GR1009057B - Μεθοδος παρασκευης χημικα σταθερων υποστρωματων με εγχαραξη πλασματος για απευθειας ομοιοπολικη ακινητοποιηση βιομοριων - Google Patents

Abstract

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια διεργασία πλάσματος η οποία ακολουθείται από μια θερμική διαδικασία ανόπτησης για την παραγωγή τυχαίως εκτραχυμένων υποστρωμάτων οργανικού πολυμερούς ή SiO2 με χημικά-σταθερή δραστικότητα. Τα υποστρώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για απευθείας, ομοιοπολική ακινητοποίηση βιομορίων. Μέθοδος για την κατασκευή χημικά-σταθερών εγχαραγμένων με πλάσμα υποστρωμάτων για απευθείας ομοιοπολική ακινητοποίηση βιομορίων.

Description

       Μέθοδος για την κατασκευή χημικά-σταθερών εγχαραγμένων με πλάσμα υποστρωμάτων για απευθείας ομοιοπολική ακινητοποίηση βιομορίων

Πεδίο της Εφεύρεσης

            Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με την παραγωγή εγχαραγμένων με πλάσμα επιφανειών οργανικού πολυμερούς ή SiO2. Αυτές οι επιφάνειες μπορεί να προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα ως υποστρώματα για την ακινητοποίηση βιομορίων.

Στάθμη της τεχνικής και υπόβαθρο της εφεύρεσης

            Η ακινητοποίηση βιομορίων επιτρέπει την αξιοποίηση των χαρακτηριστικών τους σε ελεγχόμενα περιβάλλοντα και οδηγεί σε μια μεγάλη ποικιλία εφαρμογών, στις οποίες συμπεριλαμβάνονται οι μικροσυστοιχίες βιομορίων, οι συστοιχίες κυττάρων, καθώς και οι μικρορευστονικές διατάξεις για διαγνωστικούς σκοπούς, οι βιοσυμβατές επιφάνειες για ιατρικές εφαρμογές, όπως τα εμφυτεύματα, και πολλές άλλες. Υποστρώματα από νέα υλικά, τα οποία μπορούν εύκολα να κατασκευαστούν και να ενεργοποιηθούν με διάφορες δραστικές ομάδες για την ειδική ακινητοποίηση βιομορίων γίνονται όλο και πιο ελκυστικά. Ένα βιομόριο αναφέρεται ως "ακινητοποιημένο" σε ένα στερεό υπόστρωμα, αν είναι είτε φυσικώς προσροφημένο στο υπόστρωμα μέσω δυνάμεων διασποράς van-der-Waals, δεσμών υδρογόνου ή αλληλεπιδράσεων οξέος-βάσεως, ή συνδεδεμένο ομοιοπολικά σε δραστικές ομάδες της επιφάνειας, με επαρκή αντοχή ώστε να μην μπορεί να απομακρυνθεί από το υπόστρωμα μετά την έκπλυση με επιφανειοδραστικά. Η ομοιοπολική ακινητοποίηση μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη δραστικότητα του ακινητοποιημένου βιομορίου, μειωμένη μη ειδική προσρόφηση και μεγαλύτερη σταθερότητα.

             Η προσρόφηση ενός βιομορίου σε ένα υπόστρωμα επηρεάζεται ιδιαίτερα από τις ιδιαίτερες ιδιότητες της επιφάνειας όπως η τοπογραφία, η τραχύτητα, το ηλεκτρικό φορτίο, η σκληρότητα, οι λειτουργικές ομάδες, και η ικανότητα διαβροχής (A.V. Singh, et al., J Biomed Mater Res Part A, 2013, 101A, 3019-3032). H ικανότητα διαβροχής και η τοπογραφία έχουν τεκμηριωθεί ως ιδιαίτερα κρίσιμοι παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν την ακινητοποίηση των βιομορίων (Ino, et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2007,104,420-423). Μία από τις μεθόδους που έχει χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της ακινητοποίησης βασίζεται σε ακραία αντίθεση όσον αφορά την ικανότητα διαβροχής της επιφάνειας, από υδρόφιλη σε υπερυδρόφοβη. Η μέθοδος που παρουσιάζει η εφεύρεση μας βασίζεται σε ενεργοποίηση των επιφανειών με υδροφιλοποίηση και στην τοπογραφία της επιφάνειας.

             Τα βιομόρια ακινητοποιούνται σε επιφάνειες SiO2μετά από τροποποίηση τους με οργανοσιλάνια όπως το 3-αμινοπροπυλοτριαιθοξυσιλάνιο (APTES) ή το 3-γλυκιδοξυπροπυλοτριμεθοξυσιλάνιο (GOPs), προκειμένου να εισαχθούν δραστικές ομάδες όπως αμινο- ή εποξυ-ομάδες στην επιφάνεια. Ανάλογα με το μόριο που πρόκειται να ακινητοποιηθεί, μπορεί να απαιτείται περαιτέρω ενεργοποίηση για την τροποποίηση των ομάδων που υπάρχουν στο υπόστρωμα σε πιο δραστικές ομάδες, όπως είναι οι αλδεΰδες (MacBeath, et al. ,Science,2000,289, 1760- 1763), οι ηλεκτριμιδο-εστέρες ή οι ισοθειοκυανικές ομάδες (Benters, et αι.,Chembiochem,200 1,2, 686-694) οι οποίες μπορούν να αντιδράσουν με πυρηνόφιλες ομάδες (αμινο, θειολο, υδροξυλο-ομάδες) στα μόρια που πρόκειται να ακινητοποιηθούν.

              Από την άλλη, οι επιφάνειες των οργανικών πολυμερών είναι χημικά αδρανείς και επομένως λιγότερο κατάλληλες για την ακινητοποίηση βιομορίων. Οι συνήθεις τεχνικές κατεργασίας οργανικών πολυμερών που χρησιμοποιούνται για την τροποποίηση των επιφανειών τους βασίζονται σε συνήθη υγρή χημεία, π.χ. εφαρμογή ισχυρών οξειδωτικών παραγόντων, ακτινοβολίας UV/όζον, ηλεκτρική εκκένωση κορώνας και πλάσμα (McCarley, et αl , Journal of the American Chemical Society,2004, 127, 842-843, S. Wei, et αl.,' The Journal of Physical Chemistry B,2005, 109, 16988-16996, C. Situma, et αl.,Analytical Biochemistry ,2005, 340, 123-135).

            Η κατεργασία των οργανικών πολυμερών με πλάσμα είναι μια καθιερωμένη τεχνική για πολλές εφαρμογές, λόγω της μοναδικής της ικανότητας να τροποποιεί τις επιφάνειες χωρίς να επηρεάζει τις ιδιότητες του συνόλου του πολυμερούς (R. d’ Agostino, et al. , Plasma Process. Polym.,2005,2,7, Holmberg, et al., 2002, Handbook of Applied Surface and Colloid Chemistry, John Wiley & Sons Ltd). Οι ευρέως διαδεδομένες εφαρμογές της κατεργασίας με πλάσμα οφείλονται στα ανταγωνιστικά πλεονεκτήματά που διαθέτει, όπως ο ξηρός χαρακτήρας της κατεργασίας, η χαμηλή θερμοκρασία στην οποία πραγματοποιείται και κυρίως η ευελιξία αλλαγής του αποτελέσματος της κατεργασίας από εναπόθεση σε εγχάραξη, νανο-ύφανση και χημική τροποποίηση, αλλάζοντας τη χημεία της αέριας φάσης και την ενέργεια των ιόντων βομβαρδισμού.

            Η κατεργασία με πλάσμα χρησιμοποιείται ευρέως ως στάδιο προετοιμασίας των οργανικών πολυμερικών υποστρωμάτων πριν από την ακινητοποίηση βιομορίων (Τ. Desmet, et αl. , Biomacromolecules, 2009, 10,2351), και είναι πολύ αποτελεσματική στην ενεργοποίηση των οργανικών πολυμερικών επιφανειών λόγω της υψηλής απόδοσης και της προσαρμοσμένης στο στόχο χημείας (C. Bergemann, et αl., Plasma Processes and Polymers, 2012,9,261-272). Τα τελευταία χρόνια, έχουν δημοσιευθεί αρκετές μελέτες οι οποίες ασχολούνται με τη δυνατότητα ρύθμισης και ελέγχου της προσκόλλησης κυττάρων και πρωτεϊνών μέσω της κατεργασίας επιφανειών με πλάσμα (Β. D. Ratner, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng.,2004,6,41, F. Bretagnol, et al., Plasma Processes and Polymers ,2006, 3, 443-455, Ch. Baquey, et αl.,Nucl. Instrum. Methods B, 1999, 151, 255A. Ohl, et al., J. Mater. Sci., Mater. Med., 1999, 10,747-754). Στην συνέχεια αναφέρουμε αναλυτικά τις διάφορες στρατηγικές τροποποίησης επιφανειών με βάση το πλάσμα που έχουν χρησιμοποιηθεί για τη ακινητοποίηση βιομορίων σε διαφορετικά στερεά υποστρώματα.

            Πολλές ερευνητικές ομάδες χρησιμοποίησαν την ενεργοποίηση με πλάσμα ως το πρώτο βήμα για τη δημιουργία δραστικών ομάδων όπως ΝΗxμε κατεργασία σε πλάσμα ΝΗ3, ή SOxμε κατεργασία σε πλάσμα SΟ2, ή C=Ο και -COOH και ΟΗ με κατεργασία σε πλάσμα Ο2. Στη συνέχεια, ακολούθησε πρόσδεση του συνδετικού μορίου και σύνδεση του βιομορίου στα συνδετικά μόρια (A. Jesiis Martinez-Gomez, et αl. ,Cellulose,2009, 16,501-517, A. A. Meyer-Plath, et al. , Vacuum,2003 ,71,391-406). Επίσης έχει χρησιμοποιηθεί εναπόθεση με πλάσμα πολυμερών κατάλληλων για πρόσδεση ή μη βιομορίων (F. Bretagnol, et al. , Plasma Processes and Polymers ,2006, 3, 30-38, P. Colpo, et al. ,Adv Biochem Engin/Biotechnol,2009, 109-130, P. Rossini, et al. , Materials Science and Engineering B, 2003 ,23, F. Rossi, et al., Journal of Physics: Conference Series,20 10,252,012001). Για παράδειγμα έχει προταθεί από τους Ρ. Rossini et al. (2003), ο πολυμερισμός του ακρυλικού οξέος με πλάσμα χρησιμοποιώντας υποβοηθούμενη από πλάσμα χημική εναπόθεση ατμών, για την δημιουργία ενεργοποιημένων με καρβοξυλικές ομάδες επιφανειών. Επιπροσθέτως οι F. Bretagnol et al. (2006) κατασκεύασαν μικροσχηματοποιημένες επιφάνειες με συνδυασμό φωτολιθογραφίας και πολυμερισμού σε πλάσμα για την επιλεκτική προσρόφηση πρωτεϊνών και την ευθυγράμμιση κυττάρων.

            Η απευθείας πρόσδεση βιομορίων ή κυττάρων έχει επίσης επιχειρηθεί σε ενεργοποιημένες με ΝΗΧεπιφάνειες, ή για κατεργασμένες με πλάσμα 02επιφάνειες, στις τελευταίες επιφάνειες συνήθως μετά από ενεργοποίηση με παράγοντες σύζευξης, π.χ. με καρβοδιιμίδια (V. Gubala, et al. , Colloids and Surfaces Β: Biointerfaces,201 0,81,544-548, Κ. Schroder, et a/.,Contrib. Plasma Phys.,2001, 41, 562-572, D. Okrongly, et al, Patent,1990, US4933410 Patent: Covalent attachment of macromolecules on substrate surfaces , C. Sarra-Boumet, et al, Journal of Physics D: Applied Physics, 2006, 39, 3461-3469). Oi Gubala et al. (V. Gubala, et al , Analytica Chimica Acta,2013,760,75-82) διερεύνησαν την ικανότητα δέσμευσης αμινο-τροποποιη μένων ολιγονουκλεοτίδιων υποστρωμάτων COP ενεργοποιημένων με καρβοξυλικές ομάδες, μέσω οξείδωσης σε πλάσμα και ενισχυμένης με πλάσμα χημικής εναπόθεσης ατμών. Ανέφεραν ότι οι οξειδωμένες με πλάσμα επιφάνειες παρουσίαζαν προβλήματα σταθερότητας και παρείχαν χαμηλή ένταση σήματος. Ως εκ τούτου, πρότειναν επιστρώσεις πολυμερισμένων με πλάσμα ακρυλικών με υψηλή ικανότητα δέσμευσης για την ειδική ακινητοποίηση βιομορίων μέσω αλληλεπιδράσεων με καρβοξυλια ή καρβονύλια. Κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι δραστικές ομάδες στις κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες είναι επιρρεπείς σε αποικοδόμηση στον αέρα, και πρότειναν οι ετηφάνειες να χρησιμοποιούνται αμέσως μετά πλάσμα για ακινητοποίηση των βιομορίων. Οι Bilek et al. (Μ. Μ. Μ. Bilek, et a/.,PNAS,2011, doi: 10.1073/pnas.1103277108, Μ. Μ. M. Bilek, et al, Patent, 2009, Biological functionalization of substrates,) πρότειναν μια ενεργητική υποβοηθούμενη από ιόντα διαδικασία πλάσματος (εμφύτευση ιόντων ΡΠΙ με βύθιση σε πλάσμα) η οποία παράγει επιφάνειες με ελεύθερες ρίζες στις οποίες μπορούν να ακινητοποιηθούν ομοιοπολικά λειτουργικά βιολογικά μόρια. Η μέθοδος αυτή είναι μια από τις λίγες που παράγουν ομάδες για απευθείας, ομοιοπολική πρόσδεση βιομορίων, και η οποία είναι σταθερή στο χρόνο. Ωστόσο, χρησιμοποιεί πολύ υψηλές τάσεις (αρκετά kV), οι οποίες μπορεί να βλάψουν ένα πολυμερές, ως επί το πλείστον χρησιμοποιείται σε εναποτεθειμένα υμένια αντί του ίδιου του αρχικού οργανικού πολυμερούς, και χρειάζεται εξειδικευμένη συσκευή αντί του συνήθους εξοπλισμού εγχάραξης με πλάσμα. Επιπλέον, η πυκνότητα της ακινητοποίησης των βιομορίων είναι η ίδια όπως σε μια τυπική επίπεδη επιφάνεια, και έτσι δεν επιτυγχάνεται κανένα κέρδος σε ευαισθησία στην περίπτωση που χρησιμοποιηθούν αυτές οι επιφάνειες για διαγνωστική εφαρμογή.

