段)上，可能会促进抗Ang-2到靶细胞的运输。
特异性结合剂的变异体
本发明特异性结合剂的变异体包括插入、删除和/或替换变异体。本发明一方面提供了插入变异体，其中特异性结合剂添加了一个或多个氨基酸残基。插入可发生在特异性结合剂的末端(同时发生或只发生在一端)或内部序列上。在两个末端或一个末端具有额外残基的插入变异体可包含如融合蛋白和具有氨基酸标签或标记的蛋白。插入变异体包括添加有一个或多个残基的特异性结合剂序列(或其片段)。
本发明的变异体产物也包括成熟特异性结合剂产物。这种特异性结合剂产物的前导序列或信号序列被除去，但所得蛋白相比野生型Ang-2多肽仍然具有额外的末端残基。这种额外末端残基可能来自其它蛋白，或者可能含有一个或多个不能被鉴别出具体来自哪个蛋白的残基。也考虑了在位置-1具有额外蛋氨酸残基的特异性结合剂产物(Met-1-特异性结合剂)，和在位置-2和-1具有额外蛋氨酸和赖氨酸残基的特异性结合剂产物(Met-2-Lys-1-特异性结合剂)。具有额外Met、Met-Lys、Lys(或者通常是一个或多个碱性残基)残基的特异性结合剂变异体特别有利于在细菌宿主细胞中提高重组蛋白生成。
本发明也涉及到来自特殊表达系统的具有额外氨基酸残基的特异下结合剂变异体。例如使用将所需多肽作为谷胱甘肽-S转移酶(GST)融合产物的一部分进行表达的商品化载体系统，所得产物在从所需蛋白上除去GST成分后，氨基酸位置-1即具有一个额外的甘氨酸残基。也考虑了来自其它载体系统表达的变异体，包括在氨基酸序列上包含了聚-his标签(通常位于序列的羧基末端或氨基末端)的序列。
插入变异体也包括上文所述的融合蛋白，其中特异性结合剂多肽的氨基和/或羧基末端融合了其它多肽(或其片段)，或者融合了通常不被识别为任何特定蛋白序列部分的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了删除变异体，其中特异性结合剂多肽的一个或多个氨基酸残基被删除。删除可以发生在特异性结合剂的一个或两个末端，或者发生在氨基酸序列内部。删除变异体必须包含特异性结合剂多肽的所有片段。
抗体片段包括那些结合在抗原多肽表位上的部分。这些片段包括如完整抗体在酶切或化学裂解后的Fab和F(ab′)2片段。其它结合片段包括重组DNA技术的产物，例如包含有抗体可变区编码序列的重组质粒的表达产物。本发明也涉及到保持了特异性结合Ang-2多肽能力的Ang-2结合剂的多肽片段。这里理解为至少包含5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多本发明的肽或多肽的保守性氨基酸残基的片段。优选的多肽片段具有对本发明抗原结合剂的特殊或特异性免疫学特性。可使用任何本领域已知和实践的方法来制备具有所学免疫学特性的本发明所述多肽。
另一方面本发明也提供了特异下结合剂的替换变异体。通常认为替换变异体与原多肽相似或具有一定的序列同一性，替换变异体的一个或多个残基被除去并用可选残基加以替换。本发明不仅考虑了保守性替换，也考虑了非保守性替换。
可通过已知方法方便的对相关多肽的同一性和相似性进行计算。这些方法包括(但不仅限于)以下文献所述的方法：ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford university Press，New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of SequenceData，Part1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，M.Stockton Press，New York(1991)；and Carillo 等，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。
用以确定两个多肽间的相关性或同一性百分比的优选方法，被设计成给出待测序列间的最大程度的匹配度。在公开的电脑软件中描述了确定同一性的方法。确定两个序列间同一性的优选电脑软件包括(但不仅限于)GCG软件包，包括GAP(Devereux 等，Nucl.Acid，Res，12：387(1984)；Genetics Computer Group，university of Wisconsin，Madison，WI，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul 等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))。The BLASTX program国家生物技术中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))，以及其它来源(BLAST Manual，Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul 等，supra(1990))都提供了公开的BLASTX软件。也可使用广为人知的Smith Waterman算法来确定同一性。
两个氨基酸序列间的某一比对可能仅会得到两个序列间一个短区域的匹配，即使在这两个全长序列间没有显著的相关性，这个短比对区域也可能具有高度序列同一性。因此在某些实施方案中，选择的比对方法(GAP程序)将得到至少跨越目的待测多肽全长10％的比对结果，即待测多肽至少长400氨基酸时至少比对40个连续氨基酸，待测多肽至少长300-400氨基酸时至少比对30个连续氨基酸，待测多肽至少长200-300氨基酸时至少比对20个连续氨基酸，待测多肽至少长100-200氨基酸时至少比对10个连续氨基酸。
例如使用GAP算法(Genetics Computer Group，university ofWisconsin，Madison，WI)，对两个待确定序列同一百分比的多肽进行比对以得到两者各自氨基酸的最优匹配(匹配范围，如该算法所确定的)。在某些实施方案中，将缺口开放扣分值(它典型被计算为3X平均对角线；“平均对角线”是所用对比矩阵的平均对角线；“对角线”是特定对比矩阵分配给每个最优氨基酸匹配的分数或数值)、缺口延伸扣分值(通常是缺口开放扣分值得1/10)和对比矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62与该算法联合使用。在一些实施方案中也通过算法使用标准对比矩阵(Dayhoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure，5(3)(1978)，PAM 250对比矩阵；Henikoff 等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：10915-10919(1992)，BLOSUM 62对比矩阵)。
在某些实施方案中，多肽序列对比使用的参数包括：
算法：Needleman等，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)；
对比矩阵：BLOSUM 62from Henikoff等，supra(1992)；
缺口扣分值：12
缺口长度扣分值：4
相似度阈值：0
上述参数在GAP程序可能是有效的。在某些实施方案中，使用GAP算法进行多肽对比(末端缺口无扣分值)的前述参数为默认参数。
在某些实施方案中，多肽分子序列对比使用的参数包括：
算法：Needleman 等，supra(1970)
对比矩阵：matches＝+10，mismatch＝0
缺口扣分值：50
缺口长度扣分值：3
上述参数在GAP程序也可能是有效的。在某些实施方案中，进行多肽对比的前述参数为默认参数。
也可以使用其它范例性算法、缺口开放扣分值、缺口延伸扣分值、对比矩阵、相似度阈值等，包括Program Manual，Wisconsin Package，Version 9，September，1997中所列出的。根据待进行的具体对比(例如DNA-DNA、蛋白-蛋白、蛋白-DNA；另外根据是在序列间的给定分子对间进行比较(这种情况下通常优选GAP或BedtFit)，还是在序列和大序列数据库间进行比较(这种情况下优选FASTA或BLASTA))进行详细选择，这对本领域技术人员将是显而易见的。
这里按照常规用法使用20个常规氨基酸的缩写。见Immunology--A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，通过引用并入本文。
氨基酸可具有L构型或D构型(甘氨酸除外，它没有L构型和D构型之分)，本发明的多肽和组合物可能包含不同的立体异构体。不过优选L构型。本发明也提供了反转分子，其羧基到氨基的氨基酸序列是反转的。例如正常序列X1-X2-X3的反转分子为X3-X2-X1。本发明也提供了转型(retro)-反转分子，如上文所述，一个氨基酸序列从羧基到氨基的氨基酸序列发生反转，并且正常为L对映异构体的残基变为D构型。
20个常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可能适合作本发明的多肽成分。非常规氨基酸包括如(但不仅限于)氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸、哌啶酸、氨基己酸(aminocaprioic acid)、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、二氨基丁酸、锁链素、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸等(如4-羟基脯氨酸)。
类似的，如果没有特别指出，单链多核苷酸序列的左手末端为5′末端；双链多核苷酸序列的左手方向指5’方向。新生RNA转录物的5’到3’添加方向即为转录方向；具有与RNA相同序列的DNA链上的并位于RNA转录物5’末端的5’方向的序列区域为“上游序列”；具有与RNA相同序列的DNA链上的并位于RNA转录物3’末端的3′方向的序列区域为“下游序列”。
保守性氨基酸替换可能包括非天然氨基酸残基，这典型发生在肽的化学合成而不是生物系统合成中。这包括肽模拟和氨基酸部分的其它反转或转型形式。
根据侧链共性可将天然氨基酸分为以下种类：
1)疏水氨基酸：Met，Ala，Val，Leu，Ile
2)中性亲水氨基酸：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln
3)酸性氨基酸：Asp，Glu
4)碱性氨基酸：His，Lys，Arg
5)影响链方向的残基：Gly，Pro和
6)芳香氨基酸：Trp，Tyr，Phe
例如，非保守性替换可以为一个种类的氨基酸被另一种类的氨基酸所替换。这种替换残基可被导入到人类抗体中与非人类抗体同源的区域内，或者导入到该分子的非同源性区域内。
某些实施方案中在进行这种改变时，可考虑氨基酸的亲水值。根据其疏水性和电荷特性，每个氨基酸都被分配了一个亲水值：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；酪氨酸(-0.9)；色氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。
本领域已知氨基酸亲水值在赋予蛋白交互生物功能中的重要性。Kyte 等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。已知某些氨基酸可以被其它具有相似亲水值的氨基酸所替换，并仍然保持相似的生物功能。某些实施方案中这种改变包括将亲水值差异在±2内的氨基酸进行替换。某些实施方案中这种改变包括将亲水值差异在±1内的氨基酸进行替换，某些实施方案中这种改变包括将亲水值差异在±0.5内的氨基酸进行替换。
本领域也理解根据疏水性可有效进行类似氨基酸的替换，特别是当蛋白或肽的生物功能是被制备以进行免疫学应用时，如本发明。在某些实施方案中，蛋白最大局部平均疏水性(由其邻近氨基酸疏水性决定)，与其免疫原性和抗原性相关，即与该蛋白的生物特性相关。
氨基酸残基的亲水值分配如下：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。某些实施方案中根据相似亲水值进行改变时，包括将亲水值差异在±2内的氨基酸进行替换，某些实施方案中包括包括将亲水值差异在±1内的氨基酸进行替换，某些实施方案中包括将亲水值差异在±0.5内的氨基酸进行替换。根据亲水性从初级氨基酸序列可以鉴别表位。这些区域也称作“表位核心区域”。
范例性氨基酸替换列于表1。
表1
氨基酸替换
  原始残基   替换范例   优选替换
  Ala   Val，Leu，Ile   Val
  Arg   Lys，Gln，Asn   Lys
  Asn   Gln，Glu，Asp   Gln
  Asp   Glu，Gln，Asn   Glu
  Cys   Ser，Ala   Ser
  Gln   Asn，Glu，Asp   Asn
  Glu   Asp，Asn，Gln   Asp
  Gly   Pro，Ala   Ala
  His   Asn，Gln，Lys，Arg   Arg
  Ile   Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸   Leu
  Leu   正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe   Ile
  Lys   Arg，1，4二氨基-丁酸，Gln，Asn   Arg
  Met   Leu，Phe，Ile   Leu
  Phe   Leu，Val，Ile，Ala，Tyr   Leu
  Pro   Ala   Gly
  Ser   Thr，Ala，Cys   Thr
  Thr   Ser   Ser
  Trp   Tyr，Phe   Tyr
  Tyr   Trp，Phe，Thr，Ser   Phe
  Val   Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸   Leu
使用熟知方法技术人员能够从列出的多肽中确定合适的变异体。在某些实施方案中，技术人员可鉴别出分子的合适区域，通过靶定位这些区域中相信对活性不重要的部分，这些区域可被替换而不破坏活性。在某些实施方案中，甚至也可对可能对生物活性或结构重要的区域进行保守性氨基酸替换而不破坏生物活性，或者对多肽结构没有负面影响。
另外，本领域技术人员可回顾结构-功能研究，其中鉴别了相似多肽中对活性或结构重要的残基。在进行此类比较时，可以预测一个蛋白中与类似蛋白中对活性或结构起重要作用的残基所相应的氨基酸残基的重要性。
本领域技术人员可分析相似多肽的三维结构和氨基酸序列。考虑这些信息，本领域技术人员可预测抗体的三维结构与其氨基酸残基间的比对。在某些实施方案中，由于这些残基可能涉及到该蛋白与其它分子间的重要相互作用，本领域技术人员可进行选择，以不在预测位于蛋白表面的氨基酸残基进行剧烈改变。而且，本领域技术人员可以制备试验变异体，其中的每个所需氨基酸残基上都进行替换。然后可使用本领域已知的活性检测方法来筛选这些变异体。例如，如果发现一个特殊氨基酸残基会引起活性丧失、活性的非目的性下降或者不合适的活性，那么具有这种变化的变异体就不被选用。换言之，从这些常规实验收集的信息出发，本领域技术人员可方便的确定不能进行替换(不管是单独进行替换还是与其它突变结合使用)的氨基酸。
已有大量涉及到二级结构预测的科技文献。见Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)：422-427(1996)，Chou 等，Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou 等，Biochemistry，113(2)：211-222(1974)；Chou 等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，47：45-148(1978)；Chou 等，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276and Chou 等，Biophys.J.，26：367-384(1979)。另外现在有可辅助预测二级结构的商品化电脑程序。一种预测二级结构的方法是依据同源性建模(homology modeling)。两个多肽或蛋白的序列同一性高于30％或相似性高于40％，那么这两个分子的拓扑结构通常就相似。蛋白结构数据库(PDB)最近的发展提高了二级结构的可预测性，这包括多肽或蛋白结构内潜在折叠的数目。见Holm 等，Nucl.Acid，Res，27(1)：244-247(1999)。有文献(Brenner 等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))提出一个给定多肽或蛋白内折叠数目是有限的，并且一旦结构的临界值被解决，那么就会极大提高结构预测精度。
其它二级结构预测方法包括：″threading″法(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)：15-19(1996))；“轮廓分析法”(″profile analysis″)(Bowie 等，Science，253：164-170(1991)；Gribskov 等，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov 等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)：4355-4358(1987))；“进化关系法”(″evolutionary linkage″)(Holm，supra(1999)，and Brenner，supra(1997))。
在某些实施方案中，抗体变异体包括糖基化变异体，其中相比原有多肽氨基酸序列，其糖基化位点的数目和/或类型发生改变。在某些实施方案中，相比天然蛋白，蛋白变异体包含的N-连接糖基化位点数目增多或减少。N-连接糖基化位点的特征序列为：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中的X可以为除脯氨酸外的任意氨基酸。替换氨基酸构造出这个序列，提供了一个新的添加N-连接糖基侧链的潜在位点。或者，替换以除去这个序列将除去已有的N-连接糖基侧链。也提供了N-连接糖基侧链的重排，其中除去或创建了一个或多个N-连接糖基化位点(通常是天然位点)。其它优选的抗体变异体包括半胱氨酸变异体，相比原有氨基酸序列，变异体中的一个或多个半胱氨酸残基被删除或替换为其它氨基酸(如丝氨酸)。当抗体需要重折叠成生物活性构象时(如从可溶性内涵体分离后)，半胱氨酸变异体可能是有效的。半胱氨酸变异体含有的半胱氨酸残基通常比天然蛋白少，并且典型含有偶数个半胱氨酸以将未配对半胱氨酸引起的相互作用降到最低。
某些实施方案中，氨基酸残基替换目的为：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变形成蛋白复合体的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和/或(5)赋予这些多肽的其它功能特性或修饰其功能特性。某些实施方案中，可在天然序列中(某些实施方案中，在形成分子内接触以外的序列部分上)进行单个或多个氨基酸替换(某些实施方案中为保守性替换)。某些实施方案中，保守性替换典型可能不引起原有序列结构特性的实质性变化(如氨基酸替换不倾向于破坏原有序列中的螺旋(或者破坏原有序列的其它特征二级结构))。识别多肽二级和三级结构的方法例如见“蛋白，结构和分子规则”Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；“蛋白结构信息”Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，GarlandPublishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton et at.Nature 354：105(1991)。
本发明特异性结合剂为多肽或肽替换变异体，可含有的氨基酸替换比例可高至12％。对抗体变异体来说，重链中可有50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸被替换，轻链中可有25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸被替换。
特异性结合剂的衍生物
本发明也提供了特异性结合剂的衍生物。衍生物包括被修饰(除氨基酸残基的插入、删除、替换)的特异性结合剂。这些修饰优选为共价性质，包括如与聚合物、脂质、其它有机和无机基团的化学连接。本发明衍生物的制备目的可以为提高特异性结合剂多肽的循环半衰期，或者设计成能改善多肽对目的细胞、组织或器官的靶定位能力。
本发明也涉及到的结合剂衍生物可共价修饰成包含一个或多个水溶性聚合物连接物，例如聚乙烯乙二醇、聚氧乙二醇或者聚丙二醇，见美国专利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192、4,179,337。其它本领域已知可用的聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、右旋糖苷、纤维素或其它碳水化合物聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙基化多羟基化合物(如甘油)和聚乙烯醇，以及它们的混合物。特别优选用聚乙烯(PEG)亚单位对特异性结合剂进行共价修饰。水溶性聚合物可连接到特异位置，例如特异性结合剂产物的氨基末端，或者随机连接到多肽的一个或多个侧链上。使用PEG以改善特异性结合剂的治疗能力(尤其用于人源化抗体)，见美国专利6,133,426和Gonzales 等，授权日：2000年10月17日。
抗体诱变的靶位点
可采取某些措施来操纵Ang-2特异性抗体的内在特性，例如抗体对其靶点的亲和力。这些措施包括对编码抗体的多核苷酸进行定点突变或随机突变已得到抗体变异体，然后进行筛选以回收展现所需变化(如提高或降低的亲和力)的抗体变异体。
最常用的氨基酸残基突变位点是CDR内的残基。如上文所述，CDR内含有与Ang-2发生实际作用的残基，以及影响这些作用残基的空间重排的残基。不过，CDR区域外的可变区架构区内的残基也被发现对抗体的抗原结合特性做出了实质性贡献，这些残基也可作为突变靶点以对这些特性进行操纵。见Hudson，Curr Opin Biotech，9：395-402(1999)及其参考文献。
可以在体细胞(somatic)亲和力成熟过程中，对CDR内相应于易于“超突变”区域的位点进行限制性随机突变或定点突变，以得到更小并且更有效的抗体筛选库。见Chowdhury and Pastan，NatureBiotech，17：568-572(1999)及其参考文献。已知这种方法中限定超突变位点的DNA元件类型包括正向和反向重复(direct and invertedrepeats)，某些共有序列、二级结构和回文结构。其中共有DNA序列包括四碱基序列嘌呤-G-嘧啶-A/T(即A或G-G-C或T-A或T)和丝氨酸密码AGY(其中Y可以为C或T)。
因此，本发明的一个实施方案中使用突变策略的目的是提高抗体对其靶点的亲和力。这些策略包括在整个可变重链和轻链内的突变、仅在CDR区域内进行突变、在CDR内的共有突变热点位点进行突变、在架构区内进行突变，或者联合使用这些突变方法(这里的突变可以是随机突变或定点突变)。可使用本领域已知方法如X射线结晶学技术来分析待测抗体和抗体-配体复合体的结构，从而准确描绘CDR区域并鉴别残基(包括结合位点)。根据这种抗体晶体结构的分析和鉴定，本领域已知有多种方法可用来近似描绘(尽管不准确)CDR。常用的方法如Kabat、Chothia、AbM和接触-描绘(contactdefinition)。
Kabat描绘(Kabat definition)是最常用的CDR区域预测描绘方法，它基于序列可变性。(Johnson and Wu，Nucleic Acids Res，28：214-8(2000))Chothia描绘(Chothia definition)基于loop结构的位置。(Chothia等，J Mol Biol，196：901-17(1986)；Chothia 等，Nature，342：877-83(1989))。AbM描绘(AbM definition)介于上述两者之间，它是一整套用于抗体结构模型的方法，来自Oxford Molecular Group(Martin 等，Proc Natl Acad Sci(USA)86：9268-9272(1989)；Rees，等，“ABMTM，一种抗体可变区模型软件”ABMTM，a computer program for modelingvariable regions of antibodies，Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd.)。它联合使用数据库和从头算法，模拟了抗体的一级结构到三级结构。另一种方法接触-描绘，基于对商品化晶体结构复合体的分析。
按照惯例，重链中的CDR区域典型称为H1、H2和H3，从氨基末端到羧基末端计数。轻链中的CDR区域典型称为L1、L2和L3从氨基末端到羧基末端计数。
CDR-H1大约长10-12个残基，根据Chothia和AbM描绘，通常从Cys后的4个残基处开始，或者根据Kabat描绘，从其后5个残基开始。典型的H1后为Trp，通常为Trp-Val，但也有Trp-Ile或Trp-Ala。根据AbM描绘H1长约10-12个残基，但是Chothia描绘除去了最后4个残基。
根据Kabat和AbM描绘，CDR-H2通常从H1末端后的15个残基开始。H2前面的典型残基为Leu-Glu-Trp-Ile-Gly，但是也有很多变化。H2后的典型序列为Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。根据Kabat描绘，H2长约16-19个残基，而AbM描绘预测它的典型长度为9-12个残基。
CDR-H3典型在H2末端后的33个残基开始，它前面的典型序列为Cys-Ala-Arg。H3后通常为Gly。H3的长度在3-25残基之间。
CDR-L1通常从约24号残基开始，前面通常为Cys。通常CDR-L1后的残基是Trp，其后面的典型序列为Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln或Trp-Tyr-Leu。CDR-L1长约10-17残基。本发明抗体的推定性(punitive)CDR-L1严格遵守这个模式，位于Cys残基之后，其后面跟随15个氨基酸，然后才是Trp-Tyr-Gln。
CDR-L2约开始于L1末端后的约16个残基处。它前面的残基通常为Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe，其长度约为7个残基。
CDR-L3通常开始于L2末端后33个残基处，它前面的典型残基为Cys。L3后面通常为Phe-Gly-XXX-Gly序列，其长度约为7-11个残基。
本领域中已有多种抗体修饰方法。例如美国专利5,530,101(Queen等，June 25，1996)描述了产生人源化抗体的方法，其中人源化免疫球蛋白重链可变区架构区的序列与来源免疫球蛋白相应序列有65-95％的同一性。每个人源化免疫球蛋白链除了CDR外，通常还包含了来源免疫球蛋白架构区中(例如)能够与CDR相互作用从而影响结合亲和力的残基，例如来源免疫球蛋白中与CDR直接相邻的残基，或者是那些(与CDR)相距3埃以内的残基(如分子模型技术所预测的)。当组合成一个完整抗体后，本发明的人源化免疫球蛋白将对人体基本没有免疫原性，但保持了与来源免疫球蛋白基本相同的对抗原(例如含有表位的蛋白或其它化合物)的亲和力。相关方法见美国专利5,693,761(Queen，等，授权于(issued)12月2日，1997，“编码具有改善人源化性能的免疫球蛋白的多核苷酸”“Polynucleotides encodingimproved humanized immunoglobulins”)；美国专利5,693,762(Queen，等，授权于12月2日，1997，“人源化免疫球蛋白”“HumanizedImmunoglobulins”)；美国专利5,585,089(Queen，等，授权于12月17日，1996，“人源化免疫球蛋白”“Humanized Immuno globulins”)。
例如美国专利5,565,332(Hoogenboom等，授权于10月15日，1996，“嵌合抗体的制备-一种组合方法”“Production of chimericantibodies-a combinatorial approach”)中描述了制备具有与亲代抗体相似的结合活性但人类抗体特征减少的抗体(和抗体片段)的方法。使用如噬菌体展示技术、链重排(shuffling)来得到人源化抗体，包含有非人类抗体的重链(或轻链)可变区，并特异于目的抗原的多肽与人类互补(轻或重)链可变区库进行组合。鉴别出特异于目的抗原的杂交对，来自所选杂交对的人类链与人类互补(轻或重)链可变区库进行组合。在另一实施方案中，来自非人类抗体的CDR成分与来自人类的CDR成分库进行组合。从所得抗体多肽二聚物库中选择杂种并用以进行第二轮人源化洗牌程序。或者不进行这个步骤，前提是杂种已的人类特征已经足够进行治疗。也有文献描述了进行修饰以提高人类特征的方法，也见Winter，FEBS Letts 430：92-92(1998)。
又例如美国专利5,766,886(Studnicka 等，授权于6月16日，1998，“修饰的抗体可变区”“Modified antibody variable domains”)描述的方法可鉴别抗体可变区中的这样一种残基，它们可被修饰而不减少抗原结合结构域的天然亲和力，同时减少了抗体对异类动物的免疫原性，该文同时也描述了制备这种修饰的抗体可变区的方法，修饰后可的可变区有助于将抗体导入异类动物。也见美国专利5,869,619(Studnicka，授权于2月9日，1999)。
如本文所述，使用本领域任何已知方法来修饰抗体的目的通常为提高抗体对抗原的结合亲和力和/或降低抗体对受者的免疫原性。在一种方法中，可修饰人源化抗体以除去糖基化位点，从而提高抗体对其同类抗原的亲和力(Co 等，Mol Immunol30：1361-1367(1993))。用来制备具有更高治疗能力的人源化抗体的方法例如重塑法(”reshaping”)、超嵌合法(“hyperchimerization”)和镶面/重塑表面法(“veneering/resurfacing”)。(Vaswami 等，Annals of Allergy，Asthma，&Immunol 81：105(1998)；Roguska 等，Prot Engineer 9：895-904(1996))。也见美国专利6,072,035(Hardman 等，授权于6月6日，2000)其中描述了重塑抗体的方法。虽然这些技术通过减少外源残基的数目降低了抗体的免疫原性，但它们不能防止在重复给予这些抗体后发生的抗独特型和抗同种异型抗原反应。除这些方法外，其它可选降低免疫原性的方法见Gilliland 等，J Immunol 62(6)：3663-71(1999)。
在许多例子中，人源化抗体引起了抗原结合能力的丢失。因此优选对人源化抗体进行“恢复突变”(“back mutate”)，以在人源化抗体中包含进一个或多个原有抗体(绝大多数情况下为啮齿类)中的氨基酸残基，从而试图恢复抗体的结合亲和力。见如Saldanha 等，MolImmunol 36：709-19(1999)。
非肽类特异性结合剂的类似物/拟蛋白(Protein Mimetic)
另外本发明也考虑了肽类特异性结合剂的非肽类似物，它提供了稳定化的结构或者减弱的生物降解作用。从选出的抑制肽出发，将其中一个或多个残基替换为非肽成分，从而制备特异性结合剂的拟肽类似物。非肽成分优选使得肽保持其天然构象，或者可稳定一个优选的(例如生物活性)构象，而该构象保持了识别并结合Ang-2的能力。一方面所得类似物/模拟物对Ang-2具有提高的结合亲和力。文献Nachman 等，Regul Pept 57：359-370(1995)描述了从肽类特异性结合剂出发制备非肽模拟类似物的方法。如果需要可对本发明的肽特异性结合剂进行修饰，例如糖基化、酰胺化、羧化或者磷酸化，或者形成本发明肽的酸加成盐、酰胺、酯，特别是C-末端酯以及N-酰基衍生物。也可使肽类特异性结合剂与其他成分一起形成共价或非共价复合体来进行修饰。可将化学成分连接到肽类特异性结合剂侧链的功能基团上，或者连接到N-末端或C-末端上来形成共价结合复合体。
特别的，预测肽类特异性结合剂可以与受体基团进行偶联，受体基团包括(但不仅限于)放射性标记、荧光标记、酶(如催化比色反应或荧光反应的酶)、底物、固体基质或者载体(例如生物素或抗生物素)。因此本发明提供了包含抗体分子的分子，该分子优选还包含受体选自以下物质的受体基团：放射性标记、荧光标记、酶、底物、固体基质或者载体。这些标记为本领域技术人员所熟知，例如尤其可考虑使用生物素标记。本领域技术人员也熟知对这些标记的使用，相关描述见美国专利3,817,837；美国专利No.3,850,752；美国专利No.3,996,345；美国专利No.4,277,437。其它可使用的标记包括(但不仅限于)放射性标记、荧光标记和化学发光标记。涉及到这些标记使用的美国专利包括美国专利No.3,817,837；美国专利No.3,850,752；美国专利No.3,939,350；美国专利No.3,996,345。本发明的任何肽都可包含这些标记的任意种类，标记数目可为一个、两个或更多。
特异性结合剂制备方法
本发明的蛋白类特异性结合剂可根据常规方法在溶液或固体支持物上通过化学合成而制备。目前固相合成蛋白的长度上限约为85-100个氨基酸残基。但是经常使用化学合成技术将一系列较小的肽组合成全长多肽。有多种商品化自动合成装置，并可按照已知方法来使用。例如见Stewart and Young，“固相肽合成”，Solid Phase PeptideSynthesis，2d.ed.，Pierce Chemical Co.，(1984)；Tam 等，J Am Chem Soc，105：6442，(1983)；Merrifield，Science，232：341-347，(1986)；Barany andMerrifield，The Peptides，Gross and Meienhofer，eds，Academic Press，New York，1-284；Barany 等，Int.J.Peptide Protein Res.，30，705-739(1987)；美国专利No.5,424,398，这些文献均通过引用并入本文。
固相肽合成方法使用共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，其中每克聚合物含有0.1-1.0mM胺。这些合成方法使用叔丁氧羰基(t-BOC)或9-芴甲氧羰基(FMOC))保护α-氨基。两种保护方法都为逐步合成，从肽的C-末端开始每一步加上一个氨基酸(见Coligan 等，“当前免疫学方法”Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，unit9)。在化学合成完成后，可除去t-BOC或FMOC氨基酸封阻基团以对合成肽去保护，并在低温下用酸处理(例如液体HF-10％苯甲醚在0℃处理约1h)以将肽从聚合物上切下。蒸发掉试剂后，使用1％醋酸溶液从聚合物中提取肽类特异性结合剂，得到粗材料。通常可使用Sephadex G-15，以5％醋酸为溶剂进行凝胶过滤等方法来对粗材料进行纯化。对层析柱的合适部分进行冻干，将产生均一的肽类特异性结合剂或肽衍生物，然后可使用标准方法如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光度、溶解性检测来对产物进行鉴定，并使用固相Edman降解来进行定量。
在抗Ang-2抗体、衍生物、变异体(以及这些分子的片段)和其它基于蛋白的Ang-2结合剂的化学合成中，允许在结合剂中包含进非天然氨基酸。
重组DNA技术是一种便利的方法，可用来制备本发明的抗体和其它蛋白类特异性结合剂(以及它们的片段)。可将编码抗体或其片段的cDNA分子插入到表达载体内，然后再将此载体插入到宿主细胞中以产生该抗体或片段。当然可对编码这些抗体的cDNA加以修饰以使它们与“原始”cDNA(从mRNA翻译而来)不同，从而在不同宿主细胞中提供密码子简并性或允许密码子偏好使用。
一般情况下，可使用本文实施例部分所述方法来得到编码抗体的DNA分子。当需要获得原始抗体分子相关的Fab片段或CDR时，技术人员可以使用标准方法从合适的库中(噬菌体展示文库；淋巴细胞文库)进行筛选以鉴别并克隆到相关Fab/CDR。筛选所用的探针可以是编码原始抗体Fab部分的全长或部分Fab探针，针对原始抗体Fab部分中一个或多个CDR的探针，或者是其它合适的探针。但使用DNA片段作为探针时，典型的杂交条件见Ausubel et.al.(“精编分子生物学试验指南”，Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols Press(1994))。根据诸如探针大小、预测的探针与克隆间的同源性、所用文库的类型以及筛选的克隆数目等因素，在合适的严紧性条件下洗涤探针印记。高严紧性筛选条件如50-65℃，0.1X SSC和0.1％SDS。
