GR20150100466A - Μεθοδος πολλαπλου ποσοτικου προσδιορισμου των ρυθμιστικων παραγοντων φερριτινη, ερυθροποιητινη, ιντερλευκινη-6 και ιντερλευκινη-10, σε δειγμα ορου/πλασματος αναιμικων ασθενων με νεφρικη ανεπαρκεια - Google Patents

Abstract

Η παρούσα εφεύρεση αφορά την ανάπτυξη μεθόδου για τον πολλαπλό προσδιορισμό ρυθμιστικών παραγόντων υπεύθυνων για τις διαταραχές της ομοιόστασης του σιδήρου σε βιολογικό δείγμα ορού/πλάσματος αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια. Η μεθοδολογία βασίζεται στον συνδυασμό κύτταρο μετρίας ροής με χρήση σφαιριδίων, προκειμένου να προσδιοριστούν τα επίπεδα της φερριτίνης, ερυθροποιητίνης, ιντερλευκίνης-6 και ιντερλευκίνης-10 ταυτόχρονα σε βιολογικό δείγμα ορού/πλάσματος. Η παρακολούθηση και η αξιολόγηση των επιπέδων των παραπάνω αναλυτών σε ορό ή πλάσμα αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια αποτελεί μια αξιόπιστη στρατηγική με κλινική εφαρμογή κατά την χορήγηση της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή/και σκευασμάτων σιδήρου.

Description

ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΟΛΛΑΠΛΟΥ ΠΟΣΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΝ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΦΕΡΡΙΤΙΝΗ, ΕΡΥΘΡΟΠΟΙΗΤΙΝΗ, ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-6 ΚΑΙ ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ-10, ΣΕ ΔΕΙΓΜΑ ΟΡΟΥ/ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΑΝΑΙΜΙΚΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

ΤΕΧΝΙΚΟ ΠΕΔΙΟ

Η παρούσα εφεύρεση αφορά μια μέθοδο πολλαπλού ποσοτικού προσδιορισμού μιας ομάδας βιοδεικτών, που ρυθμίζουν την ομοιόσταση του σιδήρου στον ανθρώπινο οργανισμό. Ειδικότερα, η παρούσα εφεύρεση αναπτύχθηκε για την παρακολούθηση της θεραπευτικής πορείας των αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια με βάση τον προσδιορισμό ρυθμιστικών παραγόντων όπως φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, ιντερλευκίνη-6 και ιντερλευκίνη-10 σε βιολογικό δείγμα ορού/πλάσματος.

ΥΠΟΒΑΘΡΟ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ

Ο σίδηρος είναι ένα από τα πιο βασικά στοιχεία για την διατήρηση της ζωής, καθώς η περίσσεια ή η έλλειψή του δεν είναι συμβατή με την σωστή και ομαλή λειτουργία των κυττάρων. Ο σίδηρος συμμετέχει σε ζωτικές δομικές και μεταβολικές λειτουργίες όπως η μεταφορά οξυγόνου, η αναπνοή, η σύνθεση του DNA, ο σχηματισμός ορισμένων νευροδιαβιβαστών και ορμονών και σε συγκεκριμένες περιπτώσεις άμυνας ενάντια σε παθογόνους μικροοργανισμούς, γι' αυτό και αποτελεί ένα σημαντικό θρεπτικό στοιχείο για τον οργανισμό. Στα θηλαστικά, το 70% του σιδήρου του σώματος χρησιμοποιείται στα ερυθροκύτταρα για την σύνθεση της αίμης, η οποία με την σειρά της ενσωματώνεται στην αιμοσφαιρίνη και εξυπηρετεί την δέσμευση και μεταφορά του οξυγόνου. Τα μακροφάγα εκτός από την φαγοκυττάρωση των γηρασμένων μακροφάγων είναι υπεύθυνα και για την ανακύκλωση του σιδήρου στην κυκλοφορία μέσω της παράδοσης του στους ερυθροβλάστες. Η ανακύκλωσή του από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα είναι απαραίτητη για την διατήρηση ικανοποιητικού αποθέματος σιδήρου κατά την διάρκεια της ερυθροποιητικής διεργασίας.

 Η ομοιόσταση του σιδήρου προϋποθέτει ισορροπία ανάμεσα στην απορρόφηση και αποβολή του από το εντερικό επιθήλιο, την είσοδο και την κυκλοφορία του στο πλάσμα, τη μεταφορά του σε όργανα στόχους και την αποθήκευσή του. Τα κύτταρα έχουν αναπτύξει πολύπλοκους μηχανισμούς για την ρύθμιση της ομοιόστασης του σιδήρου, ώστε να αποφεύγονται οι βλαβερές επιδράσεις του π.χ. κατά τον σχηματισμό δραστικών ελευθέρων ριζών μέσω της αντίδρασης Fenton. Στους μηχανισμούς αυτούς συμμετέχουν πρωτεΐνες, οι οποίες ρυθμίζουν την απορρόφηση, την μεταφορά και την αποθήκευση της περίσσειας του σιδήρου και μερικά παραδείγματα αυτών αποτελούν η τρανσφερίνη, ο διαλυτός υποδοχέας της τρανσφερίνης, η φερριτίνη, η εψιδίνη (ηπατιδίνη) και η φερροπορτίνη.

Η φερριτίνη είναι μια σφαιρική ετεροπολυμερή πρωτεΐνη με κύρια λειτουργία της την δέσμευση του σιδήρου. Η κυτταροπλασματική μορφή της αποτελείται από 2 υπομονάδες, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως Η και L. Ανάλογα με το είδος του ιστού και την φυσιολογική κατάσταση του κυττάρου, η αναλογία της Η υπομονάδας σε σχέση με την L στο μόριο της φερριτίνης ποικίλει. Στο ήπαρ και στον σπλήνα, το μόριο της φερριτίνης αποτελείται μόνο από την L υπομονάδα, ενώ στο νεφρό και την καρδιά επικρατεί η Η. Η φερριτίνη μαζί με την τρανσφερίνη αποτελούν τους δυο πιο συχνούς βιοδείκτες προσδιορισμού του σιδήρου σε ορό ή πλάσμα με μεθόδους ανοσοπροσδιορισμού. Για τον προσδιορισμό των αποθεμάτων σιδήρου στον οργανισμό, τα χαμηλά επίπεδα φερριτίνης στον ορό σχετίζονται με απουσία φλεγμονής υποδεικνύοντάς την ως καλύτερο προβλεπτικό βιοδείκτη από την διαλυτή τρανσφερίνη, η οποία συνδέεται κυρίως με την έλλειψη σιδήρου στους ιστούς.

 Η ερυθροποιητίνη είναι ορμόνη που εκκρίνεται από τους νεφρούς και ρυθμίζει την ταχύτητα παραγωγής ερυθρών αιμοσφαιρίων. Η υποξία που προκαλείται από ελαττωμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου διεγείρει τους νεφρούς να απελευθερώσουν ερυθροποιητίνη η οποία με τη σειρά της διεγείρει το μυελό των οστών, στην παραγωγή περισσοτέρων ερυθροκυττάρων και αιμοσφαιρίνης για τη μεταφορά οξυγόνου στους ιστούς. Αντιθέτως, όταν οι νεφροί ανιχνεύσουν περίσσεια οξυγόνου προς απελευθέρωση στους ιστούς, όπως σε πρωτοπαθή πολυκυτταραιμία, ελαττώνουν την έκκριση ερυθροποιητίνης. Τα επίπεδα ερυθροποιητίνης σε αναιμία καθορίζονται κυρίως από το βαθμό της αναιμίας. Υψηλά επίπεδα αιμοσφαιρίνης ή αιματοκρίτη αναστέλλουν την απελευθέρωση της ερυθροποιτίνης. Μικρά ποσά ερυθροποιητίνης παράγονται από το ήπαρ γι' αυτό και ασθενείς με νεφρική ανεπάρκεια εμφανίζουν χαμηλά μέχρι και φυσιολογικά επίπεδα ερυθροποιητίνης. Στη διαφορική διάγνωση αναιμιών χαμηλά επίπεδα ερυθροποιητίνης υποδηλώνουν διαταραχή παραγωγής ερυθροποιητίνης από τους νεφρούς. Υψηλές τιμές ερυθροποιητίνης υποδηλώνουν ανεπάρκεια μυελού των οστών ή σιδηροπενική αναιμία.

