FR3140171A1 - Dispositif et procede pour la caracterisation de cellules soumises a une contrainte physique - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un dispositif microfluidique et un procédé pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et du durée déterminée à des cellules en suspension, et pour la caractérisation de la morphologie et de l’état physiologique de ces cellules pendant et/ou après l’application de cette contrainte physique. Figure pour l’abrégé : Figure 1
Description
La présente invention a pour objet un dispositif microfluidique et un procédé pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et d’une durée déterminée à des cellules en suspension, et pour la caractérisation de l’état morphologique et physiologique des cellules soumises à l’application de cette contrainte physique.
La présente invention se situe donc dans le domaine des dispositifs microfluidiques et de la biologie cellulaire analytique.
Les moyens actuellement connus de description et de caractérisation de la morphologie et de la physiologie cellulaire reposent notamment sur l’utilisation de marqueurs cellulaire. La morphologie peut être elle-même utilisée comme un marqueur de l’état physiologique d’une cellule. Ces moyens nécessitent cependant, d’une part, de disposer des marqueurs appropriés et spécifiques d’un état physiologique et, d’autre part, ces méthodes caractérisent uniquement l’état physiologique de la cellule tel qu’observé au moment du marquage.
Par ailleurs, l’efficacité des bioprocédés utilisant des cellules animales, tels que notamment les processus de bioimpression, de bioproduction de cellules pour la thérapie cellulaire, et de procédés mis en œuvre à partir de cellules, tels que la production de protéines thérapeutiques, de vaccins viraux ou de vecteurs viraux, ainsi que tous les processus d’injection ou de prélèvement de cellules, dépendent de la qualité des cellules qui sont utilisées au cours desdits bioprocédés.
La qualité des cellules est en général reliée à des caractéristiques physiologiques telles que la viabilité des cellules,i.e.la proportion de cellules vivantes par rapport aux cellules engagées dans des processus de mort cellulaire (apoptose, nécrose, lyse) ou la fonction des cellules (capacité de sécrétion de molécules, capacité à se différencier en sous-type cellulaire dans le cas de cellules souches). L’efficacité d’un bioprocédé peut donc être fortement impacté par l’altération qu’il produit sur la qualité cellulaire et donc sur la physiologie cellulaire. L’un des mécanismes qui impacte très fortement la qualité, et notamment la viabilité cellulaire, au sein d’un bioprocédé est l’application de contraintes hydrodynamiques et mécaniques générées par les équipements utilisés, tels qu’un bioréacteur, un système mettant en œuvre une seringue d’injection ou de prélèvement, ou encore une étape de séparation. L’interaction entre un fluide suspendant et une paroi crée une contrainte sur les cellules en suspension dans le fluide. Une interaction directe de la cellule avec la paroi produit un impact mécanique sur la cellule. Selon la nature du procédé et des techniques employées, l’intensité et la durée d’une contrainte physique exercée sur une cellule varient très fortement. Par exemple, un procédé de thérapie cellulaire peut générer sur les cellules une contrainte dont l’intensité peut atteindre 5.000 Pa et un procédé de bioimpression peut générer une contrainte dont la durée peut atteindre 30 ms.
Il est donc souhaitable de pouvoir caractériser de façon simple et reproductible l’état physiologique de cellules pendant et/ou après application d’une contrainte physique, notamment via la caractérisation de leur morphologie. En particulier, ce type de caractérisation est souhaitable pour les cellules susceptibles d’être utilisées lors d’un bioprocédé.
Il est en outre souhaitable de caractériser l’état physiologique de cellules au moment où celles-ci sont soumises à des contraintes physiques reproduisant les conditions de contrainte physique appliquées aux cellules au cours d’un bioprocédé particulier.
WO 2015/024690 “Apparatus and method for determining the mechanical properties of cells” a pour objet un procédé et un appareil de détermination des propriétés mécaniques des cellules, et divulgue l’étude de la déformation de cellules soumises à une contrainte de cisaillement. Ce document divulgue un dispositif comprenant un simple canal capillaire dans lequel des cellules en suspension subissent une contrainte de cisaillement et un procédé de mesure de la forme des cellules lors de leur circulation dans le dispositif. Ce procédé met en œuvre des images binarisées. Les mesures se font en temps réel.
EP 3 796 212 “Device for image-based cell classification, method therefor and use thereof” décrit un dispositif de tri des cellules en temps réel et sans marquage. Ce dispositif comprend un réseau microfluidique conduisant à l’alignement de chacune des cellules selon son axe majeur et une unité de classification comprenant un réseau neural qui trie les cellules en fonction des images de celles-ci.
WO 2019/006188 “Quantitative deformability cytometry: rapid, calibrated measurements of cell mechanical properties” décrit un dispositif microfluidique et un procédé de cytométrie de déformabilité quantitative (q—DC) destiné à évaluer quantitativement les propriétés mécaniques intrinsèques de cellules. Les paramètres mécaniques déterminés sont : le module élastique E, la fluidité cellulaire β, le temps de transit TT, le temps de migration TC, la taille des cellules Dcellet l’étirement maximum εmax, à un débit de 100 cellules/s. Des outils d’apprentissage automatique sont mis en œuvre. Les cellules sont soumises à des contraintes calibrées de cisaillement.
Il existe donc un besoin de disposer d’un dispositif et d’un procédé permettant de caractériser non seulement les propriétés mécaniques de cellules ayant subi une contrainte physique, mais en outre de caractériser leur morphologie et leur état physiologique.
Il existe donc un besoin de disposer d’un dispositif et d’un procédé capables de générer au moins une contrainte physique telle que générée au cours d’un bioprocédé, dont la nature, l’intensité et la durée sont déterminées et maîtrisées, afin de caractériser les cellules susceptibles de subir lesdites contraintes. Par « contrainte physique » on entend notamment toute force exercée sur les cellules, capables notamment de générer un stress cellulaire ; une telle contrainte physique peut notamment être un impact mécanique ou une contrainte hydrodynamique, telle qu’une contrainte de d’élongation, de compression ou de cisaillement.
Les inventeurs ont mis au point un dispositif pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminées à des cellules en suspension, et pour la caractérisation des cellules ayant subi ladite au moins une contrainte physique. Un dispositif selon l’invention comprend, d’une part, un circuit microfluidique pour l’application d’au moins une contrainte physique et, d’autre part, un moyen de caractérisation des cellules.
Dans un dispositif selon l’invention, ladite au moins une contrainte physique est une contrainte choisie parmi les contraintes mécaniques, notamment un impact mécanique, et/ou les contraintes hydrodynamiques, telles qu’une contrainte hydrodynamique de compression, une contrainte hydrodynamique de cisaillement et/ou une contrainte hydrodynamique d’extension.
Dans un dispositif selon l’invention, ledit moyen de caractérisation des cellules est choisi parmi tous les moyens techniques connus d’observation des cellules, notamment les moyens d’imagerie ou de cytométrie.
Un dispositif selon l’invention comprend un circuit microfluidique comprenant au moins un segment configuré pour l’application aux cellules en suspension d’au moins une contrainte physique, ce segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d’un fluide contenant ladite cellule en suspension, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l’intérieur dudit canal.
L’invention a donc pour premier objet un dispositif pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après ladite application.
L’invention a pour deuxième objet un procédé pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après ladite application.
L’invention a également pour objet un modèle de classification, préalablement entraîné sur un jeu de données d’apprentissage, pour caractériser une cellule et prédire son état physiologique pendant et/ou après l’application d’au moins une contrainte physique, selon un dispositif et un procédé selon l’invention. Un tel modèle de classification permet un gain de temps, d’argent et de performance au regard des outils existant sur le marché.
L’invention a enfin pour objet l’utilisation d’un dispositif, d’un procédé ou d’un modèle de classification selon l’invention, pour caractériser une cellule et éventuellement prédire son état physiologique pendant et/ou après l’application d’au moins une contrainte physique.
Un dispositif et un procédé selon l’invention présentent l’avantage de générer au moins une contrainte physique, dont la nature, l’intensité et la durée sont précisément déterminées et maîtrisées, afin de caractériser les cellules ayant subi lesdites contraintes.