可使用多种表达载体/宿主系统来包含并表达编码本发明特异性结合剂的多核苷酸。这些系统包括(但不仅限于)微生物如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化了的细菌；用酵母表达载体转化了的酵母；用病毒表达载体(如杆状病毒)感染了的昆虫细胞；用病毒表达载体(如花椰菜镶嵌病毒CaMV和烟草镶嵌病毒TMV)转染了的或用细菌表达载体(如Ti或pBR322质粒)转化了的植物细胞系统；或者是动物细胞系统。
可有效用在重组特异性结合剂蛋白生产中的哺乳动物细胞包括(但不仅限于)VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢细胞系(Chinesehamster ovary(CHO)cell lines)、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293，以及本文所述的杂交瘤细胞。在制备如被典型糖基化并需要正确重折叠的抗体和抗体片段这样的特异性结合剂时，优选使用哺乳动物细胞。优选的哺乳动物细胞包括CHO细胞、杂交瘤细胞和骨髓细胞。
一些关于特异性结合剂重组表达的例子见于下文。
“表达载体”指用来表达DNA(RNA)序列的多核苷酸的质粒、病毒或载体。表达载体可包含转录单位，其中包含以下成分的组合，(1)基因元件或在基因表达中具有调节作用的元件，例如启动字或增强子，(2)结构单位或编码被转录到mRNA并被翻译为蛋白的特异性结合剂的序列，(3)合适的转录起始和终止序列。用在酵母或真核表达系统的结构单位优选包含前导序列，从而使宿主细胞可将翻译的蛋白分泌到胞外。或者，当重组特异性结合剂蛋白表达没有前导序列或转运(transport)序列时，结构单位可包含氨基酸终止子蛋氨酸残基。随后可从表达的重组蛋白上切下或保留该残基，以提供特异性结合剂的最终产物。
例如可使用商品化表达系统，按照使用说明书在酵母中重组表达特异性结合剂，如毕赤酵母表达系统(Pichia Expression System)(Invitrogen，San Diego，CA)。这个系统依赖前-α(pre-pro-α)序列进行直接分泌，而插入序列的转录在甲醇的诱导下由乙醇氧化酶(AOX1)进行驱动。
使用如从细菌和哺乳动物细胞培养上清液中纯化肽的方法，从酵母生长培养基中纯化分泌的肽类特异性结合剂。
另一可选方法是，将编码肽类特异性结合剂的cDNA克隆到杆状病毒表达系统pVL1393中，(PharMingen，San Diego，CA)。可根据使用说明书，在sF9无蛋白培养基中使用该载体感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，以生成重组蛋白。可使用肝磷脂-琼脂糖柱(Pharmacia)从培养基中纯化并浓缩特异性结合剂蛋白。
另一可选方法是，使用昆虫系统表达肽。本领域技术人员熟知用于蛋白表达的昆虫系统。在一个昆虫表达系统中，可使用苜蓿尺蠖核多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV))作为载体，在草地贪夜蛾或粉纹夜蛾(Trichoplusia larvae)中表达外源基因。可将肽类特异性结合剂的编码序列克隆到该病毒的非必需区域中，如克隆到如多角体蛋白基因中并置于如多角体蛋白启动子的控制之下。肽类特异性结合剂的成功插入会导致如多角体蛋白基因失活，从而生产缺乏衣壳蛋白(coat protein coat)的重组病毒。可用该重组病毒感染草地贪夜蛾或粉纹夜蛾，外源肽即被表达。(Smith 等，J Virol 46：584(1983)；Engelhard 等，Proc Nat Acad Sci(USA)91：3224-7(1994))
在另一实例中，可使用PCR扩增肽类特异性结合剂的编码DNA序列，并克隆到合适的载体中，如pGEX-3X(Pharmacia)。pGEX-3X载体编码了谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，它产生包含此酶和特异性结合剂蛋白(由插入到该载体克隆位点的DNA插入片段所编码)的融合蛋白。PCR引物可包含如合适的裂解位点。当与特异性结合剂融合的部分是仅用以促进表达时，或者不是它插入蛋白所需的连接物时，可从融合蛋白中GST部分上切下重组特异性结合剂。使用pGEX-3X/特异性结合剂肽转化大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene，La JollaCA)，分离单转化子病进行培养。可从单转化子中纯化质粒DNA并使用自动测序仪进行部分测序，以确认特异性结合剂编码核酸是否以正确方向被插入。
使用上文所述重组系统表达编码抗Ang-2抗体及其片段，可能会得到需要进行“重折叠”(以建立多种正确的二硫键)以发挥生物活性的抗体或其片段。这些抗体典型的重折叠方法见下节的实施例中所述。
在细菌细胞中制备的特异性结合剂可以细菌不溶性包涵体形式而生成，可采用如下方法进行纯化。可使用离心法处理宿主细胞；用0.15M NaCl，10mM Tris，pH 8，1mM EDTA进行洗涤；并用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO)在室温下处理15min。可用超声裂解使溶菌液澄清，然后12,000Xg离心10min沉淀细胞碎片。用50mMTris，pH 8，和10mM EDTA重悬含有特异性结合剂的沉淀，用50％甘油分层，并6000Xg.离心30min。用没有Mg++和Ca++的标准磷酸盐溶液(PBS)重悬沉淀。然后可用变性SDS聚丙烯酰胺凝胶分离进一步纯化特异性结合剂(Sambrook 等，supra)。可用0.4M KCl浸泡凝胶以显现蛋白，可切下凝胶并在没有SDS的凝胶电泳缓冲液中进行电泳。如果在细菌中产生GST融合蛋白(可溶性蛋白)，则可使用GST Purification Module(Pharmacia)进行纯化。
本领域技术人员熟知使用哺乳动物细胞来表达重组蛋白。可根据加工所表达蛋白或产生某种翻译后修饰(它将有利于产生蛋白活性)的特殊能力来选择宿主细胞系。这种多肽修饰包括(但不仅限于)乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。多种宿主细胞如CHO、HeLa、MDCK、293和杂交瘤细胞系都具有与这种翻译后修饰活性相关的特殊细胞机制和特征机理，可选用它们来确保对所给予外源蛋白的正确修饰和加工。
可使用多种选择系统来回收被转化了的细胞(用于重组蛋白生产)。这些选择系统包括(但不仅限于)分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸腺嘧啶激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。也可利用抗代谢物抗性来进行选择，DHFR赋予细胞对氨甲喋呤的抗性；gpt赋予细胞对霉酚酸的抗性；neo赋予细胞对氨基糖苷(aminoglycoside)G418和氯磺隆的抗性；hygro赋予细胞对潮霉素的抗性。其它可用的选择基因包括trpB(它允许细胞利用吲哚代替色氨酸)或hisD(它允许细胞利用组胺醇(histinol)代替组氨酸)。可目测鉴别转化子的标记物包括花青素、β-葡萄糖苷酶及其底物GUS、荧光素酶及其底物荧光素。
特异性结合剂的纯化和重折叠
在一些情况下，使用上文所述方法产生的特异性结合剂可能需要“重折叠”和氧化，以形成正确的四级结构并建立二硫键以发挥生物活性。可使用本领域已知的多种方法来进行重折叠。这些方法包括如在离液剂存在时使溶解的多肽暴露在pH7以上(一般情况下)。离液剂的选择类似于包涵体溶解方面的选择，但是离液剂典型在低浓度下使用。离液剂例如胍。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液中也含有还原性试剂及其氧化形式，二者浓度保持在特定比例以产生特定的氧化还原电位，从而使二硫键改组(dusykfide shuffling)得以发生以形成二硫键。通常使用的一些氧化还原分子对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫GSH、氯化亚铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫-bME。很多情况下可使用助溶剂以提高重折叠效率。通常使用的助溶剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇和精氨酸。
需要纯化本发明的特异性结合剂蛋白或其变异体。本领域技术人员熟知蛋白纯化方法。这些方法在一种水平上包括多肽和非多肽片段的粗分离。从其它蛋白中分离出特异性结合剂多肽后，可使用色谱和电泳方法纯化目的多肽，以达到部分或完整纯化(或纯化到同质(homogeneity))。特别适合于纯特异性结合剂肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱法、聚丙烯酰胺电泳、等电点聚焦。一种特别有效的肽纯化方法是快速蛋白液相色谱或HPLC。
本发明的某些方面涉及到纯化，在特定实施方案中涉及到特异性结合剂蛋白或肽的基本提纯。这里所用的“纯化的特异性结合剂蛋白或肽”是指从其它成分分离的组合物，其中特异性结合剂蛋白或肽被纯化到相对于其天然可得状态的任何程度。因此纯化的特异相结合剂蛋白或肽，也指脱离其可能天然存在环境的特异性结合剂蛋白或肽。
通常“纯化的”指已被分离除去了多种其它成分的特异性结合剂组合物，并且该组合物保持其被表达的充分生物活性。所用的“基本提纯的”指特异性结合剂蛋白或肽为主要组合物成分的特异性结合剂组合物，例如特异性结合剂蛋白或肽占组合物蛋白的比例为约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。
根据本发明本领域技术人员将了解多种用于定量特异性结合剂纯化程度的方法。这些方法包括如确定部分纯化物的特异结合活性，或者通过SDS/PAGE在一部分纯化物中检测特异性结合剂多肽的量。评价特异性结合剂的一部分纯化物纯化程度的优选方法是计算该部分的结合剂活性，并于起始提取物进行比较，从而计算出纯化程度，这里记为“纯化倍数”。当然用以代表结合活性的实际单位依赖于纯化后所选用的具体检测方法，以及表达的纯化结合剂蛋白或肽是否展示出可检测性结合活性。
本领域技术人员熟知多种可用于特异性结合剂蛋白纯化的方法。这些方法包括如硫酸铵沉淀、PEG、抗体法(免疫沉淀)、或者着热变性后离心、色谱法如亲和层析(如A蛋白-Sepharose)、离子交换层析、反相色谱、凝胶过滤、羟基磷灰石和亲和层析、等电点聚焦、凝胶电泳以及这些方法的联用。如本领域公知的，不同纯化步骤次序可发生变化，或者某些步骤可被省略，仍可得到合适的纯化方法以得到基本纯化特异性结合剂。
通常并不要求总是提供最纯状态的特异性结合剂。事实上在特定实施方案中可考虑使用特异性不是特别高的结合剂产品。可在联合方法中使用较少的纯化步骤或使用相同通过纯化方法中的不同形式，来得到部分纯化物。例如，使用HPLC装置进行阳离子交换柱层析所得纯化倍数一般高于使用低压色谱系统进行同样操作所得倍数。具有相对较低纯化程度的方法可能对总回收特异性结合剂蛋白产物有利，或者有利于保持表达的特异性结合剂蛋白的结合活性。
已知多肽在不同SDS/PAGE条件下的迁移可能不同，有时显著不同(Capaldi 等，Biochem Biophys\Res Comm，76：425(1977))。因此在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的特异性结合剂表达产物的表观分子量当然可能不同。
结合实验
免疫结合实验通常使用捕获试剂来特异性结合于并经常固定住被分析物的靶抗原。捕获试剂是特异性结合于被分析物的基团。在本发明的一个实施方案中，捕获试剂是特异性结合于Ang-2的抗体或其片段。本领域熟知这些免疫结合实验(Asai，ed.，“细胞生物学方法”Methods in Cell Biology，Vol.37，“细胞生物学中的抗体”Antibodies inCell Biology，Academic Press，Inc.，New York(1993))。
免疫结合实验经常使用标记物以标出捕获试剂和抗原形成的固定复合体的存在。标记物可以是包括固定复合体的分子中的一个，即标记物可以是被标记的特异性结合剂或被标记的抗特异性结合剂的抗体。或者标记物可以是第三种分子，通常是第三种抗体，它结合于固定复合体。标记物可以是如携带标记的抗特异性结合剂的抗体。第二种抗体特异于固定复合体，可没有标记，但是它可被第四种分子所固定，而这种分子特异于第二种抗体所属种类的抗体。例如，第二种抗体可以修饰加上一个可检测的基团如生物素，该基团可被第四种分子所固定，例如标记了的链霉抗生物素。其它能够特异结合免疫球蛋白恒定区的蛋白，如A蛋白或G蛋白也可被用作标记物。这些标记蛋白通常是链球菌细胞壁的成分，展示出与多种免疫球蛋白恒定区的强烈非免疫反应活力(通常见Akerstrom，J Immunol，135：2589-2542(1985)；Chaubert，Mod Pathol，10：585-591(1997))
贯穿这些实验，可能在每一次物质反应后都需要温育和/或洗涤步骤。温育时间可能从5s到数小时不等，优选从约5min到约24h。但是温育时间依赖于检测形式、被分析物、溶液体积、浓度等因素。通常这些检测在环境温度下进行，不过也可在一个温度范围内进行。
A.非竞争性结合实验：
免疫结合实验可以使非竞争性结合实验。这些实验中有许多被捕获的分析物，对它们进行直接测量。例如在一种优选的“三明治”实验中，捕获试剂(抗体)可被直接固定在固体基质上。这些固定化抗体然后被待测样品中的抗原所捕获(结合)。这样固定的蛋白然后被固定到标记物上，例如携带标记的第二种抗体。在另一优选的“三明治”实验中，第二种抗体没有携带标记，但是可被携带标记的另一抗体所固定，这种抗体特异于第二种抗体所属种类的抗体。第二种抗体也可被修饰添加上可检测的基团例如生物素，第三种被标记的分子可特异性结合于该基团上(见Harlow and Lane，“抗体实验手册”Antibodies，A Laboratory Manual，Ch 14，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1988)，通过引用并入本文)。
B.竞争性结合实验
免疫结合实验可以是竞争性结合实验。通过测量额外添加分析物中被样品中分析物所取代或竞争掉的量，来间接测量样品中存在的分析物的量。在一个优选的竞争性结合实验中，向样品中添加已知量的分析物(通常被标记)，然后使样品与一种抗体(捕获试剂)接触。被该抗体所固定的标记量与样品中分析物的量成反比(见See，Harlowand Lane，“抗体实验指南”Antibodies，A Laboratory Manual，Ch 14，pp.579-583，supra)。
在另一优选的竞争性结合实验中，抗体被固定在固体基质上。可通过测量蛋白/抗体复合体中蛋白的量或者测量未与抗体结合的剩余蛋白的量，来确定固定在抗体上的蛋白量。可通过提供被标记蛋白来检测蛋白量(见See，Harlow and Lane，“抗体实验指南”Antibodies，A Laboratory Manual，Ch 14，pp.579-583，supra)。
在另一优选的竞争性结合实验中利用半抗原抑制。这里将已知分析物固定在固体基质上。向样品中加入已知量的抗体，然后使样品与固定的分析物相接触。被固定分析物所捕获的抗体量与样品中分析物的量成反比。可通过检测被固定的抗体量或者检测溶液中剩余的抗体量来检测固定的抗体量。可进行直接检测，这时抗体被标记，或者随后加入被标记了的基团(它特异于该抗体，如上文所述)来进行间接检测。
C.竞争性结合实验的使用
技术人员可使用竞争性结合实验确定交叉反应活性，以确定被本发明特异性结合剂所识别的蛋白或酶复合体是否为所需蛋白，并且不是交叉反应分子，或者确定抗体是否特异于抗原并且不结合于非目的抗原上。在这种类型的实验中，抗原可被固定到固体支持物上，并向实验液中添加未知的蛋白混合物，该混合物将与特异性结合剂对固定的蛋白发生竞争性结合。竞争分子也结合于与目的抗原无关的一种或多种抗原上。将蛋白与特异性结合剂抗体间的对固定抗原的结合竞争能力，与固体支持物上所固定的相同蛋白的结合进行比较，以确定蛋白混合物的交叉反应活性。
D.其它结合实验
本发明也提供了Western印迹方法来检测或量化样品中的Ang-2。该方法步骤通常包括根据分子量使用凝胶电泳分离样品蛋白，将蛋白转移到合适的固体支持物上，如硝化纤维膜、尼龙膜或衍生尼龙膜。然后样品与特异结合Ang-2的抗体或其片段共温育，并检测所得复合体。这些抗体可被直接标记，或者随后使用特异结合第一种抗体的被标记抗体进行检测。
检测那些破坏Ang-2与其受体结合作用的Ang-2特异性结合剂的结合实验，见本文实施实例部分。
诊断实验
本发明的抗体或其片段有利于对特征为Ang-2(或其亚基)表达的症状或疾病的诊断，或者有利于在实验中对被Ang-2诱导物及其片段、Ang-2活性拮抗剂或抑制剂所处理患者的监测。Ang-2诊断实验方法包括使用特异性结合剂和标记物以检测人体液或细胞(或组织)提取物中的Ang-2。使用本发明的特异性结合剂时可加以修饰或者不修饰。在优选的诊断实验中，通过连接上如标记物或受体分子来对特异性结合剂进行标记。已知有多种标记物和受体分子，其中一些已在本文中被描述。本发明对人类疾病尤其有效。
本领域已知多种使用特异于各自受体蛋白的多抗或单抗来测量Ang-2蛋白的方法。包括如酶联免疫反应(ELISA)，放射性免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选术(fluorescence activated cell sorting，FACS)。优选使用一种基于单抗的双位点免疫测定方法，其中使用了可与Ang-2上两个互不干扰的表位发生反应的单抗，不过可使用竞争性结合实验。这些实验的描述见如Maddox 等，J Exp Med.158：1211(1983)。
为了向诊断提供依据，通常建立人体正常或标准Ang-2表达值。可在本领域熟知的适于复合体形成的条件下，联合使用正常受试者(优选为人类)的体液或细胞提取物及Ang-2的特异性结合剂(如抗体)来建立该值。可通过将特异性结合剂与已知量的Ang-2蛋白的结合作用，与对照和疾病样本的相应作用进行对比并量化对比结果，来量化标准复合体的形成作用。然后可将从正常样本得到的标准值，与从可能被感染的受试者得到的样本值加以对比。标准值和受试者值之间的偏差提示了Ang-2在疾病状态中的作用。
在某些实施方案中，为了诊断目的典型将特异性结合剂用可检测性基团加以标记。这种可检测性基团可以是任何可直接或间接产生可检测性信号的分子/基团。例如为放射性同位素如3H、14C、32P、35S、125I；荧光或化学发光化合物如荧光异硫氰酸盐、若丹明或虫萤光素；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶(Bayer 等，MethEnz，184：138-163，(1990))。
疾病
本发明提供了有效于治疗人类疾病和改善症状的结合于Ang-2的特异性结合剂。可联合使用可调节Ang-2结合活性或其它细胞活性的物质与其它治疗药物，以增强它们的治疗作用或降低可能的副作用。
一方面，本发明提供了有效于治疗特征为细胞中非必需或异常水平Ang-2活性的疾病或症状的药物和方法。这些疾病包括癌症和其它过度增生症状，如增生、牛皮癣、接触性皮炎、免疫失调和不育不孕症。
本发明也提供了治疗动物(包括人类)癌症的方法，步骤包括向动物给予有效剂量的可抑制或降低Ang-2活性的特异性结合剂。本发明也涉及到抑制癌细胞生长(过程包括细胞增殖、入侵和生物系统中转移)的方法。这些方法包括将本发明的化合物用作癌细胞生长抑制剂。优选使用这些方法来抑制或减少活体动物如哺乳动物体内的癌细胞生长、入侵、转移或肿瘤范围。本发明的方法也可在检测系统中方便的加以调节，如在癌细胞生长及其特性的检测中，和对可影响癌细胞生长的化合物的鉴别中。
可使用本发明的方法治疗的癌症优选为哺乳动物癌症。哺乳动物包括如人和其它灵长类，宠物或伴侣动物如狗和猫，实验室动物如大鼠、小鼠和兔子，以及农场动物如马、猪、绵羊和牛。
肿瘤或赘生物包括细胞增殖不受控制并具有入侵性的组织细胞生长。这种生长的其中一些是良性的，可是另一些预期是恶性的，并可能引起有机体的死亡。恶性肿瘤或癌症与良性生长的区别在于，癌细胞除了表现出入侵性细胞增殖外，它们可能侵入周围组织病发生转移。另外恶性肿瘤的特征还在于它们的分化能力丧失更多(退行发育程度更大)，以及相对彼此和它们周围的组织，它们的组织程度下降更多。这个特性被称为“退行性发育”。
可使用本发明内容进行治疗的肿瘤包括实体肿瘤(solid tumor)，即癌(carcinomas)和肉瘤(sarcomas)。癌包括那些起源于渗透(入侵)到周围组织并引起转移的上皮细胞的恶性肿瘤。腺癌起源于腺体组织，或者起源于形成可识别腺体结构的组织。另一大类癌包括肉瘤，这种肿瘤的细胞埋入纤维质或均质体中，例如胚胎结缔组织。本发明也可治疗骨髓系统或淋巴系统癌症，包括白血病、淋巴瘤和其它典型不以肿瘤块形式出现而在血管或淋巴管系统中分布存在的癌症。
本发明可有效治疗的癌症或肿瘤类型包括如产ACTH肿瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、肾上腺皮质癌、膀胱癌、脑癌、乳癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤、胆囊癌、毛细胞白血病、头颈癌、何杰金瘤、Kaposi肉瘤、肾癌、肝癌、肺癌(小和非小细胞)、恶性腹腔积液、恶性胸腔积液、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、非何杰金瘤、骨肉瘤、卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、眼癌、皮肤癌、软组织瘤、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、子宫癌、阴道癌、阴户癌和肾母细胞瘤。
本文中特别举例阐明了某些本发明可治疗的癌症。在这些说明性的实例中，使用当前科技水平上标准的体外和体内模型。这些方法可被用来鉴别那些被预测对体内治疗有效的试剂。但是本发明的方法当然不仅限于只可治疗这些类型的肿瘤，本发明的方法可用来治疗起源于任何器官系统的任何实体肿瘤。入侵或转移与Ang-2表达(或活性)相关的癌症，尤其容易被本方法的方法所抑制，或者甚至被诱导而恢复。
应用本发明的方式也可以是使用本发明的特异性结合剂如抗体。将本发明的特异性结合剂与其它抗癌化疗药物联合使用，例如任何常规的化疗药物。联合使用特异性结合剂和化疗药物从而可以增强化疗方法的效果。本领域技术人员将发现许多能够被包含进本发明方法的化疗方法。可使用任何化疗药物，包括烷基化药物、抗代谢物、激素和拮抗剂、放射性同位素和天然产物。例如本发明的化合物可以以下药物联合给予，抗生素如阿霉素和其它蒽环类似物，氮芥例如环磷酰胺，嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶，顺铂，羟基脲，紫杉醇及其天然或合成衍生物等。又例如在治疗混合物瘤如乳腺癌时(肿瘤细胞包括促性腺激素依赖和不依赖促性腺激素两种细胞)，本发明化合物可以与亮丙瑞林(leuprolide)或戈舍瑞林(goserelin)(LH-RH的合成类似物)一起给药。其它抗肿瘤方法包括联合使用四环素化合物和其它治疗形式(如手术、放疗等，在本文中也称作“辅助抗肿瘤方法”)。因此可将本发明的方法与这些常规治疗方法联合使用，以减少副作用改善治疗效果。
因此，本发明提供了可有效于许多种癌症(包括实体瘤和白血病)治疗的组合物和方法。可治疗的癌症类型包括(但不仅限于)：乳腺癌、前列腺癌和结肠癌；所有形式的肺支气管癌；骨髓瘤；黑素瘤；肝细胞瘤；成神经细胞瘤；乳突淋瘤；APUD肿瘤；迷芽瘤；鳃原性瘤；恶性综合征(malignant carcinoid syndrome)；类癌性心脏病；癌症(如Walker癌、基底细胞癌、基层鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌，Ehrlich瘤，Krebs 2，merkel细胞癌，粘液性癌，非细胞细胞肺癌，燕麦细胞肺癌，乳头癌，硬癌，支气管癌，支气管肺癌，鳞状细胞癌，移行细胞癌)；组织细胞失调；白血病；恶性组织细胞增多；何杰金瘤；非小细胞免疫增生性肺癌；非何杰金淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮增生症；黑素瘤；脂肪瘤；软骨瘤；软骨骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间质瘤；中肾瘤；肌肉瘤；造釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养细胞肿瘤(tophoblastic tumor)。其它可治疗的癌症种类为：腺瘤；胆管瘤；珠光瘤；cyclindroma；囊腺癌；囊腺瘤；粒层细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺瘤；胰岛细胞瘤；间质细胞瘤；乳突淋瘤；塞尔托利氏细胞瘤；卵泡膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌瘤；成肌细胞瘤；神经胶质瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室鼓膜瘤；神经节细胞瘤；神经胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；成神经细胞瘤；上皮瘤；纤维神经瘤；神经瘤；副神经节瘤；非嗜铬副神经节瘤；血管胶质瘤；血管淋巴样增生伴嗜酸性白细胞增多；硬化型血管瘤；血管瘤；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白色肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；瘤；神经纤维瘤病；和宫颈异常。
另外本发明的材料和方法也可用于预防和/或治疗任何皮肤过度增生，包括牛皮癣和接触性皮炎以及其它过度增生性疾病。已经证实牛皮癣和接触性皮炎患者的Ang-2活性在这些疾病状态中提高(Ogoshi 等，J.Inv.Dermatol.，110：818-23(1998))。优选联合使用特异于Ang-2的特异性结合剂和其它药物来治疗表现出这些临床症状的患者。可使用多种载体通过本文所属的途径和其它本领域技术人员熟知的途径将特异性结合剂给予患者体内。
另外本发明包括治疗涉及到血管生成的视网膜病(包括糖尿病视网膜病和年龄相关的黄斑变性)以及女性生殖道紊乱/疾病，例如子宫内膜异位、子宫纤维瘤和其它与女性生殖循环中机能不良血管增生增生(包括子宫内膜微脉管生长)相关的此类症状。
另外本发明也涉及到治疗非正常血管生长，包括脑动静脉畸形(AVM)，胃肠黏膜损害与修复，具有消化器官溃疡病史(包括)的患者的胃十二指肠黏膜溃疡，包括由心脏病发作引起的局部缺血，肝病中的一大类肺部血管失调和患非肝性门静脉高压症患者的门静脉高压症。
本发明也涉及到使用本发明的组合物和方法来预防癌症。这些药物将包括Ang-2的特异性结合剂。
药用组合物
本发明也包括Ang-2特异性结合剂的药用组合物。药用组合物包含了如美国专利6,171,586(Lam 等，授权于1月9日，2001)中详述的抗体。这些组合物中包含了有效治疗或预防剂量的特异性结合剂(例如本文所述的抗体或抗体的片段、变异体、衍生物和融合蛋白)，它与药学上可接受的试剂形成混合物。在一个优选的实施方案中，药用组合物包含了起拮抗作用的特异性结合剂，它部分或完全调节至少一种Ang-2活性，并与药学上可接受的试剂形成混合物。典型的，该特异性结合剂被充分纯化以允许导入动物体内。
药用组合物可包含制剂材料以修饰、维持或保持组合物的性质，如pH、摩尔渗透压浓度、粘性、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、分散或释放速率、吸附或渗透特性。合适的制剂材料包括(但不仅限于)氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(如硼酸盐缓冲液、种碳酸盐缓冲液、Tris-HCl、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、其它有机酸缓冲液)、湿胀剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如EDTA)、复合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环式糊精或羟基丙基-β-环式糊精)、填充剂、单糖、二糖和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、或糊精)、蛋白(如血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂或稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐反离子(salt-forming counterions)(如钠)、防腐剂(如氯苯甲烷铵、安息香酸、水杨酸、硫汞撒、苯乙基乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯、双氯苯双胍己烷、山梨酸或双氧水)、溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克类(pluronics)、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、氨基丁酸、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)、增稳剂(蔗糖或山梨醇)、张度增强剂(tonicity enhancing agents)(如碱金属卤化物(优选氯化钾或钾、甘露醇、山梨醇))、运输载体、稀释剂、赋形剂和/或药用佐剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company，1990)。
本领域技术人员可根据如目的给药途径、运输形式和所需剂量来确定最优的药用组合物。如见上文的Remington′s PharmaceuticalSciences。这样的组合物可以影响特异性结合剂的物理状体、稳定性、体内释放速率、体内清除率。
药用组合物中的初级媒介或载体可以为天然水成或者非水成的。例如合适的媒介物或载体可以为用于注射的水、生理盐水或人工脑脊髓液，并可以补充如其它在组合物中常用的注射给药材料。载体又例如为中性盐缓冲液或血清白蛋白-盐混合液。其它药用组合物的例子包含Tirs缓冲液(pH约7.0-8.5)或醋酸缓冲液(pH约4.0-5.5)，还可进一步包含山梨醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方案中，制备储存用的结合剂组合物时，可将选出的组合物(具有所需纯化度)与任选冻干块或水溶液形式的赋形剂(Remington′sPharmaceutical Sciences，supra)相混合。然后可以使用合适的赋形剂如蔗糖，将此结合剂产品制成冷冻干产物。
可选择通过注射方式给予药用组合物。或者通过呼吸道或肠道给药，例如口服给药，耳部给药，眼部给药(opthlmically)，直肠给药，或者阴道内给药。本领域技术人员了解这种药学上可接受的组合物的制备方法。
制剂成分的浓度应可被导入位置所接受。例如，用缓冲液将组合物的维持在生理pH或稍低的pH初，典型在约5-8之间。
当考虑通过注射给药时，本发明中所用的治疗组合物可以为无热源且可注射的水溶液形式，其中包含了所需的特异性结合剂以及容纳它的药学上可接受的载体。特别合适的注射用载体为无菌蒸馏水，特异性结合剂在其中被制成无菌无离子溶液，并妥善保存。可采用的另一种方式是将联合使用所需分子与一种试剂，例如可注射的微球体，可生物降解的颗粒，聚合物(聚乳酸，聚羟基乙酸)，珠子或脂质体，这些试剂使得所需产物发生控制的或持续释放，制成后将制剂通过储库型注射给药。也可使用透明质酸，它具有延长(药物)循环的持续时间的功能。所需分子的其它合适给药方式包括移植药物输送装置。
另一方面，适合注射给药的药用组合物也可制成水溶液剂型，优选在生理条件可容的缓冲液中，例如Hanks溶液，ringer溶液，或生理盐水缓冲液。注射用水悬液可包含提高悬液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和右旋糖苷。另外，活性混合物悬液也可制成合适的油性悬液形式。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪例如芝麻油，合成脂肪酸酯例如乙基油酸、甘油三酸酯，脂质体。输送也可使用非脂质聚阳离子氨基聚合物(Non-lipid polycationic aminopolymers)。悬液可任选包含合适的稳定剂或能够提高化合物溶解性的物质，以允许进行高浓度溶液制备。
在另一实施方案中可将药用组合物制成呼吸给药的形式。例如将特异性结合剂制成可吸入的干粉。也可将多肽或核酸分子吸入溶液与抛射剂制成气雾剂形式。在另一实施方案中，可将溶液制成喷雾。此外，肺部给药内容见PCT申请No.PCT/US94/001875，其中描述了通过肺部给予化学修饰后的蛋白。
也考虑某些可通过口服给药的剂型。在本发明的一个实施方案中，通过这种方式给药的特异性结合剂分子可与那些固体制剂形式中(例如片剂或胶囊)常用的载体一起制剂，也可不与这些载体一起制备。例如，可将胶囊设计成当生物药效率最大并且系统预降解最低时，组合物的活性部分在胃肠道发生释放。还可采用其它试剂来促进结合剂分子的吸收。也可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂、和粘合剂。
也可使用本领域熟知的适合口服给药剂型的药学上可接受的载体，将药用组合物制成口服给药形式。这些载体能够使药用组合物形成被患者所吸收的形式，如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、溶液、凝胶、糖浆、浆(slurries)、混悬液。
可通过使活性化合物与固体赋形剂结合，并将所得混合物制成细颗粒状(可任选在粉碎后)以得到片剂或糖衣丸核心，从而得到口服给药的药用制备物。如果需要可添加合适的辅助物。合适的赋形剂包括碳水化合物或蛋白填充物，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉或其它植物淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；树脂包括阿拉伯胶和黄芪胶；蛋白包括白明胶和胶原质。如果需要可添加崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂和褐藻酸或它们的盐，例如藻酸钠。
糖衣丸核心可与合适的包被联合使用，如浓缩糖溶液，其中也可含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或包被中添加染料或色素，以鉴别产品或标出活性化合物的特征，即剂量。
口服使用的药用制备物也可包含白明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，或者白明胶和包被(如甘油和山梨醇)制成的柔软密封胶囊。推入配合胶囊可含有活性成分和与其混合的填充物或结合剂，如蔗糖或淀粉，润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，以及(任选含或不含)稳定剂。在柔软胶囊中，活性化合物可分散或悬浮在合适的液体中，如脂肪、液体(liquid)或聚乙二醇液体(liquid)，其中可含有或不含有稳定剂。
药用制备物种也可将有效剂量的结合剂与无毒并适合丸剂制造的赋形剂相混合。通过将丸剂溶剂在无菌水或其它载体中，溶液可被制成单位剂量形式。合适的赋形剂包括(但不仅限于)稀释剂如碳酸钙、碳酸钠或重碳酸钠、乳糖、磷酸钙；或粘合剂如淀粉、白明胶或阿拉伯树胶；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
本领域技术人员也明了其它形式的药用组合物，包括使结合剂分子持续或受控释放的剂型。本领域技术人员熟知多种涉及其它持续或受控释放输送方式的制剂方法，例如脂质体载体、生物可降解微粒或多孔珠。如见PCT/US93/00829，其中描述了通过多孔聚合物微粒输送药用组合物进行受控释放。其它持续释放的例子包括包括成型的半透性聚合物基质，如膜或微胶囊。持续释放机制可包括聚酯，水凝胶，聚交酯(U.S.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman 等，Biopolymers，22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer 等，J Biomed Mater Res，15：167-277，(1981))和(Langer 等，Chem Tech，12：98-105(1982))，乙烯-醋酸乙烯共聚物(Langer 等，supra)或poly-D(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。持续释放组合物也包括脂质体，可通过若干种本领域已知方法进行制备。如见Eppstein 等，Proc Natl Acad Sci(USA)，82：3688-3692(1985)；EP36,676；EP 88,046；EP 143,949。