 Στον ανθρώπινο οργανισμό, η διαδικασία της ερυθροποίησης γίνεται με χαμηλό βασικό ρυθμό, αντικαθιστώντας τα γηρασμένα ερυθρά αιμοσφαίρια με μικρά δικτυοερυθροκύτταρα. Η παραγωγή των ερυθρών κυττάρων αυξάνεται σε μια ποικιλία κλινικών ρυθμίσεων, συμπεριλαμβανομένων αιμορραγίας, αιμόλυσης, και άλλου τύπου στρες που μειώνουν την οξυγόνωση του αρτηριακού αίματος ή την μεταφορά του οξυγόνου στους ιστούς. Η ερυθροποιητίνη είναι ο κύριος, και πιθανόν ο μόνος μεσολαβητής της υποξικής επαγωγής της ερυθροποίησης. Σε κατάσταση υποξίας, επάγεται η αύξηση της παραγωγής της ερυθροποιητίνης, η οποία στη συνέχεια κυκλοφορεί στο πλάσμα και προσδένεται σε υποδοχείς που εκφράζονται σε αφθονία στα προγονικά ερυθροειδή κύτταρα, επάγοντας έτσι τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την τελική διαφοροποίηση των πρόδρομμων ερυθροειδών κυττάρων και την προστασία από την απόπτωση, προκαλώντας την αύξηση των ερυθρών κυττάρων στο αίμα. Η αύξηση της παραγωγής της ερυθροποιητίνης φαίνεται να αυξάνεται σημαντικά σε περιπτώσεις αναιμιών και ερυθροκυττάρωσης.

Στην παθογένεια της αναιμίας συμμετέχουν κυτταροκίνες. Μελέτες με ανθρώπινα ηπατοκύτταρα καθώς και μελέτες σε ποντικούς έχουν δείξει ότι η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) επάγει την παραγωγή εφιδίνης σε αντίθεση με άλλες φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως η ιντερλευκίνη-1 (IL-1) ή ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF). Η IL-6 είναι η κύρια κυτταροκίνη που ευθύνεται για την εμφάνιση υποσιδηραιμίας κατά τη φλεγμονή και αυτή παρατηρείται μέσα σε λίγες ώρες. Έγχυση ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-6 σε υγιείς εθελοντές είχε ως αποτέλεσμα την άμεση επαγωγή εφιδίνης και την εμφάνιση υποσιδηραιμίας εντός δύο ωρών.

Οι εξετάσεις ρουτίνας οι οποίες ήδη χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση των αναιμικών ασθενών είναι οι μετρήσεις των αιματοκρίτη, αιμοσφαιρίνη, φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, κορεσμός τρανσφερίνης, τρανσφερίνη, μέτρηση ελεύθερου σιδήρου και μέτρηση παραγόντων φλεγμονής. Αυτοί οι προσδιορισμοί πραγματοποιούνται ξεχωριστά σε κάθε δείγμα και όχι ταυτόχρονα στο ίδιο δείγμα. Όλες αυτές οι μετρήσεις δεν παρέχουν ακριβή πληροφορία για κάθε στάδιο ρύθμισης της ομοιόστασης του σιδήρου, με αποτέλεσμα η εκτίμηση της χορηγούμενης δόσης και της συχνότητας των θεραπειών να στηρίζεται σε εμπειρική, κυρίως προσέγγιση από τους κλινικούς. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες μεθοδολογίες οι οποίες επιτρέπουν την ακριβή ανάλυση των διαφόρων σταδίων ομοιόστασης του σιδήρου και αφορούν είτε νέα μόρια (π.χ. εψιδίνη (υπατιδίνη), μη κωδικό μικρά μόρια RNA (miRNAs)) είτε νέες τεχνικές (π.χ εκτίμηση ενδοκυττάριου ενεργού σιδήρου, ανάλυση ισομορφών τρανσφερίνης).

 Η συνδυαστική μέθοδο ανοσοενζυμικού προσδιορισμού και κυτταρομετρίας ροής με χρήση μικροσφαιριδίων αποτελεί μια κλασσική τεχνική πολλαπλού προσδιορισμού και έχει χρησιμοποιηθεί για διάφορους συνδυασμούς βιοδεικτών. Οι Cook κ.συν., βασιζόμενοι σε αυτή την μεθοδολογία, προσδιόρισαν τα επίπεδα των ιντερφερόνη-γ (Interferon gamma, INFg), καρκινικού νεκρωτικού παράγοντα άλφα (Tumor Necrotic Factor a, TNF-a), ιντερλευκίνη-2 (IL-2), ιντερλευκίνη-4 (IL-4), ιντερλευκίνη-5 (IL-5) και ιντερλευκίνη-10 (IL-10) [Cook EB, Stahl JL, Lowe L, Chen R, Morgan E, Wilson J, et al. Simultaneous measurement of six cytokines in a single sample of human tears using microparticle-based flow cytometry: allergies vs. nonallergies. J Immunol Methods. 2001;254:109-18]. Πρόσφατα, οι Brindle κ.συν., ανέπτυξαν παρόμοια μεθοδολογία με σκοπό τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των Α1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη, C-αντιδρώσα πρωτεΐνη, δεσμευτική πρωτεΐνη ρετινόλης, φερριτίνη και διαλυτού υποδοχέα τρανσφερίνης, που σχετίζονται με την εκτίμηση της φλεγμονής, της βιταμίνης Α και της κατάστασης του σιδήρου σε βιολογικό δείγμα ορού/πλάσματος [Brindle Ε, Stevens D, Crudder C, Levin CE, Garrett D, Lyman C, et al. A multiplex immunoassay method for simultaneous quantification of iron, vitamin A and inflammation status markers. PLoS One 2014; (12):e115164],

Σύμφωνα με τα παραπάνω, υπάρχει σημαντική ανάγκη για την ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας που θα βασίζεται στον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό βιοδεικτών, που αποτελούν μόρια -στόχους στη διαδικασία ρύθμισης της ομοιόστασης του σιδήρου. Τέτοια μόρια είναι η φερριτίνη, η ερυθροποιητίνη, οι ιντερλευκίνες-6 και 10. Για αυτό τον λόγο, αναπτύχθηκε μια μεθοδολογία, η οποία στηρίζεται σε μια συνδυαστική μέθοδο ανοσοενζυμικού προσδιορισμού και κυτταρομετρίας ροής με χρήση μικροσφαιριδίων, προκειμένου να προσδιοριστεί το σύνολο των παραπάνω αναλυτών ταυτόχρονα σε ένα βιολογικό δείγμα. Ο πολλαπλός προσδιορισμός αυτών των αναλυτών παρέχει σημαντικές πληροφορίες για την ανταπόκριση των αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια στην θεραπεία ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης ή/και σκευασμάτων σιδήρου και μπορεί να συνδυαστεί με τις ήδη υπάρχουσες εξετάσεις ρουτίνας.