Un dispositif et un procédé selon l’invention présentent l’avantage de permettre l’application d’une séquence modulable d’au moins une contrainte physique, notamment la répétition d’une même contrainte et/ou la combinaison de contraintes physiques de nature différente, l’intensité et la durée de chacune étant précisément définies. Il est donc possible grâce à cet outil simple et précis de reproduire les contraintes appliquées lors d’un bioprocédé et de suivre à haute cadence l’état d’une cellule.
Un dispositif et un procédé selon l’invention présentent aussi l’avantage de permettre de prédire l’état physiologique de cellules pendant et/ou après que celles-ci ont été soumises à des contraintes physiques. Cette prédiction peut être réalisée pendant et jusqu’à plusieurs jours après l’application de ces contraintes physiques.
Enfin, un dispositif et un procédé selon l’invention présentent l’avantage de définir la capacité d’une cellule à subir l’application d’au moins une contrainte physique déterminée tout en conservant une morphologie et un état physiologique compatibles avec les exigences dudit bioprocédé. Il est en effet possible grâce à un dispositif et un procédé selon l’invention de définir, pour des cellules données, une cartographie de ses capacités de résistance à au moins une contrainte physique.
Par « capacitance », on entend la capacité d’une cellule à subir au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminée, sans modification de son état physiologique. Par « modification de son état physiologique » on entend notamment une différentiation, ou le passage d’un état viable à un état de lyse, de nécrose, ou d’apoptose.
L’utilisation d’un dispositif et d’un procédé selon l’invention permet en particulier d’optimiser les bioprocédés, et notamment les contraintes physiques associées, afin de définir les conditions opératoires optimales et d’adapter lesdites contraintes aux cellules d’intérêt. Ces conditions par exemple se focalisent sur les paramètres du bioprocédé (température, débit, vitesse de rotation), sur le fluide suspendant (viscosité, osmolarité). Il est en effet souhaitable d’optimiser les contraintes associées aux bioprocédés, afin d’adapter lesdites contraintes aux données obtenues lors de la caractérisation et de la prédiction de l’état physiologique de cellules soumises à ces contraintes physiques.
Selon un premier objet, l’invention concerne un dispositif pour l’application d’au moins une contrainte physique à au moins une cellule en suspension et pour la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après ladite application, le dispositif comprenant :
- un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d’un fluide contenant ladite cellule en suspension, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l’intérieur dudit canal, et
- un moyen de caractérisation de ladite cellule ;
- un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d’un fluide contenant ladite cellule en suspension, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l’intérieur dudit canal, et
- un moyen de caractérisation de ladite cellule ;
ledit dispositif selon l’invention étant caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique choisie parmi :
- un impact mécanique,
- une contrainte hydrodynamique de compression,
- une contrainte hydrodynamique de cisaillement et
- une contrainte hydrodynamique d’extension.
- un impact mécanique,
- une contrainte hydrodynamique de compression,
- une contrainte hydrodynamique de cisaillement et
- une contrainte hydrodynamique d’extension.
Dans l’exposé de la présente invention, le terme « pour » comme notamment dans l’expression « pour l’application d’une contrainte physique » signifie « configuré pour l’application d’une contrainte physique ». Lorsqu’un intervalle ou une plage de valeurs est indiqué, les bornes citées sont considérées comme faisant partie de ladite plage de valeurs.
Par « circuit microfluidique » on entend un circuit destiné à manipuler de petits volumes de fluides (10-18à 10-3litres) dans des canaux dont le diamètre est compris entre 5 µm et 3000 µm.
Par « fluide » on entend un milieu déformable adapté à la circulation dans un dispositif selon l’invention et à la suspension cellulaire.
De préférence, dans un dispositif selon l’invention, ledit fluide est choisi parmi les fluides newtoniens, c’est-à-dire dont la viscosité ne varie pas en fonction de la contrainte de cisaillement. Ledit fluide possède au moins l’une des propriétés suivantes :
- sa viscosité newtonienne comprise entre 1 et 1000 mPa.s, de préférence entre 1 et 100 mPa.s,
- son indice de pseudo plasticité est compris entre 0 et 1, et est de préférence de 1 mPa.s,
- il est compatible avec la survie des cellules en conditions non contraintes, son osmolarité est comprise entre 250 et 410 mOsmol,
- son pH est physiologique dans des conditions de manipulation à l’air ambiant, ledit pH est donc compris entre 6,5 et 7,8 et
- il comprend des éléments nutritifs assimilables par les cellules en suspension, tels que notamment le glucose, la glutamine ou une composition nutritive telle qu’un milieu de culture.
- sa viscosité newtonienne comprise entre 1 et 1000 mPa.s, de préférence entre 1 et 100 mPa.s,
- son indice de pseudo plasticité est compris entre 0 et 1, et est de préférence de 1 mPa.s,
- il est compatible avec la survie des cellules en conditions non contraintes, son osmolarité est comprise entre 250 et 410 mOsmol,
- son pH est physiologique dans des conditions de manipulation à l’air ambiant, ledit pH est donc compris entre 6,5 et 7,8 et
- il comprend des éléments nutritifs assimilables par les cellules en suspension, tels que notamment le glucose, la glutamine ou une composition nutritive telle qu’un milieu de culture.
Plus particulièrement, dans un dispositif et un procédé selon l’invention, le fluide pour la suspension cellulaire est choisi de préférence parmi les fluides newtoniens, et notamment parmi :
- les tampons physiologiques, habituellement utilisés pour la mise en suspension de cellules, tels que notamment PBS, HBSS ; ces tampons sont éventuellement additionnés de composés nutritifs tels qu’une solution de glucose 0,5 à 6 g/l et une solution de glutamine 2 à 4 mM,
- les milieux de culture cellulaire, tels que notamment DMEM, EMEM, alpha-MEM,
- Les solutions de séparation cellulaire, tels que notamment Ficoll et solution de sucrose,
- Les solutions de polymère à faible masse molaire.
- les tampons physiologiques, habituellement utilisés pour la mise en suspension de cellules, tels que notamment PBS, HBSS ; ces tampons sont éventuellement additionnés de composés nutritifs tels qu’une solution de glucose 0,5 à 6 g/l et une solution de glutamine 2 à 4 mM,
- les milieux de culture cellulaire, tels que notamment DMEM, EMEM, alpha-MEM,
- Les solutions de séparation cellulaire, tels que notamment Ficoll et solution de sucrose,
- Les solutions de polymère à faible masse molaire.
Lors de l’application de ladite au moins une contrainte physique, la concentration cellulaire est de préférence inférieure à 100 million de cellules par ml, de préférence entre 0,01 et 10 million de cellules par ml. En d’autres termes, le volume cellulaire représente de préférence au plus 30 % du volume total du fluide de suspension.
Dans un dispositif selon l’invention, la circulation du fluide de référence et du fluide dans lequel les cellules sont en suspension est réalisée en un écoulement stable et sans pulsation. Le dispositif est de préférence conçu afin de conduire les cellules vers une puce microfluidique poursuivant une ligne de courant définie.
Dans un dispositif et un procédé selon l’invention, l’intensité de la contrainte, également désigné par l’expression « niveau de contrainte » ou « stress » dans les figures, et le temps de séjour sous contrainte, également désigné par « durée d’application de la contrainte » ou « temps » dans les figures, ont lieu de façon contrôlée. La capture et la libération des cellules en suspension ont également lieu de façon contrôlée.
La ou les pompes contrôlent le débit et la configuration de l’écoulement. Les pompes sont de préférence des pompes à ultra haute pression, jusqu’à 1.37x105kPa.
La circulation d’un fluide au sein d’un dispositif selon l’invention est initiée et maintenue au moyen de tout appareil adapté à cet effet bien connu d’une personne du métier, tel qu’une pompe.
Dans un dispositif selon l’invention, la section des canaux peut être constante ou variable, cette section peut aussi être conique, par exemple sous la forme de buses. La présence d’une section conique, croissante ou décroissante, à l’extrémité d’un canal impose aux cellules une contrainte supplémentaire de capture et de libération contrôlée.