             Ως εκ τούτου, παρά την τεράστια πρόοδο η οποία περιγράφτηκε εν συντομία ανωτέρω, δεν φαίνεται να υπάρχει μέθοδος η οποία να παρέχει ομοιοπολική, απευθείας, υψηλής πυκνότητας και σταθερή πρόσδεση βιομορίων σε κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες οργανικού πολυμερούς ή επιφάνειες SiΟ2χωρίς τη χρήση ενδιάμεσων ομάδων πρόσδεσης.

             Η ομάδα μας πρόσφατα παρουσίασε μια μέθοδο που βασίζεται σε κατεργασία ενός σταδίου με πλάσμα Φθοράνθρακα (FC) σχηματοποιημένων υποστρωμάτων Si/SiΟ2ή υποστρωμάτων Si/Si3N4, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την επιλεκτική προσρόφηση πρωτεΐνης στις περιοχές SiΟ2ή Si3N4(Ρ. Bayiati, et al. , Biosensors and Bioelectronics,2009, 24, 2979-2984). Ο χημικός χαρακτηρισμός των επιφανειών που πραγματοποιήθηκε συνδυάζοντας ανάλυση με XPS και αντίδραση με βιομόρια τα οποία σχηματίζουν ομοιοπολικούς δεσμούς με καρβοξυλικές ή καρβονυλικές ομάδες, κατέδειξε την ομοιοπολική φύση της επιλεκτικής δέσμευσης της πρωτεΐνης στις κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες SiΟ2, οι οποίες περιέχουν καρβοξυλικές και καρβονυλικές ομάδες μετά την εγχάραξη με πλάσμα (A. Malainou, et αl. ,The Journal of Physical Chemistry A,2013, 117,13743-13751). Σε αυτές τις δημοσιεύσεις, προτείναμε ότι το πλάσμα φθοράνθρακα εναποθέτει ένα λεπτό οργανικό πολυμερές το οποίο περιέχει φθόριο (το οποίο μοιάζει με Teflon® αν και είναι λιγότερο φθοριωμένο) στην επιφάνεια του SiΟ2με αρκετούς ελεύθερους δεσμούς, οι οποίοι οξειδώνονται από τα άτομα οξυγόνου του SiΟ2ή από τα μόρια του αέρα ή από τα άτομα οξυγόνου στο πλάσμα με αποτέλεσμα την παραγωγή καρβοξυλικών ή καρβονυλικών ομάδων στην επιφάνεια. Μέσα από αυτό το λεπτό στρώμα πολυμερούς που έχει εναποτεθεί στο πλάσμα λαμβάνει χώρα εγχάραξη του SiΟ2.

            Λίγη δουλειά έχει γίνει σχετικά με το ρόλο της μικρο-και νάνο τοπογραφίας στη πρόσδεση βιομορίων σε επιφάνειες (Rucker, et αl. , Langmuir, 2005, 21 ,7621 -7625, S. Η. Yeo, et αl., J. Korean Phys. Soc.,2006,48, 1325).

            Η ομάδα μας είναι μία από τις λίγες ερευνητικές ομάδες που μελετούν την επίδραση της νανο-τοπογραφίας και της χημικής τροποποίησης στη πρόσδεση βιομορίων. Σε προηγούμενες εργασίες μας, είχαμε παρατηρήσει το σχηματισμό ελεγχόμενης επιφανειακής τραχύτητας (ύφανσης) σε πολυμερή ως αποτέλεσμα των διεργασιών πλάσματος. Χρησιμοποιήσαμε τον όρο "νανούφανση" για να περιγράφουμε την τραχύτητα που δημιουργείται από την κατεργασία σε πλάσμα η οποία περιλαμβάνει μικρο-νανο δομές με υψηλό λόγο ασυμμετρίας [(Greek patent Application number: 20050100473, PCT publication number: W02007031799) and (Greek patent Application number: 20080100404, PCT publication number: W02009150479)]. Η ομάδα μας έχει μελετήσει εκτενώς την επίδραση του πλάσματος οξυγόνου, φθορίου και φθοράνθρακα στα χαρακτηριστικά διαβροχής επιφανειών από PDMS, ΡΜΜΑ, PEEK, PS και άλλων πολυμερών και έχει κατασκευάσει τόσο υπερυδρόφιλες όσο και υπερ-υδρόφοβες επιφάνειες (A. Tserepi, et αl. , Νanotechnology ,2006, 17,3977, Κ. Tsougeni, et al., Plasma Processes and Polyiners,2007, 4, 398-405, K. Tsougeni, et al, Japanese Journal of Applied Physics,2007, 46, 744-750, K. Tsougeni et al.,Langmuir,201 0,26,13883-13891, K. Tsougeni et αl.,Langmuir,2009,25,l 1748-11759, N. Vourdas, et al. , Nanotechnology ,2007, 18, 125304, N. Vourdas, et αl. ,Int. J. Nanotechnology ,2009, 6, 1/2). Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι στις νανοϋφασμένες με πλάσμα επιφάνειες οργανικών πολυμερών, και ειδικά επιφανειών πολυ(μεθακρυλικού μεθυλεστέρα) (ΡΜΜΑ) και πολυδιμεθυλοσιλοξανίου (PDMS) επιτυγχάνεται ακινητοποίηση σημαντικά μεγαλύτερων ποσοτήτων πρωτεϊνών, σε σύγκριση με τις επίπεδες (ακατέργαστες) επιφάνειες, ανοίγοντας το δρόμο για εξαιρετικά ευαίσθητες μικροσυστοιχίες (Κ. Tsougeni et al.,Langmuir,2010, 26, 13883-13891, Κ. Tsougeni, et αl. , Microelectronic Engineering, 2009, 86, 1424- 1427). Αυτό το σημαντικό αποτέλεσμα οφείλεται κυρίως στην αύξηση της ενεργής επιφάνειας των νανοϋφασμένων υποστρωμάτων. Επίσης εφαρμόσαμε την νανοΰφανση με πλάσμα σε εμπορικά διαθέσιμα πλακίδια πολυστυρενίου (PS) και σε πλακίδια γυαλιού επικαλυμμένα με υμένιο PDMS για τη δημιουργία υποστρωμάτων μικροσυστοιχιών πρωτεϊνών ή DNA με αυξημένη ικανότητα δέσμευσης βιομορίων, ένταση σήματος φθορισμού και 100 φορές υψηλότερη ευαισθησία ανίχνευσης σε σύγκριση με τα αντίστοιχα επίπεδα υποστρώματα (Κ. Tsougeni, et αl., Analytical and Bioanalytical Chemistry ,2012,403 ,2757-2764).

            Επιση μαίνεται ότι πολύ λίγες τεχνολογίες, αν υπάρχουν, συνδυάζουν ενεργοποίηση της επιφάνειας και ταυτόχρονα δημιουργία τοπογραφίας με μεγάλη ενεργή επιφάνεια για αυξημένη, υψηλής πυκνότητας, απευθείας, ομοιοπολική σύνδεση. Ωστόσο, τα προβλήματα που παραμένουν είναι:

             1) Το πρώτο πρόβλημα είναι η υδροφοβική αποκατάσταση. Οι υπερυδρόφιλες επιφάνειες που δημιουργούνται κατά την κατεργασία με πλάσμα δεν είναι σταθερές, και υποφέρουν από ένα φαινόμενο γνωστό ως υδροφοβική αποκατάσταση το οποίο χαρακτηρίζεται από μια βαθμιαία αύξηση της γωνίας επαφής (ΓΕ) με την πάροδο του χρόνου (γήρανση). Σε προηγούμενη εργασία μας, είχαμε επιτύχει καθυστέρηση της γήρανσης των υπερ-υδρόφιλων επιφανειών για περίπου 30 ημέρες, ως αποτέλεσμα της ευεργετικής επίδρασης της νανοϋφασμένης τοπογραφίας (Κ. Tsougeni et al.,Langmuir,2009, 25,1 1748-11759). Ομοίως, οι επιφάνειες SiO2είναι ασταθείς αμέσως μετά το πλάσμα και επιρρεπείς σε γήρανση. Επιπλέον, ιδιαίτερα για τις νανοϋφασμένες επιφάνειες οργανικών πολυμερών, έχει αναφερθεί ότι η γήρανση οδηγεί σε αύξηση της ΓΈ σε τιμές υψηλότερες από τη αρχική τιμή του ακατέργαστου πολυμερούς οδηγώντας σε υπερ-υδρόφοβες επιφάνειες (Υ.Ρ. Li et al., Surface and Coatings Technology,2012, 213, 139-144).

             Πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν εξετάσει την επίδραση διαφορετικών συνθηκών αποθήκευσης (Zilio, et αl. , Βiomedical Microdevices, 2014,16,107- 114, Roy, et αl., Sensors and Actuators B: Chemical,201 0,150,537-549, D. Jucius, et αl, Applied Surface Science,2012, 263, 722-729), της θερμοκρασίας αποθήκευσης (J. Larrieu et al., Surface and Coatings T echnology,2005,200,2310-2316, W. J. Brennan, et al, Ρolymer, 1991, 32, 1527-1530, Y.P. Li et al., Surface and Coatings Technology,2012, 213, 139-144, J. Nakamatsu, et al, Journal of adhesion science and technology, 1999, 13, 753-761), της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της κατεργασίας με πλάσμα (Β. Κ. Kim, et al, Journal of adhesion science and technology,2001, 15, 1805-1816), της εμβάπτισης σε διαλύματα (Ch C. Dupont-Gillain, et al , Langmuir, 2000, 16,8194-8200), και της κρυσταλλικότητας στην υδροφοβική αποκατάσταση των κατεργασμένων με πλάσμα επιφανειών. Για παράδειγμα οι J. Larrieu et al. (J. Larrieu et al., Surface and Coatings Technology ,2005, 200, 2310-2316), μελέτησαν τη σταθερότητα κατεργασμένων με πλάσμα οξυγόνου επιφανειών ατακτικού και ισοτακτικού πολυστυρενίου (PS), a-PS και i-PS, για αυξανόμενη θερμοκρασία αποθήκευσης υπό ατμοσφαιρική πίεση και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η κρυσταλλικότητα του πολυμερούς παίζει ρόλο στη διάχυση του πολυμερικών αλυσίδων. Επίσης, η ομάδα της Mora et al. (Μ. Morra, et αl., Journal of Colloid and Interface Science, 1989, 132, 504-508, M. Morra, et αl., Die Angewandte Makromolekulare Chemie, 1991, 189, 125-136) εξέτασε την υδροφοβική αποκατάσταση επιφανειών από διάφορα οργανικά πολυμερή κατεργασμένα σε πλάσμα οξυγόνου, όπως πολυπροπυλένιο, πολυστυρένιο και πολυ(ανθρακικο εστέρα). Η αναδόμηση της επιφάνειας, στην περίπτωση του κατεργασμένου σε πλάσμα οξυγόνου πολυπροπυλενίου, παρεμποδίστηκε σε περιβάλλον υγρού αζώτου ενώ ενισχύθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας πάνω από τη θερμοκρασία δωματίου. Μέχρι στιγμής, όλες οι εργασίες που ανέφεραν ότι μπορεί να επιταχυνθεί η γήρανση με κάποια στάδια θέρμανσης χρησιμοποίησαν επίπεδες χωρίς τραχύτητα επιφάνειες, και επιπλέον δεν εξετάζουν εάν αυτές οι θερμικά κατεργασμένες επίπεδες επιφάνειες παραμένουν χημικά ενεργές όσον αφορά την ακινητοποίηση βιομορίων.

             2) Το δεύτερο πρόβλημα σχετίζεται με την σταθερότητα της ακινητοποίησης των βιομορίων μέσω φυσικής προσρόφησης. Η φυσική προσρόφηση για τα περισσότερα υποστρώματα οδηγεί σε απομάκρυνση των βιομορίων κατά τα διάφορα στάδια έκπλυσης, και καταλήγει σε πλήρη απομάκρυνση τους όταν στα στάδια έκπλυσης χρησιμοποιούνται διαλύματα που περιέχουν επιφανειοδραστικές ουσίες. Έτσι, για να παραμένουν τα βιομόρια στη θέση τους χρησιμοποιείται ομοιοπολική σύνδεση, η οποία απαιτεί υγρή χημεία ενεργοποίησης των επιφανειών και χρήση συνδετικών μορίων.

            Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μία μέθοδο για τη δημιουργία σταθερής στο χρόνο (δηλαδή μη γηράσκουσας) δραστικότητας και όπου είναι επιθυμητό μεγάλης ενεργής επιφάνειας-νανοτοπογραφία στην οποία τα βιομόρια μπορούν να συνδεθούν ομοιοπολικά απευθείας (χωρίς συνδετικά μόρια τα οποία εισάγονται με επιπλέον χημική επεξεργασία) και με υψηλή πυκνότητα.

Περίληψη της εφεύρεσης

            Η παρούσα εφεύρεση παρέχει απευθείας, ομοιοπολική ακινητοποίηση βιομορίων σε βελτιστοποιημένες επιφάνειες οργανικού πολυμερούς ή SiΟ2με επαγόμενη από πλάσμα, τυχαία υψηλής ενεργής επιφάνειας τοπογραφία, επιθυμητή χημική δραστικότητα (και ικανότητα διαβροχής), η οποία είναι σταθερή με την πάροδο του χρόνου. Στην παρούσα εφεύρεση αποκαλύφθηκε και εισήχθη ένα στάδιο ανόπτησης, το οποίο οδηγεί σε ταχεία γήρανση και σταθεροποιεί τις κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες χωρίς να καταστρέφει την επιθυμητή δραστικότητα των ομάδων -COOH. Αποδεικνύεται η απευθείας (χωρίς συνδετικά μόρια), ομοιοπολική ακινητοποίηση σε νανοϋφασμένες με το πλάσμα επιφάνειες οργανικού πολυμερούς, αφού μετά από ισχυρή έκπλυση με διάλυμα δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS), ακόμη και σε υψηλές θερμοκρασίες, η πρωτεΐνη παρέμενε μόνο στην κατεργασμένη με το πλάσμα επιφάνεια.

Σύντομη περιγραφή των σχεδίων

Το Σχήμα 1 παρουσιάζει τα ακόλουθα: σχηματική αναπαράσταση (α) μίας επίπεδης και (β) μιας τραχιάς νανοϋφασμένης με το πλάσμα επιφάνειας, καθώς και εικόνες SEM κατεργασμένων με πλάσμα Ο2επιφανειών ΡΜΜΑ μετά από (γ) 30 s (μια πρακτικά επίπεδη επιφάνεια), και (δ) 5 min εγχάραξης όπου φαίνεται ο σχηματισμός της νανοΰφανσης, και (ε) μετά από 5 min εγχάραξης με πλάσμα Ο2, εμβάπτιση της επιφάνειας σε 5% SDS και στέγνωμα, όπου φαίνεται η συσσωμάτωση της νανοΰφανσης κατά το στέγνωμα του δείγματος. Οι επιφάνειες αυτές είναι εγχαραγμένες σε έναν αντιδραστήρα πλάσματος υψηλής πυκνότητας τύπου-Helicon (ICP) με θόλο αλουμίνας.

Το Σχήμα 2 παρουσιάζει εικόνες SEM κατεργασμένων και νανοϋφασμένων επιφανειών ΡΜΜΑ μετά από εγχάραξη με πλάσμα Ο2σε έναν αντιδραστήρα πλάσματος (Αντιδραστήρα Ενεργών Ιόντων-RIE) με ηλεκτρόδιο χαλαζία, μετά από (α) 1 min, και (β) 10 min εγχάραξης με πλάσμα Ο2.

Το Σχήμα 3 παρουσιάζει την υδροφοβική αποκατάσταση (γήρανση) επιφανειών ΡΜΜΑ με και χωρίς θερμική ανόπτηση μετά από κατεργασία σε πλάσμα Ο2για 5 min στον αντιδραστήρα τύπου-Helicon. Γήρανση σε θερμοκρασία δωματίου (Λ). Γήρανση μετά από θερμική ανόπτηση στους 110 ° C για 30 min (□).

Το Σχήμα 4 παρουσιάζει εικόνες SEM κατεργασμένων και νανοϋφασμένων επιφανειών COP μετά από εγχάραξη με πλάσμα Ο2για (α) 30 s, (β) 2 min, (γ) 5 min και (δ) 10 min σε ένα αντιδραστήρα πλάσματος υψηλής πυκνότητας τύπου-Helicon (ICP) με θόλο αλουμίνας.

Το Σχήμα 5 παρουσιάζει εικόνες SEM κατεργασμένων και νανοϋφασμένων επιφανειών COP μετά από εγχάραξη με πλάσμα Ο2για 4 min σε έναν αντιδραστήρα πλάσματος (RIE) με ηλεκτρόδιο χαλαζία.

 Το Σχήμα 6 παρουσιάζει την υδροφοβική αποκατάσταση (γήρανση) επιφανειών COP με και χωρίς θερμική ανόπτηση μετά από νανοΰφανση σε πλάσμα Ο2για 10 min στον αντιδραστήρα τύπου-Helicon. Γήρανση σε θερμοκρασία δωματίου (Λ). Γήρανση μετά από θερμική ανόπτηση στους 130 ° C για 30 min (ο).

Το Σχήμα 7 (α-δ) παρουσιάζει τις αντιδράσεις ομοιοπολικής σύνδεσης και ανίχνευσης των παραγώγων βιοτίνης σε εγχαραγμένες με πλάσμα επιφάνειες οργανικού πολυμερούς και SiΟ2.

Το Σχήμα 8 παρουσιάζει τις τιμές των σημάτων φθορισμού των ομοιοπολικά συνδεδεμένων παραγώγων βιοτίνης σε ΡΜΜΑ (ι) ακατέργαστο, (ιι) κατεργασμένο με πλάσμα για 5 min στον αντιδραστήρα ICP, (ιιι) κατεργασμένο με πλάσμα για 5 min στον αντιδραστήρα ICP και θερμικά ανοπτημένο. Για την σύνδεση των παραγώγων βιοτίνης έχουν χρησιμοποιηθεί νέες και γερασμένες επί 30 ημέρες επιφάνειες, προκειμένου να αποδειχθεί η ευεργετική επίδραση της θερμικής ανόπτησης. Το σχήμα επίσης αποκαλύπτει τη σταθερότητα των συνδεδεμένων παραγώγων βιοτίνης μετά την έκπλυση με διάλυμα SDS (γραμμοσκιασμένες στήλες).

Το Σχήμα 9 παρουσιάζει τις τιμές των σημάτων φθορισμού των ομοιοπολικά συνδεδεμένων παραγώγων βιοτίνης σε περιοχές ακατέργαστου και νανοϋφασμένων με πλάσμα επιφανειών ΡΜΜΑ για 1 και 10 min σε έναν αντιδραστήρα πλάσματος RIE μετά από θερμική ανόπτηση. Το σχήμα αποκαλύπτει τον ευεργετικό ρόλο του χρόνου κατεργασίας στο πλάσμα και τη σταθερότητα των συνδεδεμένων παραγώγων βιοτίνης κατά την έκπλυση με διάλυμα SDS (γραμμοσκιασμένες στήλες).

Το Σχήμα 10 παρουσιάζει το σήμα ESR από νανοϋφασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ και COP μετά από κατεργασία σε πλάσμα οξυγόνου (α) στον αντιδραστήρα τύπου-Helicon (ICP) και (β) στον αντιδραστήρα RIE.

Το σχήμα 11 (α, β) παρουσιάζει τις τιμές των σημάτων φθορισμού που ελήφθησαν από περιοχές που είχαν προσδεθεί ομοιοπολικά παράγωγα βιοτίνης σε νανοϋφασμένες με πλάσμα επιφάνειες COP στον αντιδραστήρα τύπου-Helicon (ICP) ή (β) στον αντιδραστήρα RIE. Το σχήμα αποκαλύπτει τον ευεργετικό ρόλο του χρόνου κατεργασίας στο πλάσμα και τη σταθερότητα των συνδεδεμένων παραγώγων βιοτίνης κατά την έκπλυση με διάλυμα SDS (γραμμοσκιασμένες στήλες).

Το Σχήμα 12 παρουσιάζει τις τιμές των σημάτων φθορισμού που ελήφθησαν από περιοχές που είχαν προσδεθεί ομοιοπολικά παράγωγα βιοτίνης σε (α) μη κατεργασμένες επιφάνειες SiΟ2, (β) επιφάνειες SiΟ2κατεργασμένες επί 15 s σε πλάσμα C4F8και (γ) επιφάνειες SiΟ2κατεργασμένες επί 15 s σε πλάσμα C4F8και θερμικά ανοπτημένες. Παρουσιάζεται ο ευεργετικός ρόλος της θερμικής ανόπτησης και η σταθερότητα κατά την έκπλυση με διάλυμα SDS (γραμμοσκιασμένες στήλες). Το Σχήμα 13 παρουσιάζει τη διαδικασία ακινητοποίησης και ανίχνευσης της πρωτεΐνης σε επιφάνειες οργανικού πολυμερούς.

Το Σχήμα 14 παρουσιάζει τις τιμές των σημάτων φθορισμού που ελήφθησαν από επιφάνειες ΡΜΜΑ επικαλυμμένες με RgG μέσω επώασης επί 24 h μετά από αντίδραση με αντίσωμα κατά των γ-σφαιρινών κουνελιού επισημασμένο με AF546, συναρτήσει του χρόνου παραμονής μετά την κατεργασία στο πλάσμα σε αντιδραστήρα τύπου-Helicon (ICP) και ανόπτηση στους 110 ° C για 30 min τόσο πριν όσο και μετά την έκπλυση με διάλυμα SDS.

Το Σχήμα 15 παρουσιάζει τις τιμές των σημάτων φθορισμού που ελήφθησαν από επιφάνειες ΡΜΜΑ επικαλυμμένες με RgG μέσω επώασης επί 24 h μετά από αντίδραση με αντίσωμα κατά των γ-σφαιρινών κουνελιού επισημασμένο με AF546, συναρτήσει του χρόνου παραμονής μετά την κατεργασία στο πλάσμα σε αντιδραστήρα RIE και ανόπτηση στους 110 ° C για 30 min τόσο πριν όσο και μετά όσο και μετά την έκπλυση με διάλυμα SDS.

Το Σχήμα 16 παρουσιάζει τις τιμές των σημάτων φθορισμού που ελήφθησαν από επιφάνειες COP επικαλυμμένες με RgG μέσω επώασης επί 24 h μετά από αντίδραση με αντίσωμα κατά των γ-σφαιρινών κουνελιού επισημασμένο με AF546, συναρτήσει του χρόνου έκθεσης στο πλάσμα Ο2σε (α) αντιδραστήρα τύπου-Helicon (ICP) και (β) αντιδραστήρα RIE τόσο πριν όσο και μετά την έκπλυση με διάλυμα SDS.

Το Σχήμα 17 παρουσιάζει τη διαδικασία του μη ανταγωνιστικού ανοσοπροσδιορισμού της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP).

Το Σχήμα 18 παρουσιάζει α) τις καμπύλες βαθμσνόμησης της CRP που ελήφθησαν από κηλίδες οι οποίες δημιουργήθηκαν σε μη κατεργασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ, σε κατεργασμένες με πλάσμα Ο2επιφάνειες και σε κατεργασμένες με πλάσμα Ο2και θερμικά ανοπτημένες επιφάνειες. β) Εικόνες από μικροσκόπιο φθορισμού κηλίδων που αντιστοιχούν σε 100 ng/mL CRP σε (ι) μη κατεργασμένες επιφάνειες, (ιι) σε κατεργασμένες με πλάσμα Ο2επιφάνειες μετά από θερμική ανόπτηση και (ιιι) σε κατεργασμένες με πλάσμα Ο2επιφάνειες χωρίς ανόπτηση.

Το Σχήμα 19 παρουσιάζει εικόνες από μικροσκόπιο φθορισμού από μια σχηματοποιημένη, κατεργασμένη με πλάσμα, και θερμικά ανοπτημένη επιφάνεια στην οποία έχει ακινητοποιηθεί πολυκλωνικό αντίσωμα κατά του λιποπολυσακχαρίτη της σαλμονέλας (anti-LPS). Παρουσιάζεται η επιφάνεια μετά από αντίδραση με διάλυμα LPS συγκέντρωσης 500 ng/mL. Το σήμα φθορισμού ανιχνεύεται μετά από αντίδραση με βιοτινυλιωμένο αντίσωμα κατά του LPS, στρεπταβιδίνη, βιοτινυλιωμένη αλκαλική φωσφατάση και τελικά επώαση με καθιζάνον υπόστρωμα της αλκαλικής φωσφατάσης EFL 97.

Το Σχήμα 20 παρουσιάζει εικόνες SEM που δείχνουν την ακινητοποίηση κυττάρων σαλμονέλας σε επιφάνειες κατεργασμένες με πλάσμα και θερμικά ανοπτημένες, στις οποίες έχει ακινητοποιηθεί πολυκλωνικό αντίσωμα κατά του λιποπολυσακχαρίτη της σαλμονέλας μετά από διέλευση διαλύματος κυττάρων σαλμονέλας πυκνότητας 10<8>κύτταρα/ml.

Λεπτομερής περιγραφή της εφεύρεσης

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει εγχαραγμένες με πλάσμα επιφάνειες οργανικού πολυμερούς ή SiΟ2με επιθυμητή χημική δραστικότητα (και ικανότητα διαβροχής), οι οποίες είναι σταθερές με την πάροδο του χρόνου για την απευθείας, δηλαδή χωρίς την χρήση μορίων που εισάγονται με επιπλέον χημική κατεργασία, ομοιοπολική ακινητοποίηση βιομορίων.