Η αναπτυχθείσα μεθοδολογία παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των κλασσικών βιοχημικών εξετάσεων, τα οποία οφείλονται στην πολύ μικρή ποσότητα δείγματος (50μΙ) που απαιτείται για την ανίχνευση των βιοδεικτών, στην δυνατότητα προσδιορισμού περισσότερων από ένα βιοδεικτών στο ίδιο δείγμα ασθενούς, στην μείωση του χρόνου αξιολόγησης του αποτελέσματος, ενώ δεν απαιτούνται ιδιαίτερες γνώσεις και εξειδικευμένος εργαστηριακός εξοπλισμός για την εφαρμογή της μεθόδου. Επίσης, σύμφωνα με την κλινική πρακτική, ο "μεμονωμένος" προσδιορισμός των δεικτών του αιματοκρίτη, της αιμοσφαιρίνης και της φερριτίνης δεν δίνει αντιπροσωπευτικές πληροφορίες σε μεγάλο αριθμό παθολογικών περιπτώσεων. Συνεπώς, ο ταυτόχρονος προσδιορισμός περισσοτέρων βιοδεικτών στο ίδιο δείγμα, την ίδια στιγμή, για τον ίδιο ασθενή παρέχει στατιστικό πλεονέκτημα σε σχέση με τις άλλες μεθόδους, ενώ παράλληλα δίνει μια πλήρη εικόνα στον θεράποντα ιατρό για την κατάσταση του ασθενούς όσον αφορά την ομοιόσταση του σιδήρου, αλλά και την ανταπόκριση στην χορηγούμενη θεραπεία. Με την χρήση ειδικού αλγορίθμου γίνεται εξατομικευμένη προσέγγιση της παθολογικής κατάστασης κάθε ασθενούς, ενώ παρέχει σημαντικές πληροφορίες στις περιπτώσεις που τα αποτελέσματα είναι αμφίβολα ή βρίσκονται στην «γκρίζα» ζώνη.

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ

Είναι ένα αντικείμενο, που παρέχει μία βελτιωμένη μέθοδο πολλαπλού ποσοτικού προσδιορισμού μιας ομάδας βιοδεικτών όπως φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, ιντερλευκίνη-6 και ιντερλευκίνη-10 σε δείγμα που προέρχεται από ορό/πλάσμα αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια. Αυτό το αντικείμενο επιτυγχάνεται ολικώς ή μερικώς με μία μέθοδο σύμφωνα με την αξίωση 1.

Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στον συνδυασμό ενός πολλαπλού ανοσοενζυμικού προσδιορισμού και κυτταρομετρίας ροής με χρήση μικροσφαιριδίων και περιλαμβάνει α) την λήψη του βιολογικού δείγματος ορού/πλάσματος από έναν οργανισμό, β) την επώαση του βιολογικού δείγματος με τα τροποποιημένα μικροσφαιρίδια (μικροσφαιρίδιο-αντίσωμα σύλληψης), στα οποία έχουν προσκολληθεί αντισώματα (αντισώματα σύλληψης) έναντι των αντιγόνων (αναλύτες/βιοδείκτες), γ) την δημιουργία συμπλέγματος τροποποιημένου μικροσφαιριδίου-αντιγόνου/αναλύτη-αντισώματος ανίχνευσης, δ) την διέλευση και τον διαχωρισμό των συμπλεγμάτων από κυτταρομετρητή ροής και τέλος την εκτίμηση των επιπέδων του κάθε αναλύτη στο δείγμα με την βοήθεια κατάλληλου αλγορίθμου.

Το δείγμα προς ανάλυση λαμβάνεται από έναν ανθρώπινο οργανισμό ή κατά προτίμηση απομονώνεται από έναν ανθρώπινο οργανισμό. Ένα τέτοιο δείγμα μπορεί να είναι πλάσμα ή ορός, που λαμβάνεται από ένα βιολογικό υγρό, π.χ. περιφερικό αίμα, καί στο οποίο θα προσδιοριστούν ταυτόχρονα η ερυθροποιητίνη, φερριτίνη, IL-6 και IL-10.

Πιο αναλυτικά, η μέθοδος σύμφωνα με την εφεύρεση η οποία προσδιορίζει ταυτόχρονα τα επίπεδα των αναλυτών: φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 σε δείγμα ορού/πλάσματος αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια, περιλαμβάνει τα εξής στάδια (Σχ. 1):

•    την σύζευξη κατάλληλου αντισώματος σύλληψης στην στερεή επιφάνεια κάθε μικροσφαιριδίου (τροποποιημένο μικροσφαιρίδιο) έναντι των αντιγόνων των προσδιοριζόμενων αναλυτών/βιοδεικτών (βήμα 1),

•    την επώαση των τροποποιημένων μικροσφαιριδίων με το βιολογικό δείγμα, το οποίο περιέχει τα αντιγόνα/αναλύτες έναντι των προσκολλημένων αντισωμάτων στα τροποποιημένα μικροσφαιρίδια (βήμα 2),

•    την προσθήκη ενός επισημασμένου αντισώματος ανίχνευσης με βιοτίνη, το οποίο θα συνδεθεί με το αντιγόνο/αναλύτη, με σκοπό την δημιουργία ενός συστήματος τροποποιημένου μικροσφαιριδίου-αντιγόνου/αναλύτη-αντισώματος ανίχνευσης, χρησιμοποιώντας το είδος ανοσοενζυμικου προσδιορισμού τύπου sandwich ELISA (βήμα 3),

•    την προσθήκη του συστήματος στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη, το οποίο με την σειρά του θα προσκολληθεί στο αντίσωμα ανίχνευσης, παρέχοντας ένταση σήματος φθορισμού ανάλογου της ποσότητας του δεσμευμένου αναλύτη,

 • την διέλευση των μικροσφαψιδίων από κυτταρομετρητή ροής, ο οποίος θα διαχωρίσει τους ειδικούς υποπληθυσμούς μικροσφαψιδίων για τον κάθε αναλύτη, • την αξιολόγηση του αποτελέσματος μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών τιμών, σύμφωνα με πρότυπες καμπύλες αναφοράς, με την βοήθεια κατάλληλου αλγορίθμου.

 Η κυτταρομετρία ροής με χρήση σφαψιδίων συνδυάζει την κυτταρομετρία ροής με την τύπου Sandwich ELISA μέθοδο. Ο ανοσοενζυμικός προσδιορισμός τύπου Sandwich ELISA με την χρήση μικροσφαψιδίων στηρίζεται στην προσκόλληση αντισωμάτων σύλληψης, έναντι των τεσσάρων αντιγόνων/αναλυτών, στην στερεή επιφάνεια των σφαψιδίων ώστε ο κάθε υποπληθυσμός μικροσφαψιδίων να είναι τροποποιημένος με διαφορετικό αντίσωμα σύλληψης. Τα τροποποιημένα μικροσφαιρίδια συνδέονται με τα αντίστοιχα αντιγόνα, που βρίσκονται στο βιολογικό δείγμα, μετά από επώαση του μίγματος με το βιολογικό υλικό. Η προσθήκη, στη συνέχεια, επισημασμένου αντισώματος με ένζυμο για την ανίχνευση, οδηγεί στον σχηματισμό του συστήματος μικροσφαιριδίου-αναλύτηαντισώματος ανίχνευσης. Η Sandwich ELISA πραγματοποιεί τον ποσοτικό προσδιορισμό του αντιγόνου μεταξύ δύο στρωμάτων αντισωμάτων (δηλ. μεταξύ αντισώματος σύλληψης και αντισώματος ανίχνευσης). Το αντιγόνο που πρόκειται να μετρηθεί πρέπει να περιέχει τουλάχιστον δύο αντιγονικούς επιτόπους ικανούς για πρόσδεση με το αντίσωμα. Τελικά, ο ποσοτικός προσδιορισμός των αντιγόνων/αναλυτών γίνεται με την διέλευση των σφαψιδίων από κυτταρομετρητή ροής, όπου θα διαχωριστούν οι υποπληθυσμοί των σφαιριδίων ανάλογα με το μέγεθος και την ένταση φθορισμού. Επιπλέον, ένας κατάλληλος αλγόριθμος θα δώσει πληροφορίες σχετικά με το αν τα επίπεδα συγκέντρωσης του κάθε αναλύτη σε κάθε δείγμα βρίσκονται εντός φυσιολογικών ή παθολογικών τιμών.