Lors de la mise en circulation dans le circuit microfluidique d’un fluide comprenant les cellules en suspension, des lignes de courants sont générées et permettent le contrôle de la trajectoire des cellules. Les cellules à caractériser sont positionnées sur l’une des lignes de courant permettant le contrôle de l’intensité de contrainte.
Le diamètre préférentiel du canal principal est compris entre 10 et 3000 µm.
Les canaux sont constitués d’un matériau adapté à la circulation d’un fluide soumis à une pression comprise entre 10-3et 106kPa, et de préférence entre 1 et 104kPa, et/ou d’un matériau adapté pour la circulation d’un fluide dont la viscosité est comprise entre 1 et 2000 mPa.s.
La capacitance de cellules dépend de leur origine (clone, espèce, organe), de leur mode de culture (nombre de doublement en culture, milieu de culture, condition environnementale de la culture, i.e. agitation ou non, température, pH) et de leur mode de collecte (trypsination, récolte mécanique). Par exemple, le mode de culture des cellules, notamment en 2D ou 3D, leur culture sous forme adhérente ou en suspension et la nature du milieu de culture utilisé influencent la capacitance des cellules
Dans un dispositif selon l’invention, selon un mode de réalisation particulier, le circuit microfluidique est constitué par un ensemble de canaux constitués par un matériau approprié, notamment choisi parmi les suivants PEEK (PolyEtherEtherCetone), PVC (PolyChlorure de Vinyle), PTFE (PolyTetraFluoroEthene), FEP (Fluorinated ethylene polypropylene), PDMS (PolyDimethylSiloxane) ou l’acier. Selon un autre mode de réalisation, le circuit microfluidique est constitué par une puce microfluidique constituée en un matériau choisi parmi : le PDMS, le polyacrylate, le SEBS (StyreneEthyleneButyleneStyrene) le verre, le polycarbonate ou céramique.
Un dispositif selon l’invention peut comprendre, selon des modes de réalisation particuliers, des canaux disposés en série et/ou des canaux disposés en parallèle.
La circulation de fluide dans un dispositif selon l’invention est caractérisée par au moins un des paramètres suivants :
- un débit de circulation du fluide, dans le canal considéré pour la caractérisation de la contrainte physique appliquée aux cellules, compris entre 0 et 5 ml/min, de préférence entre 0 et 1 ml/min et/ou
- une vitesse de circulation du fluide comprise entre 5 µm/s et 300 m/s, et/ou
- un débit de cellules analysées supérieur à 1000 cellules / minutes.
- un débit de circulation du fluide, dans le canal considéré pour la caractérisation de la contrainte physique appliquée aux cellules, compris entre 0 et 5 ml/min, de préférence entre 0 et 1 ml/min et/ou
- une vitesse de circulation du fluide comprise entre 5 µm/s et 300 m/s, et/ou
- un débit de cellules analysées supérieur à 1000 cellules / minutes.
La durée totale de présence des cellules dans ledit canal est comprise de préférence entre 1 µs et 10000 s, de préférence entre 1 µs et 100 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 100 ms.
Par « cellule en suspension » on entend tout type de cellule, animale ou végétale, procaryote ou eucaryote. En effet, selon le diamètre des canaux et le grossissement de l’objectif permettant l’analyse d’image, un dispositif selon l’invention permet de caractériser par exemple des cellules de bactéries, d’algues ou de champignons.
L’invention a particulièrement pour objet un dispositif pour l’application d’au moins une contrainte physique et la caractérisation d’au moins une cellule en suspension pour au moins un des aspects suivants :
- la taille de la cellule,
- la forme de la cellule, notamment la sphéricité de la cellule
- l’aspect de la membrane externe,
- l’aspect du cytoplasme, notamment sa granulosité
- la présence d’au moins un marqueur à la surface de la cellule,
- le contenu protéique de la cellule et
- le contenu en acides nucléiques de la cellule, notamment la quantité d’ADN, la quantité d’ARN, la séquence nucléotidique d’un ou plusieurs acides nucléiques, qu’il s’agisse d’ADN ou d’ARN.
- la taille de la cellule,
- la forme de la cellule, notamment la sphéricité de la cellule
- l’aspect de la membrane externe,
- l’aspect du cytoplasme, notamment sa granulosité
- la présence d’au moins un marqueur à la surface de la cellule,
- le contenu protéique de la cellule et
- le contenu en acides nucléiques de la cellule, notamment la quantité d’ADN, la quantité d’ARN, la séquence nucléotidique d’un ou plusieurs acides nucléiques, qu’il s’agisse d’ADN ou d’ARN.
Par « caractérisation de la cellule » on entend la définition d’au moins une caractéristique de ladite cellule. Dans le cas ou plus d’une caractéristique cellulaire est définie, la caractérisation de ladite cellule comprend la définition de la combinaison desdites caractéristiques.
La caractérisation des cellules conduit à la détermination de l’état physiologique des cellules après l’application de ladite au moins une contrainte. La physiologie étudie le rôle, le fonctionnement et l’organisation mécanique, physique et biochimique des cellules et de leurs composants, notamment les organistes cellulaires. La physiologie étudie également les interactions entre une cellules et son environnement. La détermination de l’état physiologique des cellules comprend l’état de différentiation et/ou la détermination des fonctions de nutrition, de prolifération et de relation, telles que la mobilité et les fonctions sensorielles.
Cet état physiologique est de préférence choisi parmi les suivants : celluls vivante, cellule morte, cellule lysée, cellule nécrotique, cellule apoptotique, cellule différentiée ou cellule non différentiée, cellule pathologique ou cellule saine.
La relation entre l’état physiologique et les différents aspects de la caractérisation sont connus de l’homme du métier.
L’état physiologique des cellules après l’application d’au moins une contrainte physique peut en outre être comparé à l’état physiologique des cellules avant l’application de ladite contrainte physique.
Au sens de la présente invention, la capacité des cellules à subir au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminée tout en conservant un état physiologique compatible avec une utilisation ultérieure est définie comme la « capacitance » des cellules.
Selon un aspect particulier, l’invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique de compression, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type (A) comprenant, ou constitué par, un premier canal rejoint, au même niveau, par deux canaux, chacun faisant un angle compris entre 30 et 150 degrés avec ledit premier canal, cet angle est aussi désigné « angle de flow focusing », ou angle de focalisation de flux.
Par « contrainte hydrodynamique de compression » on entend l’application de forces équilibrées vers l’intérieur des cellules, cette contrainte est aussi désignée par « Flow focusing ». Dans un dispositif et un procédé selon l’invention, l’intensité de la contrainte de compression appliquée aux cellules est comprise entre 10-3et 103kPa, de préférence entre 10-3et 102kPa, de préférence entre 10-3et 10 kPa. La représente schématiquement un exemple de segment de type (A).
Selon un autre aspect particulier, l’invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte hydrodynamique de cisaillement, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type (B) comprenant, ou constitué par, un canal de diamètre compris entre 10 et 2000 µm, de préférence entre 20 et 200 µm
Par « contrainte hydrodynamique de cisaillement » on entend une contrainte mécanique appliquée de manière parallèle ou tangentielle à la face d’un matériau. Dans un dispositif et un procédé selon l’invention, l’intensité de la contrainte de cisaillement appliquée aux cellules est comprise entre 10-3et 105kPa, de préférence entre 10-3et 104kPa, de préférence entre 0,1 et 103kPa.
Une contrainte hydrodynamique de cisaillement est appliquée notamment lors de la circulation des cellules dans un canal capillaire, dont le diamètre est de préférence compris entre 10 et 2000 µm, de préférence entre 20 et 200 µm. La représente schématiquement un exemple de segment de type (B).
Selon un autre aspect particulier, l’invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique d’extension, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type (C) comprenant, ou constitué par, i) un canal de section croissante ou décroissante ou ii) un premier canal rejoint par un second dans lequel la circulation du fluide s’effectue dans un sens différent, de préférence opposé, à celui du premier canal.
Par « contrainte hydrodynamique d’extension » on entend l’application de forces équilibrées vers l’extérieur des cellules, ou une contrainte d’élongation. Dans un dispositif et un procédé selon l’invention, l’intensité de la contrainte d’extension appliquée aux cellules est comprise entre 10-3et 103kPa, de préférence entre 10-3et 102kPa, de préférence entre 10-3et 10 kPa. La représente schématiquement un exemple de segment de type (C).