用于体内给药的药用组合物典型必须无菌。这可通过使用无军旅膜过滤来实现。当组合物为冻干形式时，这种除菌方法可在冻干之前或之后(重新溶解后)进行。用于注射的组合物可以在冻干形式下保存或在溶液中保存。另外盛装注射用组合物的容器通常具有无菌阀门，例如使用静脉注射溶液包或者经由一个可被皮下注射针头所刺穿的塞子。
一旦药用组合物制剂完成，可以将其以溶液、悬液、凝胶、乳状液、固体、脱水或冻干粉的形式装在无菌小瓶中。这些制剂的储存方式可以为即用的形式，或者为使用前需要重溶的形式(如冻干)。
在本发明的一个特定实施方案中，使用成套包装盒以得到单剂量给药单位。成套包装盒中可含有两种容器，第一种含有干燥蛋白，第二种含有水状制剂。本发明也考虑使用这类成套包装盒，即含有单腔或多腔预填充注射器(如液体注射器和液体溶胶注射器(lyosyringes))。
药用组合物的使用有效剂量依赖于如治疗环境和目标。本领域技术人员将理解合适的治疗剂量水平因此将高低不同，部分依赖于输送分子、待使用结合剂分子的使用指导、给药途径、以及患者的体格(体种、体表面积或器官体积)和条件(年龄和总体健康状况)。因此临床医生可改变剂量并调整给药途径已达到最优治疗效果。根据上述因素，典型剂量范围可为约0.1mg/kg-100mg/kg。在其它实施方案中，剂量范围为约0.1mg/kg-100mg/kg，或者约1mg/kg-100mg/kg，或者约5mg/kg-100mg/kg。
任何化合物的治疗有效剂量开始都可通过细胞培养试验或动物模型进行估计，如使用小鼠、大鼠、兔、狗或猪。可使用动物模型来确定合适的浓度范围和给药途径。然后可使用这些信息来确定人体的有效剂量和给药途径。
精确剂量要根据需要治疗的受试者的相关因素来确定。调整剂量和给药方式以提供足够水平的活性化合物，或保持所需效果。被纳入考虑范围的因素可包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、年龄、体重、性别、给药的时机和频率、药物化合物、反应敏感性和治疗反应。根据特定组合物的半衰期和清除速率，长效药用组合物的给药频率可为每3d或4d一次，每周一次，或两周一次。
给药频率要依赖于所用剂型中结合剂的药代动力学参数。典型的，给予组合物直至药物达到所需效果为止。因此可单次给予组合物，或者在一个时期内多次给药(以相同或不同浓度/剂量)，或者持续灌输。精确确定合适的剂量将是例行工作。可通过使用合适的给药反应数据来估计合适的剂量。
药用组合物的给药途径与已知方法一致，如口服、静脉注射、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉、病灶内途径、髓内、脑脊髓膜内、心室内、穿皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部给药、舌下、尿道、阴道、或直肠途径、通过持续释放系统或移植设备。如果需要，可使用静脉推注或持续灌注。
或者可选择局部给药，通过移植膜、海绵或其它吸收了所需分子或将其包装进胶囊的合适材料来实现。使用移植装置时，可将移植物给予任何合适的组合或器官，而所需分子可通过扩散、定时释放推注或持续给予来进行输送。
在一些情况下，可能需要以先体外后体内(ex vivo)方式使用药用组合物。在这种方式下，从患者取出细胞、组织或器官然后暴露在药用组合物下，再移植回患者体内。
另外一些情况下，当结合剂为多肽分子时，可使用如本文所述方法来对某些细胞进行基因操作，然后将这些细胞移植入受试者体内，以表达并分泌该多肽。这种细胞可以是动物细胞或者人类细胞，也可以是自体同源细胞、异源细胞或异种细胞。任选可使用无限增殖化细胞。为减少免疫反应的机会，这些细胞可被装入胶囊以避免渗透到周围组织。胶囊材料通常为生物相容、半透性聚合物外壳或包膜，它们必须允许蛋白释放并且可防止细胞被患者免疫系统或其它环境有害因子所破坏。
联合疗法
可联合使用本发明的特异性结合剂和Ang-2相关疾病治疗中的其它治疗方法。这些治疗方法包括入放疗、化疗和靶疗法，如下文所述。本发明也考虑了其它没有在本文中特别列出的连用疗法。
因此，本发明包括联合使用本发明的一种或多种特异性结合剂和一种或多种其它合适药物，来给予同一患者体内，给药均按照各自药物合适的方法进行。这包括同时给予本发明的特异性结合剂和一种或多种合适药物。这里所用的“同时给药”指本发明的一种或多种特异性结合剂和其它一种或多种合适药物基本上同时给药。
这里所用的“非同时给药”指本发明的一种或多种选择性结合剂与另一种或多种合适试剂的在不同时间给药，不管给药重叠与否，而二者给药的前后顺序随意。这包括(但不仅限于)联用成分顺序给药(如预处理、后处理或重叠处理)，和轮流给予药物，以及一种成分长期给药而其它则间歇给药。可以在同一制剂中给予各种成分或者在分开的制剂中给予，给予途径也可相同或不同。
在某些实施方案中，联合治疗包括使用能够结合Ang-2的特异性结合剂，以及至少一种其它抗促血管生成素剂。这种药物包括(但不仅限于)体外合成的化学组合物、抗体、抗原结合区域、放射性核以及这些物质的组合。在某些实施方案中，使用的药物可抑制或激发其靶子(如受体、酶激活或抑制)，从而起始细胞死亡或破坏细胞生长。
化疗可使用抗肿瘤药物，如烷基化合物，包括：氮芥如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲如亚硝脲氮芥(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)；乙烯亚胺/甲基三聚氰胺如三亚乙基三聚氰胺(TEM)、三乙烯硫代磷酰胺(噻替派)、六甲基三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺)；磺酸烷基酯如白消安；三嗪如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢物包括叶酸类似物如甲氨喋呤和三甲曲沙；嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、阿糖胞苷(AraC，阿糖胞苷)、5-氮杂胞嘧啶核苷、2，2′-双氟去氧胞苷；嘌啉类似物如6-巯基嘌啉、6-硫鸟嘌啉、咪唑巯嘌啉、2’-脱氧助间型霉素(喷司他丁)、红-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨、2-氯去氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)、2-CdA)；天然产物包括抗有丝分裂药物如紫杉醇(paclitaxel)、长春花生物碱包括长春碱(VLB)、长春新碱和长春瑞宾(vinorelbine)、多烯紫杉醇、雌莫司汀(Estramustine)和磷雌氮芥；表鬼臼毒素(ppipodophylotoxins)如依托泊甙和替尼泊苷；抗生素如纺线菌素D、道诺霉素(红比霉素)、阿霉素、米托蒽醌、去甲氧基柔红霉素、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)、丝裂霉素C、放射菌素；酶如L-天冬酰胺酶；生物反应修饰物如α干扰素、IL-2、G-CSF和GM-CSF；各种药物包括铂配合物如顺铂和顺铂、蒽醌类(anthracenediones)如米托蒽醌、取代的脲如羟基脲、甲苄肼衍生物包括N-甲苄肼(MIH)和甲基苄肼；肾上腺皮质抑制剂如米托坦(o，p′-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂包括肾上腺皮质类固醇如强的松和等效物、地塞米松和氨鲁米特；孕酮如己酸孕酮单酯、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素如己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素如三苯氧胺；男性激素包括丙酸睾酮和氟羚甲基睾丸素/等效物；抗雄激素如如氟他胺、促性腺激素-释放激素类似物和亮丙瑞林；和非类固醇抗雄激素如氟他胺。
癌症治疗(可通过给予Ang-2的特异性结合剂)也包括(但不仅限于)本文所述的靶向疗法。靶向疗法例如(但不仅限于)使用治疗性抗体。治疗性抗体包括如(但不仅限于)鼠源抗体、鼠-人嵌合抗体、CDR-移植抗体、人源化抗体或完全人类抗体，以及合成抗体，包括(但不仅限于)从抗体文库中筛选所得的抗体。抗体包括如(但不仅限于)可结合于肿瘤细胞上的细胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白(mucin-like glycoprotein)，以及表皮生长因子受体(EGFR)，并可对展示这些蛋白的肿瘤细胞任选产生抑细胞生长和/或细胞毒性作用的抗体。抗体也包括如HERCEPTINTM(trastuzumab)(它可被用来治疗乳腺癌和其它癌症)、ITUXANTM(rituximab)、ZEVALINTM(替伊莫单抗)、GLEEVECTM，和LYMPHOCIDETM(依帕珠单抗)(它可被用来治疗非何杰金瘤和其它癌症)。某些抗体例子也包括ERBITUXTM(IMC-C225)、IRESSATM(ertinolib)、BEXXARTM(碘-131托西莫单抗)、KDR(激酶结构域受体)抑制剂、抗VEGF抗体和拮抗剂(如AVASTINTM和VEGAF-TRAP)、抗VEGF受体抗体和抗原结合区、抗Ang-1抗体和抗原结合区、针对Tie-2和其它Ang-1/Ang-2受体的抗体、Tie-2配基、针对Tie-2激酶抑制剂的抗体，和(阿仑单抗)。在某些实施方案中，抗癌药物为能够选择性引起肿瘤细胞凋亡的多肽，包括(但不仅限于)TNF-相关多肽，如TRAIL(TNF受体凋亡诱导配体)。
在某些实施方案中，已知合适的抗癌药物具有抗血管生成作用。这种药物中的某些包括(但不仅限于)IL-8，CampathTM，B-FGF，FGF拮抗剂，Tek拮抗剂(Cerretti 等，U.S.公开No.2003/0162712，Cerretti等，美国专利No.6,413,932；Cerretti等，美国专利No.6,521,424，均通过引用并入本文)，抗TWEAK药物(包括(但不仅限于)抗体和抗原结合区)，可溶性TWEAK受体拮抗剂(Wiley，美国专利No.6,727,225)，ADAM去整合素(distintegrins)(或其片段以抑制整合素与其配体的结合，Fanslow等，U.S.公开No.2002/0042368)，抗eph受体和抗ephrin抗体(和抗原结合区)或拮抗剂(美国专利No.5,981,245、5,728,813、5,969,110、6,596,852、6,232,447、6,057,124和它们的专利家族成员)，本文所述的抗VEGF药物(如特异性结合VEGF的抗体和抗原结合区，或可溶性VEGF受体或其配基结合区)如AVASTINTM或VEGF-TRAPTM，抗VEGF受体药物(如特异性结合它的抗体和抗原结合区)，EGFR抑制剂(如特异性结合它的抗体和抗原结合区)如panitumumab，IRESSATM(gefitinib)，TARCEVATM(erlotinib)，抗Ang-1和抗Ang-2药物(如特异性结合它的抗体和抗原结合区或特异性结合它们的受体(如Tie-2/TEK)的抗体和抗原结合区)，和抗Tie-2激酶抑制剂(特异性结合生长因子并抑制其活性的抗体，如干细胞生长因子抑制剂(HGF，也称分散因子(ScatterFactor))，和特异性结合其受体“c-met”的抗体和抗原结合区，抗PDGF-BB拮抗剂，针对PDGF-BB配体的抗体和抗原结合区，PDGFR激酶抑制剂。
在某些实施方案中，癌症治疗药物为促血管生成素抑制剂。其中一些包括(但不仅限于)SD-7784(Pfizer，USA)；西仑吉肽(cilengitide)(Merck KGaA，Germany，EPO 770622)；pegaptaniboctasodium，(Gilead Sciences，USA)；肿瘤血管抑制肽(Alphastatin)，(BioActa，UK)；M-PGA，(Celgene，USA，US 5712291)；伊洛马司他(ilomastat)(Arriva，USA，US 5892112)；semaxanib，(Pfizer，USA，US5792783)；vatalanib，(Novartis，Switzerland)；2-甲氧雌二醇，(EntreMed，USA)；TLC ELL-12，(Elan，Ireland)；醋酸阿奈可他，(Alcon，USA)；α-D148Mab，(Amgen，USA)；CEP-7055，(Cephalon，USA)；抗VnMab，(Crucell，Netherlands)；DAC：抗血管生成，(ConjuChem，Canada)；Angiocidin，(InKine Pharmaceutical，USA)；KM-2550，(KyowaHakko，Japan)；SU-0879，(Pfizer，USA)；CGP-79787，(Novartis，Switzerland，EP 970070)；ARGENT technology，(Ariad，USA)；YIGSR-Stealth，(Johnson&Johnson，USA)；纤维蛋白原-E片段，(BioActa，UK)；血管生成抑制剂，(Trigen，UK)；TBC-1635，(EncysivePharmaceuticals，USA)；SC-236，(Pfizer，USA)；ABT-567，(Abbott，USA)；Metastatin，(EntreMed，USA)；血管生成抑制剂(Tripep，Sweden)；maspin，(Sosei，Japan)；2-甲氧雌二醇，(Oncology SciencesCorporation，USA)；ER-68203-00，(IVAX，USA)；氟草胺(Benefin)，(Lane Labs，USA)；Tz-93，(Tsumura，Japan)；TAN-1120，(Takeda，Japan)；FR-111142，(Fujisawa，Japan，JP 02233610)；血小板第四因子，(RepliGen，USA，EP 407122)；血管上皮生长因子抑制剂，(Borean，Denmark)；癌症治疗(cancer therapy)，(university of South Carolina，USA)；bevacizumab(pINN)，(Genentech，USA)；血管生成抑制剂，(SUGEN，USA)；XL 784，(Exelixis，USA)；XL 647，(Exelixis，USA)；MAb，α5β3整合素，第二代，(Applied Molecular Evolution，USA andMedImmune，USA)；基因治疗，视网膜病(gene therapy，retinopathy)，(Oxford BioMedica，UK)；enzastaurin hydrochloride(USAN)，(Lilly，USA)；CEP 7055，(Cephalon，USA and Sanofi-Synthelabo，France)；BC1，(Genoa Institute of Cancer Research，Italy)；血管生成抑制剂，(Alchemia，Australia)；VEGF拮抗剂，(Regeneron，USA)；rBPI 21和BPI-起源的抗血管生成剂，(XOMA，USA)；PI 88，(Progen，Australia)；西仑吉肽(cilengitide)(pINN)，(Merck KGaA；Munich Technicaluniversity，Germany，Scripps Clinic and Research Foundation，USA)；cetuximab(INN)，(Aventis，France)；AVE 8062，(Ajinomoto，Japan)；AS1404，(Cancer Research Laboratory，New Zealand)；SG 292(Telios，USA)；Endostatin，(Boston Childrens Hospital，USA)；ATN 161，(Attenuon，USA)；人血管抑素(angiostatin)，(Boston Childrens Hospital，USA)；2-甲氧雌二醇，(Boston Childrens Hospital，USA)；ZD 6474，(AstraZeneca，UK)；ZD 6126，(Angiogene Pharmaceuticals，UK)；PPI2458，(Praecis，USA)；AZD 9935，(AstraZeneca，UK)；AZD 2171，(AstraZeneca，UK)；vatalanib(pINN)，(Novartis，Switzerland andSchering AG，Germany)；组织因子突击抑制剂(EntreMed，USA)；pegaptanib(Pinn)，(Gilead Sciences，USA)；黄姜根醇(xanthorrhizol)，(Yonsei university，South Korea)；基因疫苗VEGF-2，(Scripps Clinic andResearch Foundation，USA)；SPV5.2，(Supratek，Canada)；SDX 103，(university of California at San Diego，USA)；PX 478，(ProlX，USA)；METAS TATIN，(EntreMed，USA)；肌钙蛋白I，(Harvard university，USA)；SU 6668，(SUGEN，USA)；OXI 4503，(OXiGENE，USA)；o-胍，(Dimensional Pharmaceuticals，USA)；motuporamine C，(BritishColumbia university，Canada)；CDP 791，(Celltech Group，UK)；atiprimod(pINN)，(GlaxoSmithKline，UK)；E 7820，(Eisai，Japan)；CYC381，(Harvard university，USA)；AE 941，(Aeterna，Canada)；疫苗，血管生成(vaccine，angiogenesis)(EntreMed，USA)；尿激酶纤维蛋白溶酶原激活质抑制剂(Dendreon，USA)；oglufanide(pINN)，(Melmotte，USA)；HIF-1alfa inhibitors，(Xenova，UK)；CEP 5214，(Cephalon，USA)；BAY RES 2622，(Bayer，Germany)；Angiocidin，(InKine，USA)；A6，(Angstrom，USA)；KR 31372，(Korea Research Institute of ChemicalTechnology，South Korea)；GW 2286，(GlaxoSmithKline，UK)；EHT0101，(ExonHit，France)；CP 868596，(Pfizer，USA)；CP 564959，(OSI，USA)；CP 547632，(Pfizer，USA)；786034，(GlaxoSmithKline，UK)；KRN 633，(Kirin Brewery，Japan)；药物给予系统，眼内，2-甲氧雌二醇(drug delivery system，intraocular，2-methoxyestradiol)(EntreMed，USA)；anginex，(Maastricht university，Netherlands，and Minnesotauniversity，USA)；ABT 510，(Abbott，USA)；AAL 993，(Novartis，Switzerland)；VEGI，(ProteomTech，USA)；肿瘤坏死因子α抑制剂，(National Institute on Aging，USA)；SU 11248，(Pfizer，USA and SUGENUSA)；ABT 518，(Abbott，USA)；YH16，(Yantai Rongchang，China)；S-3APG，(Boston Childrens Hospital，USA and EntreMed，USA)；MAb，KDR，(ImClone Systems，USA)；MAb，α5β1，(Protein Design，USA)；KDR激酶抑制剂(Celltech Group，UK，and Johnson&Johnson，USA)；GFB 116，(South Florida university，USA and Yale university，USA)；CS706，(Sankyo，Japan)；combretastatin A4前体药物，(Arizona Stateuniversity，USA)；软骨素AC，(IBEX，Canada)；BAY RES 2690，(Bayer，Germany)；AGM 1470，(Harvard university，USA，Takeda，Japan，andTAP，USA)；AG 13925，(Agouron，USA)；四硫钼酸铵，(university ofMichigan，USA)；GCS 100，(Wayne State university，USA)CV 247，(IvyMedical，UK)；CKD 732，(Chong Kun Dang，South Korea)；MAb，血管上皮生长因子(Xenova，UK)；irsogladine(INN)，(Nippon Shinyaku，Japan)；RG 13577，(Aventis，France)；WX 360，(Wilex，Germany)；squalamine(pINN)，(Genaera，USA)；RPI 4610，(Sirna，USA)；cancertherapy，(Marinova，Australia)；heparanase抑制剂，(InSight，Israel)；KL 3106，(Kolon，South Korea)；Honokiol，(Emory university，USA)；ZK CDK，(Schering AG，Germany)；ZK Angio，(Schering AG，Germany)；ZK 229561，(Novartis，Switzerland，and Schering AG，Germany)；XMP 300，(XOMA，USA)；VGA 1102，(Taisho，Japan)；VEGF受体调节物，(Pharmacopeia，USA)；VE-cadherin-2拮抗剂，(ImClone Systems，USA)；Vasostatin，(National Institutes of Health，USA)；vaccine，Flk-1，(ImClone Systems，USA)；TZ 93，(Tsumura，Japan)；TumStatin，(Beth Israel Hospital，USA)；部分长度可溶性FLT 1(vascular endothelial growth factor receptor 1)，(Merck&Co，USA)；Tie-2配体，(Regeneron，USA)；血小板反应蛋白1抑制剂，(AlleghenyHealth，Education and Research Foundation，USA)；；2-苯磺酰胺，4-(5-(4-氯苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)-；Arriva；和C-Met.AVE 8062((2S)-2-氨基-3-羟基-N-[2-甲氧基-5-[(1Z)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯基丙酰胺单氢氯)；metelimumab(pINN)(免疫球蛋白G4，抗-(人转化生长因子β.1(人单克隆CAT 192.γ.4-链))，二硫化人单抗CAT192.κ.-链二聚物)；Flt3配体；CD40配体；白介素-2；白介素-12；4-1BB配体；抗4-1BB抗体；TNF拮抗剂和TNF受体拮抗剂，包括TNFR/Fc，TWEAK拮抗剂和TWEAK-R拮抗剂包括TWEAK-R/Fc；TRAIL；VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体；VEGF受体(包括VEGF-R1和VEGF-R2，也称为Flt1和Flk1或KDR)拮抗剂；CD148(也称为DEP-1，ECRTP，和PTPRJ，见Takahashi等，J.Am.Soc.Nephrol.10：2135-45(1999)，通过引用并入本文)拮抗剂；血小板反应蛋白1抑制剂，和Tie-2或Tie-2配体(如Ang-2)之一的抑制剂，或二者同时的抑制剂。本领域已知许多Ang-2抑制剂，包括某些抗Ang-2抗体(美国专利申请No.20030124129(相应于PCT申请No.WO03/030833)和美国专利No.6,166,185，其内容通过引用并入本文)。另外本领域也已知Ang-2肽体(peptibody)，可见如美国专利申请No.20030229023(相应于PCT申请No.WO03/057134)和美国专利申请No.20030236193，其内容通过引用并入本文。
某些癌症治疗药物包括(但不仅限于)萨立多胺(thalidomide)和类似物(N-(2，6-二氧代-3-哌啶基)苯邻二甲酰亚胺)；硫化多糖钠(tecogalansodium)(硫酸多糖肽聚糖(sulfated polysaccharide peptidoglycan))；TAN 1120(8-乙酰基-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-10-[[八氢-5-羟基-2-(2-羟丙基)-4，10-二甲基吡喃[3，4-d]-1，3，6-二氧杂氮杂环辛因(dioxazocin)-8-基]氧基]-5，12-萘二酮)；suradista(7，7′-[羰基双[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]双-1，3-萘二磺酸四钠盐)；SU 302；SU 301；SU 1498((E)-2-氰基-3-[4-羟基-3，5-双(1-甲基乙基)苯基]-N-(3-苯基丙基)-2-丙酰胺)；SU 1433(4-(6，7-二甲基-2-喹喔啉基)-1，2-苯二醇)；ST 1514；SR25989；可溶性Tie-2；SERM衍生物，Pharmos；semaxanib(pINN)(3-[(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮)；S 836；RG 8803；RESTIN；R 440(3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-6-硝基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)；R 123942(1-[6-(1，2，4-噻二唑-5-基)-3-哒嗪基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-4-哌啶胺)；脯氨酰羟化酶抑制剂；进展加速基因(progression elevated genes)；普啉司他(INN)((S)-2，2-二甲基-4-[[对-(4-吡啶氧基)苯基]磺酰基]-3-硫吗啉异甲羟肟酸)；NV 1030；NM 3(8-羟基-6-甲氧基-α-甲基-1-氧代-1H-2-苯并呲喃基-3醋酸)；NF 681；NF 050；MIG；METH 2；METH 1；manassantinB(α-[1-[4-[5-[4-[2-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羟基-1-甲基乙氧基]-3-甲氧基苯基]四氢-3，4-二甲基-2-呋喃]-2-甲氧基苯氧基]乙基]-1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-甲醇)；KDR单抗；α5β3整合素单抗；LY 290293(2-氨基-4-(3-吡啶基)-4H-萘并[1，2-b]吡喃-3-腈)；KP 0201448；KM 2550；整合素特异性肽；INGN 401；GYKI 66475；GYKI 66462；greenstatin(101-354-血纤维蛋白溶酶原(人))；风湿性关节炎、前列腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、内皮抑素、肠癌的基因治疗剂，ATF BTPI、抗血管生成基因、血管生成抑制剂或拮抗剂；白明胶酶抑制剂、FR 111142(4，5-二羟基-2-己烯酸5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷基]-1-氧杂螺[2.5]辛-6-基酯)；forfenimex(pINN)(S)-α-氨基-3-羟基-4-(羟甲基)苯乙酸)；纤维连接蛋白拮抗剂(1-乙酰基-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-丝氨酰-L-半胱氨酰-L-天冬酰胺)；纤维组织母细胞生长因子受体抑制剂；组织母细胞生长因子拮抗剂；FCE 27164(7，7′-[羰基双[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]双-1，3，5-萘三磺酸六钠盐)；FCE 26752(8，8′-[羰基双[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]双-1，3，6-萘三磺酸)；内皮单核细胞活性多肽II；VEGFR反义寡核苷酸；抗血管生成和肝营养因子；ANCHOR拮抗剂；内皮抑素；Del-1血管生成蛋白；CT 3577；contortrostatin；CM 101；软骨素酶AC；CDP 845；CanStatin；BST 2002；BST 2001；BLS 0597；BIBF 1000；ARRESTIN；apomigren(1304-1388-XV类胶原质(人基因COL15A1α链前体))；血管抑制素；aaATIII；A 36；醋酸9α-氟甲氧基孕酮(fluoromedroxyprogesterone)((6-α)-17-(乙酰氧基)-9-氟-6-甲基-孕甾-4-烯-3，20-二酮)；2-甲基-2-酞酰亚氨基-戊二酸(2-(1，3-二氢-1-氧代-2H-异吲哚-2-基)-2-甲基戊二酸)；Yttrium 90标记的单抗BC-1；Semaxanib(3-(4，5-二甲基吡咯-2-基亚甲基)吲哚-2-酮)(C15H14N2O)；PI 88(硫酸化磷酸甘露戊糖)；Alvocidib(4H-1-苯并吡喃-4-酮，2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(3-羟基-1-甲基-4-哌嗪基)-顺-(-)-)(C21H20C1N O5)；E 7820；SU 11248(5-[3-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺)(C22H27F N4O2)；角鲨胺(胆甾烷-7，24-二醇，3-[[3-[(4-氨基丁基)氨基丙基]氨基]-，24-(硫酸氢盐)，(3.β.，5.a.，7.a.)-)(C34H65N3O5S)；Eriochrome Black T；AGM 1470(氨基甲酸，(氯乙酰)-，5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷基]-1-氧杂螺[2，5]辛-6-基酯[3R-[3α，α(2R，3R)，5β，6β]])(C19H28C1N O6)；AZD 9935；BIBF 1000；AZD 2171；ABT 828；KS-白细胞介素-2；uteroglobin；A 6；NSC 639366延胡索酸(1-[3-(二乙基氨基)-2-羟基丙基氨基]-4-(氧杂丙烷(oxyran)-2-基甲基氨基)蒽醌)(C24H29N3O4.C4H4O4)；ISV 616；抗-ED-B融合蛋白；HUI 77；Troponin I；BC-1单抗；SPV 5.2；ER 68203；CKD731(3-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2(E)-丙烯酸(3R，4S，5S，6R)-4-[2(R)-甲基-3(R)-3(R)-(3-甲基-2-丁烯基)氧杂丙烷-2-基]-5-甲氧基-1-氧杂螺[[2.5]辛-6-基酯)(C28H38O8)；IMC-1C11；aaATIII；SC 7；CM 101；Angiocol；Kringle 5；CKD 732(3-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-2(E)-丙烯酸)(C29H41N O6)；U 995；Canstatin；SQ 885；CT 2584(1-[11-(十二氨基)-10-羟基十一烷基]-3，7-二甲基黄嘌呤)(C30H55N5O3)；Salmosin；EMAP II；TX 1920(1-(4-甲基哌嗪基)-2-(2-硝基-1H-1-咪唑酰基)-1-乙酮)(C10H15N5O3)；α-v β-x抑制剂；CHIR 11509(N-(1-丙炔基)甘氨酰-[N-(2-萘基)]甘氨酰-[N-(氨基甲酰甲基)]甘氨酸双(4-甲氧基苯基)甲基酰胺)(C36H37N5O6)；BST 2002；BST 2001；B 0829；FR 111142；4，5-二羟基-2(E)-己烯酸(3R，4S，5S，6R)-4-[1(R)，2(R)-环氧-1，5-二甲基-4-己烯基]-5-甲氧基-1-氧杂螺[2.5]辛烷-6-基酯(C22H34O7)；和激酶抑制剂包括(但不仅限于)N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺；4-[4-[[[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基]羰基]氨基]苯氧基]-N-甲基-2-吡啶羧酰胺；N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(5-氟-1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺；3-[(4-溴-2，6-二氟苯基)甲氧基]-5-[[[[4-(1-吡咯烷基)丁基]氨基]羰基]氨基]-4-异噻唑羧酰胺；N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基-4-哌啶基)甲氧基]-4-喹唑啉胺；3-[5，6，7，13-四氢-9-[(1-甲基乙氧基)甲基]-5-氧代-12H-茚并[2，1-a]吡咯并[3，4-c]咔唑-12-基]丙基酯N，N-二甲基-甘氨酸；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-哌啶羧酰胺；N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-哌嗪]氨基]-苯基]苯甲酰胺；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-4-喹唑啉胺；N-(3-乙基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺；N-(3-((((2R)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((3-(1，3-氧氮杂茂-5-基)苯基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；2-(((4-氟甲基)甲基)氨基)-N-(3-((((2R)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶羧酰胺；N-[3-(吖丁啶-3-基甲氧基)-5-三氟甲基)苯基]-2-(4-氟-苄氨基)-烟酰胺；6-氟-N-(4-(1-甲基乙基)苯基)-2-((4-吡啶甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；2-((4-吡啶甲基)氨基)-N-(3-(((2S)-2-吡咯烷基甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-(1，1-二甲基乙基)-1H-吡唑-5-基)-2-((4-吡啶甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-6-基)-2-((4-吡啶甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-((((2S)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((4-吡啶甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；2-((4-吡啶甲基)氨基)-N-(3-((2-(1-吡咯烷基)乙基)氧基)-4-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-((4-吡啶甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(4-(五氟乙基)-3-(((2S)-2-吡咯甲基)氧基)苯基)-2-((4-吡啶甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-((3-吖丁啶基甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((4-吡啶甲基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(3-(4-哌啶基氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((2-(3-吡啶)乙基)氨基)-3-吡啶羧酰胺；N-(4，4-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-7-基)-2-(1H-吲哚-6-基氨基)-烟酰胺；2-(1H-吲哚-6-基氨基)-N-[3-(1-甲基吡啶-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-烟酰胺；N-[1-(2-二甲基氨基-乙酰基)-3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基]-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；2-(1H-吲唑-6-基氨基)-N-[3-(吡啶-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-烟酰胺；N-(1-乙酰基-3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；N-(4，4-二甲基-1-氧代-1，2，3，4-四氢-异喹啉-7-基)-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；N-[4-(叔丁基)-3-(3-哌啶丙基)苯基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]羧酰胺；N-[5-(叔丁基)异噁唑-3-基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]羧酰胺；和N-[4-(叔丁基)苯基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]羧酰胺和激酶抑制剂，见美国专利No.6,258,812；6,235,764；6,630,500；6,515,004；6,713,485；5,521,184；5,770,599；5,747,498；5,990,141；U.S.公开No.US20030105091；和PCT公开No.WO01/37820；WO01/32651；WO02/68406；WO02/66470；WO02/55501；WO04/05279；WO04/07481；WO04/07458；WO04/09784；WO02/59110；WO99/45009；WO98/35958；WO00/59509；WO99/61422；WO00/12089；和WO00/02871，均通过引用并入本文。