Οι αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής που βασίζονται σε σφαιρίδια έχουν την ικανότητα να προσδιορίζουν ταυτόχρονα και ποσοτικά πολλαπλά αντιγόνα ή αντισώματα σε ένα μικρό όγκο βιολογικού υγρού. Πιο συγκεκριμένα, στην παρούσα μεθοδολογία, χρησιμοποιείται ένα ζεύγος μικροσφαιριδίων (σφαιρίδια Α και σφαιρίδια Β), τα οποία διαφέρουν τόσο στο μέγεθος όσο και στην ένταση της εσωτερικής φθορίζουσας χρωστικής ουσίας. Τα σφαιρίδια A είναι μικρότερης διαμέτρου από τα σφαιρίδια Β και διαφέρουν ως προς την ένταση φθορισμού. Επιπλέον, το ζεύγος σφαιριδίων διαχωρίζεται περαιτέρω με φθορίζουσα χρωστική ουσία διαφορετικής εσωτερικής έντασης (internal fluorescent intensities), η οποία ανιχνεύεται από το APC κανάλι (APC channel) του οργάνου και μπορεί να διακριθεί από τη μέση ένταση φθορισμού (Median Fluorescence Intensity, MFI) μετά από ανάλυση με κυτταρομετρητή ροής (Σχ. 2).

Τα σφαιρίδια κάθε ζεύγους είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένα με αντισώματα τα οποία μπορούν να δεσμεύσουν ειδικά ένα συγκεκριμένο αναλύτη, ο οποίος βρίσκεται στον ορό/πλάσμα αναιμικού ασθενούς με νεφρική ανεπάρκεια. Επομένως, το κάθε σφαιρίδιο τροποποιείται ώστε στην επιφάνειά του να βρίσκεται προσκολλημένο ένα κατάλληλο αντίσωμα σύλληψης έναντι του προσδιοριζόμενου αναλύτη, που θα προσδεθεί σε αυτό. Συνεπώς για τον προσδιορισμό του κάθε αναλύτη χρησιμοποιείται συγκεκριμένο σφαιρίδιο με συγκεκριμένο μέγεθος και κατάλληλο αντίσωμα σύλληψης έναντι του αναλύτη στην επιφάνειά του (Πίνακας 1).

 Πίνακας 1: Το μέγεθος και ο αναλύτης-στόχος του κάθε μικροσφαιριδίου

 Για παράδειγμα: 

      • για τον προσδιορισμό του αναλύτη της ερυθροποιητίνης χρησιμοποιείται το τροποποιημένο σφαιρίδιο Α6 με κατάλληλο αντίσωμα σύλληψης έναντι του αναλύτη της ερυθροποιητίνης στην επιφάνειά του,

      • για τον προσδιορισμό του αναλύτη της IL-6 χρησιμοποιείται το τροποποιημένο σφαιρίδιο Α7 με κατάλληλο αντίσωμα έναντι του αναλύτη της IL-6 στην επιφάνειά του,

      • για τον προσδιορισμό του αναλύτη της IL-10 χρησιμοποιείται το τροποποιημένο σφαιρίδιο Α10 με κατάλληλο αντίσωμα σύλληψης έναντι του αναλύτη της IL-10 στην επιφάνειά του,

       • για τον προσδιορισμό του αναλύτη της φερριτίνης χρησιμοποιείται το τροποποιημένο σφαιρίδιο Β2, με κατάλληλο αντίσωμα σύλληψης έναντι του αναλύτη της φερριτίνης στην επιφάνειά του,

Η ανάμιξη και η επώαση του μίγματος των τροποποιημένων μικροσφαιριδίων μαζί με το βιολογικό δείγμα ορού/πλάσματος επιτυγχάνει την σύζευξη των αντισωμάτων σύλληψης (βρίσκονται προσκολλημένα πάνω στο μικροσφαιρίδιο) με το αντιγόνο/αναλύτη. Η προσθήκη αντισώματος ανίχνευσης, το οποίο είναι επισημασμένο με ένζυμο βιοτίνης, και η επώαση του μίγματος οδηγεί στον σχηματισμό σάντουιτς συμπλόκων, σύμφωνα με τον ανοσοενζυμικό προσδιορισμό (ELISA). Τα σάντουιτς σύμπλοκα αποτελούν συστήματα αντισώματος σύλληψης-αντιγόνου/αναλύτη-αντισώματος ανίχνευσης. Η προσθήκη του συστήματος στρεπταβιδίνης-φυκοερυθρίνης απαιτείται ώστε να προσδεθεί η στρεπταβιδίνη με την βιοτίνη, λόγω υψηλής συγγένειας και ειδικότητας (Σχ.1).

Ο διαχωρισμός των σφαιριδίων γίνεται με την βοήθεια του κυτταρομετρητή ροής. Τα μικροσφαιρίδια που διέρχονται από τον κυτταρομετρητή ρέουν υπό την μορφή υγρού λεπτής ροής και μέσω του υδροηλεκτρικού εστιασμού οδηγούνται στο σημείο στο οποίο θα συναντηθούν με την ακτίνα laser. Όταν η ακτινοβολία laser συναντήσει ένα σφαιρίδιο τότε σκεδάζεται. Ο εμπρόσθιος σκεδασμός (forward scatter) είναι ο σκεδασμός που συμβαίνει σε κατεύθυνση σχεδόν παράλληλη με αυτή της αρχικής ακτινοβολίας laser, ενώ ο πλευρικός σκεδασμός (side scatter) είναι ο σκεδασμός που συμβαίνει σε κατεύθυνση σχεδόν κάθετη με αυτή της αρχικής ακτινοβολίας laser. Και οι δύο παράμετροι εξαρτώνται από το μέγεθος του σφαιριδίου.

Εκτός από τη σκέδαση του φωτός στην κυτταρομετρία ροής μελετάται και αναλύεται ένα ακόμα φυσικό φαινόμενο που είναι ο φθορισμός. Ο φθορισμός είναι η ιδιότητα ορισμένων ουσιών να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος από αυτήν που δέχονται (διεγείρουσα ακτινοβολία). Εφόσον γίνει η επεξεργασία των σφαιριδίων με ανιχνευτές που φθορίζουν - μονοκλωνικά ή πολύκλωνικά αντισώματα, ενωμένα με φθορίζουσες χρωστικές που ανιχνεύουν τα χαρακτηριστικά αντιγόνα των σφαιριδίων- εκτός από τη σκεδαζόμενη πρωτογενή ακτινοβολία, μπορεί να ανιχνευθεί και η δευτερογενής από τον φθορισμό ακτινοβολία (flurescence-1 FL-1 πράσινος φθορισμός, flurescence-2 FL-2 κόκκινος φθορισμός).

Μετά την απόκτηση των στοιχείων του δείγματος με κυτταρομετρία ροής υπολογίζεται η μέση ένταση φθορισμού για κάθε υποπληθυσμό σφαιριδίων, στα οποία έχει δεσμευτεί ο αναλύτης. Τα ληφθέντα αποτελέσματα δημιουργούν μία γραφική παράσταση μεταξύ της συγκέντρωσης ενός δεδομένου αναλύτη και της έντασης για να επιλεγεί ένα κατάλληλο στατιστικό μοντέλο. Συνεπώς, παράγονται 4 πρότυπες καμπύλες, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση των συγκεντρώσεων των βιοδεικτών στα δείγματα που μελετώνται (Σχ. 3).