Selon un autre aspect particulier, l’invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins un impact mécanique, ledit dispositif comprenant au moins un segment de type (D) comprenant, ou constitué par, un premier canal au sein duquel la ligne de trajet des cellules rencontre un obstacle, tel que notamment la paroi d’un second canal. La représente schématiquement un exemple de segment de type (D).
Par « impact mécanique » on entend tout type de choc mécanique, tel que par exemple un choc à la rencontre d’une paroi ou une collision inertielle à la surface. Dans un dispositif et un procédé selon l’invention, l’intensité de l’impact mécanique appliqué aux cellules est comprise entre 1 et 300 m/s, de préférence entre 1 et 100 m/s, de préférence entre 1 et 10 m/s. La durée du temps d’impact est de préférence inférieure à 1 µs.
Plus particulièrement, un dispositif selon l’invention pour l’application d’au moins une contrainte physique et la caractérisation d’au moins une cellule en suspension, comprend un circuit microfluidique comprenant ou consistant en :
- au moins un segment de type (A), et/ou
- au moins un segment de type (B), et/ou
- au moins un segment de type (C), et/ou
- au moins un segment de type (D),
lesdits segments étant combinés entre eux.
- au moins un segment de type (A), et/ou
- au moins un segment de type (B), et/ou
- au moins un segment de type (C), et/ou
- au moins un segment de type (D),
lesdits segments étant combinés entre eux.
Un dispositif selon l’invention est notamment conçu pour l’application d’une séquence comprenant une ou plusieurs itérations d’une contrainte physique de même nature, à une fréquence et une intensité déterminées, et/ou pour l’application d’une séquence de plusieurs contraintes physiques de nature différente, à une fréquence et une intensité déterminées.
Par « application d’au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminées » on entend :
- au moins une application d’une contrainte physique particulière d’intensité et de durée déterminées, optionnellement suivie de l’application d’une, deux, trois quatre ou davantage répétitions de l’application de ladite contrainte physique particulière, et/ou
- au moins une application d’une séquence d’au moins deux contraintes physiques particulières d’intensité et de durée déterminées, optionnellement suivie de l’application d’une, deux, trois quatre ou davantage séquences d’au moins deux contraintes physiques, et/ou
- l’application de tout type de séquence de contrainte physique telles que décrites dans la présente demande.
- au moins une application d’une contrainte physique particulière d’intensité et de durée déterminées, optionnellement suivie de l’application d’une, deux, trois quatre ou davantage répétitions de l’application de ladite contrainte physique particulière, et/ou
- au moins une application d’une séquence d’au moins deux contraintes physiques particulières d’intensité et de durée déterminées, optionnellement suivie de l’application d’une, deux, trois quatre ou davantage séquences d’au moins deux contraintes physiques, et/ou
- l’application de tout type de séquence de contrainte physique telles que décrites dans la présente demande.
Selon un autre aspect particulier, l’invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes physiques successives de nature différente. La séquence pouvant être répétée une, deux, trois fois ou plus.
Selon un autre aspect particulier, l’invention a particulièrement pour objet un dispositif configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes physiques successives de même nature. Selon cet aspect particulier, le dispositif est configuré pour l’application à ladite cellule d’une contrainte physique répétée au moins 1 fois, au moins deux fois, au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 fois, ou même davantage.
Un exemple de ce mode de réalisation d’un dispositif selon l’invention est schématisé par la , qui représente un dispositif conçu pour l’application aux cellules d’un grand nombre de contraintes de compression, séparées par des segments conçus pour que les cellules ne subissent pas de contrainte. Ces séquences de contraintes physiques peuvent être considérées comme équivalentes à l’application d’une déformation dynamique des cellules. Il s’agit de répétitions d’une même séquence de contrainte.
Plus particulièrement, un dispositif selon l’invention est caractérisé en ce que l’intensité totale de ladite au moins une contrainte physique appliquée à la cellule est comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa, de préférence entre 1 kPa et 102kPa.
Plus particulièrement, par ailleurs, un dispositif selon l’invention est caractérisé en ce que la durée totale de l’application de ladite au moins une contrainte physique est comprise entre 1 µs et 10000 s, de préférence 1 µs et 100 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence 10 µs et 100 ms.
Dans un dispositif microfluidique selon l’invention, la caractérisation de ladite au moins une cellule en suspension est réalisée pendant l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique et/ou après l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique. Selon un premier mode de réalisation, la caractérisation de ladite au moins une cellule en suspension est réalisée pendant l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique.
Selon un autre mode de réalisation, un dispositif selon l’invention est caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule a lieu après l’application de ladite au moins une contrainte, cette caractérisation est réalisée pendant une période comprise entre 0 et 120 jours, de préférence entre 0 et 30 jours, de préférence entre 0 et 1 jour après l’application de ladite au moins une contrainte physique.
Plus particulièrement, un dispositif selon l’invention est caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule après l’application de ladite au moins une contrainte comprend, ou consiste en, au moins une caractérisation ponctuelle ou au moins une caractérisation réalisée pendant une durée comprise entre 1 µs et 10000 s, de préférence 1 µs et 100 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence 10 µs et 100 ms.
Plus particulièrement, un dispositif selon l’invention est caractérisé en ce que le moyen de caractérisation de ladite au moins une cellule est choisi parmi : un cytomètre, un microscope, un moyen d’analyse du contenu protéique de la cellule, un moyen d’analyse et de séquençage des acides nucléiques de ladite cellule, et un moyen de capture d’image et/ou de signal électrique, combiné avec un moyen d’analyse de signal et notamment un moyen d’analyse. Par exemple, un dispositif selon l’invention peut comporter une microélectrode ou une photodiode.
Plus particulièrement, un dispositif selon l’invention est caractérisé en ce que ledit moyen d’analyse de signal et/ou d’image comprend, ou est constitué par, une unité centrale informatique comprenant un moyen logiciel adapté pour l’analyse de signal et/ou d’image.
Encore plus particulièrement, un dispositif selon l’invention comprenant un moyen d’analyse de signal et/ou d’image comprend en outre un premier et/ou un second modèle de classification. La présence d’au moins un premier et/ou un second modèle de classification présente l’avantage d’accélérer le processus d’analyse des images et de permettre une analyse en temps réel.
Par « modèle de classification » on entend un algorithme d’apprentissage automatique préalablement entraîné, en particulier lors d’un apprentissage supervisé, ainsi qu’un jeu de données d’apprentissage, permettant l’entraînement dudit algorithme, et un jeu de données d’évaluation. Un modèle de classification peut consister en un programme d’ordinateur, ledit programme d’ordinateur pouvant être écrit en tout langage informatique adapté, connu d’une personne du métier. Ledit programme d’ordinateur est susceptible d’être mis en œuvre sur un ordinateur pour générer un résultat technique. Des exemples de ces résultats techniques sont décrits ci-après.
Le jeu de données d’apprentissage peut comprendre un jeu d’entraînement et un jeu de test du modèle. Le modèle peut être ainsi testé sur la base de test et le jeu de test peut être utilisé pour déterminer si l’apprentissage du modèle est satisfaisant ou non. Le jeu d’entraînement et le jeu de test peuvent être différents. Alternativement, le jeu de test peut correspondre à une partie du jeu d’entraînement.
Encore plus particulièrement, un dispositif selon l’invention comprenant un moyen d’analyse d’image comprend en outre un premier modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage, et comprenant un algorithme d’apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé. Ledit premier modèle de classification est adapté pour la prédiction de l’état physiologique d’une cellule donnée à partir d’au moins une caractéristique de ladite cellule.
Dans le cas du premier modèle de classification, selon un mode de réalisation particulier, les données d’entrée sont des images avec objets. Les données de sortie sont des objets avec une étiquette : un pourcentage d’appartenance à une classe précise. L’algorithme d’entraînement comprend au moins 10 epochs, le calcul de perte est l’entropie croisée et l’optimiseur est Adam (descente de gradient améliorée). Le modèle est du transfert learning avec YOLO, la nature du réseau est un modèle supervisé (1733 images de cellules / 1733 annotations). Le modèle comprend de préférence 106 couches convolutives. Les fonctions réalisées dans un neurone sont : convolution, addition, softmax, « up sampling ». Des connexions neurones/couches sont réalisées. Le jeu de données d’apprentissage peut comprendre une multitude de couples de données, chacun des couples de données comprenant une première donnée représentant au moins une caractéristique de ladite cellule et une deuxième donnée représentant un état physiologique de ladite cellule.