Μια σημαντική καινοτομία της παρούσας εφεύρεσης είναι η ανακάλυψη ενός σταδίου θερμικής ανόπτησης, το οποίο οδηγεί σε ταχεία γήρανση και σταθεροποιεί τις κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες (τόσο του οργανικού πολυμερούς όσο και του SiΟ2) διατηρώντας παράλληλα ή ακόμα και ενισχύοντας την επιθυμητή χημική δραστικότητα τους. Πράγματι, αυτές οι κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες, είναι δυνατόν να γηράσκουν ταχέως και να σταθεροποιούνται μετά από ένα επιπρόσθετο στάδιο ανόπτησης, με θέρμανση κάτω από τη θερμοκρασία υαλώδους μεταπτώσεως Tg, του οργανικού πολυμερούς, κατά προτίμηση σε θερμοκρασία 5 έως 40 βαθμούς κάτω από το Tg, και κατά μεγαλύτερη προτίμηση σε θερμοκρασία 10 βαθμούς κάτω από το Tg, και να αποκτούν σταθερή ικανότητα (μη-γήρανσης) διαβροχής για μήνες. Για την περίπτωση του SiΟ2, όπως συζητήθηκε στις εργασίες (Ρ. Bayiati, et αl. , Biosensors and Bioelectronics,2009, 24 ,2979-2984) και (A. Malainou, et αl., The Journal of Physical Chemistry A, 2013, 117,13743-13751) εναποτίθεται ένα οργανικό πολυμερές που περιέχει φθόριο, το οποίο μοιάζει με Teflon® αν και είναι λιγότερο φθοριωμένο, και έτσι η ανόπτηση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία μικρότερη από το Tg του Teflon®. Στην πραγματικότητα, μετρήθηκε το Tg του εναποτιθέμενου οργανικού πολυμερούς και διαπιστώθηκε ότι είναι ίσο με 116 °C, μία τιμή πολύ κοντά στο Tg του εμπορικού Teflon® (G. Calleja et αl., European Polymer Journal, 20 13, 49(8), 2214-2222). Οι ταχέως γηράσκουσες εγχαραγμένες υδρόφιλες επιφάνειες βρέθηκε ότι είναι σταθερές όσον αφορά την ομοιοπολική ακινητοποίηση επί τουλάχιστον 4 μήνες μετά την κατεργασία με πλάσμα. Οι μη κατεργασμένες επιφάνειες, δεν παρείχαν ομοιοπολική σύνδεση. Η σταθεροποίηση της υδροφιλικότητας και της χημικής δραστικότητας ήταν εντελώς απρόσμενη, δεδομένου ότι είχε αναφερθεί από εμάς και άλλους ερευνητές, ότι η γήρανση έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της τιμής της γωνίας επαφής σε τιμές υψηλότερες από τη τιμή του ακατέργαστου πολυμερούς οδηγώντας συχνά σε υπερ-υδρόφοβες τραχιές επιφάνειες (Κ. Tsougeni et al., Langmuir ,2009, 25,11748-11759, Y.P. Li et al., Surface and Coatings T echnology,2012,213,139-144).

Συνήθως οι επιφάνειες οργανικού πολυμερούς νανοϋφαίνονται με κατεργασία σε πλάσμα. Επιφάνειες με τέτοια μορφολογία μπορούν να παραχθούν με διάφορες μεθόδους, όπως η κατεργασία με πλάσμα αερίων (εγχάραξη ή εναπόθεση), η ηλεκτροχημική εγχάραξη ή εναπόθεση, η απομάκρυνση υλικού με λέιζερ, η εναπόθεση νανοσωματιδίων, και πολλές άλλες. Στην παρούσα εφεύρεση τέτοιες οι επιφάνειες παράγονται κατά προτίμηση με κατεργασία με πλάσμα αερίων.

Στο παρόν ο όρος νανοΰφανση χρησιμοποιείται για να περιγράφει μια τραχιά επιφάνεια, η οποία περιλαμβάνει δομές μεγέθους μικρομέτρων ή αρκετών εκατοντάδων νανομέτρων ή μεγέθους μικρότερου από εκατό νανόμετρα, μονής κλίμακας, τοποθετημένες τυχαία ή ημι-τακτικά, ή σύνθετες δομές πολλαπλής κλίμακας. Μια σχηματική αναπαράσταση παρουσιάζεται στο Σχ. 1 (α, β). Το σημαντικό χαρακτηριστικό αυτών των επιφανειών είναι η αυξημένη ενεργή επιφάνεια σε σύγκριση με τις επίπεδες επιφάνειες τουλάχιστον κατά ένα παράγοντα 3 και κατά προτίμηση κατά έναν παράγοντα μεγαλύτερο από 10.

Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση ο όρος "επιφάνεια οργανικού πολυμερούς" αναφέρεται σε μια επιφάνεια κατασκευασμένη από ένα οργανικό πολυμερές, καθώς και μία επιφάνεια κατασκευασμένη από άλλα υλικά, όπως γυαλί, μέταλλο, διαφορετικό οργανικό πολυμερές ή άλλο υπόστρωμα, το οποία είναι επικαλυμμένα με ένα υμένιο οργανικού πολυμερούς.

Κατά προτίμηση, το οργανικό πολυμερές των επιφανειών της παρούσας εφεύρεσης ανήκει στην ομάδα των ακρυλικών συμπολυμερών, ή των ολεφινικών, ή των φαινολικών πολυμερών, των σιλικόνών ή των οργανοπυριτικών πολυμερώνοργανικών συμπολυμερών. Κατά μεγαλύτερη προτίμηση, το οργανικό πολυμερές επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από πολυ(μεθακρυλικό μεθυλεστέρα) (ΡΜΜΑ), πολυ(διαιθεροκετόνη) (PEEK), πολυ(τερεφθαλικό αιθυλενεστέρα) (ΡΕΤ), πολυμερές κυκλοολεφίνης (COP), συμπολυμερές κυκλοολεφίνης (COC), πολυστυρένιο (PS), διασταυρωμένο πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS) και ακρυλικό συμπολυμερές-PDMS. Κατά ακόμα μεγαλύτερη προτίμηση, τα οργανικά πολυμερή είναι πολυ(μεθακρυλικός μεθυλεστέρας) (ΡΜΜΑ), ή πολυστυρένιο (PS), ή πολυμερές κυκλοολεφίνης (COP).

 Το οργανικό πολυμερές χρησιμοποιείται κατά προτίμηση υπό την μορφή πλακιδίων, ή φύλλων, ή υμενίων επικαλυμμένων με περιστροφή σε επίπεδες ή κυρτά επιφάνειες, όπως δισκία πυριτίου, μέταλλο, ή γυάλινα υποστρώματα ή άλλα κυρτά αντικείμενα. Η επιφάνεια του SiO2είναι ένα υμένιο διοξειδίου του πυριτίου το οποίο κατασκευάζεται με διάφορες μεθόδους, όπως ανάπτυξη σε πυρίτιο, ή απόθεση σε οποιοδήποτε υπόστρωμα. Μπορεί επίσης να είναι χαλαζίας ή ειδικό γυαλί ή άλλη καθαρή μορφή του SiO2. Σε αντίθεση με τα οργανικά πολυμερή που αναφέρθηκαν παραπάνω, η επιφάνεια του SiO2είναι ομαλότερη και λιγότερο νανοΰφασμένη (κατά ένα παράγοντα μεταξύ 1 με 2), αλλά είναι χημικώς τροποποιημένη μετά την κατεργασία με το πλάσμα.

Οι επιφάνειες της παρούσας εφεύρεσης είναι εγχαραγμένες και ταυτοχρόνους νανοϋφασμένες (αν είναι επιθυμητό) σε πλάσμα που περιέχει οξυγόνο ή φθόριο ή φθοράνθρακα ή τα μίγματά τους. Κατά προτίμηση, τα οργανικά πολυμερή εγχαράσσονται σε οξυγόνο ή σε μίγματα πλούσια σε οξυγόνο, ενώ το SiO2εγχαράσσεται σε αέρια φθοράνθρακα ή μείγματα πλούσια σε φθοράνθρακα, το οποίο εναποθέτει λεπτά πολυμερή στην επιφάνεια του SiO2. Υπό συνθήκες μεταβαλλόμενης ενέργειας ιόντων, χρόνου κατεργασίας και θερμοκρασίας, διάφορες γεωμετρίες νανοΰφανσης μπορεί να παραχθούν με αποτέλεσμα τη διαφορετική αύξηση της ενεργής επιφάνειας σε σύγκριση με μια επίπεδη επιφάνεια. Η εγχάραξη και η νανοΰφανση (εάν εφαρμόζεται), του οργανικού πολυμερούς ή των επιφανειών SiO2μπορεί να πραγματοποιείται με χρήση ενός αντιδραστήρα υψηλής πυκνότητας τύπου-Helicon ή ενός επαγωγικώς συζευγμένου αντιδραστήρα πλάσματος, ή ενός εγχαράκτη ενεργών ιόντων ή άλλων αντιδραστήρων πλάσματος.

Η εγχάραξη πρέπει να διεξάγεται παρουσία αναστολέων εγχάραξης. Όπως παρουσιάστηκε σε προηγούμενες εφευρέσεις μας ( Greek patent Application number: 20050100473, PCT publication number: W02007031799 ) και ( Greek patent Application number: 20080100404, PCT publication number: W02009150479) o σχηματισμός της νανοΰφανσης προκαλείται με την εγχάραξη του πολυμερούς και την ταυτόχρονη εναπόθεση των δυσκόλως εγχαρασσομένων αναστολέων από τα τοιχώματα του αντιδραστήρα πλάσματος ή από τα ηλεκτρόδια ή από την εγχάραξη του πολυμερούς το οποίο περιέχει από πριν τέτοιους αναστολείς ή από το πολυμερές ή από την επιφάνεια του οργανικού πολυμερούς. Σε επαγωγικά συζευγμένους αντιδραστήρες πλάσματος (ICP) ή σε αντιδραστήρες τύπου-Helicon, εάν τα ηλεκτροστατικά πεδία δεν είναι θωρακισμένα στην κεραία, η συν-ιoνοβολή διηλεκτρικού υλικού κατά τη διάρκεια της εγχάραξης δημιουργεί τους αναστολείς εγχάραξης με αποτέλεσμα το σχηματισμό της νανοΰφανσης (Ε. Gogolides, et αl., Journal of Physics D: Applied Physics, 20 11,44,174021). Στους αντιδραστήρες εγχάραξης με ενεργά ιόντα (RIE) η ιονοβολή του υλικού του ηλεκτροδίου δημιουργεί τους αναστολείς εγχάραξης. Η αλλαγή των παραμέτρων πλάσματος (για ένα συγκεκριμένο αντιδραστήρα πλάσματος) αλλάζει τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της νανοΰφανσης.

Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, η εγχάραξη πρέπει να διεξάγεται υπό συνθήκες ανισοτροπικής εγχάραξης με τυπικές πιέσεις λειτουργίας 0,4-7 Pa και κατά προτίμηση 0.5-2 Pa, τυπική ισχύ πλάσματος 100-3000 W και κατά προτίμηση 1500-3000W, και τυπική τάση πόλωσης η οποία κυμαίνεται από - 50 - -300 V. Για τους αντιδραστήρες ενεργών ιόντων χαμηλής πυκνότητας οι συνθήκες πίεσης κυμαίνονται από 5-100 mT, και η ισχύς πλάσματος από 100-1000 W.

Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση η νανοΰφανση θα πρέπει να είναι αρκετή για να αυξάνει τη ενεργή διαθέσιμη για τη σύνδεση βιο μορίων επιφάνεια, σε σύγκριση με τη μη κατεργασμένη επιφάνεια, κατά ένα συντελεστή 1-10. Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση η νανοΰφανση και η ενεργή επιφάνεια του οργανικού πολυμερούς ή των επιφανειών SiO2μπορεί να ελέγχεται μεταβάλλοντας την ενέργεια των ιόντων (δηλαδή την αρνητική τάση πόλωσης που εφαρμόζεται στο δείγμα και η οποία παράγεται από μια γεννήτρια ισχύος), και για μια συγκεκριμένη ενέργεια μεταβάλλοντας τη διάρκεια της εγχάραξης.

Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, όταν χρησιμοποιείται ένας αθωράκιστος επαγωγικά συζευγμένος εγχαράκτης πλάσματος, η επιθυμητή υψηλής ενεργής επιφάνειας νανοΰφανση μπορεί να επιτευχθεί με τουλάχιστον 3 min εγχάραξης, όταν η απόλυτη τιμή της αρνητικής τάσης πόλωσης είναι κατά προτίμηση υψηλότερη από 100V. Η διάρκεια της εγχάραξης είναι κατά προτίμηση μεγαλύτερη από 3 min, και κατά μεγαλύτερη προτίμηση μεγαλύτερη από 5 min.

Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση η κατεργασία με πλάσμα μπορεί να πραγματοποιηθεί σε όλη την επιφάνεια, ή σε επιλεγμένες περιοχές, όταν η υπόλοιπη επιφάνεια προστατεύεται από μια μάσκα. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται στην επιφάνεια σχη ματοποίηση των περιοχών που έχουν κατεργαστεί με πλάσμα, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια για τη σχη ματοποίηση βιομορίων ή κυττάρων.

Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, μετά την κατεργασία με το πλάσμα και πριν από την ακινητοποίηση των βιομορίων το οργανικό πολυμερές ή οι επιφάνειες SiO2πρέπει να ανοπτηθούν σε μία θερμοκρασία χαμηλότερη από τη θερμοκρασία υαλώδους μεταπτώσεως Tgτου οργανικού πολυμερούς ή το Tg του πολυμερούς που εναποτίθεται με το πλάσμα, κατά προτίμηση 5 έως 40 βαθμούς κάτω από το Tg, και κατά μεγαλύτερη προτίμηση 10 βαθμούς κάτω από το Tg για 10-120 min, με σκοπό την ταχεία γήρανσης της χημικής δραστικότητας, η οποία είναι σταθερή για μήνες, με γωνίες επαφής που κυμαίνονται από 40-90°, διατηρώντας ή ενισχύοντας την επιθυμητή χημική δραστικότητα. Η παρούσα εφεύρεση παρέχει περαιτέρω τη χρήση οργανικού πολυμερούς ή επιφανειών SiΟ2για απευθείας ομοιοπολική ακινητοποίηση βιομορίων χωρίς τη χρήση συνδετικών μορίων. Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση ένας συνδέτης είναι οποιοδήποτε μόριο που παρεμβάλλεται μεταξύ του βιομορίου και της επιφάνειας και συνδέεται χημικά και με τα δύο, το οποίο εισάγεται με επιπλέον χημική κατεργασία. Τα βιομόρια περιλαμβάνουν αλλά δεν περιορίζονται σε πρωτεΐνες, αντισώματα, και αντιγόνα.

Στην παρούσα εφεύρεση το διάλυμα του βιομορίου έρχεται σε επαφή με την επιφάνεια για 1-24 ώρες και κατά προτίμηση 24 ώρες ακολουθούμενη από έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα. Η επαφή με το διάλυμα του βιομορΐου μπορεί να λάβει χώρα σε όλη την επιφάνεια ή μόνο σε κηλίδες, εάν χρησιμοποιηθεί μια συσκευή εναπόθεσης μικροκηλίδων για τη κατανομή του διαλύματος.

Η ακινητοποίηση των βιομορίων στην επιφάνεια μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά μέσω της αντίδρασης με επισημασμένα με φθορίζουσες ουσίες συμπληρωματικά μόρια. Βρέθηκε ότι η πυκνότητα σύνδεσης αυξήθηκε κατά ένα συντελεστή 1-10, και κατά προτίμηση 5-10 σε σύγκριση με αυτό που επιτεύχθηκε σε μία επίπεδη επιφάνεια.

Έχει βρεθεί ότι οι κατεργασμένες όπως περιγράφηκε παραπάνω επιφάνειες διευκολύνουν την ομοιοπολική πρόσδεση βιομορίων τα οποία δεν απομακρύνονται κατά την έκπλυση με επιφανειοδραστικά.

Ως εκ τούτου, η πρόσδεση των βιομορίων στις επιφάνειες είναι σταθερή ακόμη και μετά από έκπλυση με ισχυρό επιφανειοδραστικά όπως το δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) σε υψηλές θερμοκρασίες, ακόμη και μέχρι τους 90 °C.

Η παρούσα εφεύρεση επιτυγχάνει 40-90% διατήρηση του ακινητοποιη μένου βιομορίου. Αντίθετα, στην περίπτωση των μη κατεργασμένων επιφανειών, η έκπλυση με SDS απο μακρύνει όλα τα προσροφημένα βιομόρια.

Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι οι επιφάνειες που κατεργάζονται όπως περιγράφηκε παραπάνω διευκολύνουν τη σταθερή ομοιοπολική σύνδεση των βιομορίων. Οι φρέσκες κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες δεσμεύουν ομοιοπολικά, εξαιτίας της παρουσίας δραστικών ομάδων και κυρίως λόγω των ομάδων C = Ο και -COOH.

Η παρούσα εφεύρεση παρέχει υποστρώματα νανοϋφασμένα με πλάσμα τα οπαία αναμένεται να βρουν ευρεία εφαρμογή σε μικρού μεγέθους μικρορευστονικές συσκευές (lab-on-a-chip) (όπως μικρορευστονικές διατάξεις ή μικροσυστοιχίες ή συστοιχίες κυττάρων) για χημική και βιολογική ανάλυση, σε διαγνωστικές εφαρμογές, και σε ιατρικές συσκευές, όπως ενδοπροθέσεις, εμφυτεύματα και συσκευές χορήγησης φαρμάκων.

Η προτεινόμενη μεθοδολογία μπορεί να εφαρμοστεί σε σημαντικές βιοαναλυτικές εφαρμογές ταυτόχρονης ανίχνευσης πολλών αναλυτών χρησιμοποιώντας ως μεταλλάκτες σήματος ολοκληρωμένους κυματοδηγούς διοξειδίου του πυριτίου. Τα συνθετικά υποστρώματα μπορούν να εφαρμοστούν σε βιοαισθητήρες με αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης, ως υποστρώματα μοντέλα για μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, όπως επίσης και υποστρώματα για την καλλιέργεια των κυττάρων και μηχανική ιστών.

Επιπλέον, παρέχεται ακινητοποίηση κυττάρων μέσω της πρόσδεσης επάνω σε εγχαραγμένα με το πλάσμα υποστρώματα τροποποιημένα με αντισώματα έναντι αντιγόνων του κυτταρικού τους τοιχώματος. Ως εκ τούτου, έχουν προβλεφθεί εφαρμογές σε συστοιχίες κυττάρων για υψηλής απόδοσης επιλογή φαρμάκων, όπου μόνο μικρές ποσότητες των υποψήφιων φαρμάκων είναι διαθέσιμες. Επιπλέον, οι συστοιχίες κυττάρων μπορεί να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της έκφρασης γονιδίων μεμονωμένων κυττάρων και κυτταρικών αποκρίσεων, σε περιπτώσεις όπου οι πληροφορίες από το μέσο όρο της καλλιέργειας μπορεί να συγκαλύψουν την ετερογένεια των επιμέρους κυτταρικών αποκρίσεων.

Τα πλεονεκτήματα της παρούσας εφεύρεσης περιλαμβάνουν την απλότητα, την ταχύτητα και την σταθερότητα με την πάροδο του χρόνου, σε σύγκριση με άλλα πρωτόκολλα ενεργοποίησης, όπου πρέπει οι επιφάνειες να χρησιμοποιηθούν γρήγορα μετά το πλάσμα, επειδή είναι επιρρεπείς σε αποικοδόμηση στον αέρα, και όπου πρέπει να προστεθούν συνδετικά μόρια για να πραγματοποιηθεί η ομοιοπολική πρόσδεση των βιομορίων.

Παραδείγματα

Παράδειγμα 1: Κατασκευή μικρό- και νανο- υφασμένων επιφανειών οργανικού πολυμερούς ΡΜΜΑ με σταθερή χημική δραστικότητα μετά την εγχάραξη με πλάσμα Ο2και την θερμική αν όπτηση

            Η εγχάραξη με πλάσμα οξυγόνου χρησιμοποιήθηκε για τη νανο-ύφανση των επιφανειών ΡΜΜΑ και PEEK με αποτέλεσμα την δημιουργία τοπογραφίας με μεγάλη ενεργή επιφάνεια για την ακινητοποίηση βιομορίων. Υπό συνθήκες ανισοτροπικής εγχάραξης σε έναν αντιδραστήρα πλάσματος υψηλής πυκνότητας (Alcatel MET) (πίεση Ο20,75 Pa, ισχύς πλάσματος 1900 W, και τάση πόλωσης -100 V, ρυθμός εγχάραξης για το ΡΜΜΑ 990 nm/min), η κατεργασία με πλάσμα των επιφανειών ΡΜΜΑ έχει σαν αποτέλεσμα το σχηματισμό νανοδομών με τη μορφή κολώνων. Το πλάσμα αναπτύσσει νανοτραχύτητα, και έτσι η ενεργή επιφάνεια συνεχίζει να αυξάνει με το χρόνο εγχάραξης. Το Σχ. 1 (γ, δ) παρουσιάζει εικόνες SEM, σε πλάγια όψη, μιας μη κατεργασμένης επιφάνειας και επιφανειών ΡΜΜΑ κατεργασμένων σε πλάσμα Ο2για 30 s και 5 min, αντίστοιχα. Οι εικόνες αποκαλύπτουν το σχηματισμό πυκνών μικρό- και νανο-κολώνων ύψους 1 pm, μετά από 5 min κατεργασία σε πλάσμα Ο2. Το δείγμα το οπαίο έχει κατεργαστεί για 30 s έχει αμελητέα τοπογραφία σε σύγκριση με την επιφάνεια που έχει κατεργαστεί για 5 min, αλλά συμπεριλαμβάνεται στις επιφάνειες υπό διερεύνηση για να ληφθεί υπόψη μόνο η επίδραση της χημικής τροποποίησης που προκαλείται από το πλάσμα στην ομοιοπολική σύνδεση των πρωτεϊνών.

            Ο σχηματισμός των κολώνων είναι αποτέλεσμα της ιονοβολής αλουμίνας από το θόλο του αντιδραστήρα που δημιουργεί μικρομάσκες στην επιφάνεια του πολυμερούς. Η ανάλυση XPS έδειξε ότι η επιφάνεια είναι μολυσμένη με Α1 με τη μορφή οξειδίου του αργιλίου ή οξυφθοριδίου. Το ποσοστό και η σύνθεση της μόλυνσης με αλουμίνιο ποικίλει ανάλογα με την ιστορία του αντιδραστήρα πλάσματος, αλλά είναι συνήθως ένα μικρό ποσοστό.

            Το Σχ. 1 (ε) παρουσιάζει μια εικόνα SEM σε πλάγια όψη μιας επιφάνειας ΡΜΜΑ κατεργασμένη σε πλάσμα Ο2για 5 min μετά από εμβάπτιση σε διάλυμα SDS με περιεκτικότητα 5% για 10 min στους 90 °C. Οι δομές συσσωματώνονται και καταρρέουν μετά από την εμβάπτιση στο διάλυμα SDS, οδηγώντας σε μικρότερες (0,47 μm), αλλά περισσότερο ισχυρές δομές. Η συσσωμάτωση εμφανίζεται κατά το στέγνωμα του διαλύματος, ως αποτέλεσμα των τριχοειδών δυνάμεων και της ισορροπίας μεταξύ της προσκόλλησης και των ελαστικών δυνάμεων των δομών με τον υψηλό λόγο ασυμμετρίας.

            Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης χρησιμοποιώντας τον αντιδραστήρα ενεργών ιόντων χαμηλής πυκνότητας (RIE) με ηλεκτρόδιο χαλαζία, υποδηλώνοντας ανεξαρτησία από τον τύπο του αντιδραστήρα πλάσματος. Το Σχ. 2 παρουσιάζει εικόνες SEM σε πλάγια όψη εικόνες επιφανειών ΡΜΜΑ κατεργασμένων σε έναν αντιδραστήρα πλάσματος RIE (πλάσμα Ο2, 10 mT, 400 W, 50 sccm, ρυθμός εγχάραξης 430 nm/min) για (ι) 1 min, και (ιι) 10 min, αντίστοιχα. Οι εικόνες αποκαλύπτουν το σχηματισμό μικρό- και νανο-κολώνων με ύψος 0,3 μm και 1,3 μm μετά από κατεργασία 1 min και 10 min, πιθανώς λόγω της ιονοβολής του χαλαζία. Ωστόσο, προκειμένου να επιτευχθεί το ίδιο ύψος κολώνων και η ίδια αύξηση της ενεργής επιφάνειας με αυτόν τον αντιδραστήρα, μεγαλύτεροι χρόνοι εγχάραξης απαιτήθηκαν λόγω του χαμηλότερου ρυθμού εγχάραξης.

            Το ΡΜΜΑ είναι ένα υδρόφιλο υλικό και παρουσιάζει στατική γωνία επαφής ίση με 65°. Είναι σημαντικό να σημειώσουμε ότι οι υδρόφιλες από το πλάσμα επιφάνειες υποφέρουν από ένα φαινόμενο γνωστό ως υδροφοβική αποκατάσταση, δηλαδή τη σταδιακή αύξηση της γωνίας επαφής με το χρόνο (γήρανση). Σε προηγούμενη εργασία μας, είχαμε καθυστερήσει τη γήρανση των υπερ-υδρόφιλων επιφανειών ΡΜΜΑ για ένα μήνα περίπου, λόγω της επίδρασης της νανοϋφασμένης τοπογραφίας (Κ. Tsougeni et al.,Langmuir,2009,25,l 1748-11759). Η παρούσα εφεύρεση προτείνει μια μέθοδο η οποία δημιουργεί νανοϋφασμένες επιφάνειες με σταθερή συμπεριφορά διαβροχής συναρτήσει του χρόνου αμέσως μετά το πλάσμα, μέσω ενός επιπλέον σταδίου ανόπτησης στους 110 ° C για 30 min.

            Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, διαπιστώθηκε ότι η ύπαρξη της νανο-ύφανσης καθυστερεί την υδροφοβική αποκατάσταση των επιφανειών ΡΜΜΑ. Οι επιφάνειες που κατεργάστηκαν για 5 min στον αντιδραστήρα τύπου-helicon παρουσίασαν υπερυδροφιλικότητα για χρονικό διάστημα 4 ημερών και σιγά-σιγά άρχισαν να γηράσκουν στην αρχική γωνία επαφής σε μία περίοδο 17 ημερών. Αντιθέτως, η γωνία επαφής των ταχέως γηρασμένων επιφανειών μετά από 5 min κατεργασία στο πλάσμα επέστρεψε αμέσως στο αρχικό επίπεδο μετά το στάδιο της ανόπτησης και παρέμεινε σταθερή μετά από μια μεγάλη χρονική περίοδο (> τέσσερις μήνες).