Οι τιμές που λαμβάνονται για κάθε αναλύτη καταγράφονται σε ένα συνοδευτικό λογισμικό το οποίο αξιολογεί με χρήση στατιστικής απεικόνισης την πορεία ανταπόκρισης του ασθενούς και την απόφαση λήψης ή μη θεραπευτικού σχήματος. Ο κάθε αναλύτης αξιολογείται συνδυαστικά με τις εξετάσεις ρουτίνας του ασθενούς. Το συνοδευτικό λογισμικό ανάλυσης (FLOWCYTOGEN ANALYSIS TOOL) δύναται να ενσωματώσει απεριόριστο αριθμό αναλύσεων ανά ασθενή. Η μέθοδος που περιγράφεται εδώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί επωφελώς για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10, με σκοπό:

      ϊ. την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, ή/και ii. την παρακολούθηση της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, ή/και

    iii. την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα

όπου το δείγμα είναι δείγμα ορού/πλάσματος ενός αναιμικού ασθενούς με νεφρική ανεπάρκεια.

 Κατά την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, η μέθοδος περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

α) την λήψη του βιολογικού δείγματος ορού/πλάσματος από έναν οργανισμό, β) την εκτέλεση της μεθόδου για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

γ) τον προσδιορισμό των ποσοτικών επιπέδων των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10,

δ) την σύγκριση του αποτελέσματος που ανιχνεύεται στο εν λόγω δείγμα με ένα θετικό ή/και αρνητικό πρότυπο ελέγχου, με σκοπό την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος της θεραπείας στον ανθρώπινο οργανισμό.

Κατά την παρακολούθηση της θεραπείας για την νόσο με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, η μέθοδος περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

α) την λήψη του βιολογικού δείγματος ορού/πλάσματος από έναν οργανισμό,

 β) την εκτέλεση της μεθόδου για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

γ) τον προσδιορισμό των ποσοτικών επιπέδων των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

 δ) την επανάληψη των σταδίων α) έως γ), σε ένα ή περισσότερα χρονικά σημεία κατά την διάρκεια της θεραπείας για την νόσο, και μια μεταβολή στα επίπεδα των ρυθμιστικών παραγόντων στο εν λόγω δείγμα με την πάροδο του χρόνου σχετίζεται με την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, όπου ο οργανισμός είναι ένας ανθρώπινος οργανισμός, όπου το δείγμα είναι βιολογικό δείγμα ορού/πλάσματος.

Έτσι, μια ένδειξη της παρακολούθησης της θεραπείας είναι μια σχετική μεταβολή στη μείωση ή αύξηση των επιπέδων των ρυθμιστικών παραγόντων στο εν λόγω δείγμα σε σχέση με το προηγούμενο δείγμα που αναλύθηκε.

 Κατά την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας σε ένα δείγμα που υποβάλλεται σε θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου, η μέθοδος περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

 α) την λήψη του βιολογικού δείγματος ορού/πλάσματος από έναν οργανισμό,

 β) την εκτέλεση της μεθόδου για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων όπως φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα, γ) τον προσδιορισμό των ποσοτικών επιπέδων των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

δ) την αποτίμηση του αποτελέσματος που ανιχνεύεται στο εν λόγω δείγμα με βάση πρότυπες καμπύλες αναφοράς μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών τιμών με σκοπό την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.

Έτσι, μια ένδειξη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας είναι μια σχετική μεταβολή στη μείωση των επιπέδων των ρυθμιστικών παραγόντων στο εν λόγω δείγμα σε σχέση με το προηγούμενο δείγμα που αναλύθηκε κατά τα βήματα επανάληψης της μεθόδου.

 Η εφεύρεση σχετίζεται με ένα κιτ με την εμπορική ονομασία FERRUM FLOW BEAD ARRAY KIT για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων όπως φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 σε ένα βιολογικό δείγμα που προέρχεται από ορό/πλάσμα αναιμικού ασθενούς με νεφρική ανεπάρκεια και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την:

     ϊ. την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, ή/και

     Μ. την παρακολούθηση της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, ή/και

    iii. την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα.

 Το κιτ για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων όπως φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 σε ένα βιολογικό δείγμα που προέρχεται από ορό/πλάσμα αναιμικού ασθενούς με νεφρική ανεπάρκεια, αποτελείται από:

       1) μείγμα σφαιριδίων (Α10, Α7, Α6 και Β2) με διαφορετικό μέγεθος και ένταση κόκκινου χρώματος. Τα σφαιρίδια είναι επικαλυμμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι των μορίων στόχων,

       2) μείγμα πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι των μορίων στόχων επισημασμένα με βιοτίνη,

       3) στρεπταβιδίνη επισημασμένη με φυκοερυθρίνη,

       4) λογισμικό ανάλυσης αποτελέσματος,

       5) λογισμικό καταγραφής και στατιστικής επεξεργασίας αποτελεσμάτων (FLOWCYTOGEN ANALYSIS TOOL).

 ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΣΧΕΔΙΩΝ

 Σχ.1: απεικονίζει  την πειραματική πορεία  της μεθόδου. 

Σχ.2: παρουσιάζει ενδεικτικές εικόνες σφαιριδίων με διαφορετική ένταση φθορισμού και διαφορετικό μέγεθος.

Σχ.3: παρουσιάζει πρότυπες καμπύλες αναλυτών.

Σχ.4: παρουσιάζει χαρακτηριστικές καμπύλες του ασθενούς 2 υπό θεραπεία και σύγκριση με κλασσικούς δείκτες.

Σχ.5: παρουσιάζει χαρακτηριστικές καμπύλες του ασθενούς 3 υπό θεραπεία και σύγκριση με κλασσικούς δείκτες.

Σχ. 6: απεικονίζει την κατανομή φυσιολογικών τιμών ανά αναλυτή.

Ορισμοί

Οι όροι που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εφεύρεση, σε γενικές γραμμές, αναμένονται να συμμορφώνονται με τυποποιημένους ορισμούς γενικά αποδεκτούς από αυτούς που έχουν συνήθη εμπειρία στον τομέα της βιολογίας.

Ο όρος "αντίσωμα" χρησιμοποιείται για μια ουσία η οποία παράγεται από τα Β λεμφοκύτταρα σε απάντηση ενός και μοναδικού αντιγόνου. Κάθε μόριο αντισώματος συνδέεται με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο για να το ελέγξει ή να το καταστρέφει. Όλα τα αντισώματα, εκτός από τα φυσικά αντισώματα (π.χ. αντισώματα για τις διάφορες ομάδες αίματος), παράγονται από τα Β λεμφοκύτταρα, τα οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούνται από εξωγενή αντιγόνα, τα οποία κατά κανόνα είναι πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες ή νουκλεϊνικά οξέα. Ένα μόριο αντισώματος αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες (δύο ελαφρές και δύο βαριές). OL βαριές αλυσίδες σχηματίζουν την περιοχή πρόσδεσης με το συμπλήρωμα, και οι ελαφρές μαζί με τις βαριές αλυσίδες σχηματίζουν την περιοχή δέσμευσης του αντιγόνου. Στην παρούσα εφεύρεση αναφέρονται οι όροι "αντίσωμα σύλληψης" και "αντίσωμα ανίχνευσης". Ως "αντίσωμα σύλληψης" περιγράφεται το αντίσωμα, το οποίο είναι προσκολλημένο στην στερεή επιφάνεια του μικροσφαιριδίου με σκοπό την "σύλληψη" ή "παγίδευση" του αντίστοιχου αντιγόνου, που περιέχεται μέσα στο βιολογικό δείγμα. Ως "αντίσωμα ανίχνευσης" περιγράφεται το αντίσωμα που έχει επισημανθεί με κατάλληλο ένζυμο και του οποίου το υπόστρωμα προστίθεται στο τελικό στάδιο της διαδικασίας. Η αντίδραση που ακολουθεί παράγει ένα ανιχνεύσιμο σήμα, συνήθως μία αλλαγή του χρώματος στο υπόστρωμα, το οποίο διαβάζεται από το -ατάλληλο μηχάνημα και παρέχει πληροφορίες ποιοτικές και ποσοτικές για την παρουσία ή συγκέντρωση του ζητούμενου αναλύτη στο δείγμα.