Le jeu de données d’apprentissage peut être préalablement constitué à partir de données obtenues en laboratoire par analyse de caractéristiques de cellules dont l’état physiologique a été déterminé.
Ledit premier modèle de classification peut notamment être mis en œuvre sur un ordinateur pour générer un résultat technique consistant, par exemple en une classification d’une cellule en fonction de ses caractéristiques.
Ledit premier modèle de classification permet de générer un diagramme en trois dimensions, représentant, par exemple, pour une cellule donnée :
- l’intensité de la contrainte physique appliqué aux cellules, exprimé en Pa,
- la durée d’application de la contrainte physique appliqué aux cellules, ou temps de séjour, ou « temps », exprimé en s,
- l’état physiologique des cellules, c’est-à-dire la viabilité cellulaire, la nécrose, l’apoptose ou la lyse, exprimées en pourcentage, ou bien le caractère différencié ou non différencié.
- l’intensité de la contrainte physique appliqué aux cellules, exprimé en Pa,
- la durée d’application de la contrainte physique appliqué aux cellules, ou temps de séjour, ou « temps », exprimé en s,
- l’état physiologique des cellules, c’est-à-dire la viabilité cellulaire, la nécrose, l’apoptose ou la lyse, exprimées en pourcentage, ou bien le caractère différencié ou non différencié.
On estime que le premier modèle de classification a atteint un niveau d’apprentissage satisfaisant sur l’ensemble des profils du jeu de test si la classification atteint notamment un F1 score minimum de 70%.
Encore plus particulièrement, lorsqu’un dispositif selon l’invention comprend un moyen d’analyse d’image, le ledit moyen d’analyse d’image comprend en outre un deuxième modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage, et comprenant un algorithme d’apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé, ledit deuxième modèle de classification étant adapté pour la détection et le suivi de la déformation d’une cellule donnée, en réponse à au moins une contrainte physique.
Ledit premier modèle de classification peut notamment être mis en œuvre sur un ordinateur pour générer un résultat technique consistant, par exemple en un suivi de l’évolution morphologique d’une cellule selon différentes applications de contraintes physiques.
De préférence, ledit deuxième modèle de classification utilise au moins un réseau neuronal dont les fonctions sont les suivantes :
i) Localiser et isoler la cellule de ladite image
ii) Valider la présence d’une seule cellule
iii) Améliorer la qualité de l’image puis traiter l’image par application d’un masque sur la cellule et en déterminer son contour,
iv) positionner et mesurer l’axe majeur et mineur de l’ellipse décrivant le contour de la cellule. La déformation étant définie comme le rapport entre l’axe majeur et l’axe mineur.
i) Localiser et isoler la cellule de ladite image
ii) Valider la présence d’une seule cellule
iii) Améliorer la qualité de l’image puis traiter l’image par application d’un masque sur la cellule et en déterminer son contour,
iv) positionner et mesurer l’axe majeur et mineur de l’ellipse décrivant le contour de la cellule. La déformation étant définie comme le rapport entre l’axe majeur et l’axe mineur.
Selon un mode de réalisation particulier, le second modèle de classification comprend : données d’entrée 440 images de cellules découpées et ajustées en niveau de gris, données de sortie : masque binaire de segmentation. Les données d’entraînement comprennent 420 images d’entraînement. Pour l’algorithme d’entraînement au moins 10 epochs sont nécessaires, le calcul de perte est l’entropie croisée et l’optimiseur est Adam (descente de gradient améliorée). La nature du réseau est U-Net. Le nombre de couche est : 5 couches de contraction, 5 couches d’expansion, soit 10 au total. Les fonctions réalisées dans un neurone sont : convolution 2D entre image et filtre, c’est-à-dire compresser l’image, extraire le vecteur caractéristique qui contient l’objet d’intérêt et décompresser l’image. Les connections neurones/couches se caractérisent en ce que les couches sont composées de deux convolutions suivies toutes deux de fonctions d’activation (ReLU).
Un exemple de localisation et d’isolement d’une cellule est représenté en . Un exemple de positionnement et de mesure de l’axe majeur et de l’axe mineur de l’ellipse est représenté en .
On estime que ledit deuxième modèle de classification a atteint un niveau d’apprentissage satisfaisant sur l’ensemble des profils du jeu de test si la classification atteint notamment un F1 score minimum de 65%, de préférence au moins 80 %.
Selon un deuxième objet, l’invention concerne un procédé pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule après ladite application, le procédé comprenant les étapes suivantes :
a) le dépôt et la mise en circulation d’un fluide contenant ladite au moins une cellule en suspension dans un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d’un fluide contenant ladite cellule, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l’intérieur dudit canal, et
b) la caractérisation de ladite cellule après l’application de ladite au moins une contrainte,
a) le dépôt et la mise en circulation d’un fluide contenant ladite au moins une cellule en suspension dans un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d’un fluide contenant ladite cellule, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l’intérieur dudit canal, et
b) la caractérisation de ladite cellule après l’application de ladite au moins une contrainte,
un procédé selon l’invention est caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique choisie parmi :
- un impact mécanique,
- une contrainte hydrodynamique de compression,
- une contrainte hydrodynamique de cisaillement et
- une contrainte hydrodynamique d’extension.
- un impact mécanique,
- une contrainte hydrodynamique de compression,
- une contrainte hydrodynamique de cisaillement et
- une contrainte hydrodynamique d’extension.
Un procédé selon l’invention concerne particulièrement l’application d’une contrainte physique et la caractérisation d’au moins une cellule en suspension, ladite caractérisation concerne au moins un des aspects suivants : la taille, la forme, l’aspect de la membrane externe, l’aspect du cytoplasme, la présence d’au moins un marqueur à la surface de la cellule, le contenu protéique de la cellule et le contenu en acides nucléiques de la cellule.
Plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé selon l’invention comprenant l’application d’au moins une contrainte physique à au moins une cellule en suspension, ladite contrainte physique étant caractérisée en ce que la cellule est soumise à :
- au moins un impact mécanique d’intensité comprise entre 1 et 300 m/s de préférence entre 1 et 100 m/s, de préférence entre 1 et 10 m/s et/ou pendant une durée de moins de 1 µs et/ou
- au moins une contrainte de cisaillement d’intensité comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa, de préférence entre 1 kPa et 102kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10.000 s, de préférence entre 1 µs et 100 s, de préférence entre 10 µs et 1 s, et/ou
- au moins une contrainte de compression d’intensité comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa, de préférence entre 1 kPa et 102kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 10 ms et/ou
- au moins une contrainte d’extension d’intensité comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa, de préférence entre 1 kPa et 102kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 10 ms.
- au moins un impact mécanique d’intensité comprise entre 1 et 300 m/s de préférence entre 1 et 100 m/s, de préférence entre 1 et 10 m/s et/ou pendant une durée de moins de 1 µs et/ou
- au moins une contrainte de cisaillement d’intensité comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa, de préférence entre 1 kPa et 102kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10.000 s, de préférence entre 1 µs et 100 s, de préférence entre 10 µs et 1 s, et/ou
- au moins une contrainte de compression d’intensité comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa, de préférence entre 1 kPa et 102kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 10 ms et/ou
- au moins une contrainte d’extension d’intensité comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa, de préférence entre 1 kPa et 102kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 10 ms.
Plus particulièrement, dans un procédé selon l’invention, les paramètres i) de débit de fluide et ii) de la viscosité du fluide sont choisis afin de reproduire les intensités de contrainte et le temps de séjour reproduisant les contraintes qui sont ressenties par les cellules lors d’un bioprocédé particulier. Lors de la circulation du fluide dans le dispositif, une ligne de courant est générée. Lors de la circulation du fluide dans le dispositif, la cellule suit la ligne de courant développée par le mouvement du fluide et son interaction avec la géométrie du canal. En calculant ou mesurant la contrainte hydrodynamique sur cette ligne et la vitesse de mouvement de la cellule, on peut déduire la contrainte et le temps de séjour pour la cellule.