Παράδειγμα 2: Κατασκευή μικρό- και νάνο- υφασμένων επιφανειών οργανικού πολυμερούς COP με σταθερή χημική δραστικότητα μετά την εγχάραξη με πλάσμα Ο2και την θερμική ανόπτηση

            Το Σχ. 4 απεικονίζει εικόνες SEM υπό πλάγια όψη από επιφάνειες COP κατεργασμένες με πλάσμα Ο2για (α) 30 s, (β) 2 min, (γ) 5 min, και (δ) 10 min αντίστοιχα. Ενώ η επιφάνεια που έχει κατεργαστεί για 30 s παραμένει σχεδόν επίπεδη, οι εικόνες αποκαλύπτουν το σχηματισμό πυκνών νάνο- και μικρο-κολώνων με ύψος 0.13 μm, 0.56 μm και 1,7 μm, αντίστοιχα.

            Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση του αντιδραστήρα ενεργών ιόντων χαμηλής πυκνότητας (RIE). Το Σχ. 5 παρουσιάζει εικόνες SEM υπό πλάγια όψη από επιφάνειες COP, οι οποίες έχουν υποβληθεί σε κατεργασία στον αντιδραστήρα πλάσματος RIE (πλάσμα Ο2, 10 mT, 400 W, 50 seem, ρυθμός εγχάραξης COP 210 nm/min) για 4 min. Οι εικόνες αποκαλύπτουν το σχηματισμό μικρο-και νανο-κολώνων ύψους 0,15 μm μετά από κατεργασία 4 min. Ωστόσο, προκειμένου να επιτευχθεί το ίδιο ύψος κολώνων και η ίδια αύξηση της ενεργής επιφάνειας με αυτόν τον αντιδραστήρα, μεγαλύτεροι χρόνοι εγχάραξης απαιτήθηκαν λόγω του χαμηλότερου ρυθμού εγχάραξης.

            To COP είναι ένα υδρόφοβο υλικό και παρουσιάζει στατική γωνία επαφής 91°. Οι νανοϋφασμένες με το πλάσμα υπερ-υδρόφιλες επιφάνειες COP καθυστέρησαν τη γήρανση για ένα μήνα περίπου, λόγω της επίδρασης της νανοϋφασμένης τοπογραφίας. Η παρούσα εφεύρεση προτείνει μια μέθοδο η οποία μπορεί να δημιουργήσει νανοϋφασμένες επιφάνειες με σταθερή συμπεριφορά διαβροχής συναρτήσει του χρόνου, αμέσως μετά το πλάσμα, μέσω ενός επιπλέον σταδίου ανόπτησης στους 130 °C για 30 min, όπως φαίνεται επίσης στο σχήμα. 6.

            Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, διαπιστώθηκε ότι η ύπαρξη της μικρό- και νανούφανσης καθυστέρησε την υδροφοβική αποκατάσταση των επιφανειών COP. Οι κατεργασμένες με πλάσμα Ο2επιφάνειες COP για 10 min σε ένα αντιδραστήρα τύπου-helicon παρουσίασαν υπερ-υδροφιλικότητα για χρονικό διάστημα 3 ημερών, και στη συνέχεια άρχισαν να γηράσκουν επί μία περίοδο περίπου 30 ημερών. Αντιθέτως, η γωνία επαφής των ταχέως γηρασμένων επιφανειών μετά από 10 min κατεργασία στο πλάσμα επέστρεψε αμέσως στο αρχικό επίπεδο μετά το στάδιο της ανόπτησης και παρέμεινε σταθερή για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Παράδειγμα 3: Νανοϋφασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ με σταθερή χημική δραστικότητα ικανές για ομοιοπολική σύνδεση βιομορίων

            Προκειμένου να προσδιοριστεί η ικανότητα για ομοιοπολική ακινητοποίηση στις κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες με σταθερή χημική δραστικότητα, σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες, χρησιμοποιήσαμε ειδικά βιομόρια, ονομαστικά παράγωγα βιοτίνης, τα οποία έχουν σχεδιαστεί για να σχηματίζουν ομοιοπολικούς δεσμούς με συνήθης δραστικές ομάδες όπως οι ομάδες καρβοξυλίου (-COOH) ή οι αλδεϋδομάδες (C=Ο): 1) υδατοδιαλυτό παράγωγο βιοτίνης που περιέχει πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) ως πλευρική ομάδα η οποία καταλήγει σε μια ελεύθερη αμινομάδα (Amine-PEG3-Biotin), 2) μίγμα Amine-PEG3-Biotin με EDC (1-αιθυλο-3(3-διμεθυλαμινοπροπυλο)καρβοδιϊμίδιο), 3) D-βιοτίνη και 4) διαδικασία δύο σταδίων: ενεργοποίηση μετά από αντίδραση με μίγμα σουλφο-NHS (Ν-υδροξυσουλφοηλεκτριμίδιο)/ΕDC ακολουθούμενη από αντίδραση με Amine-PEG3-Biotin. Σε όλες τις περιπτώσεις ακολούθησε αντίδραση με στρεπταβιδίνη επισημασμένη με φθορίζοντα μόρια.

            Η κατεργασία των επιφανειών ΡΜΜΑ με πλάσμα O2δημιουργεί δραστικές ομάδες όπως C=O, -COOH, και C-OH, όπως έχει αποκαλυφθεί με ανάλυση XPS. Αποδεικνύουμε ότι τα συγκεκριμένα βιομόρια τα οποία αναφέρθηκαν παραπάνω συνδέονται ομοιοπολικά με τις νανοϋφασμένες επιφάνειες μέσω των δραστικών ομάδων που σχηματίζονται μετά το πλάσμα O2. Αυτό αποδεικνύεται από την παρατήρηση των επιφανειών με φθορισμό μετά από επανειλημμένες εκπλύσεις με SDS στους 90 °C, ένα ισχυρό και επιθετικό πρωτόκολλο κατεργασίας με επιφανειοδραστικό σχεδιασμένο για να αφαιρεί όλα τα μη ομοιοπολικά συνδεδεμένα μόρια. Η παραμονή του φθορισμού μετά από ένα τέτοιο ισχυρό βήμα έκπλυσης ήταν η έμμεση απόδειξη της ομοιοπολικής σύνδεσης.

            Πιο συγκεκριμένα, η ομάδα -ΝΗ2της Amine-PEG3-Biotin συνδέεται ομοιοπολικά με μια αλδεϋδομάδα από το νανοϋφασμένο υπόστρωμα. Έτσι, η απευθείας σύνδεση της Amine-PEG3-Biotin υποδηλώνει ομοιοπολική σύνδεση μέσω των ομάδων αλδεΰδης. To EDC ενεργοποιεί τις ομάδες καρβοξυλίου από το νανουφασμένο υπόστρωμα (σχηματίζοντας μια ασταθή ενδιάμεση ένωση Ο-ακυλοουρίας η οποία επιτρέπει τη σύνδεση του καρβοδιϊμιδίου με την αμινομάδα του παραγώγου βιοτίνης στην επιφάνεια μέσω ενός αμιδικού δεσμού) για να συνδεθούν με την ομάδα -ΝΗ2της Amine-PEG3-Biotin. Έτσι, η άμεση σύνδεση του μίγματος Amine-PEG3-Biotin/EDC δείχνει επίσης την παρουσία δραστικών ομάδων καρβοξυλίου. Επίσης, το μείγμα σουλφο-NHS/EDC ενεργοποιεί τις ομάδες καρβοξυλίου από το τροποποιημένο υπόστρωμα σχηματίζοντας μια ενδιάμεση ένωση Ο-ακυλο-ουρίας. Αυτό το ενδιάμεσο κατόπιν αντιδρά άμεσα με την ομάδα-ΝΗ2της Amine-PEG3-Biotin, δίδοντας ένα σταθερό αμιδικό δεσμό. Η D-βιοτίνη επίσης επωάστηκε με τις επιφάνειες για να αποκλειστεί η σύνδεση των παραγώγων με θέσεις εκτός των ειδικών δραστικών ομάδων των επιφανειών.

            Όλες οι διαδικασίες που ακολουθήθηκαν για την ομοιοπολική σύνδεση των ενεργοποιημένων παραγώγων βιοτίνης στις εγχαραγμένες με πλάσμα επιφάνειες του οργανικού πολυμερούς και των επιφανειών SiΟ2, καθώς και η ανίχνευση τους απεικονίζονται σχηματικά στο Σχ. 7 (α-δ).

            Για τον εντοπισμό της παρουσίας των αλδεϋδομάδων στις επιφάνειες, ερευνήθηκε η απευθείας ακινητοποίηση της (α) Amine-PEG3-Biotin, και (β) D-βιοτίνης. Τα δύο αντιδραστήρια αραιώθηκαν σε συγκέντρωση 25 mM σε διάλυμα NaHC030,1 Μ, pH 8.5, και 80 μL, σταγόνες από κάθε διάλυμα εναποτέθηκαν πάνω στις επιφάνειες. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου μέσα σε ένα θάλαμο υγρασίας.

            Για την ανίχνευση των ομάδων καρβοξυλίου στις επιφάνειες, ακολουθήθηκαν δύο προσεγγίσεις (α) άμεση ακινητοποίηση μίγματος 25 mM Amine-PEG3-Biotin / 5 mM EDC σε 0,1 Μ ρυθμιστικό διάλυμα MES σε pH 5 και (β) διαδικασία δύο σταδίων: 1) ενεργοποίηση των ομάδων καρβοξυλίου με ένα μίγμα EDC / σουλφο-NHS (10 mM EDC και 5 mM σουλφο-NHS σε ρυθμιστικό διάλυμα MES 0,1 Μ, pH 5) για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. 2) Σύνδεση της Amine-PEG3-Biotin από ένα διάλυμα 25 mM σε διάλυμα NaHCO30,1 Μ, pH 8.5, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου.

            Στη συνέχεια όλα τα δείγματα εκπλύθηκαν με διάλυμα NaHCO30,1 Μ, pH 8.5, και εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού των ελεύθερων θέσεων δέσμευσης του υποστρώματος αποτελούμενο από 10 g/1 BSA (σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 10 mM, pH 7.0) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από αυτό το βήμα, οι επιφάνειες εκπλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM, pH 7.4. Τα ακινητοποιημένα παράγωγα βιοτίνης στις επιφάνειες ανιχνεύθηκαν μέσω της αντίδρασης με 2.5 μg/mL στρεπταβιδίνη επισημασμένη με AF546, σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM, pH 7.4, που περιείχε BSA 10 g/Ι για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, οι επιφάνειες εκπλύθηκαν εκτεταμένα πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM, pH 7.4, και απεσταγμένο νερό και στεγνώθηκαν υπό ροή Ν2. Οι εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού Axioskop 2 Plus (Carl Zeiss, Γερμανία) το οποίο ήταν συνδεμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Sony Cyber-Shot® και επεξεργάστηκαν με το λογισμικό ImagePro Plus® (Media Cybernetics, Inc).

            Στο Σχ. 8 (α) παρέχονται οι εντάσεις φθορισμού που ελήφθησαν από περιοχές τροποποιημένες με τα αντίστοιχα παράγωγα βιοτίνης πριν και μετά την έκπλυση με το SDS για (ι) μη κατεργασμένες επιφάνειες και (ιι) κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ για 5 min στον αντιδραστήρα τύπου-helicon, (ιιι) ταχέως γερασμένες (μετά από ανόπτηση) κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ για 5 min στον αντιδραστήρα τΰπου-helicon οι οποίες εξετάστηκαν κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 30 ημερών. Όπως φαίνεται στο Σχ. 8, οι μη κατεργασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ έδωσαν εξαιρετικά χαμηλές απόλυτες τιμές φθορισμού, ως εκ τούτου, δεν παρουσίασαν ομοιοπολική σύνδεση. Από την άλλη πλευρά, οι νανοϋφασμένες με το πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ έδωσαν υψηλές τιμές φθορισμού, υποδεικνύοντας την αντίδραση καρβοξυλικών ομάδων με NHS/EDC ή/και Amine-PEG3-Biotin ή των αλδεϋδομάδων με Amine-PEG3-Biotin. Οι φρέσκες επιφάνειες ΡΜΜΑ μετά το πλάσμα συνδέουν μόρια ομοιοπολικά λόγω των ομάδων C=O και -COOH. Οι γερασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ μετά το πλάσμα συνδέουν μόρια ομοιοπολικά λόγω των ομάδων -COOH, διότι η ένταση του φθορισμού της Amine-PEG3-Biotin, η οποία συνδέεται ομοιοπολικά με τις αλδεϋδομάδες, έχει μια πτωτική τάση. Στις ταχέως γερασμένες μέσω θερμικής ανόπτησης επιφάνειες ΡΜΜΑ μετά την κατεργασία με πλάσμα η ένταση του φθορισμού είναι σταθερή κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 30 ημερών και η ομοιοπολική σύνδεση οφείλεται στις ομάδες C=O και -COOH.