 Ο όρος "αντιγόνο" χρησιμοποιείται για έναν πρωτεϊνικό ή ολιγοσακχαριδικό δείκτη που βρίσκεται στην επιφάνεια των κυττάρων με βάση τον οποίο αναγνωρίζεται το κύτταρο σαν ενδογενές ή εξωγενές, αναγνωρίζεται η προέλευση του κυττάρου π.χ. δέρμα, νεφροί, ενεργοποιείται η παραγωγή αντισωμάτων, από τα Β λεμφοκύτταρα, τα οποία απενεργοποιούν ή καταστρέφουν το κύτταρο εάν είναι αναγκαίο, και ενεργοποιούν την κυτταροτοξική αντίδραση των κοκκιοκυττάρων, των μονοκυττάρων και των λεμφοκυττάρων. Το αντιγόνο μπορεί να είναι ξένο ή αυτοαντιγόνο, το οποίο έχει υποστεί κάποια εκφύλιση και για το λόγο αυτό αναγνωρίζεται σαν ξένο. Η αντίδραση των Β και Τ λεμφοκυττάρων σε κάποιο αντιγόνο αποτελεί τμήμα της ειδικής ανοσολογικής απάντησης.

Ο όρος "φθορισμός" είναι η ιδιότητα ορισμένων ουσιών να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος από αυτήν που δέχονται (διεγείρουσα ακτινοβολία).

 Ο όρος "βιοδείκτης" αναφέρεται σε μια μετρήσιμη ουσία σε ένα βιολογικό σύστημα που οι διαφορές στην συγκέντρωσή της αντανακλά διαταραχές στην φυσιολογική λειτουργία του συστήματος. Στην παρούσα εφεύρεση ο όρος "βιοδείκτης" ταυτίζεται με τους όρους "αναλύτης" ή "αντιγόνο".

Οπως χρησιμοποιείται εδώ, ένα "βιολογικό δείγμα" περιλαμβάνει δείγμα ορού/πλάσματος που λαμβάνεται από αναιμικό ασθενή με νεφρική ανεπάρκεια και που παρουσιάζει ή όχι διαταραχές στην ομοιόσταση του σιδήρου κατά την λήψη χορηγούμενης θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή/και σκευασμάτων σιδήρου.

 Ο όρος '"πλάσμα αίματος" ή "πλάσμα" είναι το ωχρό ή ωχροκίτρινο χρώματος υγρό συστατικό του αίματος που συνήθως συγκρατεί τα κύτταρα του αίματος στο πλήρες αίμα. Αποτελεί περίπου το 55% του συνολικού αίματος κατ' όγκο. Είναι το ενδοαγγειακό μέρος του εξωκυτταρικού υγρού (όλα τα υγρά του σώματος εκτός κυττάρων). Η σύστασή του αποτελείται κυρίως από νερό (93 % κατ' όγκο), και περιέχει διαλυμένες πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων αλβουμινών, ανοσοσφαιρινών, και ινωδογόνου, γλυκόζης, παράγοντες πήξεως, ηλεκτρολύτες (Na<+>, Ca<2+>, Me<2>, HCO<3 '>, Cl κλπ), ορμόνες και διοξείδιο του άνθρακα.

Όπως χρησιμοποιείται εδώ, ένας "αναλύτης" αποτελεί την προσδιοριζόμενη ουσία που θα υποβληθεί για ανάλυση. Στην προκειμένη περίπτωση ο αναλύτης είναι μια από τις παρακάτω ουσίες: φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, ιντερλευκίνη-6 και ιντερλευκίνη-10.

Ο όρος "ELISA" αποτελεί μια ταχεία ενζυμική ανοσοχημική μέθοδο για τον καθορισμό της παρουσίας ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε βιολογικό δείγμα. Ενα αντιγόνο ή ένα αντίσωμα δεσμεύεται σε ένα ένζυμο (π.χ. υπεροξειδάση χρένου ή αλκαλική φωσφατάση). Το μόριο που προκύπτει μπορεί να συνδεθεί με ειδικούς ανοσολογικούς στόχους σε δείγματα σωματικών υγρών και να υποδείξει την παρουσία τους ενζυμικά. Η ELISA παλαιότερα ήταν γνωστή ως ανοσοπροσροφητική ανάλυση στερεός φάσεως με σύνδεση ενζύμου (ELISA), αποτελεί μια από τις κυριότερες διαγνωστικές εξετάσεις για πολλές λοιμώδεις νόσους, συμπεριλαμβανομένου και του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV).

Ο όρος "κυτταρομετρία ροής" αναφέρεται σε μία τεχνική για τη μέτρηση και τον χαρακτηρισμό μικροσκοπικών σωματιδίων σε ρέον υγρό. Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση πολλών παραμέτρων των φυσικών ή χημικών χαρακτηριστικών μεμονωμένων κυττάρων τα οποία ρέουν διαμέσου μιας συσκευής οπτικής ή/και ηλεκτρονικής ανίχνευσης. Στις εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής μπορεί να περιλαμβάνεται και η ταξινόμηση των συστατικών βάσει φυσικών παραμέτρων. Στην παρούσα εφεύρεση χρησιμοποιείται μια παραλλαγή της κυτταρομετρίας ροής σε συνδυασμό με τον ανοσοενζυμικό προσδιορισμό, όπου τα κύτταρα αντικαθίσταται από σφαιρίδια διαφορετικού μεγέθους και εσωτερικής πυκνότητας φθορίζουσας ουσίας για τον προσδιορισμό πολλών βιοδεικτών ταυτόχρονα.

Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος επικοινωνούν μεταξύ τους κατά τη διάρκεια της ανοσολογικής απάντησης, εκκρίνοντας διάφορους διαβιβαστές πρωτεϊνικής ή γλυκοπρωτεϊνικής φύσης, που ονομάζονται κυτταροκίνες. Χαρακτηριστικά των κυτταροκινών είναι το ευρύ φάσμα δράσεων, και η αποτελεσματικότητά τους σε πάρα πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Οι περισσότερες δρουν μόνο τοπικά, σε γειτονικούς ιστούς (παρακρινής δράση). Μερικές κυτταροκίνες, ωστόσο, μπορούν να δράσουν σε απομακρυσμένους στόχους, μέσω της κυκλοφορίας του αίματος. Η διάκριση μεταξύ κυτταροκινών (που εκκρίνονται από τα μακροφάγα) και λεμφοκινών (που εκκρίνονται από τα λεμφοκύτταρα) δεν είναι απόλυτα σαφής, καθώς έχει βρεθεί ότι μια κυτταροκίνη μπορεί να εκκρίνεται από διαφορετικά κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος. Αλλά και οι δράσεις τους εμφανίζουν σημαντική αλληλοεπικάλυψη. Ο όρος "ιντερλευκίνες" αναφέρεται σε μια κατηγορία κυτταροκινών που παράγονται από τα λευκοκύτταρα και δρουν κυρίως σε αυτά. Στις κυτταροκίνες συμπεριλαμβάνονται και οι ιντερφερόνες (IFNs, Interferons), ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF, Tumor Necrosis Factor), ο τροποποιητικός αυξητικός παράγοντας (TGF, Transforming Growth Factor) και οι παράγοντες πολλαπλασιασμού των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (CSFs, Colony Stimulation Factors). Πιο συγκεκριμένα, η ιντερλευκίνη-6 παράγεται κυρίως από τα μακροφάγα και αποτελεί μεσολαβητή της φλεγμονώδους αντίδρασης και των σηπτικών φαινομένων, ενώ αυξάνει τη σύνθεση πρωτεϊνών οξείας φάσης από το ήπαρ. Η ιντερλευκίνη-10 αναστέλλει την παραγωγή κυτταροκινών και αυξάνει την παραγωγή αντισωμάτων από τα Β-λεμφοκύτταρα.

ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ

Η παρούσα εφεύρεση βασίζεται στον ποσοτικό προσδιορισμό ρυθμιστικών παραγόντων του σιδήρου όπως φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10. Ο πολλαπλός προσδιορισμός αυτών των πρωτεϊνικών παραγόντων σχετίζεται με την παρακολούθηση και διαχείριση των αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια στην χρήση ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης ή/και σκευασμάτων σιδήρου.

Ασθενείς

Για την ανάπτυξη και την επικύρωση της παρούσας μεθοδολογίας αναλύθηκαν i) 10 δείγματα πλάσματος/ορού αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια και 20 δείγματα πλάσματος/ορού υγιούς πληθυσμού. Ορίστηκε το εύρος φυσιολογικών τιμών (Πίνακας 2, Σχ. 6), με σκοπό τον διαχωρισμό τους από τις αντίστοιχες παθολογικές τιμές. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μεθόδου για 2 ασθενείς συγκρίθηκαν με τους αντίστοιχους βιοδείκτες που χρησιμοποιούνται ήδη στην κλινική ρουτίνα, ώστε να φανεί η κλινική αξία της μεθόδου.

Πίνακας 2: Εύρος φυσιολογικώς τιμών ανά αναλύτη

Παράδειγμα 1

Για την ανάπτυξη της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα δείγματα γνωστής συγκέντρωσης και ορίστηκαν οι εξής παράμετροι: ευαισθησία, επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα.

Για την ευαισθησία της μεθόδου, αναλύθηκε γνωστό δείγμα το οποίο αραιώθηκε μέχρι το σημείο μη ανίχνευσης αποτελέσματος. Με βάση την παραπάνω προσέγγιση ορίστηκε η ευαισθησία της μεθόδου για κάθε αναλύτη/βιοδείκτη. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.

    Πίνακας 3: Εύρος ανάλυσης και ευαισθησίας της μεθόδου ανά αναλυτή με βάση την ανάλυση γνωστών δειγμάτων

     Για την επαναληψιμότητα της μεθόδου, μετρήθηκε ένα δείγμα, 9 φορές την ίδια μέρα και τα αποτελέσματα καθώς και τα στατιστικά στοιχεία παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.

    Πίνακας 4: Αποτελέσματα επαναληψιμότητας της μεθόδου ανά αναλύτη

     Για την αναπαραγωγιμότητα, μετρήθηκε ένα δείγμα 6 διαφορετικές μέρες και τα αποτελέσματα καθώς και τα στατιστικά στοιχεία παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.

Πίνακας 5: Αποτελέσματα αναπαραγωγιμότητας της μεθόδου ανά αναλύτη

Παράδειγμα 2

Στα σχήματα 3 και 4, παρουσιάζονται χαρακτηριστικές καμπύλες των διαφορετικών χρονικών σημείων, 2 ασθενών, κατά την παρακολούθηση της θεραπείας. Στα δύο σχήματα παρουσιάζεται η σύγκριση μεταξύ των υπό μελέτη βιοδεικτών και αυτών που χρησιμοποιούνται στην κλινική ρουτίνα (TIBC, serum IRON, κορεσμός τρανσφερίνης). Η εμφάνιση χαρακτηριστικών κορυφών για τους δείκτες ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 ενισχύει την απόφαση λήψης θεραπευτικού σχήματος στα σημεία αυτά.

Πιο συγκεκριμένα στο σχήμα 3 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα ενός ασθενούς που βρίσκεται υπό θεραπεία με σίδηρο και ερυθροποιητίνη. Οι κλασσικοί δείκτες ανάλυσης (TIBC, serum IRON και κορεσμός τρανσφερίνης) παρουσιάζουν σταδιακή αύξηση και συνεπώς βελτίωση της κλινικής εικόνας, ενώ παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται και από την καμπύλη της φερριτίνης με την κλίση της να είναι πιο έντονη. Οι δείκτες IL-6, IL-10 και ερυθροποιητίνη παρουσιάζουν αρχικά μείωση και εν συνεχεία αύξηση (μεταξύ 3<ης>και 4<ης>συνεδρίας), ορίζοντας το σημείο αυτό ως υποχρεωτικό σημείο έναρξης της θεραπείας. Ο συνδυασμός των IL-6, IL-10 και ερυθροποιητίνη απαιτεί μικρό όγκο δείγματος (30μl), ενώ προσφέρει καλύτερη και διακριτή διαφοροποίηση στην παρακολούθηση της πορείας του ασθενούς συγκριτικά με τις κλασσικές αναλύσεις ρουτίνας.

Αντίστοιχα αποτελέσματα παρουσιάζονται και στο σχήμα 4. Συγκρίνοντας την καμπύλη της φερριτίνης με τους κλασσικούς δείκτες ανάλυσης (TIBC, serum IRON και κορεσμός τρανσφερίνης) παρουσιάζεται σταδιακή αύξηση και συνεπώς βελτίωση της κλινικής εικόνας τους ασθενούς (έντονη κλίση της καμπύλης της φερριτίνης). Οι δείκτες IL-6, IL-10 και ερυθροποιητίνη παρουσιάζουν αρχικά μείωση συνεδρίας), ορίζοντας το σημείο αυτό ως υπ συνδυασμός των IL-6, IL-10 και ερυθροποιητί προσφέρει καλύτερη και διακριτή διαφοροπο ασθενούς συγκριτικά με τις κλασσικές αναλύσε και εν συνεχεία αύξηση (μεταξύ 3<ης>και 4<ης>οχρεωτικό σημείο έναρξης της θεραπείας. Ο νη απαιτεί μικρό όγκο δείγματος (30μΙ), ενώ ίηση στην παρακολούθηση της πορείας του ις ρουτίνας.

Claims (4)

ΑΞΙΩΣΕΙΣ

       1. Μια in vitro μέθοδο παρακολούθησης της θεραπείας αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια κατά την χορήγηση ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης ή/και σκευασμάτων σιδήρου, που βασίζεται στον πολλαπλό ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των παραγόντων ερυθροποιητίνη, φερριτίνη, IL-6 και IL-10 και αποτελείται από τα εξής στάδια:

                    1) την επώαση του βιολογικού δείγματος με τα τροποποιημένα μικροσφαιρίδια, στα οποία έχουν προσκολληθεί αντισώματα (αντισώματα σύλληψης) έναντι

των προσδιοριζόμενων αντιγόνων (αναλυτών) σε μια μικροπλάκα,

                    2) την δημιουργία συμπλέγματος τροποποιημένου μικροσφαιριδίου-αναλύτηαντισώματος ανίχνευσης,

                    3) την διέλευση και τον διαχωρισμό των συμπλεγμάτων από κυτταρομετρητή ροής και την εκτίμηση των επιπέδων του κάθε αναλύτη στο δείγμα με την βοήθεια κατάλληλου αλγορίθμου.