可与生长因子联合使用的治疗药物包括细胞因子、生长因子或其它造血因子如M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNF0、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子和红细胞生产素。其它成分可包括已知的血管生产素如Ang-1、-2、-4、-Y和/或人类促血管生成素多肽，和/或血管内皮生长因子(VEGF)。(P50-58)生长因子包括促血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体-IA、骨形态发生蛋白受体IB、脑元神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、细胞因子诱导嗜中性白细胞趋化因子-1、细胞因子诱导嗜中性白细胞趋化因子、内皮细胞生长因子、内皮素-1、表皮生长因子、上皮细胞来源的嗜中性粒细胞趋化物、纤维原细胞生长因子-4、纤维原细胞生长因子-5、纤维原细胞生长因子-6、f纤维原细胞生长因子-7、纤维原细胞生长因子-8、纤维原细胞生长因子-8b、纤维原细胞生长因子-8c、纤维原细胞生长因子-9、纤维原细胞生长因子-10、酸性纤维原细胞生长因子、碱性纤维原细胞生长因子、胶质细胞源性神经营养因子-1、胶质细胞源性神经营养因子-2、生长相关蛋白、生长相关蛋白-2、生长相关蛋白-3、肝素结合的表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体-1、神经生长因子、水晶石中因子受体、神经营养因子-3、神经营养因子-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子-2、血小板衍化内皮细胞生长因子、血小板衍化生长因子、血小板衍化生长因子A链、血小板衍化生长因子AA、血小板衍化生长因子AB、血小板衍化生长因子B链、血小板衍化生长因子BB、血小板衍化生长因子受体-1、血小板衍化生长因子受体-2、促进B细胞增殖刺激因子、肝细胞因子、肝细胞因子受体、转化生长因子-1、转化生长因子-2、转化生长因子-3、转化生长因子-1.2、转化生长因子-4、转化生长因子-5、潜在转化生长因子-1、转化生长因子-1结合蛋白I、转化生长因子-1结合蛋白II、转化生长因子-1结合蛋白III、肿瘤坏死因子I型受体(TNF-R1)、肿瘤坏死因子II型受体(TNF-R2)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、血管内皮生长因子、和上述分子的嵌合蛋白以及生物活性或免疫活性片段。
当然本发明的特异性结合剂可与一种或多种抗炎症药物联合给药。这里所用的“抗炎症因子”通常指任何降低患者炎症反应或肿胀的药物。本文提到了许多抗炎症因子实例，不过当然还有未被提及的其它何时抗炎症因子，但这些药物也在本发明的考虑范围之内。
抗炎症因子可以为如抑制了炎症细胞因子与其受体间作用的化合物。可与本发明特异性结合剂联合使用的细胞因子抑制剂包括如TGF-β拮抗剂(如抗体)和直接针对涉及到炎症的白介素的拮抗剂(如抗体)。本文描述了这些白介素，优选的包括(但不仅限于)IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17和IL-18。见Feghali，等，Frontiers in Biosci.，2：12-26(1997)。
本发明的特异性结合剂可与第一类蛋白激酶A抑制剂联合给药，以增强接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染者体内T细胞的增殖。
也可联合使用本发明的特异性结合剂和神经生长因子(NGF)，以治疗某些疾病。这些疾病包括神经退化性疾病、脊索伤害和多发性硬化症，还包括青光眼和糖尿病。
优选一种或多种IL-1抑制剂与本发明的特异性结合剂进行联合治疗。IL-1抑制剂包括(但不仅限于)IL-1受体肽片段，直接针对IL-1或IL-1β或第一类IL-1受体的抗体，以及包含所有或部分IL-1受体的重组蛋白(或其修饰变异体)，这包括基因修饰的突变蛋白、多聚体形式和持续释放制剂。特异拮抗剂包括IL-1ra多肽，IL-1β转换酶(ICE)抑制剂，第一类IL-1受体的拮抗抗体，第一类IL-1受体的IL-1结合形式和第二类IL-1受体，针对IL-1(包括IL-1α、IL-1β和其它IL-1家族成员)的抗体和治疗剂IL-1Trap(Regeneron)。IL-1ra包括美国专利No.5,075,222中所述的IL-1ra形式和修饰和变异体形式，包括美国专利5,922,573，WO 91/17184，WO 9216221和WO 9609323中所述。IL-1β转换酶(ICE)抑制剂包括肽酰和小分子ICE抑制剂，包括PCT专利申请WO 91/15577，WO 93/05071，WO93/09135，WO 93/14777，WO 93/16710，欧洲专利申请0547699中所述。非肽化合物包括下列文献中所述的此类化合物，PCT申请WO 95/26958、美国专利No.5,552,400、美国专利No.6,121,266、以及Dolle 等，J.Med.Chem.，39，pp.2438-2440(1996)。其它ICE抑制剂的描述见美国专利No.6,162,790、6,204,261、6,136,787、6,103,711、6,025,147、6,008,217、5,973,111、5,874,424、5,847,135、5,843,904、5,756,466、5,656,627、5,716,929。I型IL-1受体的IL-1结合形式和II型IL-1受体的描述见美国专利No.4,968,607、4,968,607、5,081,228、Re 35,450、5,319,071、和5,350,683。其他合适的IL-1拮抗剂包括(但不仅限于)可竞争性结合于IL-1信号受体的IL-1起源肽、I型IL-1受体。其它一些IL-1(和其它细胞因子)的拮抗剂的描述可见美国专利No.6,472,179。
此外，TNF抑制剂也是合适的，这包括(但不仅限于)TNFα的受体结合肽片段、抑制TNFα生成的反义寡核苷酸或核酶、直接针对TNFα抗体、包含TNFα受体全部或部分的重组蛋白或其修饰变异体，包括基因修饰变异蛋白嵌合形式和持续释放制剂。TACE(肿瘤坏死因子-α转换酶)抑制剂也是合适的，如TAPI(Immunex Corp.)和GW-3333X(Glaxo Wellcome Inc.)。抑制IgA-α1AT复合体(如EP 0614464B中所述)形成的分子或者针对此复合体的抗体也是合适的。其它合适的分子包括(但不仅限于)TNFα-抑制二糖、葡萄糖胺的硫酸盐衍生物，或其它类似的碳水化合物，见美国专利No.6,020,323，还包括TNFα肽抑制剂(美国专利No.5,641,751和5,519,000)，含有D-氨基酸的肽(美国专利No.5,753,628)。此外，TNFα转换酶的抑制剂也是合适的。WO 01/03719中进一步描述了可参与本发明联合使用的药物。
其它合适的分子包括(但不仅限于)小分子如萨立多胺或萨立多胺类似物、己酮可可碱(pentoxifylline)、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂或其它小分子。适于本发明的MMP抑制剂包括如美国专利No.5,883,131、5,863,949和5,861,510中所述分子，和美国专利No.5,872,146中所述的烷基肽酰化合物。其它能够减少TNFα生成的小分子包括如美国专利5,508,300、5,596,013和5,563,143中所述分子。其它合适的小分子包括(但不仅限于)美国专利5,747,514，和5,691,382中所述的MMP抑制剂，和美国专利No.5,821,262中所述的氧肟酸衍生物。其它合适的分子包括如可抑制磷酸二酯酶IV和TNFα生成的小分子，如取代的肟衍生物(WO 96/00215)、喹啉磺胺(美国专利No.5,834,485)、芳基呋喃衍生物(WO 99/18095)杂双环(heterobicyclic)衍生物(WO 96/01825；GB 2291422A)。抑制TNFα和IFNγ的噻唑衍生物(WO 99/15524)和抑制TNFα和其它炎症细胞因子的的黄嘌呤衍生物(见如美国专利No.5,118,500、5,096,906和5,196,430)也是合适的。美国专利No.5,547,979中所述分子也适用于本发明。
可在联合治疗中使用的其它药物和药物类型实例包括(但不仅限于)抗病毒药物、抗生素、止痛剂(如醋氨酚、可待因、萘磺酸丙氧芬、盐酸羟考酮、重酒石酸二氢可待因酮、曲马多)、皮质类固醇、炎症细胞因子拮抗剂、疾病调节抗风湿病药物(Disease-Modifying Anti-Rheumatic Drugs，DMARD)、非甾体类抗炎药(NSAID)、慢作用抗风湿药物(SAARD)。
疾病修饰抗风湿病药物(DMARD)包括如(但不仅限于)RheumatrexTM(甲氨喋呤)；(依那西普(etanercept))；(infliximab)；HumiraTM(阿达木单抗(Adalimumab))；(阿非莫单抗(afelimomab))；AravaTM(来氟米特(leflunomide))；KineretTM(阿那白滞素(anakinra))；AravaTM(来氟米特(leflunomide))；D-青霉胺；金硫基代丁二酸钠；羟氯喹；RidauraTM(金诺芬(Auranofin))；硫代葡萄糖金油剂(Solganal)；来那西普(lenercept)(Hoffman-La Roche)；CDP870(Celltech)；CDP571(Celltech)，以及EP 0516785B1、美国专利No.5,656,272、EP 0492448A1中所述药物；p55肿瘤坏死因子连接蛋白(onercept)(Serono；CAS reg.no.199685-57-9)；MRA(Chugai)；ImuranTM(咪唑硫嘌啉)；NFKB抑制剂；CytoxanTM(环磷酰胺)；环孢霉素；硫酸羟氯喹；二甲胺四环素；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；以及金化合物如口服金、硫代苹果酸金钠和金硫葡萄糖。
其它合适的分子包括如起源于TNFα受体分子胞外区的TNFR衍生物(不同于p55和p75TNFR)，例如WO 99/04001中所述的TNFR，包括起源于该TNFR的TNFR-Ig。此外合适的TNFα抑制剂也适合于本文所述用途。这不仅包括用作本文所述的针对TNFα或TNFR的抗体，也包括用作为可发挥TNFα的竞争性抑制剂作用的TNFα衍生肽(如美国专利美国专利No.5,795,859或No.6,107,273所述)，用作TNFR-IgG融合蛋白(如一个含有p55TNFα受体胞外部分的蛋白)，用作可溶性TNFR(不是IgG融合蛋白)，用作其它可减少内生性TNFα水平的分子，如TNFα转换酶抑制剂(见如美国专利5,594,106)，或小分子或TNFα抑制剂。以上许多在本文中具有描述。
尽管TNF抗体的最优剂量需要富有经验的医疗人员根据患者的具体需要而加以确定，针对TNFα的抗体的优选的一个剂量范围为0.1-20mg/kg，更优选为1-10mg/kg。其它合适的抗TNFα抗体的剂量为0.75-7.5mg/kg体重。
本发明也可使用特异性结合剂和任意一种或多种非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID的抗炎功能至少部分上依赖于它们对前列腺素合成的抑制。(Goodman and Gilman，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，MacMillan 7th Edition(1985))。NSAID的特征基团有9个：(1)水杨酸衍生物；(2)丙酸衍生物；(3)粗酸衍生物；(4)芬那酸衍生物；(5)羧酸衍生物；(6)丁酸衍生物；(7)，2-苯并噻嗪类；(8)吡唑和(9)吡唑啉酮。NSAID包括如(但不仅限于)AnaproxTM、AnaproxDSTM(甲氧萘丙酸钠)；AnsaidTM(氟比洛芬钠(flurbiprofen))；ArthrotecTM(双氯芬酸钠+米索前列醇(Misoprostil))；CataflamTM/VoltarenTM(双氯芬酸钾)；ClinorilTM(米索前列醇)；DayproTM(奥沙普秦(oxaprozin))；DisalcidTM(水杨酸水杨酸酯)；DolobidTM(二氟尼柳(Diflunisal))；EC NaprosynTM(甲氧萘丙酸钠)；FeldeneTM(吡罗昔康(piroxicam))；IndocinTM、Indocin SRTM(吲哚美辛(indomethacin))；LodineTM、Lodine XLTM(依托度酸(etodolac))；MotrinTM(异丁苯丙酸)；NaprelanTM(甲氧萘丙酸)；NaprosynTM(甲氧萘丙酸)；OrudisTM、(酮洛芬(ketoprofen))；OruvailTM(酮洛芬)；RelafenTM(萘丁美酮(nabumetone))；TolectinTM、(托美汀钠(tolmetin sodium))；TrilisateTM(三柳胆镁)；Cox-1抑制剂；Cox-2抑制剂如VioxxTM(rofecoxib)；Arcoxiatm(依托考昔(etoricoxib))、CelebrexTM(celecoxib)；MobicTM(美洛昔康(meloxicam))；BextraTM(valdecoxib)、DynastatTM(甲氧萘丙酸钠)；PrexigeTM(lumiracoxib)和nambumetone。其它合适的NSAID包括(但不仅限于)：ε-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟丁酸、阿米西群(amixetrine)、阿尼扎芬(anitrazafen)、安曲非宁(antrafenine)、bendazac、苄达赖氨酸(bendazac lysinate)、benzydamine、beprozin、溴哌莫(broperamole)、布可隆(bucolome)、丁苯唑酸(bufezolac)、环丙喹宗(ciproquazone)、cloximate、达齐胺(dazidamine)、地波沙美(deboxamet)、detomidine、吡啶基联苯基乙酰胺、difenpyramide、difisalamine、ditazol、依莫法宗(Emorfazone)、fanetizole mesylate、芬氟咪唑(fenflumizole)、氟奎氨苯酯(floctafenine)、flumizole、flunixin、氟丙喹宗(fluproquazone)、fopirtoline、磷霉素、胍美柳(guaimesal)、guaiazolene、isonixirn、盐酸利非他明(lefetamine HCl)、来氟米特(leflunomide)、洛非咪唑(lofemizole)、氯替法唑(lotifazole)、clonixinate溶菌酶、美西拉宗(meseclazone)、萘丁美酮(nabumetone)、尼克吲哚(nictindole)、尼美舒利(Nimesulide)、orgotein、奥帕诺辛(orpanoxin)、oxaceprolm、奥沙帕朵(oxapadol)、瑞尼托林(paranyline)、哌立索唑(perisoxal)、柠檬酸哌立酮、哌福肟(pifoxime)、萘普生哌嗪酸(Piproxen)、吡拉唑酸(pirazolac)、pirfenidone、普鲁奎松(proquazone)、普罗沙唑(proxazole)、thielavin B、替氟咪唑(tiflamizole)、替美加定(timegadine)、托来汀(tolectin)、托帕朵(tolpadol)、tryptamid和分配为如下列公司编码的药物480156S、AA861、AD1590、AFP802、AFP860、AI77B、AP504、AU8001、BPPC、BW540C、CHINOIN 127、CN100、EB382、EL508、F1044、FK-506、GV3658、ITF182、KCNTEI6090、KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、ONO3144、PR823、PV102、PV108、R830、RS2131、SCR152、SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281、SY6001、TA60、TAI-901(4-苯酰-1-吲丹羧酸)、TVX2706、U60257、UR2301和WY41770。具有类似止痛和抗炎功能的NSAID结构相关物也可包括在其中。
合适的SAARD或DMARDS包括(但不仅限于)阿洛酮钠(allocupreide sodium)、金诺芬(Auranofin)、金硫葡萄糖(aurothioglucose)、α-硫金基乙酰苯胺(aurothioglycanide)、咪唑硫嘌啉、布喹那(Brequinar Sodium)、布溪那明(bucillamine)、钙3-硫金(aurothio)-2-丙醇-1-磺酸钠、苯丁酸氮芥、氯喹、氯丁扎利(clobuzarit)、铜克索林(cuproxoline)、环磷酰胺、环胞霉素、氨苯砜、15-脱氧精胍菌素(15-deoxyspergualin)、双醋瑞因(Diacerein)、葡萄糖胺、金盐(如环喹金盐、硫代苹果酸金钠、硫代硫酸金钠)、羟化氯喹、羟基脲、凯布宗(kebuzone)、左咪唑、氯苯扎利(lobenzarit)、蜂毒肽、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、咪唑立宾(mizoribine)、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)、金硫乙酸钙、氮芥、D-青霉胺、羟基吡啶吡唑如SKNF86002和SB203580、雷帕霉素(Rapamycin)、硫醇、促胸腺生成素和长春新碱。具有类似止痛和抗炎功能的SAARD或DMARD结构相关物也可包括在其中。
信号级联中的激酶抑制剂也适合与本发明特异性结合剂联合使用。这包括(但不仅限于)能够抑制P-38的药物(又称“RK”或“SAPK-2”、Lee et al，Nature、372：739(1994))。P-38被描述为丝氨酸/苏氨酸激酶(见Han 等、Biochimica Biophysica Acta、1265：224-227(1995))。已发现P-38抑制剂通过抑制依赖于信号途径的激酶，干扰了胞外刺激与IL-1和TNFα与(涉及到阻遏信号传导(blocking signaltransduction)的)细胞中分泌之间的联系。
MK-2抑制剂和tp1-2抑制剂也合适。此外合适的还有T细胞抑制剂包括如ctla-4、CsA、Fk-506、OX40、OX40R-Fc、OX40抗体、OX40配体、OX40配体的抗体、ck和ZAP70。类维生素A包括口腔类维生素A和TGF-β拮抗剂也是合适的。
其它合适与本发明特异性结合剂联合使用的药物包括如任意一种或多种水杨酸衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐。这包括：醋氨沙洛(acetaminosalol)、阿洛普令(aloxiprin)、阿司匹林、扑炎痛(benorylate)、溴水杨醇、乙酰水杨酸钙、三柳胆镁、diflusinal、依特柳酯(etersalate)、芬度柳(fendosal)、2，5-二羟基苯甲酸、水杨酸乙二醇、水杨酸咪唑、赖氨匹林、mesalamine、水杨酸吗啉、1-萘基水杨酸、水杨嗪、帕沙米特(parsalmide)、苯基乙酰水杨酸、苯基水杨酸、醋水杨胺(salacetamide)、水杨酰胺O-乙酸、水杨酸水杨酸酯和水杨嗪。具有类似止痛和抗炎功能的水杨酸结构相关物也可包括在其中。其它合适的药物包括如丙酸衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：阿米洛芬(Alminoprofen)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、布氯酸(Bucloxic acid)、卡洛芬(Carprofen)、右吲哚洛芬(dexindoprofen)、苯氧布洛芬(fenoprofen)、氟诺洛芬(flunoxaprofen)、氟洛芬(fluprofen)、氟比洛芬钠(flurbiprofen)、呋洛芬(furcloprofen)、异丁苯丙酸、异丁苯丙酸铝、黄原酸异丙酯、吲哚洛芬(indoprofen)、异洛芬(isoprofen)、苯酮苯丙酸(ketoprofen)、洛索洛芬(loxoprofen)、米洛芬(miroprofen)、甲氧萘丙酸、oxaprozin、吡酮洛芬(piketoprofen)、pimeprofen、吡氯布洛芬(pirprofen)、普拉洛芬(Pranoprofen)、丙替嗪酸、pyridoxiprofen、舒洛芬(suprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)和硫噁洛芬。具有类似止痛和抗炎功能的丙酸结构相关物也可包括在其中。其它合适的药物包括如醋酸衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：阿西美辛、阿氯芬酸(alclofenac)、氨基苯酰基苯乙酸、丁苯羟酸、吲哚拉新(cinmetacin)、氯吡酸(clopirac)、地美辛(delmetacin)、双氯芬酸钠(diclofenacsodium)、依托度酸(etodolac)、联苯乙酸(FELBINAC)、芬氯酸(fenclofenac)、苯克洛酸(fenclorac)、芬克洛酸(fenclozic acid)、芬替酸(fentiazac)、乙基二氢苯并呋喃乙酸、葡美辛(glucametacin)、异丁苯乙酸(ibufenac)、茚甲新、三苯唑酸(isofezolac)、伊索克酸(Isoxepac)、氯那唑酸(lonazolac)、甲嗪酸(metiazinic acid)、奥沙美辛(oxametacin)、oxpinac、吡美辛(pimetacin)、丙谷美辛(proglumetacin)、舒林酸(sulindac)、他美辛(talmetacin)、羟哌苯酮(tiaramide)、二氢氧二苯并硫杂、痛灭定(tolmetin)、齐多美辛(zidometacin)、佐灭酸(zomepirac)。具有类似止痛和抗炎功能的醋酸结构相关物也可包括在其中。此外合适的还有灭酸衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：苯乙氨茴酸、依托芬那酯(etofenamate)、氟灭酸(flufenamicacid)、异尼辛(isonixin)、甲氯灭酸(meclofenamic acid)、甲氯胺苯酸钠(meclofenamate sodium)、甲氯芬那酸(medofenamic Acid)、甲灭酸(mefanamic acid)、尼氟灭酸(niflumic acid)、他尼氟酯(talniflumate)、特罗氨酯(terofenamate)、托灭酸(tolfenamic acid)和乌芬那酯(ufenamate)。具有类似止痛和抗炎功能的灭酸结构相关物也可包括在其中。
此外合适的还有羧酸衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：克力丹酸(clidanac)、二氟尼柳(Diflunisal)、氟苯柳(flufenisal)、inoridine、酮咯酸(ketorolac)和替诺立啶(tinoridine)。具有类似止痛和抗炎功能的羧酸结构相关物也可包括在其中。此外合适的还有丁酸衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：丁丙二苯肼(bumadizon)、布替布芬(butibufen)、苯布芬(fenbufen)和联苯丁酸(xenbucin)。具有类似止痛和抗炎功能的丁酸结构相关物也可包括在其中。此外合适的还有昔康衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：德罗喜康(droxicam)、依诺利康(enolicam)、异恶噻酰胺(isoxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、湿痛喜康(Sudoxicam)、替诺昔康(tenoxicam)和4-羟基-1，2-苯并噻嗪1，1-二氧4-(N-苯基)-羧酰胺。具有类似止痛和抗炎功能的昔康结构相关物也可包括在其中。此外合适的还有吡唑衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：二苯米唑(difenamizole)和依匹唑(epirizole)。具有类似止痛和抗炎功能的吡唑结构相关物也可包括在其中。此外合适的还有吡唑啉酮衍生物，及其酯前体药物或药学上可接受的盐，这包括：阿扎丙宗(apazone)、阿扎丙宗(azapropazone)、苄哌立隆(benzpiperylon)、非普拉宗(feprazone)、莫非布宗(mofebutazone)、吗拉宗(morazone)、羟基保泰松、苯基丁氮酮、哌布宗(pipebuzone)、propylphenazone、雷米那酮(ramifenazone)、琥布宗(suxibuzone)和thiazolinobutazone。具有类似止痛和抗炎功能的吡唑啉酮结构相关物也可包括在其中。
此外，皮质甾类酯前体药物和药学可接受的盐适于用在对TNF介导的疾病的治疗中。皮质甾类酯前体药物和药学可接受的盐包括氢化可的松以及来源于氢化可的松的化合物，如21-乙酸基-孕烯醇酮、alclomerasone、阿尔孕酮(algestone)、安西奈德(amcinonide)、氯地米松(beclomethasone)、倍他米松(β-methasone)、戊酸倍他米松(betamethasone valerate)、布地奈德(budesonide)、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯倍他索(clobetasol)、丙酸氯倍米松(clobetasolpropionate)、氯倍他松(clobetasone)、丁酸氯倍他松(clobetasonebutyrate)、氯可托龙(clocortolone)、氯泼尼醇(cloprednol)、肾上腺酮、可的松、可的伐唑(cortivazol)、deflazacon、地索奈德(desonide)、desoximerasone？、地塞米松、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龙(diflucortolone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、甘草次酸(enoxolone)、氟扎可特(fluazacort)、氟氯奈德(flucloronide)、flumethasone、氟米松匹酯(flumethasone pivalate)、氟尼缩松(Flunisolide)、氟轻松(flucinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟氢松醋酸酯(fluorocinolone acetonide)、氟可丁(fluocortin butyl)、氟可龙(fluocortolone)、己酸氟可龙(fluorocortolone hexanoate)、双氟可龙戊酸酯(diflucortolone valerate)、氟甲松龙(Fluorometholone)、醋酸氟培龙(fluperolone acetate)、醋酸氟泼尼定(fluprednidene acetate)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、氟羟可舒松(flurandenolide)、福莫可他(formocortal)、氯氟松、卤米松、醋酸卤泼尼松(halopredone acetate)、氢可他酯、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、磷酸氢化可的松、21-钠琥珀酸氢化可的松、叔丁乙酸盐、氢化可的松、马泼尼酮(mazipredone)、甲羟松(medrysone)、甲泼尼松(meprednisone)、methylprednicolone、莫美他松糠酸酯(MometasoneFuroate)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼卡酯、氢化泼尼松、21-二乙氨基乙酸(diedryaminoacetate)泼尼松龙、氢化泼尼松磷酸钠、氢化泼尼松琥珀酸钠、氢化泼尼松21-m-苯甲酸钠、21-硬脂酰甘油酸钠、强的松龙叔丁乙酯、21-三甲基醋酸氢化泼尼松、强的松、泼尼松龙戊酸酯(prednival)、泼尼立定(prednylidene)、21-二乙基氨基醋酸泼尼立定、巯氢可的松(tixocortol)、氟羟氢化泼尼松、丙酮氟羟氢化泼尼松、苯曲安奈德(triamcinolone benetonide)和己曲安缩松(triamcinolonehexacetonide)。具有类似止痛和抗炎功能的皮质甾类结构相关物也可包括在其中。
抗微生物剂(及其酯前体药物和药学可接受的盐)也可应用在本文所述的联合使用中。合适的抗菌剂包括如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、金霉素(aureomicin)、杆菌肽、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、cephachlor、头孢氨苄、头孢拉定、环丙沙星、克拉维酸、氯唑青霉素、双氯青霉素、红霉素、氟氯青霉素、庆大霉素、短杆菌肽、甲氧苯青霉素、新霉素、苯唑西林、青霉素以及万古霉素。具有类似止痛和抗炎功能的抗菌剂结构相关物也可包括在其中。
其它合适的化合物包括(但不仅限于)BN 50730；替尼达普(tenidap)；E 5531；tiapafant PCA 4248；尼美舒利(Nimesulide)；panavir；咯利普兰(Rolipram)；RP 73401；T肽(peptide T)；MDL 201，449A；(1R，3S)-顺式-1-[9-(2，6-二氨基嘌呤基)]-3-羟基-4-盐酸环戊烯；(1R，3R)-反式-1-[9-(2，6-二氨基)嘌啉]-3-乙酰氧基环戊烷；(1R，3R)-反式-1-[9-腺嘌啉)-3-叠氮基环戊烷甲酸和(1R，3R)-反式-1-[6-羟基-嘌啉-9-基)-3-叠氮基环戊烷。
已经发现IL-4在某些情况下可引起炎症反应，如在哮喘中IL-4在肺部的过量表达引起上皮细胞肥大，和淋巴细胞、嗜曙红细胞、嗜中性粒细胞的的积累。该反应代表了由其它Th2细胞因子所引起的前炎症反应的主要特征。因此如上文所述，IL-4的抑制剂也可在本发明中发挥作用。另外，某些免疫抑制剂药物当然也可用于治疗关节炎，这些药物包括(但不仅限于)iNOS抑制剂和5-脂肪氧合酶抑制剂。
已发现Ginger具有一定的抗炎作用，因此也适合作为本发明中的抗炎药物，类似情况还有软骨素。
在某些实施方案中，Ang-2特异性结合剂的给予可发生在抗癌药物治疗的之前、同时或之后。癌症包括如(但不仅限于乳癌、肠癌、胃癌、神经胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、遗传散发性乳头状肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、Li-Fraumeni综合征、胸膜恶性间皮瘤、黑素瘤、多骨髓瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、膀胱移行癌。
在某些实施方案中，可以单独使用Ang-2特异性结合剂或与至少一种其它癌症治疗药物联合使用。在某些实施方案中，Ang-2特异性结合剂与一种有效剂量的癌症治疗药物联合使用。这种可与Ang-2特异性结合剂联合使用的癌症治疗药物包括如(但不仅限于)anisamycin抗生素中格尔德霉素(geldanamycin)家族的成员；Pro-HGF；NK2；a c-蛋氨酸肽抑制剂；生长因子受体结合蛋白2(Grb2)SH2(Src homology 2)结构域的拮抗剂；Gab1调节物；显性阴性Src；von-Hippel-Landau抑制剂，包括(但不仅限于)渥曼青霉素；P13激酶抑制剂、其它抗受体(anti-receptor)疗法、抗EGFR、COX-2抑制剂、CelebrexTM、VioxxTM；血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF调节物、纤维原细胞生长因子(FGF)、FGF调节物、内皮生长因子(EGF)；EGF调节物；角化细胞生长因子(KGF)、KGF相关分子、KGF调节物；基质金属蛋白酶(MMP)调节物。
在本发明的某些实施方案中，所用药物包括Ang-2特异性结合剂和至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，并使用这些药物进行治疗。在某些实施方案中，所用药物包括Ang-2特异性结合剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和至少一种其它本文中所述的分子。
在某些情况下，蛋白酶/蛋白酶(protease/protease)平衡的破坏可引起蛋白酶-介导的组织破坏，包括(但不仅限于)肿瘤入侵正常组织，从而引起肿瘤转移。
在某些实施方案中，Ang-2特异性结合剂可与至少一种炎症治疗药物联合使用。在某些实施方案中，Ang-2特异性结合剂可与至少一种免疫失调治疗药物联合使用。炎症和免疫失调治疗药物包括如(但不仅限于)环氧酶1(COX-1)和环氧酶2(COX-2)抑制剂；38kDa的有丝分裂原活化的蛋白激酶(mito gen-activated protein kinase(p38-MAPK))的小分子调节物；参与炎症途径的胞内分子的小分子调节物，这种胞内分子包括(但不仅限于)jnk、IKK、NF-κB、ZAP70、和lck。某些炎症治疗药物例子可见如C.A.Dinarello and L.L.Moldawer“风湿性关节炎中的前炎症和抗炎细胞因子：治疗依据”，Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in RheumatoidArthritis：A Primer for Clinicians Third Edition(2001)Amgen Inc.Thousand Oaks，CA。