De préférence, dans un procédé selon l’invention, le débit de fluide est compris entre 10-3et 10 ml/min, de préférence entre 10-3et 1 ml/min. De préférence, dans un procédé selon l’invention, le temps de séjour des cellules est compris entre 1 µs et 10.000 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 100 ms.
Plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé selon l’invention comprenant l’application d’au moins une contrainte physique à au moins une cellule en suspension, puis la caractérisation de ladite cellule, le procédé comprenant en outre une étape de prédiction de l’état physiologique d’une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape b).
Plus particulièrement, l’invention a également pour objet un procédé selon l’invention comprenant l’application d’au moins une contrainte physique à au moins une cellule en suspension, puis la caractérisation de ladite cellule, le procédé comprenant en outre une étape de prédiction de l’état physiologique d’une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape b), ledit premier modèle de classification comprenant : un algorithme d’apprentissage automatique, un réseau neuronal à apprentissage supervisé, semi-supervisé ou non-supervisé, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage.
Plus particulièrement, l’invention a également pour objet un procédé selon l’invention comprenant en outre une étape de suivi de la déformation d’une cellule à différents instants de son séjour dans ledit canal microfluidique, par un deuxième modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape b).
Selon un troisième aspect, l’invention a également pour objet un modèle de classification, préalablement entraîné sur un jeu de données d’apprentissage pour prédire, dans un procédé selon l’invention, un état physiologique d’une cellule après l’application d’au moins une contrainte physique.
Selon un quatrième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d’un dispositif ou d’un procédé selon l’invention, ou d’un modèle de classification selon l’invention pour la caractérisation de cellules de type suivant : cellule procaryote, cellule eucaryote, cellule animale, cellule végétale, cellule humaine, cellule souche, cellule épithéliale, fibroblaste, cellule sanguine, cellule génétiquement modifiée ou mime cellulaire synthétique.
Plus particulièrement selon ce quatrième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d’un dispositif ou d’un procédé selon l’invention, ou d’un modèle de classification selon l’invention pour la détermination de la « capacitance » d’une cellule.
Encore plus particulièrement selon ce quatrième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d’un dispositif ou d’un procédé selon l’invention, ou d’un modèle de classification selon l’invention pour la définition d’au moins un paramètre d’un bioprocédé.
Encore plus particulièrement, l’invention a pour objet l’utilisation d’un dispositif ou d’un procédé selon l’invention, ou d’un modèle de classification selon l’invention pour la définition d’au moins un paramètre d’un bioprocédé choisi parmi : la bioimpression, la thérapie cellulaire et la bioproduction.
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants, qui sont donnés pour illustrer l’invention et non pour en limiter la portée. On pourra notamment imaginer des variantes de l’invention ne comprenant qu’une sélection des caractéristiques décrites par la suite, isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l’invention par rapport à de l’état de la technique antérieur.
La est une représentation schématique d’exemples de segments (A), (B), (C) et (D).
La est une représentation schématique d’un exemple de dispositif dans lequel plusieurs types de contraintes physiques sont appliquées aux cellules, ici un enchainement de contraintes de cisaillement et d’élongation. Le graphe du bas représente un grossissement du graphe du haut. La cellule subit une contrainte répétée. Ce type de contrainte peut également être défini comme une déformation dynamique, ou une déformation oscillatoire.
La représente les étapes d’isolement d’une cellule.
La représente la mesure de l’axe mineur et de l’axe majeur de l’ellipse.
La , dans l’exemple 2, représente l’état de viabilité de cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC après application de contraintes de cisaillement d’intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules dans un état physiologique particulier est donné en fonction de la durée d’application (temps) exprimée en secondes et de l’intensité (contrainte) exprimée en Pa, de la contrainte de cisaillement. La représente ainsi le pourcentage de cellules viables (cadre A), cellules lysées (cadre B), cellules nécrosées (cadre C) et cellules en apoptose (cadre D).
La , dans l’exemple 3, représente l’état de viabilité de cellules fibroblastes après application d’une contrainte de cisaillement. Les fibroblastes sont caractérisés après l’application de contraintes de cisaillement d’intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules dans un état physiologique particulier est donné en fonction de la durée d’application (temps), exprimée en secondes, et de l’intensité (contrainte), exprimée en Pa, de la contrainte de cisaillement. La représente ainsi le pourcentage de cellules viables (cadre A), lysées (cadre B), nécrosées (cadre C) ou en apoptose (cadre D).
La , dans l’exemple 4, représente la proportion de cellules souches AD-MSC non–différentiées (cercle blanc) et de cellules différenciées (cercle noir) après application d’une contrainte de cisaillement, en fonction de la durée d’application (temps), exprimée en secondes, et de l’intensité (contrainte), exprimée en Pa de la contrainte de cisaillement.
La , dans l’exemple 5, représente l’état de viabilité de cellules HEK293T après application d’une contrainte d’élongation. Les cellules HEK293T sont caractérisés après l’application de contraintes d’élongation d’intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules dans un état physiologique particulier est donné en fonction de la durée d’application (temps), exprimée en secondes, et de l’intensité (contrainte), exprimée en Pa, de la contrainte d’élongation. La représente ainsi le pourcentage de cellules en apoptose (cadre A), viables (cadre B), nécrosées (cadre C) ou lysées (cadre D).
La , dans l’exemple 6, représente l’état de viabilité de cellules fibroblastes après application d’une contrainte de cisaillement, la viabilité étant mesurée par cytométrie (barres d’histogramme) ou par coloration au bleu trypan (cercles noirs).
La , dans l’exemple 7, représente l’état de viabilité de cellules HEK293T après application de contraintes de cisaillement d’intensité et de durée variables. Le pourcentage de cellules viables, mesuré par coloration au bleu trypan, est donné en fonction de la durée d’application (temps) exprimée en secondes, et de l’intensité (contrainte), exprimée en Pa, de la contrainte de cisaillement. Le pourcentage de cellules viables est exprimé après un petit nombre de passages (HEK293T P07, triangles blancs) ou après un nombre plus élevé de passages (HEK293T P18, cercles noirs).
La , dans l’exemple 8, représente l’état de viabilité de cellules fibroblastes après application de contraintes de cisaillement d’intensité et de durée variables, selon deux séries de mesures réalisées sur le même échantillon de cellules (P06), représentées respectivement par des triangles blancs et des cercles noirs.
Exemple 1 : Matériels et méthodes pour la caractérisation de cellules après l’application d’une contrainte physique
Les cellules AD-MSCs sont cultivées dans le milieu de culture commercialisé sous le nom MSC-Growth, avec une concentration d’ensemencement de l’ordre de 2500 cellules par cm2. Le milieu a été changé tous les deux jours. Afin d’avoir une confluence de 70%, les cellules ont passé sept jours d’incubation dans une flasque de T175.
Les cellules fibroblastes sont cultivées dans le milieu de culture commercialisé sous le nom DMEM GLUTAMAX - Gibco, avec une concentration d’ensemencement de l’ordre de 5500 cellules par cm2. Afin d’avoir une confluence de 80%, les cellules ont passé sept jours d’incubation dans une flasque de T175.
Les cellules HEK293T sont cultivées dans le milieu de culture commercialisé sous le nom DMEM GLUTAMAX - Gibco avec une concentration d’ensemencement de l’ordre de 12000 cellules par cm2. Afin d’avoir une confluence de 80%, les cellules ont passé quatre jours d’incubation dans une flasque de T175.
Pendant la durée d’incubation, la température est maintenue à 37 °C et la concentration de CO2de l’ordre de 5%.