            Πιο συγκεκριμένα, οι τιμές φθορισμού των ταχέως γερασμένων μέσω θερμικής ανόπτησης επιφανειών ΡΜΜΑ μετά την κατεργασία με το πλάσμα που ελήφθησαν μετά από την αντίδραση του αντίστοιχου παραγώγου βιοτίνης με ομάδες καρβοξυλίου ήταν 44-φορές υψηλότερες από τις τιμές που ελήφθησαν με την εφαρμογή της D-βιοτίνης επάνω σε μια παρόμοια επιφάνεια. Περαιτέρω, η αντίδραση των επιφανειών με Amine-PEG3-Biotin έδωσε 23-φορές υψηλότερο φθορισμό σε σύγκριση με εκείνο της D-βιοτίνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι χημικώς σταθεροποιημένες νανοϋφασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ μετά την κατεργασία με το πλάσμα οδηγούν στο σχηματισμό δραστικών και διαθέσιμων ομάδων καρβοξυλίου και αλδεϋδομάδων οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ομοιοπολική ακινητοποίηση των βιομορίων. Κάποιος μπορεί να παρατηρήσει περαιτέρω ότι οι ταχέως σταθεροποιημένες επιφάνειες ΡΜΜΑ έχουν μια σταθερή ένταση σήματος, και ότι αυτό το σήμα σχεδόν δεν επηρεάζεται μετά από την ισχυρή έκπλυση με επιφανειοδραστικό στους 90 °C, γεγονός που υποδηλώνει ότι γίνεται ομοιοπολική σύνδεση. Το Σχ. 9 παρουσιάζει τις εντάσεις φθορισμού για κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ για 1 min και 10 min και ταχέως γερασμένες (μετά από ανόπτηση) στον αντιδραστήρα RLE οι οποίες δοκιμάστηκαν πριν και μετά την έκπλυση με το επιθετικό πρωτόκολλο SDS. Οι φρέσκες επιφάνειες ΡΜΜΑ μετά το πλάσμα συνδέουν μόρια ομοιοπολικά λόγω των ομάδων C=O και -COOH. Οι μη κατεργασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ δεν παρουσίασαν ομοιοπολική σύνδεση.

            Περαιτέρω, ερευνήσαμε το μηχανισμό της ομοιοπολικής σύνδεσης της πρωτεΐνης γ-σφαιρίνης κουνελιού (RgG) σε νανοϋφασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ και COP. Η ομάδα της Bilek et al. ακινητοποίησε πρωτεΐνες σε υδρόφιλες επιφάνειες δημιουργώντας ρίζες σε αρκετό βάθος κάτω από την επιφάνεια χρησιμοποιώντας μια ενεργητική διαδικασία πλάσματος υποβοηθούμενη από ιόντα. Η πυκνότητα των ελεύθερων ριζών μπορεί να ποσοτικοποιηθεί χρησιμοποιώντας το συντονισμό περιστροφής ηλεκτρονίων (ESR). Για το λόγο αυτό, ελήφθησαν μετρήσεις ESR προκειμένου να εξεταστεί εάν οι νανοϋφασμένες επιφάνειες μετά την κατεργασία με το πλάσμα διαθέτουν ελεύθερες ρίζες οι οποίες μπορούν να σχηματίσουν ομοιοπολικούς δεσμούς. Το Σχ. 10 παρουσιάζει το σήμα ESR από τις κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ και COP και στους δυο αντιδραστήρες (α) τύπουhelicon και (β) RIE. Όπως φαίνεται, το σήμα ESR από τις νανοϋφασμένες επιφάνειες δεν στηρίζει την παρουσία ανιχνεύσιμων ελεύθερων ριζών. Αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από την ομάδα της Bilek et al., η οποία έχει δείξει, ότι το σήμα ESR ήταν αμελητέο όταν η ενέργεια των ιόντων ήταν κάτω 500 eV (στην περίπτωση μας η ενέργεια των ιόντων είναι της τάξεως των 100eV). Το αρνητικό αυτό αποτέλεσμα αποδεικνύει ουσιαστικά ότι στην περίπτωσή μας οι ελεύθερες ρίζες δεν μπορεί να είναι υπεύθυνες για την ομοιοπολική σύνδεση. Η σύνδεση είναι πιθανόν να οφείλεται σε συγκεκριμένες χημικές ομάδες, όπως συζητήθηκε παραπάνω για το ΡΜΜΑ και πιο κάτω για το COP.

Παράδειγμα 4: Νανο-υφασμένες επιφάνειες COP με σταθερή χημική δραστικότητα ικανές για ομοιοπολική σύνδεση βιομορΐων

            Δείγματα οργανικού πολυμερούς COP υποβλήθηκαν επίσης σε κατεργασία με πλάσμα και γηράνθηκαν με ανόπτηση στους 130 °C για 30 min, όπως συζητήθηκε στο παράδειγμα 2. Ακολουθήθηκαν οι ίδιες διαδικασίες όπως εκείνες που περιγράφηκαν ανωτέρω στο παράδειγμα 3 σχετικά με την αντίδραση με ειδικά παράγωγα βιοτίνης. Στο Σχ. 11 (α, β) οι εντάσεις φθορισμού που ελήφθησαν από περιοχές τροποποιημένες με τα αντίστοιχα παράγωγα βιοτίνης παρέχονται πριν και μετά την έκπλυση με το ισχυρό πρωτόκολλο SDS για κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ και ταχέως γερασμένες (μετά από ανόπτηση) και στους δυο αντιδραστήρες (α) τύπου-helicon και (β) RIE, οι οποίες εξετάστηκαν αμέσως μετά την κατεργασία στο πλάσμα. Ομοίως, οι κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες COP συνδέουν ομοιοπολικά μόρια μέσω ομάδων C=O και -COOH. Οι μη κατεργασμένες επιφάνειες COP δεν παρουσίασαν ομοιοπολική σύνδεση. Οι ταχέως γερασμένες (μετά από ανόπτηση) επιφάνειες COP παρουσίασαν σταθερή ομοιοπολική σύνδεση.

Παράδειγμα 5: Εγχαραγμένες με πλάσμα επιφάνειες SiO2με σταθερή χημική δραστικότητα ικανές για ομοιοπολική σύνδεση βιομορΐων

             Οι επιφάνειες SiO2υποβλήθηκαν επίσης σε κατεργασία με πλάσμα που περιέχει φθοράνθρακα, ονομαστικά πλάσμα C4F8και σταθεροποιήθηκαν με ανόπτηση στους 106 °C για 60 min. Ακολουθήθηκαν οι ίδιες διαδικασίες όπως εκείνες που περιγράφηκαν παραπάνω στο παράδειγμα 3 για την αντίδραση με τα ειδικά παράγωγα βιοτίνης. Στο Σχ. 12 (α, β), οι εντάσεις φθορισμού που ελήφθησαν από περιοχές τροποποιημένες με τα αντίστοιχα παράγωγα βιοτίνης παρέχονται για τις μη κατεργασμένες επιφάνειες, για τις κατεργασμένες με πλάσμα C4F8επιφάνειες SiO2για 15-s, και για τις σταθεροποιημένες επιφάνειες μετά το πλάσμα C4F8μετά από αντίδραση με στρεπταβιδίνη επισημασμένη με AF546.

             Όπως φαίνεται στο Σχ. 12 (α, β), τα μη κατεργασμένα υποστρώματα SiO2δεν εμφάνισαν ομοιοπολική σύνδεση. Από την άλλη πλευρά, οι κατεργασμένες με πλάσμα επιφάνειες SiO2έδωσαν υψηλές τιμές φθορισμού, υποδεικνύοντας την αντίδραση των ομάδων καρβοξυλίου με NHS/EDC και αμίνη βιοτίνη ή των αλδεϋδομάδων με Amine-PEG3-Biotin. Πιο συγκεκριμένα, οι τιμές φθορισμού των σταθεροποιημένων μετά το πλάσμα επιφανειών SiO2που ελήφθησαν μετά από την αντίδραση του αντίστοιχου παραγώγου βιοτίνης με ομάδες καρβοξυλίου ήταν 93-φορές υψηλότερες από τις τιμές που ελήφθησαν με την εφαρμογή της D-βιοτίνης επάνω σε μια παρόμοια επιφάνεια. Αντίθετα για τη μη κατεργασμένη επιφάνεια μια παρόμοια δοκιμή έδειξε ότι οι τιμές φθορισμού των ομάδων καρβοξυλίου ήταν μόνο 2-φορές υψηλότερες από τις τιμές που ελήφθησαν με την εφαρμογή της D-βιοτίνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι κατεργασμένες με πλάσμα C4F8επιφάνειες SiO2οδηγούν στο σχηματισμό δραστικών και διαθέσιμων ομάδων καρβοξυλίου και αλδεϋδομάδων οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ομοιοπολική ακινητοποίηση των βιομορίων.

Παράδειγμα 6: Σταθερή ακινητοποίηση υψηλής πυκνότητας της πρωτεΐνης γσφαιρίνη κουνελιού (RgG) σε κατεργασμένες με πλάσμα Ο2επιφάνειες ΡΜΜΑ Εδώ αποδεικνύουμε την ικανότητα σταθερής ακινητοποίησης της γ-σφαιρίνης κουνελιού (RgG) σε νανοϋφασμένες με πλάσμα και θερμικά επεξεργασμένες μετά από ανόπτηση στους 110 °C για 30 min επιφάνειες ΡΜΜΑ, μετά την έκπλυση με δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), ένα ιοντικό επιφανειοδραστικό ικανό να ξεπεράσει τις δυνάμεις που είναι υπεύθυνες για φυσική προσρόφηση, ενώ δεν επηρεάζει τους ομοιοπολικούς δεσμούς, όπως συζητήθηκε από την ομάδας της Bilek et al.

            Η ακινητοποίηση των πρωτεϊνών RgG στις επιφάνειες οργανικού πολυμερούς πραγματοποιήθηκε με εναπόθεση με πιπέττα 1μl διαλύματος RgG (100 μg/ml) σε 50 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.4 και επώαση για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε θάλαμο με υγρασία. Μετά από τρεις εκπλύσεις με 50 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.4, τα δείγματα εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα SDS για 10 min στους 90 °C. Μετά την επώαση στο επιφανειοδραστικό, τα δείγματα εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού των ελεύθερων θέσεων δέσμευσης του υποστρώματος αποτελούμενο από 10 g/l BSA (σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 10 mM, pH 7.0) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ακινητοποιη μένη πάνω στην επιφάνεια RgG ανιχνεύθηκε μέσω αντίδρασης με 5 μg/ml αντισώματος κατά των γσφαιρινών κουνελιού επισημασμένου με AF488 σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM, pH 7.4, που περιείχε BSA 10 g/l για 1 h n σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι επιφάνειες εκπλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM, pH 7.4 που περιείχε 0.05 % ν/ν Tween 20 και απεσταγμένο νερό και στεγνώθηκαν υπό ροή Ν2. Οι εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού Axioskop 2 Plus (Carl Zeiss, Γερμανία) το οποίο ήταν συνδεμένο με μια με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Sony Cyber-shot και επεξεργάστηκαν με το λογισμικό ImagePro Plus (Media Cybernetics, Inc., ΗΠΑ). Η διαδικασία της ακινητοποίησης των πρωτεϊνών και της ανίχνευση τους απεικονίζεται στο Σχήμα 13.

            Στο Σχ. 14, παρουσιάζεται η ένταση φθορισμού επιφανειών ΡΜΜΑ που έχουν επικαλυφθεί με την πρωτεΐνη RgG (100 pg/mL), μετά από κατεργασία σε αντιδραστήρα πλάσματος τύπου-helicon για (α) 30 s και (β) 5 min πριν και μετά την έκπλυση με το ισχυρό πρωτόκολλο SDS, και για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την κατεργασία στο πλάσμα (περίπου 30 ημέρες). Μια επιφάνεια κατεργασμένη μόνο για 30 s συμπεριλήφθηκε επίσης στη μελέτη. Η επιφάνεια αυτή αναμένεται να έχει τη χημική τροποποίηση που οφείλεται στην έκθεση στο πλάσμα O2, αλλά έχει σχεδόν αμελητέα τοπογραφία. Μια τάση που παρατηρείται σε γενικές γραμμές είναι η αύξηση της έντασης φθορισμού με το χρόνο κατεργασίας στο πλάσμα μέχρι περίπου 3 φορές μετά από 5 min κατεργασία, σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες. Σημειώστε ότι, η κατεργασμένη για 30 s επιφάνεια, η οποία έχει σχεδόν αμελητέα τοπογραφία, έχει επίσης σχεδόν την ίδια ικανότητα προσρόφηση πρωτεϊνών με τη μη κατεργασμένη επιφάνεια. Οι κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ δείχνουν συνήθως 40-85% διατήρηση της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ, όπου το SDS αφαιρεί όλη τη προσροφημένη πρωτεΐνη RgG.

            Επίσης, στο σχήμα. 15 (α, β) παρουσιάζεται η ένταση φθορισμού επιφανειών ΡΜΜΑ που έχουν επικαλυφθεί με την πρωτεΐνη RgG (100 μg/mL), μετά από κατεργασία σε αντιδραστήρα RIE για (α) 1 min και (β) 10 min πριν και μετά την έκπλυση με το ισχυρό πρωτόκολλο SDS, για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την κατεργασία στο πλάσμα (περίπου 30 ημέρες). Ομοίως, οι κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ δείχνουν 40-85% διατήρηση της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ, όπου το SDS αφαιρεί όλη τη προσροφημένη πρωτεΐνη RgG. Σημειώστε, ότι μετά από κατεργασία 1 min στον αντιδραστήρα RIE οι νανοϋφασμένες επιφάνειες ΡΜΜΑ εμφανίζουν 85% διατήρηση της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες. Αυτό καταδεικνύει ότι λαμβάνει χώρα σχηματισμός ομοιοπολικού δεσμού ο οποίος είναι υπεύθυνος για την ισχυρή προσκόλληση των πρωτεϊνών. Το ποσοστό της πρωτεΐνης που δεν παραμένει στην επιφάνεια μπορεί να αποδοθεί σε φυσική προσρόφηση.