在某些实施方案中，药用组合物包含一种以上的不同Ang-2特异性结合剂。在某些实施方案中，药用组合物包含一种以上的Ang-2特异性结合剂，它们结合于一种以上的表位上。
免疫治疗
通常免疫治疗依赖于使用免疫影响物细胞和分子以靶定位并摧毁癌症细胞。免疫影响物例如可以是本发明的抗体，它识别靶细胞表面上的一些标记。这种抗体可单独作为治疗影响物，或者可激发其它细胞发挥实际杀死细胞的功能。这种抗体也可以与药物或毒素(化疗药物、放疗药物、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)联合使用，抗体仅扮演定位剂的角色。
根据本发明，免疫治疗剂(本发明的抗体或抗体偶联物)可靶定位突变体形式的Ang-2。特别需要的支出的是，本发明的抗体组合物可以与Ang-2靶定位剂一起用在联合疗法中。
已证明被动免疫疗法对许多癌症尤其有效。见如WO 98/39027。
下文实例仅用以阐述本发明，而不对本发明做出任何限定。
实施例1
在病理性组织和正常组织中表达Ang-2
使用原位杂交检测正常组织和病理性组织中Ang-2的表达。通过逆转录PCR从人或鼠胎儿肺脏cDNA中扩增出人Ang-2序列片段(Genbank检索号：AF004327，核苷酸1274-1726)和鼠Ang-2片段(Genbank检索号：AF004326，核苷酸1135-1588)，并克隆到pGEM-T质粒载体中，通过测序确证。使用33P-UTP和RNA聚合酶以线性化质粒为模板转录得到33P标记的反义RNA探针。经甲醛封阻并包埋在石蜡中的组织被切片(5μm)并收集在荷电的(charged)玻片上。原位杂交之前，用0.2M HCl浸透(permeabilized)组织，然后用蛋白酶K消化，并用三乙醇胺和醋酸酐乙酰化。在55℃下使放射性标记探针与切片杂交过夜，然后用RNase消化，并用约0.1X SSC在55℃下进行高严紧性洗涤。将玻片浸没在Kodak NTB2液中，并在4℃下暴露2-3周，显影并复染色。使用暗视野和标准光照检查切片，以便同时评价组织形态和杂交信号。
结果表明，在正常出生后的人体中，Ang-2表达被限制在少数几个含有新生血管的组织中，如卵巢、胎盘和子宫。正常成人心脏、大脑、肾脏、肝脏、肺、胰脏、脾脏、肌肉、扁桃腺、胸腺、阑尾、淋巴结、胆囊、前列腺和睾丸中都没有Ang-2表达。在5周龄小鼠肾脏的直小血管中有显著的Ang-2表达，而在成年猴或人中则没有。为确认此表达是否是胚胎发育的残留，使用鼠Ang-2探针和上述反应条件对不同大小的小鼠(直至1岁)肾脏进行检测。发现随着出生后的生长，Ang-2表达降低，但在1岁小鼠肾脏中仍明显存在。
几乎所有试验的肿瘤类型中均检测到了Ang-2表达，这包括人原发性肿瘤如如结肠癌(5例)，乳癌(10例)，肺癌(8例)，多形性胶质母细胞瘤(1例)，人转移瘤如乳癌(2例)，肺癌(2例)和卵巢癌(2例)(已转移到大脑)，和啮齿类肿瘤模型如C6(大鼠神经胶质瘤)，HT29(人结肠癌)，Colo-205(人结肠癌)，HCT116(人结肠癌)，A431(人表皮样癌)，A673(人横纹肌肉瘤)，HT1080(人纤维肉瘤)，PC-3(人前列腺癌)，B16F10(鼠黑素瘤)，MethA(鼠肉瘤)，和Lewis肺癌转移(Lewis lung carcinoma mets)。另外，对响应VEGF而生长进入基质胶塞(Matrigel plug)的新生血管，和小鼠早熟视网膜病缺氧模型也进行了Ang-2表达检测。
实例例2
重组mAng-2蛋白和兔多克隆抗Ang-2抗血清的制备
使用扩增全长人Ang-2所用的PCR引物，从15日龄鼠胚胎cDNA文库(Marathon-Ready-cDNA，Cat.#7459-1，Clonetech，Inc.)通过PCR(Clontech Advantage PCR Kit，Cat.#K1905-01)得到带有His标签的全长鼠Ang-2cDNA。将PCR产物连接到CMV启动子表达载体上，用FuGENE6转染试剂(Roche，Cat.#1814443)将所得质粒转染进HT1080人纤维肉瘤细胞(得自ATCC)。通过G418选择分离稳定克隆。使用抗His标签ELASA和Western印迹筛选出表达mAng-2-his的克隆。
从这些细胞的条件培养基(C.M.)中纯化重组mAng-2多肽。使用两步色谱法纯化含有mAng-2-His的条件培养基。简短来说，向条件培养基中添加Tris缓冲液(pH 9.5)直至终浓度为约20mM，调节pH到8.9。另外也添加去污剂CHAPS直至终浓度为约5mM。然后使培养基直接上阴离子交换柱Q-sepharose ff(Pharmacia)。用浓度约为10mM的Tris缓冲液(pH 8.0，含有约50mM NaCl)洗涤柱子。使用浓度为10mM的Tris缓冲液(pH 8.0，含有约350mM NaCl和5mM的CHAPS)在一个步骤中洗脱重组mAng-2-His。
Q-sepharose柱洗出液用浓度约4mM的咪唑调节，并通过固定金属亲合柱(Ni-NTA superflow(Qiagen))。用含有浓度约5mM的CHAPS和约100mM的咪唑的PBS洗脱结合的蛋白。然后将洗出液浓缩到约1.0mg/ml，并用PBS透析。SDS-PAGE考马斯蓝染色表明mAng-2-His的纯度高于90％。
通过注射约0.2mg的mAng-2来免疫兔子，以产生抗体。向兔子体内注射1mL Hunter’s(Sigma)和mAng-2的混合液(比例为1∶1)。4周后，每只兔子均接受重复注射或加强免疫；两周后，再次接受加强剂；在第七周抽血并评价mAng-2滴度。如果血清滴度高，则每周抽血50mL，连续6周。但是如果血清滴度低，就给予兔以附加加强剂，并从第九周开始每周抽血50mL，连续6周。抽血6周后，对兔不进行任何处理，时间为6周。如果需要更多血清则在最后抽血后的一个月后再次对兔进行加强免疫。
使用中和ELISA(见下文)，观察从5245号和5255号兔所得的兔抗mAng-2多克隆抗血清对mAng-2：Tie2相互作用的中和。
实施例3
评价Ang-2抗体的分子实验
开发了分子实验(亲和ELISA、中和ELISA和BIAcore)以对结合于Ang-2及相关家族成员的抗体进行直接评价，并评价抗体对mAng-2：Tie2相互作用的影响。下文描述了这些基于细胞的体外实验。
A.亲和ELISA
为了对候选抗Ang-2抗体进行初始筛选，使用纯化的人Ang-2(Rand D Systems，Inc；目录号623-AN；其中Ang-2以两种切短片段混合物形式提供)或鼠Ang-2多肽(按上文所述方法制备)。为了进行确认性结合实验，使用全长人Ang-2DNA转染人293T细胞，并在无血清DMEM中(含有约50微克/ml的牛血清白蛋白(BSA)进行培养，从该条件培养基中得到人Ang-2。
使用微量滴定板，向每孔中加入约100微升Ang-2，并温育约2h。然后用磷酸盐缓冲液(PBS，含有约0.1％的Tween-20)洗涤微量滴定板4次。每孔使用约250微升约含5％BSA的PBS进行封阻，然后在室温下温育约2h。温育后除去过量的封阻液，向每孔中加入约100微升候选抗Ang-2抗体，其稀释梯度起始为约40nmol，然后用含有约1％BSA的PBS连续稀释四倍。然后在室温下温育过夜。温育后，用含有约0.1％Tween-20的PBS洗涤微量滴定板5次，然后向每孔加入约100微升羊抗人IgG(Fc)-HRP(Pierce Chemical Co.，目录号#31416，预先用含1％BSA的PBS稀释为1∶5000)。微量滴定板在室温下温育约1h后，用含约0.1％Tween-20的PBS洗涤5次，然后向每孔加入约100微升TMB(3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯LiquidSubstrate System；Sigma chemical Company，St.Louis，MO，目录号T8665)底物，并温育5-15min直到蓝色出现。然后370nm处测量吸光度。
B.中和ELISA
如亲和ELISA部分所述在微量滴定板上固定人Ang-2多肽。用含有约1％BSA和约1nM Tie2(以Tie2-Fc分子形式提供，其中Tie2部分仅含有该分子的可溶性胞外部分，R和D系统，目录号313-TI)的PBS溶液如上文亲和ELISA部分所述对候选抗Ang-2抗体进行梯度稀释。向每孔中加入约100微升抗体/Tie2溶液后，室温下温育过夜，用含0.1％Tween-20的PBS洗涤5次。然后向每孔加入约100微升抗Tie2抗体(Pharmingen Inc.，目录号557039)使终浓度为约1微克/ml，室温温育约1h。然后向每孔加入约100微升羊抗鼠IgG-HRP(Pierce Chemical Co.，目录号31432，预先用含1％BSA的PBS稀释为1∶10000)。微量滴定板在室温下温育约1h后，用含0.1％Tween-20的PBS洗涤5次，然后向每孔加入约100微升TMB底物(如上文所述)，并温育直到颜色出现。然后在370nm处测量吸光度。
C.亲和BIAcore
以PBS和0.005％的P20表面活性剂(BIAcore，Inc.)作为运行缓冲液，在2000(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)上对每个候选Ang-2抗体均进行亲和分析。使用Amine Coupling Kit(Biacore，Inc.)根据使用说明书通过伯胺基团将重组G蛋白(Repligen，Needham，MA)固定在研究级别的CM5传感器芯片上(Biacore，Inc.)。
结合实验步骤如下。首先将每种候选抗Ang-2抗体约100Ru连接在固定的G蛋白上，然后在固定抗体表面上方注射入不同浓度(0-100nM)的huAng-2或mAng-2，流速约为50μl/min，持续约3min。使用BIA evaluation 3.1版计算机程序(BIAcore，Inc.)确定抗体结合动力学，包括ka(结合速率常数)，kd(解离速率常数)和KD(解离平衡常数)。低解离平衡常数说明Ang-2抗体的亲和力更高。
实施例4
噬菌体展示法制备全长人Ang-2抗体
根据下文描述，针对人Ang-2多肽(R and D Systems Inc.，目录号623-AN)从靶向查询噬菌体Fab文库(Target Quest Phage Display Fablibrary)(Target Quest，Inc.)中淘选得到全长人Ang-2抗体。
通过两种方法将人Ang-2固定在聚苯乙烯磁力珠表面上：(1)直接包被，用Ang-24℃下反应过夜；(2)间接捕获，用50μg/ml的羊抗Ang-2抗体在4℃下反应过夜捕获Ang-2。用含2％牛奶的PBS(MPBS)封阻珠子表面。对人Fab噬菌体文库进行预选择以除去与未包被磁力珠反应或与羊抗Ang-2抗体反应的噬菌体。然后使被Ang-2包被的珠子与噬菌体文库在室温下温育1.5h。在噬菌体结合步骤后，用含0.1％Tween-20的MPBS洗涤珠子6次，再用含0.1％Tween-20的PBS洗涤6次，再用PBS洗涤2次。首先用约10μg/ml的Tie2-Fc(R andD Systems，Minneapolis，MN)洗脱固定的噬菌体，然后用约100mM的三乙醇胺洗脱。用洗脱所得噬菌体感染大肠杆菌TG1细胞，扩增后回收用于进一步筛选。在连续筛选回合中，通过采用更严紧的洗涤条件和减少噬菌体输入量，来增大选择压力。3轮筛选后鉴别得到18个独特Ang-2结合Fab克隆，通过上文所述的ELISA亲和实验检测，它们几乎都识别人Ang-2、大鼠Ang-2和小鼠Ang-2。这些噬菌体中约有10％也结合人Ang-1。按下文所述将这些克隆转化为IgG1抗体。
为得到额外独特噬菌体，进行第二轮筛选，使用相同文库只是方法稍有不同。在这个方法中，将人Ang-2加到装有NaHCO3缓冲液(pH 9.6)的Nunc maxisorp免疫管中，4℃过夜。第1、2、3轮淘选的Ang-2浓度分别为1.5、0.74、0.3μg/ml。使用含2％牛奶的PBS(MPBS)封阻免疫管表面，然后与上文中所述同一文库(Target Quest)的约2万亿噬菌体颗粒(文库中每个独特克隆约50个拷贝)在约4ml2％MPBS中温育。噬菌体温育步骤后，用PBS加上约0.1％Tween-20洗涤表面20次，再用PBS洗涤20次。使用1μM hAng-2或1μM人Tie2(R and D Systems，同上文)洗脱固定的噬菌体。用洗脱所得噬菌体感染大肠杆菌TG1细胞(带有噬菌体文库)，扩增后回收用于下一轮筛选。通过对所有固定hAng-2或Tie2的噬菌体进行PCR扩增，鉴别到16个独特Ang-2结合Fab克隆，并使用限制性酶切分析了这些克隆。对这16个克隆的DNA都进行了测序。
每个噬菌体的每条重链可变区的编码序列均使用互补引物扩增。引物设计成在可变区的5’末端含有HindIII和XbaI位点、Kozak序列和信号序列(翻译的肽为MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC；SEQ ID NO：202)，而在PCR产物的3’末端含有BsmBI位点。例如如下克隆重链，扩增来自544号克隆的噬菌体DNA模板(SEQ ID NO：19)，使用2248-21引物(GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCAGGT CCA GCT GGT GCA G；SEQ ID NO：203，添加有信号序列的最后7个氨基酸)，2502-31引物(ATT ACG TCT CAC AGT TCG TTTGAT CTC CAC；SEQ ID NO：204，可变区末端添加有BsmBI位点)。所得产物再次扩增，使用2148-98引物(CCG CTC AGC TCC TGGGGC TCC TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT；SEQ IDNO：205，添加9个氨基酸到信号肽(AQLLGLLLL；SEQ ID NO：206))和2502-31引物，再使用2489-36引物(CAG CAG AAG CTT CTAGAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT CCC CGC TCA GCT CCTGGG；SEQ ID NO：207)和2502-31引物再次扩增。2498-36引物从5’到3’添加了HindIII和XbaI位点，Kozak序列和信号肽的前6个氨基酸。使用XbaI和BsmBI消化PCR产物，然后克隆到含有人IgG1恒定区的哺乳动物表达载体中。此载体含有SV40启动子和DHFR选择区。
来自每个噬菌体的轻链均为κ类或λ类。就轻链而言，互补引物设计成从5’到3’含有HindIII和XbaI位点，Kozak序列和信号肽(见上文)。克隆那些具有无错(error-free)编码区的链作为全长产物。例如扩增来自536噬菌体克隆的轻链(SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：210)作为全长编码区，所用引物为2627-69引物(GTG GTT GAG AGGTGC CAG ATG TGA CAT TGT GAT GAC TCA GTC TCC；SEQ IDNO：208，添加有信号肽的最后7个氨基酸)，和2458-54引物(CTTGTC GAC TTA TTA ACA CTC TCC CCT GTT G；SEQ ID NO：209，在终止密码子之后添加有SalI位点)。再如上文所述分别使用另外的5’引物2148-98和2489-36(与2458-54引物配对)扩增PCR产物，以完成信号肽序列和克隆位点的添加。如上文所述将全长轻链作为XbaI-SalI片段克隆到哺乳动物表达载体中。
某些λ克隆与天然人恒定区序列相比较，在其恒定区中有错误。为纠正这些错误，使用编码无错误λ恒定区的DNA和来自这些噬菌体可变区进行重叠PCR。如上文所述将这些克隆作为XbaI-SalI片段克隆到哺乳动物表达载体中。
当从它们的恒定区独立克隆κ可变区时，向PCR产物的3’末端加上一个BsmBI位点。在用XbaI和BsmBI消化PCR产物后，将κ链可变区克隆到含有人κ恒定区的表达载体中。
大体上按照使用说明书，通过磷酸钙转染试剂盒(CalciumPhosphate Transfection Kit)(Invitrogen Corp.)使用来自每个转化的噬菌体的轻链/重链配对构建体共转染CHO细胞。转染后14-16h更换一次培养基，根据使用说明书在约48h后在细胞培养皿中传代细胞，以进行选择。使用HT选择分离转染细胞约3周，此时转染的CHO细胞克隆被用胰蛋白酶消化(trypsinzed)并汇合成转染细胞“池”。
48h后收集小量的条件培养基，并使用抗人Fc抗体、抗人κ抗体或抗人λ抗体进行Western印迹来检测抗体的生成。然后使用标准组织培养无菌技术在选择压力下对选出的细胞群进行传代，直到得到足够的细胞，以接种到4个850cm2滚瓶中(每瓶个2×107活细胞)并使用DMSO制备细胞系冻干保存物。接种后使用培养基(含10％血清的DMEM(Gibco/BRL，Inc)，并添加谷氨酸和非必需氨基酸)在滚瓶中维持细胞。维持细胞2-3天，直到细胞融汇度达到约80％。此时更换滚瓶中的培养基，使用无血清培养基混合物(50％DMEM、50％F12，Gibco，并添加谷氨酸和非必需氨基酸)。7d后收集条件培养基，并加入新鲜无血清培养基再收集，同法额外收集1-2次。
使用标准方法直接从条件培养基中通过G蛋白亲和层析纯化抗体。使用低pH缓冲液(pH约为3)从G蛋白柱中洗脱抗体，然后用1MTris(pH8.5)中和洗脱的抗体，再用10kD分子量截断离心浓缩器进行浓缩。然后将浓缩所得抗体通过缓冲液交换转移到PBS中。
建立了31个抗体，每个均由两个重链和两个轻链(κ或λ)构成，如下表2所示。
表2
  抗体重链
  526κ
  528λC1
  531λC3
  533-κ
  535λC3
  536κ
  537λC3(G 107A R)
  540λC3
  543κ
  544-λC3
  545λC2
  546λC1(G 107A S，N 112A，T114S)
  551κ
  553κ
  555κ
  558HC   558κ
  559HC   559λC1(N 112 A，T 114 S)
  565κ
  F1-C6HC   F1-C6λC2
  FB1-A7HC   FB1-A7λC2(G 107 A S)
  FD-B2HC   FD-B2λC3(G 107 A S)
  FE-B7HC   FE-B7κ
  FJ-G11HC   FJ-G11κ
  FK-E3HC   FK-E3κ
  G1D4λC2
  GC1E8HC   GC1E8λC3(K 149 R)
  H1C12HC   H1C12λC2
  IA1-1E7HC   IA1-1E7κ
  IF-1C10HC   IF-1C10λC3(T 212 A)
  IK-2E2HC   IK-2E2λC2(T 212 A)
  IP-2C11HC   IP-2C11κ
*如本文所述，检测了与hAng-2、mAng-2和hAng-1的结合。
#一些λ轻链恒定区表现为多于1个种系λ恒定区基因的嵌合体。指出了最接近的λ恒定区种系基因以及与该种系基因不同的氨基酸，用Kabat系统编号。
31个Ang-2抗体(从噬菌体转化来的全长IgG1抗体)的重链和轻链(κ和λ)序列和SEQ ID NO序号，见下面4个表格。使用VBASE数据库(它使用的方法见Kabat et al，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(NIH公开No.91-3242；U.S.Dept.Health andHuman Services，5th ed.))预测了多抗的互补决定区(CDR)。使用来自MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge，UK)的工具对Fab区域用最近缘种系序列与数据库中的序列进行了比对，然后将这些序列进行了目视比较。每个可变区(重链或轻链)的CDR列于表7。
表3
重链可变区
表4
κ链可变区
表5
λ链可变区
表6
人恒定区(CR)
  抗体恒定区(CR)   序列
  Humanλ恒定区1(C1)(SEQ ID NO：63)   GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
  Humanλ恒定区2(C2)(SEQ ID NO：64)   GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
  Humanλ恒定区3(C3)(SEQ ID NO：65)   GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
  Humanλ恒定区7(C7)(SEQ ID NO：66)   GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
  Humanκ恒定区(SEQ ID NO：67)   RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
  Human IgG1恒定区(SEQ ID NO：68)   ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表7
Ang-2抗体重链(HC)和轻链(LC)的互补决定区(CDR)
 CDR1  CDR2 CDR3
  抗体  残基  残基 残基
  Ab 526HC SYGMH(SEQ ID NO：69) AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：105) DLLDYDILTGPYAY(SEQ ID NO：144)
  Ab 526
  KC  RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70)  LGSNRAS-(SEQ ID NO：106) MQALQTPPT(SEQ ID NO：145)
  Ab 528HC SYAIS(SEQ ID NO：71) GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO：107) GVVGDFDWLSFFDY(SEQ ID NO：146)
  Ab 528LC SGDKLGYTYTS(SEQ ID NO：72) QDFKRPS(SEQ ID NO：108) QAWDSTTAVV(SEQ ID NO：147)
  Ab 531HC SYAIS(SEQ ID NO：71) GIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：109) DREDTAMVFNY(SEQ ID NO：148)
  Ab 531LC SGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：73) DNNKRPS(SEQ ID NO：110) GTWDSSLSAFWV(SEQ ID NO：149)
  Ab 533HC SYGMH(SEQ ID NO：69) YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：111) DLLDYDILTGYGY(SEQ ID NO：150)
  Ab 533KC RSSQSLLHSNGYNYLN(SEQ ID NO：74) LGSNRAS(SEQ ID NO：106) MQGLQTPPT(SEQ ID NO：151)
  Ab 535HC SYAIS(SEQ ID NO：71) GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO：107) FSPFTETDAFDI(SEQ ID NO：152)
  Ab 535LC SGSNSNIGNNFVS(SEQ ID NO：75) DNNKRPS(SEQ ID NO：110) GTWDSSLSAAEVV(SEQ ID NO：153)
  Ab 536HC SYGMH(SEQ ID NO：69) YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：111) DLLDYDILTGYGY(SEQ ID NO：150)
  Ab 536(THw)KC RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70) LGSNRAS(SEQ ID NO：106) MQGTHWPPT(SEQ ID NO：154 )
  Ab 536(LQT)KC RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70) LGSNRAS(SEQ ID NO：106) MQGLQTPPT(SEQ ID NO：212)
  Ab 537HC SYAIS(SEQ ID NO：71) GIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：109) GSSDAAVAGM(SEQ ID NO：155)
  Ab 537LC SGNNSNIGNNYVS(SEQID NO：76) DNHKRPS(SEQ ID NO：112) GTWDTSLSANWV(SEQ ID NO：156)
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  Ab 543HC SYAIS(SEQ ID NO：71) RIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：114) PYYDFWSGPGGMDV(SEQ ID NO：159)
  Ab 543KC RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70) LGSNRAS(SEQ ID NO：106) MQALQTPLT(SEQ ID NO：160)
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  Ab 544LC SGDALPKQYAY(SEQID NO：78) KDSERPS(SEQ ID NO：115) QSADSSHVV(SEQ ID NO：162)
  Ab 545HC SYGMH(SEQ ID NO：69) VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：116) GPVDFDYGDYAIDY(SEQ ID NO：163)
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  Ab 546HC SYAMS(SEQ ID NO：80) AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：105) ETISFSTFSGYFDY(SEQ ID NO：165)
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  Ab 551HC SYAIS(SEQ ID NO：71) GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO：107) GYDFWSGYSLDAFDI(SEQ ID NO：167)
  Ab 551KC RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70) LGSNRAS(SEQ ID NO：106) MQALQTPLT(SEQ ID NO：160)
  Ab 553HC SYAMH(SEQ ID NO：82) WINAGNGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：119) GVDDYGGNSWAFDI(SEQ ID NO：168)
  Ab 553KC RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70) LGSNRAS(SEQ ID NO：106) MQALQTPLT(SEQ ID NO：160)
  Ab 555HC SYAMH(SEQ ID NO：82) VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：116) SASDHYYDSSGYYSDAFDI(SEQ ID NO：169)
  Ab 555KC RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70) LASNRAS(SEQ ID NO：120) MQTLQIPIT(SEQ ID NO：170)
  Ab 558HC GYYWS(SEQ ID NO：83) EINHSGSTNFNPSLKS(SEQID NO：121) GHDWGMGIGGAAYDI(SEQ ID NO：171)
  Ab 558KC RASQSVSSSSLA(SEQID NO：84) AASSRAT(SEQ ID NO：122) QHYGSSPRT(SEQ ID NO：172)
  Ab 559HC ESSMH(SEQ ID NO：85) GFDPEHGETIYAQKFQG(SEQ ID NO：123) GVQVTSGYHYFDH(SEQ ID NO：173)
  Ab 559LC TGTNSDIGSYPFVS(SEQ ID NO：86) DVSNRPS(SEQ ID NO：124) SSFTMNSFVI(SEQ ID NO：174)
  Ab 565HC SYAIS(SEQ ID NO：71) GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO：107) SPIYYDILTGIDAFDI(SEQ ID NO：175)
  Ab 565KC  RASQSVSSSSLA(SEQID NO：213)  AASSRAT(SEQ ID NO：214) QHYGSSPRT(SEQ ID NO：215)
  Ab 565(2)KC RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：70) LGSSRAS(SEQ ID NO：125) MQALDTPPT(SEQ ID NO：176)
  Ab F1-C6HC SYAIS(SEQ ID NO：71) RIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：114) DPIPSGWYFDL(SEQ ID NO：177)
  Ab F1-C6LC SGSSSNIGNNAVN(SEQID NO：87) YDDLLPS(SEQ ID NO：126) ATWDDSLSGWV(SEQ ID NO：178)
  AbFB1-A7HC SYGMH(SEQ ID NO：69) VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：127) EVGNYYDSSGYGY(SEQ ID NO：179)
  AbFB1-A7LC TRSGGGIGSSFVH(SEQID NO：88) DDNQRPT(SEQ ID NO：128) QSSHSTAVV(SEQ ID NO：180)
  Ab FD-B2HC SNSAAWN(SEQ ID NO：89) RTYYRSKWYSDYAVSLRG(SEQ ID NO：129) DRGGYIDS(SEQ ID NO：181)
  Ab FD-B2LC TRSSGSIATNYVQ(SEQID NO：90) EDNQRPS(SEQ ID NO：130) QSYGDNNWV(SEQ ID NO：182)
  Ab FE-B7HC DYEMN(SEQ ID NO：91) YIIGSGKTIFYADSVKG(SEQ ID NO：131) GGGSAYYLNTSDI(SEQ ID NO：183)
  Ab FE-B7KC RSSQSLLHSKGDNYLD(SEQ ID NO：92) LGSHRAS(SEQ ID NO：132) MQALQTPLT(SEQ ID NO：160)
  Ab FJ-G11HC SYGIS(SEQ ID NO：93) WISAYNGNTNYAQKLQG(SEQ ID NO：133) DRGIAARSAYYYGMDV(SEQ ID NO：184)
  Ab FJ-G11KC RSSQSLLDSDDGKTYLD(SEQ ID NO：94) TTSSRAS(SEQ ID NO：134) MQATQFPYT(SEQ ID NO：185)
  Ab FK-E3HC SYDLN(SEQ ID NO：95) WMNPTSGNTGYAQKFQG(SEQ ID NO：135) DPPSGGWEFDY(SEQ ID NO：186)
  Ab FK-E3KC RSSQSLVHEDGNTYLN(SEQ ID NO：96) KISKRFS(SEQ ID NO：136) MQSTRFPRT(SEQ ID NO：187)
  AbG1D4HC SHAIS(SEQ ID NO：97) RIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO：114) SRLEWLLYLDY(SEQ ID NO：188)
  AbG1D4LC TRSSGSIASNYVQ(SEQID NO：98) EDKQRPS(SEQ ID NO：137) QSYNSRGVM(SEQ ID NO：189)
  AbGC1E8HC SYGIS(SEQ ID NO：93) WISAYNGNTNYAQKLQG(SEQ ID NO：133) GGSPYGGYAYPFDY(SEQ ID NO：190)
  AbGC1E8LC TRSSGSIASNYVQ(SEQID NO：98) EDNQRPS(SEQ ID NO：130) QSYDSNIWV(SEQ ID NO：191)
  AbH1C12HC SYGMH(SEQ ID NO：69) YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：111) DLLDYDILTGYGY(SEQ ID NO：150)
  AbH1C12LC SGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO：73) GNTNRPS(SEQ ID NO：138) QSYDSSLSGSLV(SEQ ID NO：192)
  Ab IA1-1E7HC GYYWS(SEQ ID NO：83) EINHSGSTNFNPSLKS(SEQID NO：121) GHDWGMGIGGAAYDI(SEQ ID NO：171)
  Ab IA1-1E7KC RASQSVSSSFLA(SEQ DTSTRAT(SEQ ID NO：139) QQYDFSPLT(SEQ ID NO：
 ID NO：99) 193)
  Ab IF-1C10HC STYAMT(SEQ ID NO：100) VIRSNGGTDYADFVKG(SEQ ID NO：140) DYY(SEQ ID NO：194)
  Ab IF-1C10LC TGSGGSIASNYVQ(SEQID NO：101) EDNQRPS(SEQ ID NO：130) QSYDSSTWV(SEQ ID NO：195)
  Ab IK-2E2HC SYAMS(SEQ ID NO：80) AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：105) ETISFSTFSGYFDY(SEQ ID NO：165)
  Ab IK-2E2LC TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO：102) KVNNRPS(SEQ ID NO：141) SSYTSSSTLG(SEQ ID NO：196)
  Ab IP-2C11HC SYDIN(SEQ ID NO：103) WMNPNSGNTGYAQKFQG(SEQ ID NO：142) EIAVAGTRYGMDV(SEQ ID NO：197)
  Ab IP-2C11KC RASQSISTFLA(SEQID NO：104) DASNRAT(SEQ ID NO：143) QHRINWPLT(SEQ ID NO：198)
使用亲和ELISA和中和ELISA(如上文实施例3所述)以及BIAcore中和实验确定了这些抗体中的17个和阴性对照IgG1(称为RDB1)的亲和力、中和作用和特异性。所得结果列于下文表8，并使用标准方法进行计算。
表8
Ang-2抗体的EC50和IC50
按上文所述使用BIAcore分析检测了克隆536和克隆545的抗体。如上文所述用BIAcore确定了抗体的结合作用，KDs较低说明亲和力较高，所得结果见表9。
表9
抗体对hAng-2和mAng-2的亲和力
上文中分析的克隆536所含有的是两个变异抗体的混合物，分别为表4中的SEQ ID NO：12(536κTHW)和SEQ ID NO：210(536κLQT)。这两个536变异体是独立的并单独进行ELISA和HTRF实验，以确定其作用能力。