Pour décrocher les cellules de la surface de flasque, d’abord le milieu de culture a été enlevé. Les cellules accrochées à la flasque sont rincées avec 15 ml de PBS. Ensuite, 5 ml de Trypsine-EDTA 0.5 % ont été ajoutés dans la flasque. La durée d’application de trypsine était deux minutes à 37°C, puis 10ml de milieu de culture contenant le sérum de veau fœtal ont été ajoutés dans la flasque, afin de stopper la réaction. La suspension a été placée dans un tube et centrifugée à 1200 rpm/210 g pendant 5 minutes. Le liquide a été enlevé et les cellules ont été suspendues dans une solution de PBS et Ficoll à une concentration d’un million par ml.
Le dispositif microfluidique pour la contrainte cisaillement consiste en un canal microfluidique en PDMS de diamètre 50 micromètre et de longueur de 10 cm. Les cellules ont été mises en suspension dans un fluide (une solution de PBS et Ficoll) dont la viscosité était 1,91 mPa.s.
Le dispositif microfluidique pour la contrainte élongationnelle consiste en un canal microfluidique principal de diamètre 162 micromètres et de longueur de 1 cm. La section du canal d’abord diminue de 162 à 30 micromètres et puis augmente de 30 à 162 micromètres. Ce changement de section se fait sur une distance de 360 micromètres. La viscosité de fluide suspendant (une solution de PBS et Ficoll avec une concertation volumique de 60% de Ficoll) est de 1,91 mPa.s.
La suspension des cellules et le fluide sans cellules sont injectés dans le dispositif grâce aux pompe seringues et les tuyaux PEEK de diamètre 3 mm.
Les cellules sont injectées dans le dispositif avec un débit compris entre 25 et 800 microlitres par minute. Les mesures et la récolte des cellules sont effectuées après que la stabilité hydrodynamique au sein de système a été atteinte.
Après passage dans la zone de la contrainte, les cellules ont été récoltées. La suspension des cellules récoltées est centrifugée afin d’enlever le fluide suspendant (la solution de Ficoll et PBS) pour la remplacer par le tampon de marquage.
Pour le test de viabilité, les cellules sont marquées avec l’annexine V, marqueur de cellules apoptotiques ou l’iodure de propidium, marqueur de cellules nécrotiques. Pour cela, Une population de 100000 cellules correspondantes à chaque débit d’injection a été suspendue dans 100 microlitres de tampon de marquage. Ensuite 2 microlitres de marqueur annexine V et 2 microlitres d’iodure de propidium ont été rajoutés dans le tampon. La suspension des cellules avec les marqueurs de viabilité a été incubée pendant 15 minutes dans un endroit sombre. Puis, les cellules ont été centrifugées et rincées par le tampon de marquage.
Pour le test de la caractère souche et l’état de différenciation des cellules souche AD-MSC, les cellules sont marquées grâce au kit «BD Human Mesenchymal Stem Cell Analysis Kit (BDB562245) ». Le kit contient les marqueurs hMSC positive : CD90, CD105, CD73 et CD 44 et les marqueurs hMSC négatives :CD34, CD11b, CD19, CD45 et HLA-DR. Pour la procédure de marquage, 100000 cellules sont suspendues dans 100 microlitres du tampon « BD Stain Buffer (FBS) », ensuite 5 microlitres de chaque marqueur positif et 20 microlitres de chaque marqueur négatif ont été rajouté dans le tampon. La suspension des cellules avec les marqueurs a été incubée pendant 15 minutes dans un endroit sombre. Puis, les cellules ont été centrifugées et rincées par le tampon de marquage.
Les cellules sont étudiées par cytométrie (FACS Canto II) et caractérisées selon leur état : cellule viable, lyse, nécrose, apoptose ou caractère souche. Chaque point de mesure correspond à une analyse d’au minimum 50.000 cellules.
A partir des résultats obtenus, un modèle mathématique de prédiction de l’état physiologique des cellules en fonction de l’intensité et de la durée de la contrainte est établi. Le modèle est une expression mathématique qui fait une relation entre les paramètres par exemple une expression polynomiale, une loi de puissance, une somme de sinus ou les autres expressions mathématique 2D ou 3D. Par exemple, nous pouvons utiliser une loi de puissance sous la forma qui établit une relation entre et . Dans ce modèle est une constante de proportionnalité, est l’exposant et est le terme d’erreur. En utilisant cette méthode, nous modélisons l’état physiologique des cellules avant ou/et après passage dans la zone de contrainte en fonction de l’intensité de la contrainte et du temps de séjour sous contrainte. Pour cela, le modèle est établi comme suit : Etat physiologique = A x ContrainteB+ C ; Temps de séjour = D/Contrainte. Les paramètres A, B, C et D diffèrent pour chaque type cellulaire, type de contrainte et le nombre de passage.
Exemple 2 : Caractérisation de l’état de viabilité de cellules souches AD-MSCs après l’application d’une contrainte de cisaillement
Des cellules souches AD-MDCs ont été cultivées puis soumises à une contrainte de cisaillement dont l’intensité et la durée sont variables. Après application de ces contraintes, l’état de viabilité des cellules est caractérisé en fonction de l’intensité de la contrainte de cisaillement et du temps de séjour des cellules sous contrainte. La caractérisation de l’état physiologique (viable, lyse, nécrose ou apoptose) des cellules a été effectuée comme décrit dans l’exemple 1.
Le modèle mathématique défini dans ce cas est le suivant :
Etat = A x ContrainteB+ C ; Temps = D / Contrainte.
Etat = A x ContrainteB+ C ; Temps = D / Contrainte.
Les valeurs A, B, C et D telles que définies pour chacun des états physiologiques possible sont les suivantes :
Les résultats obtenus sont présentés dans la . Ces résultats montrent que les cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC sont sensibles à l’intensité de la contrainte de cisaillement et au temps de séjour sous la contrainte. Nous observons que les cellules AD-MSC ont une capacitance mécanique face à la contrainte d’environ 1000 Pa avec un temps de séjour d’environ 0,25 s. Au-delà de ces valeurs, les cellules souches AD-MSC ne supportent plus la contrainte et subissent une mortalité. La voie de mortalité par lyse ou par nécrose est la plus présente, en revanche le niveau d’apoptose est négligeable dans cette gamme de contrainte et temps de séjours.
Exemple 3 : Etat physiologique de fibroblastes après l’application d’une contrainte de cisaillement
Des cellules fibroblastes ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à des contrainte de cisaillement d’intensité et de durée variables. Après application de ces contraintes, le caractère de viabilité ou de lyse, nécrose ou apoptose des cellules a été déterminé comme décrit dans l’exemple 1.
Le modèle mathématique défini dans ce cas est le suivant :
Etat = A x ContrainteB+ C ; Temps = D / Contrainte
Etat = A x ContrainteB+ C ; Temps = D / Contrainte
Les valeurs A, B, C et D telles que définies pour chacun des états physiologiques possibles sont les suivantes :
Les résultats obtenus sont présentés dans la . Ces résultats montrent que les cellules fibroblastes sont fortement sensibles à la contrainte de cisaillement et au temps de séjour sous la contrainte. Nous pouvons constater que les cellules fibroblastes jusqu’à 900 Pa et pendant 0,04 s, sont capable de supporter la contrainte de cisaillement sans être endommagées, c’est-à-dire sans présenter de caractère de lyse, apoptose ou nécrose. Ces valeurs sont la capacitance mécanique des cellules fibroblastes face à la contrainte de cisaillement. En revanche, au-delà de cette capacitance mécanique, la réponse physiologique, c’est-à-dire la perte de viabilité, des fibroblastes est considérable. En effet, les fibroblastes ne résistent pas à la contrainte et le niveau de viabilité de 85% à 900 Pa chute soudainement à 30% à 1000 Pa et atteint un niveau de moins de 5% de viabilité à 2000 Pa. La mortalité des cellules fibroblastes est causée plutôt par la voie de lyse et les autres états physiologiques sont négligeables.