Παράδειγμα 7: Σταθερή ακινητοποίηση υψηλής πυκνότητας της πρωτεΐνης γσφαιρίνης κουνελιού (RgG) σε κατεργασμένες με πλάσμα Ο2επιφάνειες COP Το παράδειγμα 7, είναι παρόμοιο με το παράδειγμα 6, αλλά για ένα διαφορετικό πολυμερές, το COP. Στο Σχ. 16 (α), οι εντάσεις φθορισμού επιφανειών COP που έχουν επικαλυφθεί με την πρωτεΐνη RgG (100 μg/mL), παρέχονται επίσης για κατεργασμένες επιφάνειες αμέσως μετά πλάσμα σε αντιδραστήρα τύπου-helicon, πριν και μετά την έκπλυση με το ισχυρό πρωτόκολλο SDS και συναρτήσει του χρόνου κατεργασίας στο πλάσμα Ο2(τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν αμέσως μετά πλάσμα). Και πάλι, οι κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες COP, παρόμοια με τα αποτελέσματα του ΡΜΜΑ, δείχνουν 50-75% διατήρηση της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες COP, όπου το SDS αφαιρεί όλη τη προσροφημένη πρωτεΐνη RgG.

            Στο Σχ. 16 (β), οι εντάσεις φθορισμού επιφανειών COP που έχουν επικαλυφθεί με την πρωτεΐνη RgG (100 μg/mL), παρέχονται επίσης για κατεργασμένες επιφάνειες αμέσως μετά πλάσμα σε αντιδραστήρα RIE, πριν και μετά την έκπλυση με το ισχυρό πρωτόκολλο SDS και συναρτήσει του χρόνου κατεργασίας στο πλάσμα Ο2(τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν αμέσως μετά πλάσμα). Και πάλι, οι κατεργασμένες με το πλάσμα επιφάνειες COP, παρόμοια με τα αποτελέσματα του ΡΜΜΑ, δείχνουν 50-75% διατήρηση της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες COP, όπου το SDS αφαιρεί όλη τη προσροφημένη πρωτεΐνη RgG.

Παράδειγμα 8: Απ’ ευθείας ακινητοποίηση του αντισώματος της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) σε θερμικά ανοπτημένες, νανοδομημένες σε πλάσμα Ο2επιφάνειες ΡΜΜΑ και εφαρμογή σε ανοσοανάλυση της CRP.

             Οι επιφάνειες ΡΜΜΑ ήταν νανοϋφασμένες και ταχέως γερασμένες σε πλάσμα Ο2όπως εξηγήθηκε στο παράδειγμα 1, και χρησιμοποιήθηκαν σαν υποστρώματα για ανοσοανάλυση ανίχνευσης της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP). Η διαδικασία παρουσιάζεται στο Σχήμα 17.

            Αντίσωμα κατά της CRP ακινητοποιήθηκε στην επιφάνεια μέσω επώασης διαλύματος συγκέντρωσης 100 μg/mL σε 50 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 7.4, όλο το βράδυ σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Τα δείγματα τότε εκπλύθηκαν με 10 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 7.4, και εμβαπτίστηκαν σε 10 g/L διάλυμα BSA σε 50 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 7.4 (διάλυμα blocking) για 1 ώρα σε RT. Οι επιφάνειες εκπλύθηκαν ξανά τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών. Το ακινητοποιημένο αντίσωμα αντέδρασε επί 1 ώρα με διαλύματα CRP (0-100 ng/mL) σε 10 mM PBS, pH 7.4, που περιείχε 10 mg/mL BSA, 0.05% (ν/ν) Tween 20, ακολουθούμενο από επώαση 1 ώρας με διάλυμα βιοτινυλιωμένου αντισώματος κατά της CRP (10 μg/mL) στον ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Η ανίχνευση των ακινητοποιη μένων στην επιφάνεια ανοσοσυμπλεγμάτων πραγματοποιήθηκε με χρήση της συσκευασίας ELF 97 Immunohistochemistry kit (Invitrogen Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με μικροσκόπιο επιφθορισμού Axioskop 2 Plus® (Carl Zeiss, Γερμανία) εξοπλισμένο με ψηφιακή κάμερα Sony Cyber-Shot® 8-bit και έγινε επεξεργασία με το λογισμικό ImagePro Plus® (Media Cybernetics, Inc.).

            Στο Σχήμα 18 (α) παρουσιάζονται οι καμπύλες βαθμονόμησης για την CRP που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας κατεργασμένες με πλάσμα Ο2για 5 λεπτά και ακατέργαστες επιφάνειες ΡΜΜΑ. Όπως φαίνεται, οι νανοϋφασμένες με κατεργασία σε πλάσμα επιφάνειες έδωσαν σημαντικά υψηλότερο (κατά 15 φορές) σήμα φθορισμού για τις ίδιες συγκεντρώσεις CRP σε σύγκριση με τις ακατέργαστες, οδηγώντας σε τουλάχιστον 50 φορές μεγαλύτερη ευαισθησία ανίχνευσης για την CRP. Επίσης, παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες φθορισμού κηλίδων anti-CRP μετά από αντίδραση με 50 μg/mL διάλυμα CRP που έγιναν σε (18β(ι)) ακατέργαστη, (18β(ιι)) ταχέως γερασμένη μέσω θερμικής ανόπτησης και (18β(ιιι)) κατεργασμένη με πλάσμα αλλά όχι ανοπτημένη επιφάνεια ΡΜΜΑ, χρησιμοποιώντας συσκευή εναπόθεσης μικροκηλίδων και ανίχνευση με χρήση της συσκευασίας ELF 97 Immunohistochemistry kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όπως μπορούμε να δούμε από το διάγραμμα και τις εικόνες των κηλίδων, τα ταχέως γερασμένα (ανοπτημένα) κατεργασμένα με πλάσμα δείγματα εμφάνισαν αυξημένη προσρόφηση, σε σύγκριση με τα νανοϋφασμένα, μη ανοπτημένα και ακατέργαστα δείγματα.

Παράδειγμα 9: Απ’ ευθείας ακινητοποίηση του πολυκλωνικού αντισώματος κατά του λιποπολυσακχαρίτη της σαλμονέλας (anti-LPS) πάνω σε ταχέως γερασμένες, σχηματοποιημένες με πλάσμα επιφάνειες ΡΜΜΑ για να δειχτεί η λειτουργικότητα του αντισώματος και η δέσμευση κυττάρων σαλμονέλας Σε αυτό το παράδειγμα, δείχνουμε σημαντικά αυξημένη ακινητοποίηση αντισώματος (και συγκεκριμένα πολυκλωνικού αντισώματος κατά του πολυσακχαρίτη που έχει απομονωθεί από Salmonella) σε κατεργασμένες σε πλάσμα περιοχές ΡΜΜΑ σε σύγκριση με ακατέργαστες. Οι νανοϋφασμένες περιοχές σχηματίστηκαν με εγχάραξη σε πλάσμα ενός υποστρώματος ΡΜΜΑ μέσω σχη ματοποίησης ενός στρώματος Ormocomp. Για το σκοπό αυτό, σχηματοποιήθηκαν κυκλικές περιοχές σε υπόστρωμα ΡΜΜΑ χρησιμοποιώντας τη στοιβάδα του φωτοπολυμερούς LOR/Ormocomp, ακολούθησε εγχάραξη του σχήματος για 25 min (~19 μm βαθύ), και απομάκρυνση του φωτοπολυμερούς. Η διαδικασία του μη ανταγωνιστικού ανοσοπροσδιορισμού του LPS συνοψίζεται παρακάτω: (1) Επικάλυψη με αντίσωμα κατά του LPS μέσω επώασης για 24 ώρες σε RT με διάλυμα συγκέντρωσης 100 μg/mL, (2) έκπλυση και εμβάπτιση για 2 ώρες σε διάλυμα 10g/l BSA, (3) 2 ώρες αντίδραση με (0-500 ng/mL) διαλύματα LPS (Lipopolysaccharides from Salmonella enterica serotype typhimurium), (4) 2 ώρες αντίδραση με βιοτυνιλιωμένο αντίσωμα κατά του LPS, και (5) ανίχνευση με χρήση της συσκευασίας ELF 97 Immunohistochemistry kit (Invitrogen Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όπως φαίνεται από το Σχήμα 19, το αντίσωμα κατά του LPS προσδένεται μόνο στις νανοϋφασμένες, κατεργασμένες με πλάσμα περιοχές, και όχι στις ακατέργαστες (κύκλοι).

            Έχοντας αποδείξει ότι το αντίσωμα κατά του LPS προσδένεται στη νανοϋφασμένη επιφάνεια, χρησιμοποιήσαμε νανοϋφασμένες επιφάνειες τροποποιημένες με αντίσωμα για να δεσμεύσουμε κύτταρα σαλμονέλας. Στο Σχήμα 20 δείχνουμε αντιπροσωπευτικές εικόνες υπό κλίση από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (SEM) κυττάρων Salmonella Typhimurium δεσμευμένων στην επιφάνεια που αποδεικνύουν ότι τα κύτταρα σαλμονέλας μπορούν να δεσμευτούν από τα ακινητοποιημένα σε τέτοιες νανοϋφασμένε αποδεικνύει ότι τα βακτήρια προσδένοντα μικροκαναλιού.

ς επιφάνειες αντισώματα. Η εικόνα SEM ι στον πυθμένα και στα τοιχώματα του

Claims (10)

Αξιώσεις

 1. Μια διεργασία για την παραγωγή εγχαραγμένης στο πλάσμα οργανικής πολυμερικής επιφάνειας ή επιφάνειας SiΟ2, με καρβονυλικές ή καρβοξυλικές ομάδες, όπου η διεργασία περιλαμβάνει το βήμα της εγχάραξης της επιφάνειας με οξυγόνο ή φθόριο ή πλάσμα που περιέχει φθοράνθρακες και προκαλεί εναπόθεση, ή μίγμα αυτών, κάτω από ανισοτροπικές συνθήκες εγχάραξης, παρουσία ενός παρεμποδιστή εγχάραξης, που χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι μετά το βήμα εγχάραξης με πλάσμα η επιφάνεια υποβάλλεται σε βήμα θερμικής ανόπτησης με θέρμανση για 10-120 min σε θερμοκρασία 5 έως 40 βαθμούς χαμηλότερη από τη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης του οργανικού πολυμερούς ή του πολυμερούς που αποτίθεται στο πλάσμα.

2.  Μια διεργασία σύμφωνα με την αξίωση 1, που χαρακτηρίζεται από το ότι η επιφάνεια θερμαίνεται σε θερμοκρασία 10 βαθμούς χαμηλότερη από την θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης του οργανικού πολυμερούς ή του πολυμερούς που αποτίθεται στο πλάσμα.

3.  Μια διεργασία σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 ή 2, όπου το οργανικό πολυμερές επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από πολυ(μεθακρυλικό μεθυλεστέρα) (ΡΜΜΑ), πολυ(διαιθεροκετόνη) (PEEK), πολυ(τερεφθαλικό αιθυλενεστέρα) (ΡΕΤ), πολυμερές κυκλοολεφίνης (COP), συμπολυμερές κυκλοολεφίνης (COC), πολυστυρένιο (PS), διασταυρωμένο πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS) και ακρυλικό συμπολυμερές-PDMS .

4.  Μια διεργασία σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1 με 3, όπου η εγχάραξη γίνεται μέσα από μάσκα που εκθέτει στο πλάσμα μόνο επιλεγμένες περιοχές της επιφάνειας.

5.  Μια διεργασία για την ακινητοποίηση ενός βιομορίου πάνω σε εγχαραγμένη με πλάσμα οργανική πολυμερική επιφάνεια ή επιφάνεια SiΟ2χωρίς τη χρήση μορίων που συνδέουν το βιομόριο με την επιφάνεια, που αποτελείται από τα εξής βήματα: α) Παραγωγή μιας εγχαραγμένης στο πλάσμα επιφάνειας σύμφωνα με την διεργασία οποιοσδήποτε από τις αξιώσεις 1-3.

β) Φέροντας σε επαφή διάλυμα βιομορίων με την εγχαραγμένη στο πλάσμα επιφάνεια για 1-24 ώρες.

6.  Μια διεργασία για τη δημιουργία σχήματος από ακινητοποιημένα βιομόρια πάνω σε εγχαραγμένη σε πλάσμα οργανική πολυμερική επιφάνεια ή επιφάνεια SiΟ2χωρίς τη χρήση μορίων που συνδέουν το βιομόριο με την επιφάνεια που περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

a) Παραγωγή μιας εγχαραγμένης στο πλάσμα επιφάνειας σύμφωνα με την διεργασία της αξίωσης 4.

b) Φέροντας σε επαφή διάλυμα βιομορίων με την εγχαραγμένη στο πλάσμα επιφάνεια για 1-24 ώρες.

 7. Μια διεργασία σύμφωνα με τις αξιώσεις 5 ή 6, όπου το βιομόριο προσδένεται σε συγκεκριμένο τύπο κυττάρου.

8.   Μια διαγνωστική διάταξη που περιλαμβάνει μια εγχαραγμένη στο πλάσμα επιφάνεια οργανικού πολυμερούς ή SiO2, που χαρακτηρίζεται από το ότι η επιφάνεια παράγεται σύμφωνα με τη διεργασία οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 1-8.

9.  Μια διαγνωστική διάταξη σύμφωνα με την αξίωση 8, όπου η διάταξη περιέχει μια μικροσυστοιχία ή μια μικρορευστονική διάταξη.

 10. Μια ιατρική διάταξη που αποτελείται από μια εγχαραγμένη στο πλάσμα επιφάνεια οργανικού πολυμερούς η SiΟ2που χαρακτηρίζεται από το ότι η επιφάνεια παράγεται σύμφωνα με τη διεργασία των αξιώσεων 1 μέχρι 8.