ELISA使用96孔板，37℃下用含有重组促血管生成素的293T细胞条件培养基(DMEM/50μg/ml BSA)进行包被，反应1h。调节条件培养基中促血管生成素的浓度，使得对1nM hTie2-Fc(R&DSystems，目录号313-TI)的结合力为最大结合作用的80％。使用PBS/0.1％Tween-20洗板，然后在室温下用PBS/5％BSA封阻2h。向PBS/1％BSA/1nM Tie2溶液中滴加促血管生成素中和剂，浓度从100nM到0.4pM，然后将此溶液加到被促血管生成素包被的多孔板上，室温下温育过夜再用PBS/0.1％Tween-20洗板。向每个孔中加入鼠源抗Tie2抗体(BD Pharmingen Inc.，目录号557039)直至终浓度达到1μg/ml，室温下温育1h后，用PBS/0.1％Tween-20洗板。向PBS/1％BSA中加入羊抗鼠IgG-HRP(Pierce，目录号31432)，稀释度为1∶10000，室温下温育1h后，用PBS/0.1％Tween-20洗板若干次。加入TMB底物(Sigma，目录号T8665)，测量OD370nm，通过与Tie2标准曲线相比较确定促血管生成素：Tie2的中和程度。
为进行HTRF实验，向96孔板的每个孔加入50μl HTRF缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，100mM NaCl，0.05％Tween 20，0.1％BSA)，其中还含有0.8nM铕-偶联链霉抗生物素(PERKIN ELMERLIFE SCIENCES INC.，目录号AD0062)和4.0nM生物素酰化的人促血管生成素1(R&D Systems)或促血管生成素2(Amgen Inc.)，以制备混合板(mix plate)。在另一块板上，向HTRF缓冲液中滴加促血管生成素中和剂(从400nM到20pM)，然后取每种连续稀释的促血管生成素中和剂50μl转移到混合板上(含有链霉抗生物素-铕/促血管生成素)并混合。然后将此板置于摇床上室温下温育1h。接下来在混合板的每个孔中取20μl转移到“实验板”(96孔板，每孔中有HTFR缓冲液溶液20μl，其中含10nM的人异藻青蛋白(allophycocyanin)-偶联人Tie2-Fc)。所得的实验板在室温下摇床上温育2h。实验板上溶液的终浓度为：1.0nM促血管生成素，5.0nM人Tie2-Fc和100nM到5.0pM梯度稀释的促血管生成素中和剂。使用Rubystar读板器(BMG Labtechnologies，Offenberg，Germany)分析实验板。使用“无促血管生成素中和剂”对照(代表零抑制)和“无促血管生成素”对照(代表完全抑制)，通过计算每种浓度的促血管生成素中和剂的抑制百分比，来确定促血管生成素：Tie2的中和程度。使用GRAFIT 5.0程序(Erithacus Software Ltd.)分析抑制百分比来计算IC50值。
所有结果均表示为用以下公式从样品计算得到的IC50曲线，样品进行一式两份检测。IC50结果使抑制数据符合一个双参数方程，其中数据下限为0(即该数据经背景校正)，上限为100(即该数据经范围校正)。
该方程中，s为斜率(slope factor)。该方程假定y随着x的增加而减少，它使用了软件GRAFIT 5.0(Erithacus Software Limited)。
所得结果见表10和11。
表10
Ab536变异体ELISA IC50结果
  样品  人Ang1 IC50(nM)  人Ang2 IC50(nM)  鼠Ang2 IC50(nM)
  Ab536LQT  ＞100  0.35  0.10
  Ab536THW  ＞100  0.31  0.088
表11
Ab536变异体HTRF IC50结果
 样品  人Ang1 IC50(nM)  人Ang2 IC50(nM)
 Ab53 6LQT  ＞100  0.072
 Ab536THW  ＞100  0.071
实施例5
使用抗Ang-2抗体的疗效研究
使用小鼠检测(使用G蛋白纯化的)兔抗Ang-2多抗的药代动力学。使用兔抗Ang-2多抗处理了24只小鼠(每只1mg)。在注射抗体后的1h、6h、1d、3d、7d和14d分别处死4只处理过的小鼠。
结果表明总兔IgG的循环血清半衰期大约为19d，而总IgG中的抗Ang-2IgG成分的半衰期约为8d。
为了评价疗效，使用异种移植了A431肿瘤的小鼠(每组10只)。在移植后的1d、5d、6d、7d、8d、12d、13d、14d、15d、18d向小鼠腹膜内注射10个剂量的(使用G蛋白纯化的)兔抗Ang-2多抗(每只每个剂量约为10mg IgG)。在第7d、12d、15d、19d、21d测量肿瘤大小。在第0d、7d、15d、21d测量体重，发现体重不受影响。重复测量ANOVA结果表明，相比用无免疫活性的纯化多抗抗血清(每只每个剂量约10mg IgG)和载体(PBS)处理的对照，抗Ang-2多抗抑制了A431肿瘤异种移植物的生长，抑制程度约50％，p＝0.008。
为了评价全长人抗Ang-2单抗的体内疗效，使用异种移植了A431肿瘤的小鼠(每组10只)。分别向小鼠腹膜内注射抗Ang-2抗体克隆533、537、544，或阴性对照(PBS或人IgG1-κ)。注射量为，第1次每只约420μg蛋白，接下来三次每次每只约140μg蛋白，接下来四次每次每只约55μg蛋白，每只总共注射8次。每周记录肿瘤大小和体重两次。在研究的最后阶段处死动物并收集血清，通过ELISA测量血清抗体水平。每组动物均收集肿瘤和一组正常组织。
在用抗Ang-2抗体治疗组合对照组的肿瘤生长情况间有明显差别，见图1。所有用抗Ang-2抗体治疗的三组相比对照，肿瘤生长均受到抑制(所有3个抗体治疗组与hIgG1对照的p＜.005，重复测量ANOVA)。与之相反，对照组的肿瘤继续以更高的速率进行生长。
实施例6
表位作图
将人Ang-2(hAng-2)的全长蛋白(1-495位氨基酸)、N-末端(1-254位氨基酸)和C-末端(255-495位氨基酸)克隆到CMV驱动的哺乳动物表达载体中(其中含有C-末端6xHis标签)。在293T细胞中瞬时表达所得的3个构建体以及对照载体。然后收集转染细胞的条件培养基，并使用抗6xHis ELISA和Western印迹来估计培养基中的Ang-2表达水平。
通过ELISA确定它们对三种人hAng-2的结合能力，来确定抗Ang-2抗体和肽体的结合表位，方法如下：在高效结合实验96孔板的每孔中使用100μl条件培养基进行包被，37℃下温育1h。吸干(aspirated)条件培养基，每孔用200μl含5％BSA的PBS在室温下封阻1h。然后吸干封阻液。向每孔加入含有1μg/ml抗体、肽体或Tie2-Fc以及1％BSA的PBS溶液100μl，室温下温育1h。用含0.1％Tween的PBS溶液200μl洗板4次。向每孔中加入HRP-偶联的羊抗人IgG或羊抗鼠IgG 100μl，室温温育45min。然后用含0.1％Tween的PBS溶液200μl洗板4次。向每孔中加入100μl TMB底物，测量OD370nm。
所得结果见图2A、2B和2C。
                序列表
<110>Oliner，John
Graham，Kevin
<120>促血管生成素-2特异性结合剂
<130>04-881-A
<140>10/982,440
<141>2004-11-04
<150>60/620,161
<151>2004-10-19
<160>215
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>2
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>3
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Val Val Gly Asp Phe Asp Trp Leu Ser Phe Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Thr Tyr Thr
            20                  25                  30
Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Phe
        35                  40                  45
Gln Asp Phe Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Ala Val
                85                  90                  95
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
            100                 105
<210>5
<211>120
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Glu Asp Thr Ala Met Val Phe Asn Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>6
<211>111
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Ala Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>7
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>8
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Ile Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>9
<211>121
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Phe Ser Pro Phe Thr Glu Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>10
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Val Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Ala Ala Glu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>11
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>12
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>13
<211>119
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Ser Asp Ala Ala Val Ala Gly Met Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>14
<211>111
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Val Tyr Asp Asn His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Asp Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Ala Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>15
<211>120
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Phe Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Val Pro Gly Thr Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>16
<211>111
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asn Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Ala Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>17
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro Gly Gly Met Asp Val
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>18
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1                5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>19
<211>121
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Phe Glu Ser Gly Tyr Trp Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>20
<211>106
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser His Val Val
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>21
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Pro Val Asp Phe Asp Tyr Gly Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>22
<211>111
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg
                85                  90                  95
Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>23
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23
Glu Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Thr Ile Ser Phe Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Ala Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>24
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ala Asn
            20                  25                  30
Gly Val Ser Trp Tyr His Gln Val Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Leu Ser His Asp Gly Leu Val Thr Ser Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser
    50                  55                  60
Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu His
65                  70                  75                  80
Ser Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>25
<211>124
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Asp Ala Phe Asp
            100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>26
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>27
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Val Asp Asp Tyr Gly Gly Asn Ser Trp Ala Phe Asp Ile
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>28
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>29
<211>128
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ala Ser Asp His Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser
            100                 105                 110
Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>30
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr
                85                  90                  95
Leu Gln Ile Pro Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105                 110
<210>31
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Phe Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly His Asp Trp Gly Met Gly Ile Gly Gly Ala Ala Tyr Asp Ile
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>32
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Val Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>33
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Ser
            20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu His Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Val Gln Val Thr Ser Gly Tyr His Tyr Phe Asp His Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>34
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>34
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
            20                  25                  30
Pro Phe Val Ser Trp Tyr Gln Arg His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Met Asn
                85                  90                  95
Ser Phe Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>35
<211>125
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1              5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Pro Ile Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ile Asp Ala Phe
            100                 105                 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>36
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Val Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>37
<211>120
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Ile Pro Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>38
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>38
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>39
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>39
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Val Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr Trp
                100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            115                 120
<210>40
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>40
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Gly Gly Gly Ile Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Phe Val His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
        35                  40                  45
Ile Phe Asp Asp Asn Gln Arg Pro Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Ala Ala Ile Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser His Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>41
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Val Ser Leu Arg Gly Arg Ile Thr Ile Asn Leu Asp Thr Asp Thr Ser
65                  70                  75                  80
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr
                85                  90                  95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asp Ser Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>42
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>42
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1                5                  10                  15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Thr Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Ala Thr Val
        35                  40                  45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Leu Thr Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Gly Asp
                85                  90                  95
Asn Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>43
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Ser Leu Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ile Gly Ser Gly Lys Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Ser Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Leu Asn Thr Ser Asp Ile Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>44
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Lys Gly Asp Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>45
<211>125
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>46
<211>113
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>46
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
            20                  25                  30
Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Met Tyr Thr Thr Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
                85                  90                  95
Ala Thr Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>47
<211>120
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Met Asn Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Pro Ser Gly Gly Trp Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>48
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>48
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Glu
            20                  25                  30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu His Gln Arg Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
                85                  90                  95
Thr Arg Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>49
<211>120
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser His
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Ser Arg Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>50
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>50
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Val Ile Ile Pro Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Lys Arg Pro Gly Ser Ala Pro Ser Ile Val
        35                  40                  45
Ile Tyr Glu Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asn Ser
                85                  90                  95
Arg Gly Val Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>51
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Ala Tyr Pro Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>52
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>52
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Leu Glu Ser Ala Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Thr Asn Val
        35                  40                  45
Ile Phe Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65                   70                  75                  80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
                85                  90                  95
Asn Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>53
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>54
<211>111
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>54
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ala Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Ser Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>55
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>55
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Phe Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly His Asp Trp Gly Met Gly Ile Gly Gly Ala Ala Tyr Asp Ile
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>56
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>56
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Phe Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>57
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>57
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Val Ser Val Ile Arg Ser Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Phe Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Met Thr Asp Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210>58
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>58
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Gly Ser Ile Ala Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
        35                  40                  45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
                85                  90                  95
Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>59
<211>123
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Thr Ile Ser Phe Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>60
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>60
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
            20                  25                  30
Asn Tyr Val SerTrp Phe Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                 40                  45
Met Ile Tyr Lys Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Leu Ser Asn Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gln Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
                85                  90                  95
Ser Thr Leu Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>61