       2. Η in vitro μέθοδος, σύμφωνα με την αξίωση 1, παρακολούθησης της θεραπείας αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια κατά την χορήγηση ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης ή/και σκευασμάτων σιδήρου, που βασίζεται στον πολλαπλό ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των παραγόντων ερυθροποιητίνης, φερριτίνης, IL-6 και IL-10 και αποτελείται από τα εξής στάδια:

                    1) την σύζευξη διαφορετικού αντισώματος σύλληψης στην στερεή επιφάνεια κάθε μικροσφαιριδίου (τροποποιημένο μικροσφαιρίδιο) έναντι των αντιγόνων ερυθροποιητίνης, φερριτίνης, IL-6 και IL-10,

                    2) την επώαση των τροποποιημένων μικροσφαιριδίων με το βιολογικό δείγμα, το οποίο περιέχει τα αντιγόνα της ερυθροποιητίνης, φερριτίνης, IL-6 και IL-10 έναντι των προσκολλημένων αντισωμάτων στα τροποποιημένα μικροσφαιρίδιο,

                    3) την προσθήκη ενός επισημασμένου αντισώματος ανίχνευσης με βιοτίνη, το οποίο θα συνδεθεί με το κάθε αντιγόνο/αναλύτη, με σκοπό την δημιουργία ενός συστήματος τροποποιημένου μικροσφαιριδίου-αντιγόνου/αναλύτηαντισώματος ανίχνευσης,

                    4) την προσθήκη του συστήματος στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη, το οποίο με την σειρά του θα προσκολληθεί στο αντίσωμα ανίχνευσης, παρέχοντας ένταση σήματος φθορισμού ανάλογου της ποσότητας του δεσμευμένου αναλύτη, 5) την διέλευση των μικροσφαιριδίων από κυτταρομετρητή ροής, ο οποίος θα διαχωρίσει τους ειδικούς υποπληθυσμούς μικροσφαιριδίων για τον κάθε αναλύτη,

              6) την αξιολόγηση του αποτελέσματος μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών τιμών, σύμφωνα με πρότυπες καμπύλες αναφοράς, με την βοήθεια κατάλληλου αλγορίθμου.

3.    Η μέθοδος σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 και 2, βασίζεται στην χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων σύλληψης για την δημιουργία των τροποποιημένων μικροσφαιριδίων. 4. Η μέθοδος σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 και 2, βασίζεται στην χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων ανίχνευσης για την πρόσδεση των αναλυτών/βιοδεικτών του βιολογικού υλικού.

5.     Η μέθοδος σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 και 2, όπου ο πολλαπλός ποσοτικός προσδιορισμός των βιοδεικτών βασίζεται στον συνδυασμό ανοσοενζυμικού προσδιορισμού και κυτταρομετρίας ροής με την χρήση μικροσφαιριδίων.

6.     Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 5, όπου ο ανοσοενζυμικός προσδιορισμός βασίζεται σε μέθοδο τύπου σάντουιτς ELISA (Sandwich ELISA).

7.     Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 6, κατά την οποία η ανοσοενζυμική τύπου σάντουιτς ELISA είναι μη ανταγωνιστικού τύπου ELISA.

8.     Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 5, στην οποία τα μικροσφαιρίδια είναι παραμαγνητικά.

9.     Η μέθοδος βασίζεται στην χρήση ενός ζεύγους μικροσφαιριδίων διαφορετικού μεγέθους, τα οποία διακρίνονται από τον κυτταρομετρητή ροής με βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασμό της ακτινοβολίας laser.

10.  Σύμφωνα με τις αξιώσεις 8 και 9, οι υποπληθυσμοί των μικροσφαιριδίων είναι τέσσερις και διαφέρουν ως προς το μέγεθος, την εσωτερική φθορίζουσα χρωστική και το προσκολλημένο αντίσωμα.

11.  Σύμφωνα με τις αξιώσεις 8-10, όπου το κάθε σφαιρίδιο τροποποιείται προσκολλώντας διαφορετικό αντίσωμα έναντι των αναλυτών IL-10, IL-6, ερυθροποιητίνη, φερριτίνη σε κάθε περίπτωση αναλύτη.

12.  Σύμφωνα με τις αξιώσεις 8-10, όπου το μικροσφαιρίδιο στο οποίο θα προσκολληθεί το αντίσωμα έναντι της IL-10 έχει μέγεθος διαμέτρου 5μm και υψηλής έντασης φθορισμού στο κόκκινο.

13.  Σύμφωνα με τις αξιώσεις 8-10, όπου το μικροσφαιρίδιο στο οποίο θα προσκολληθεί το αντίσωμα έναντι της IL-6 έχει μέγεθος διαμέτρου 5μm και μεσαίας έντασης φθορισμού στο κόκκινο.

14.  Σύμφωνα με τις αξιώσεις 8-10, όπου το μικροσφαιρίδιο στο οποίο θα προσκολληθεί το αντίσωμα έναντι της ερυθροποιητίνης έχει μέγεθος διαμέτρου 5μm και χαμηλής έντασης φθορισμού στο κόκκινο.

15.  Σύμφωνα με τις αξιώσεις 8-10, όπου το μικροσφαιρίδιο στο οποίο θα προσκολληθεί το αντίσωμα έναντι της φερριτίνης έχει μέγεθος διαμέτρου 7μm και χαμηλής έντασης φθορισμού στο κόκκινο.

16.  Η μέθοδος, σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 και 2, χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της θεραπείας σε ένα δείγμα που υποβάλλεται σε θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου και αποτελείται από τα εξής στάδια:

       1) την εκτέλεση της μεθόδου για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

       2) τον προσδιορισμό των ποσοτικών επιπέδων των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

       3) την επανάληψη των σταδίων α) και β), σε ένα ή περισσότερα χρονικά σημεία κατά την διάρκεια της θεραπείας για την νόσο, και μια μεταβολή στα επίπεδα των ρυθμιστικών παραγόντων στο εν λόγω δείγμα με την πάροδο του χρόνου σχετίζεται με την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, όπου ο οργανισμός είναι ένας ανθρώπινος οργανισμός, όπου το δείγμα είναι βιολογικό δείγμα ορού/πλάσματος.

17.  Η μέθοδος, σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 και 2, χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας σε ένα δείγμα που υποβάλλεται σε θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου, αποτελείται από τα εξής στάδια:

       1) την εκτέλεση της μεθόδου για τον πολλαπλό ποσοτικό προσδιορισμό των ρυθμιστικών παραγόντων όπως φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

       2) τον προσδιορισμό των ποσοτικών επιπέδων των ρυθμιστικών παραγόντων φερριτίνη, ερυθροποιητίνη, IL-6 και IL-10 στο εν λόγω δείγμα,

       3) την αποτίμηση του αποτελέσματος που ανιχνεύεται στο εν λόγω δείγμα με βάση πρότυπες καμπύλες αναφοράς μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών τιμών με σκοπό την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.

18.  Η μέθοδος, σύμφωνα με παραπάνω αξιώσεις, κατά την οποία το δείγμα είναι βιολογικό δείγμα πλάσματος/ορού.

19.  Χρήση της in vitro μεθόδου προσδιορισμού των παραγόντων ερυθροποιητίνη, φερριτίνη, IL-6 και IL-10 για:

             1) την πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, ή/και

             2) την παρακολούθηση της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη

ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα, ή/και

             3) την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη ή σκευασμάτων σιδήρου σε ένα δείγμα όπου το δείγμα είναι δείγμα ορού/πλάσματος ενός αναιμικού ασθενούς με νεφρική ανεπάρκεια.

20.  Η χρήση του κιτ που περιλαμβάνει την χρήση μιας in vitro μεθόδου, σύμφωνα με την αξίωση 19, για την παρακολούθηση των διαταραχών ομοιόστασης του σιδήρου αναιμικών ασθενών με νεφρική ανεπάρκεια κατά την χορήγηση θεραπείας, αποτελείταιαπό:

              1) μείγμα σφαιριδίων με διαφορετικό μέγεθος και ένταση κόκκινου χρώματος.

                    Τα σφαιρίδια είναι επικαλυμμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι των μορίων στόχων,

             2) διάλυμα έκπλυσης (PBS),

              3) μείγμα πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι των μορίων στόχων επισημασμένα με βιοτίνη,

             4) στρεπταβιδίνη επισημασμένη με φυκοερυθρίνη,

              5) λογισμικό ανάλυσης αποτελέσματος,

              6) λογισμικό καταγραφής και στατιστικής επεξεργασίας αποτελεσμάτων (FLOWCYTOGEN ANALYSIS TOOL).