<211>122
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Ile Ala Val Ala Gly Thr Arg Tyr Gly Met Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>62
<211>107
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>62
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Phe
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Arg Ile Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>63
<211>106
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>63
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
            20                  25                  30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
        35                  40                  45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
    50                  55                  60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65                  70                  75                  80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
                85                  90                  95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
            100                 105
<210>64
<211>106
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>64
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
            20                  25                  30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
    50                  55                  60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65                  70                  75                  80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
                85                  90                  95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
            100                 105
<210>65
<211>106
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>65
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
            20                  25                  30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
    50                  55                  60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65                  70                  75                  80
Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
                85                  90                  95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
            100                 105
<210>66
<211>106
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>66
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp
            20                  25                  30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
        35                  40                  45
Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
    50                  55                  60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65                  70                  75                  80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
                85                  90                  95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
            100                 105
<210>67
<211>107
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>67
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210>68
<211>330
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>68
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 2302                 35                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>69
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>69
Ser Tyr Gly Met His
1               5
<210>70
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>70
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1               5                   10                  15
<210>71
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>71
 Ser Tyr Ala Ile Ser
1              5
<210>72
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>72
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Thr Tyr Thr Ser
1               5                   10
<210>73
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>73
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>74
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>74
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210>75
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>75
Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn Phe Val Ser
1               5                   10
<210>76
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>76
Ser Gly Asn Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>77
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>77
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>78
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>78
Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr
1               5                   10
<210>79
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>79
Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1               5                   10
<210>80
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>80
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>81
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>81
Ser Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ala Asn Gly Val Ser
1               5                   10
<210>82
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>82
Ser Tyr Ala Met His
1               5
<210>83
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>83
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1               5
<210>84
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>84
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala
1               5                   10
<210>85
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>85
Glu Ser Ser Met His
1               5
<210>86
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>86
Thr Gly Thr Asn Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Pro Phe Val Ser
1               5                   10
<210>87
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>87
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn
1               5                   10
<210>88
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>88
Thr Arg Ser Gly Gly Gly Ile Gly Ser Ser Phe Val His
1               5                   10
<210>89
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>89
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1               5
<210>90
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>90
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Thr Asn Tyr Val Gln
1               5                   10
<210>91
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>91
Asp Tyr Glu Met Asn
1               5
<210>92
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>92
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asp Asn Tyr Leu Asp
1               5                   10                  15
<210>93
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>93
Ser Tyr Gly Ile Ser
1               5
<210>94
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>94
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Leu
1               5                   10                  15
Asp
<210>95
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>95
Ser Tyr Asp Leu Asn
1               5
<210>96
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>96
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210>97
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>97
Ser His Ala Ile Ser
1               5
<210>98
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>98
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1               5                   10
<210>99
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>99
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala
1               5                   10
<210>100
<211>6
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>100
Ser Thr Tyr Ala Met Thr
1               5
<210>101
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>101
Thr Gly Ser Gly Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1               5                   10
<210>102
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>102
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>103
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>103
Ser Tyr Asp Ile Asn
1               5
<210>104
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>104
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Phe Leu Ala
1               5                   10
<210>105
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>105
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>106
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>106
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1               5
<210>107
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>107
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>108
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>108
Gln Asp Phe Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>109
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>109
Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>110
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>110
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>111
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>111
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>112
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>112
Asp Asn His Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>113
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>113
Asn Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>114
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>114
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>115
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>115
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser
1               5
<210>116
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>116
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>117
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>117
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1               5
<210>118
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>118
His Asp Gly Leu Val Thr Ser
1               5
<210>119
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>119
Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>120
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>120
Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser
1               5
<210>121
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>121
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>122
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>122
Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>123
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>123
Gly Phe Asp Pro Glu His Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>124
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>124
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1               5
<210>125
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>125
Leu Gly Ser Ser Arg Ala Ser
1               5
<210>126
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>126
Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser
1               5
<210>127
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>127
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>128
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>128
Asp Asp Asn Gln Arg Pro Thr
1               5
<210>129
<211>18
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>129
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala Val Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly
<210>130
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>130
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1               5
<210>131
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>131
Tyr Ile Ile Gly Ser Gly Lys Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>132
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>132
Leu Gly Ser His Arg Ala Ser
1               5
<210>133
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>133
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>134
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>134
Thr Thr Ser Ser Arg Ala Ser
1               5
<210>135
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>135
Trp Met Asn Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>136
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>136
Lys Ile Ser Lys Arg Phe Ser
1               5
<210>137
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>137
Glu Asp Lys Gln Arg Pro Ser
1               5
<210>138
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>138
Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser
1               5
<210>139
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>139
Asp Thr Ser Thr Arg Ala Thr
1               5
<210>140
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>140
Val Ile Arg Ser Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>141
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>141
Lys Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5
<210>142
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>142
Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>143
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 <400>143
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210>144
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>144
Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Tyr
1               5                   10
<210>145
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>145
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>146
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>146
Gly Val Val Gly Asp Phe Asp Trp Leu Ser Phe Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>147
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>147
Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Ala Val Val
1               5                   10
<210>148
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>148
Asp Arg Glu Asp Thr Ala Met Val Phe Asn Tyr
1               5                   10
<210>149
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>149
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Phe Trp Val
1               5                   10
<210>150
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>150
Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr
1               5                   10
<210>151
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>151
Met Gln Gly Leu Gln Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>152
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>152
Phe Ser Pro Phe Thr Glu Thr Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>153
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>153
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Ala Glu Val Val
1               5                   10
<210>154
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>154
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Thr
1                5
<210>155
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>155
Gly Ser Ser Asp Ala Ala Val Ala Gly Met
1               5                   10
<210>156
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>156
Gly Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Asn Trp Val
1               5                   10
<210>157
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>157
Ala Val Pro Gly Thr Glu Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>158
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>158
Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Ser Trp Val
1               5                   10
<210>159
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>159
Pro Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro Gly Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>160
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>160
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>161
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>161
Phe Glu Ser Gly Tyr Trp Gly Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>162
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>162
Gln Ser Ala Asp Ser Ser His Val Val
1               5
<210>163
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>163
Gly Pro Val Asp Phe Asp Tyr Gly Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr
1               5                   10
<210>164
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>164
Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu Ser Gly Ser Val
1               5                   10
<210>165
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>165
Glu Thr Ile Ser Phe Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>166
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>166
Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Val Val
1               5                   10
<210>167
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>167
Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10                  15
<210>168
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>168
Gly Val Asp Asp Tyr Gly Gly Asn Ser Trp Ala Phe Asp Ile
1               5                  10
<210>169
<211>19
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>169
Ser Ala Ser Asp His Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Ala
1               5                   10                  15
Phe Asp Ile
<210>170
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>170
Met Gln Thr Leu Gln Ile Pro Ile Thr
1               5
<210>171
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>171
Gly His Asp Trp Gly Met Gly Ile Gly Gly Ala Ala Tyr Asp Ile
1               5                   10                  15
<210>172
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>172
Gln His Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr
1               5
<210>173
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>173
Gly Val Gln Val Thr Ser Gly Tyr His Tyr Phe Asp His
1               5                   10
<210>174
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>174
Ser Ser Phe Thr Met Asn Ser Phe Val Ile
1               5                   10
<210>175
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>175
Ser Pro Ile Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ile Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10                  15
<210>176
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>176
Met Gln Ala Leu Asp Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>177
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>177
Asp Pro Ile Pro Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu
1               5                   10
<210>178
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>178
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val
1               5                   10
<210>179
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>179
Glu Val Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr
1               5                   10
<210>180
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>180
Gln Ser Ser His Ser Thr Ala Val Val
1               5
<210>181
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>181
Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asp Ser
1               5
<210>182
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>182
Gln Ser Tyr Gly Asp Asn Asn Trp Val
1               5
<210>183
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>183
Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Leu Asn Thr Ser Asp Ile
1               5                   10
<210>184
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>184
Asp Arg Gly Ile Ala Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>185
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>185
Met Gln Ala Thr Gln Phe Pro Tyr Thr
1               5
<210>186
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>186
Asp Pro Pro Ser Gly Gly Trp Glu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>187
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>187
Met Gln Ser Thr Arg Phe Pro Arg Thr
1               5
<210>188
<211>11
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>188
Ser Arg Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>189
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>189
Gln Ser Tyr Asn Ser Arg Gly Val Met
1               5
<210>190
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>190
Gly Gly Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Ala Tyr Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>191
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>191
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Ile Trp Val
1               5
<210>192
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>192
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Leu Val
1               5                  10
<210>193
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>193
Gln Gln Tyr Asp Phe Ser Pro Leu Thr
1               5
<210>194
<211>3
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>194
Asp Tyr Tyr
1
<210>195
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>195
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Trp Val
1               5
<210>196
<211>10
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>196
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Gly
1               5                   10
<210>197
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>197
Glu Ile Ala Val Ala Gly Thr Arg Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>198
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>198
Gln His Arg Ile Asn Trp Pro Leu Thr
1               5
<210>199
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR1区
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa为R、S、T、G、E或D
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa为S、G、A、R、N、T、Y或H.
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa为S、D、N、Q、T、Y、A、G或E
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa为Q、K、S、N、A、G、I、M、W或L
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa为S、L、G、A、M、H或N
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa为L、G、N、P、V、D、W、S、T、I，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>Xaa为L、Y、I、K、S、N、V，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa为H、T、G、Q、S、A、D，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>Xaa为S、Y、N、A、T、E、G、F，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa为N、T、A、G、S、Y、K、D、F、L，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>Xaa为G、S、Y、F、L、P、A、F、D、N，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>Xaa为Y、V、D、A、F、G、N，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa为N、S、V、H、Q、K、T，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>Xaa为Y、H、S、T，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Xaa为L、Y，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>Xaa为D、N、L，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>Xaa为D，或不存在
<400>199
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa
<210>200
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR2区
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa为L、Q、D、N、K、G、H、A、Y、E、T、R、V或W
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa为G、D、N、A、V、T、I、F或M
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa为S、F、N、H、G、D、K、T、I、W、Y或R
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa为N、K、E、L、S、Q、H、T、G、P、Y或A
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa为R、V、L、S、I、D、G、E、Y、T或N
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa为A、P、T、F、G、L、N、H或S
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>Xaa为S、T、G或K
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa为S、T、I、N、E、W，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>Xaa为T、A、I、K、N、Y、D，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa为Y、N、K、F、I、S、G，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>Xaa为Y、N、D、A，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>Xaa为A、S、P、Y、D，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa为D、Q、S、A、F，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>Xaa为S、K、L、V，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Xaa为V、F、K、S、L，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>Xaa为K、Q、S、L、F、G，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>Xaa为G、R，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>Xaa为G，或不存在
<400>200
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa
<210>201
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CDR3区
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa为D、M、G、Q、G、A、P、E或S
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa为L、Q、V、A、R、T、S、Y、E、P、H、G或I
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa为L、A、V、W、E、P、G、S、Y、I、D、T、Q、F或R
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa为D、L、G、F、T、S、W、V、Y、P、N、H、I或E
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa为Y、Q、D、S、T、H、A、F、W、G、M、R或N
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa为D、T、F、A、S、E、W、R、G、Y、I、M、N或L
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>Xaa为I、P、D、T、M、L、S、V、G、H、Y、W、A、N或R
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa为任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>Xaa为任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa为任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>Xaa为任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>Xaa为任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>Xaa为任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>Xaa为任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Xaa为I、D，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>Xaa为A、I、V，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>Xaa为F，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>Xaa为D，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>Xaa为I，或不存在
<400>201
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa
<210>202
<211>22
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>202
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
            20
<210>203
<211>40
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>203
gtggttgaga ggtgccagat gtcaggtcca gctggtgcag              40
<210>204
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>204
attacgtctc acagttcgtt tgatctccac                               30
<210>205
<211>48
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>205
ccgctcagct cctggggctc ctgctattgt  ggttgagagg tgccagat          48
<210>206
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>206
Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu
1               5
<210>207
<211>54
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>207
cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggg    54
<210>208
<211>45
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>208
gtggttgaga ggtgccagat gtgacattgt gatgactcag tctcc              45
<210>209
<211>31
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>209
cttgtcgact tattaacact ctcccctgtt g                             31
<210>210
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>210
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>211
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>211
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Lys Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Asp Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>212
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>212
Met Gln Gly Leu Gln Thr Pro Pro Thr
1               5
<210>213
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>213
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala
1               5                   10
<210>214
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>214
Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>215
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>215
Gln His Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr
1               5

Claims (47)

1.一种特异性结合促血管生成素-2的分离的多肽，其中所述多肽至少包含一种互补决定区(CDR)，其中所述CDR为：
a)含下式的氨基酸序列的CDR1区域：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(SEQ IDNO：199)，其中
X1为R、S、T、G、E、D；
X2为S、G、A、R、N、T、Y、H；
X3为S、D、N、Q、T、Y、A、G、E；
X4为Q、K、S、N、A、G、I、M、W、L；
X5为S、L、G、A、M、H、N；
X6为L、G、N、P、V、D、W、S、T、I，或不存在；
X7为L、Y、I、K、S、N、V，或不存在；
X8为H、T、G、Q、S、A、D，或不存在；
X9为S、Y、N、A、T、E、G、F，或不存在；
X10为N、T、A、G、S、Y、K、D、F、L，或不存在；
X11为G、S、Y、F、L、P、A、F、D、N，或不存在；
X12为Y、V、D、A、F、G、N，或不存在；
X13为N、S、V、H、Q、K、T，或不存在；
X14为Y、H、S、T，或不存在；
X15为L、Y，或不存在；
X16为D、N、L，或不存在；
X17为D，或不存在；
b)含下式的氨基酸序列的CDR2区域：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18(SEQID NO：200)，其中，
X1为L、Q、D、N、K、G、H、A、Y、E、T、R、V、W；
X2为G、D、N、A、V、T、I、F、M；
X3为S、F、N、H、G、D、K、T、I、W、Y、R；
X4为N、K、E、L、S、Q、H、T、G、P、Y、A；
X5为R、V、L、S、I、D、G、E、Y、T、N；
X6为A、P、T、F、G、L、N、H、S；
X7为S、T、G、K；
X8为S、T、I、N、E、W，或不存在；
X9为T、A、I、K、N、Y、D，或不存在；
X10为Y、N、K、F、I、S、G，或不存在；
X11为Y、N、D、A，或不存在；
X12为A、S、P、Y、D，或不存在；
X13为D、Q、S、A、F，或不存在；
X14为S、K、L、V，或不存在；
X15为V、F、K、S、L，或不存在；
X16为K、Q、S、L、F、G，或不存在；
X17为G、R，或不存在；
X18为G，或不存在；或者
c)含下式的氨基酸序列的CDR3区域：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19(SEQ ID NO：201)，其中，
X1为D、M、G、Q、F、A、P、E、S；
X2为L、Q、V、A、R、T、S、Y、E、P、H、G、I；
X3为L、A、V、W、E、P、G、S、Y、I、D、T、Q、F、R；
X4为D、L、G、F、T、S、W、V、Y、P、N、H、I、E；
X5为Y、Q、D、S、T、H、A、F、W、G、M、R、N；
X6为D、T、F、A、S、E、W、R、G、Y、I、M、N、L；
X7为I、P、D、T、M、L、S、V、G、H、Y、W、A、N、R；
X8为L、P、W、A、V、S、D、G、F、N、Y、I、R、E、T；
X9为T、L、V、F、A、G、P、D、S、H、N、M、Y，或不存在；
X10为G、S、V、N、F、A、M、D、Y、L、W、I、T，或不存在；
X11为P、F、Y、W、D、E、I、G、A、V、L、S、M，或不存在；
X12为Y、F、V、G、I、V、M、A、D，或不存在；
X13为A、D、Y、V、F、H、I、G，或不存在；
X14为Y、V、D、I、S、F、M，或不存在；
X15为I、D，或不存在；
X16为A、I、V，或不存在；
X17为F，或不存在；
X18为D，或不存在；和
X19为I，或不存在。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽至少含有一个选自SEQ IDNO：69-104和SEQ ID NO：213的氨基酸序列。
3.权利要求1的多肽，其中所述多肽至少含有一个选自SEQ IDNO：105-143和SEQ ID NO：214的氨基酸序列。
4.权利要求1的多肽，其中所述多肽至少含有一个选自SEQ IDNO：144-198、SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：215的氨基酸序列。
5.权利要求1的分离多肽，其中所述多肽为抗体。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体是多抗、单抗、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
7.权利要求6的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
8.一种杂交瘤，所述杂交瘤产生权利要求6所述的单抗。
9.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1的多肽。
10.一种载体，所述载体含有权利要求9的核酸分子。
11.一种宿主细胞，所述细胞含有权利要求10的载体。
12.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求5、6或7的抗体。
13.一种载体，所述载体含有权利要求12的核酸分子。
14.一种宿主细胞，所述细胞含有权利要求13的载体。
15.一种制备抗体的方法，其中所述方法包括：
(a)使用至少一个编码权利要求5、6或7抗体的核酸分子来转化宿主细胞；
(b)在所述宿主细胞中表达核酸分子；和
(c)分离所述特异性结合剂。
16.一种抑制哺乳动物不希望有的血管生成的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1的分离多肽。
17.一种治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1的分离多肽。
18.一种抑制哺乳动物不希望有的血管生成的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求5、6或7的抗体。
19.一种治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求5、6或7的抗体。
20.一种药用组合物，所述组合物含有权利要求1的分离多肽和药学上可接受的赋形剂。
21.一种药用组合物，所述组合物含有权利要求5、6或7的抗体和药学上可接受的赋形剂。
22.一种调节或抑制促血管生成素-2活性的方法，所述方法包括给予患者权利要求1的分离多肽。
23.一种调节或抑制促血管生成素-2活性的方法，所述方法包括给予患者权利要求5、6或7的抗体。
24.一种调节哺乳动物血管渗透性和/或血浆渗漏的方法，所述方法包括给予哺乳动物治疗有效量的权利要求1的分离多肽。
25.一种治疗以下哺乳动物疾病中至少一种的方法：眼新生血管性疾病、肥胖、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病、炎症、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、肿瘤性疾病、骨相关疾病或牛皮癣，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1的分离多肽。
26.一种调节哺乳动物血管渗透性和/或血浆渗漏的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求5、6或7的抗体。
27.一种治疗以下哺乳动物疾病中至少一种的方法：眼新生血管性疾病、肥胖、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病、炎症、动脉粥样硬化、子宫内膜异位、肿瘤性疾病、骨相关疾病或牛皮癣，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求5、6或7的抗体。
28.一种治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1的分离多肽和化疗药物。
29.权利要求28的方法，其中分离多肽和化疗药物被同时给予。
30.权利要求28的方法，其中分离多肽和化疗药物并非被同时给予。
31.一种治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求5、6或7的抗体和化疗药物。
32.一种可结合促血管生成素-2的分离抗体，所述抗体含有CDR1，其中CDR1包含SEQ ID NO：69-104或SEQ ID NO：213中任一项所示的氨基酸序列。
33.一种可结合促血管生成素-2的分离抗体，所述抗体含有CDR2，其中CDR2包含SEQ ID NO：105-143或SEQ ID NO：214中任一项所示的氨基酸序列。
34.一种可结合促血管生成素-2的分离抗体，所述抗体含有CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NO：144-198、SEQ ID NO：212或SEQID NO：215中任一项所示的氨基酸序列。
35.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求32、33或34的抗体。
36.一种载体，所述载体含有权利要求35的核酸分子。
37.一种宿主细胞，所述细胞含有权利要求36的载体。
38.一种检测生物样品中促血管生成素-2水平的方法，所述方法包括：
(a)用所述样品接触权利要求1的分离多肽；和
(b)确定特异性结合剂与所述样品的结合程度。
39.一种检测生物样品中促血管生成素-2水平的方法，所述方法包括：
(a)用所述样品接触权利要求32、33或34的抗体；和
(b)确定抗体与所述样品的结合程度。
40.一种含重链和轻链的抗体，其中所述重链中含有的重链可变区选自以下序列：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61；及其抗原结合片段；
且所述轻链含有的轻链可变区含有SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：210或SEQ ID NO：211所示的氨基酸序列，或其抗原结合片段。
41.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求40的抗体。
42.一种载体，所述载体含有权利要求41的核酸分子。
43.一种宿主细胞，所述细胞含有权利要求42的载体。
44.一种可特异性结合促血管生成素-2的抗体，所述抗体含重链和轻链，其中所述轻链含有的轻链可变区包含SEQ ID NO：12、SEQID NO：210或SEQ ID NO：211所示的氨基酸序列，或其抗原结合片段。
45.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求44的抗体。
46.一种载体，所述载体含有权利要求45的核酸分子。
47.一种宿主细胞，所述细胞含有权利要求46的载体。
HK10100546.7A 2004-10-19 2005-10-19 促血管生成素-2特異性結合劑 HK1136836A (zh)

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