Exemple 4 : Etat de différentiation de cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC après l’application d’une contrainte de cisaillement
Des cellules souches AD-MSC ont été cultivées comme indiqué dans l’exemple 1. En prérequis, les cellules souches AD-MSC ont été caractérisées par la cytométrie pour confirmer leurs caractères souches avant l’application d’une contrainte de cisaillement d’intensité et de durée variables. Après passage dans la zone de contrainte, les cellules sont récoltées et resuspendues dans un milieu de culture DMEM (+). L’état de différenciation a été caractérisé après leur remise en culture. L’ensemencement a été réalisé à 80% de la confluence. Après trois semaines d’incubation, les cellules ont été récoltées, marquées grâce au kit «BD Human Mesenchymal Stem Cell Analysis Kit (BDB562245) » et analysées en cytométrie en flux (FACS Canto II). Chaque point de mesure correspond à minimum 30.000 cellules. La caractérisation a été faite par la cytométrie en flux qui permet ici d’identifier l’état des cellules après application de la contrainte dans une façon binaire : différenciées ou non-différenciées. La procédure de la caractérisation par la cytomètre a été effectuée comme indiqué dans l’exemple 1.
Le modèle mathématique défini dans ce cas est le suivant : Etat non-différencié : Temps = D / Contrainte où D = 30,6 dans la gamme de 0,147 s < temps < 0.39 s et 78 < contrainte < 2082 Pa
Les résultats obtenus sont présentés dans la . Ces résultats montrent l’absence de cellules différenciées. Ceci indique que les cellules souches mésenchymateuses humaines AD-MSC maintiennent leurs caractère souche après avoir subi une contrainte cisaillement dans la gamme représentée dans la figure. L’état physiologique des cellules AD-MSC, ici le maintien du caractère souche, n’a donc pas été affecté par la contrainte et le temps de séjour dans la gamme 0-2100 Pa et 0,015-0,4 s.
Exemple 5 : Etat de viabilité de cellules HEK293T après l’application d’une contrainte d’élongation
Des cellules HEK293T ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à des contraintes d’élongation d’intensité et de durée variables. Après application de ces contraintes, le caractère de viabilité ou de lyse, nécrose ou apoptose des cellules a été déterminé comme décrit dans l’exemple 1.
Les résultats obtenus sont présentés dans la . Ces résultats montrent que les cellules HEK293T ont un taux de survie élevé face à la contrainte élongationnelle dans la gamme de contrainte entre 10 et 110 Pa et le temps de séjour entre 0,1 ms et 0,8 ms. Les états de lyse, nécrose et apoptose sont négligeables par rapport à l’état viable.
Exemple 6 : Etat de viabilité de cellules fibroblastes après l’application d’une contrainte de cisaillement, tel que mesuré par deux protocoles
Des cellules fibroblastes ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à des contraintes de cisaillement d’intensité et de durée variables. Après application de ces contraintes, le caractère de viabilité des cellules a été déterminé par deux protocoles différents : analyse par cytométrie et numération au bleu trypan. La viabilité est illustrée en fonction de l’intensité de la contrainte de cisaillement. Le temps de séjour sous la contrainte correspond à l’équation suivante :
temps (s) = 30,6 / intensité de la contrainte de cisaillement (Pa)
temps (s) = 30,6 / intensité de la contrainte de cisaillement (Pa)
Les cellules ont été récoltées après le passage dans la zone de contrainte. Ensuite elles ont été divisées en deux lots afin d’être analysé par la cytométrie et par le Bleu Trypan. Pour l’analyse par cytométrie, le lot a été marqué par les marqueurs Annexine V et iodure de propidium. Par la suite, les cellules marquées ont été analysées par la cytomètre. Chaque point de mesure correspond à minimum 50.000 cellules. Pour l’analyse par le bleu Trypan, le lot de cellules a été mélangé avec Bleu Trypan. Trois comptages sur la totalité de la surface de la lame Malassez ont été effectués. La barre d’erreur correspond à ces trois comptages.
Exemple 7 : Etat de viabilité de cellules HEK293T après l’application d’une contrainte de cisaillement
Des cellules HEK293T ont été cultivées puis des échantillons de cellules ont été soumis à une contrainte de cisaillement d’intensité et de durée variables, comme décrit dans l’exemple 1. Les cellules HEK293T ont été récoltées après le passage dans la zone de contrainte, ensuite ont été mélangée avec Bleu Trypan. Trois comptages sur la totalité de la surface de la lame Malassez ont été effectués. La valeur correspond à la moyenne de ces trois comptages.
Les résultats obtenus sont présentés dans la . Ces résultats montrent que le nombre de passage des cellules dans la culture cellulaire clairement affecte la capacitance mécanique des cellules HEK293T. Ces cellules avec un passage P07 (7 passages) résistent parfaitement à la contrainte avec un taux de viabilité 100% pour les contraintes inférieures à 200 Pa. Mais au-delà de cette capacitance mécanique, les mêmes cellules HEK293T passage P07 rencontrent une chute de viabilité. Cependant, la même lignée cellulaire mais avec un passage P18 (18 passages) perd cette capacitance mécanique et ne résiste pas à la moindre contrainte.
Exemple 8 : Démonstration de la reproductibilité des mesures
La caractérisation de l’état physiologique des cellules fibroblastes après application d’une contrainte de cisaillement ont été effectuées en duplicat. Les deux mesures ont été faites sur le même échantillon de la cellule (P06). La reproductibilité de l’expérience a une erreur moyenne de 3,45% de viabilité. Les analyses réalisées par le système sont donc reproductibles.
Claims (27)
- Dispositif pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule, pendant et/ou après l’application de ladite contrainte, le dispositif comprenant :
- un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d’un fluide contenant ladite cellule en suspension, ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l’intérieur dudit canal, et
- un moyen de caractérisation de ladite cellule,
caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique choisie parmi : un impact mécanique, une contrainte hydrodynamique de compression, une contrainte hydrodynamique de cisaillement et une contrainte hydrodynamique d’extension. - Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel la caractérisation de ladite cellule a pour objet au moins un critère choisi parmi : la taille, la forme, l’aspect de la membrane externe, l’aspect du cytoplasme, la présence d’au moins un marqueur à la surface de la cellule, le contenu protéique de la cellule et le contenu en acides nucléiques de la cellule.
- Dispositif selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit au moins un segment A, configuré pour l’application à ladite cellule d’une contrainte de compression, comprend, ou est constitué par, un premier canal rejoint, au même niveau, par deux canaux, chacun faisant un angle compris entre 30 et 150 degrés avec ledit premier canal.
- Dispositif selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit au moins un segment B, configuré pour l’application à ladite cellule d’une contrainte de cisaillement, comprend, ou est constitué par, un canal de diamètre compris entre 10 et 2000 µm, de préférence entre 20 et 200 µm.
- Dispositif selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit au moins un segment C, configuré pour l’application à ladite cellule d’une contrainte d’extension, comprend, ou est constitué par, i) un canal de section croissante ou décroissante ou ii) un premier canal rejoint par un second canal dans lequel la circulation du fluide s’effectue dans un sens différent, de préférence opposé, à celui du premier canal.
- Dispositif selon l’une des revendications précédente, caractérisé en ce que ledit au moins un segment D, configuré pour l’application à ladite cellule d’un impact mécanique, comprend, ou est constitué par, un premier canal au sein duquel la ligne de trajet des cellules rencontre un obstacle, tel que notamment la paroi d’un second canal.
- Dispositif selon l’une quelconque des revendications 3 à 6 précédentes, caractérisé en ce que ledit circuit comprend : au moins un segment A et/ou au moins un segment B et/ou au moins un segment C et/ou au moins un segment D, combinés entre eux.
- Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit circuit est configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes physiques successives de nature différente.
- Dispositif selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit circuit est configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une séquence comprenant, ou consistant en, au moins deux contraintes physiques successives de même nature.
- Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’intensité d’au moins une contrainte physique appliquée à la cellule est comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 et 103kPa, de préférence entre 1 et 102kPa et/ou en ce que la durée totale de l’application de ladite au moins une contrainte physique est comprise entre 1 µs et 10000 s, de préférence entre 1 µs et 100 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence 10 µs et 100 ms.
- Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule après l’application de ladite au moins une contrainte est réalisée pendant une période comprise entre 0 et 120 jours, de préférence entre 0 et 30 jours, de préférence entre 0 et 1 jour après l’application de ladite au moins une contrainte physique.
- Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après l’application de ladite au moins une contrainte comprend, ou consiste en, au moins une caractérisation ponctuelle ou au moins une caractérisation réalisée pendant une durée comprise entre 1 µs et 10000 s, de préférence 1 µs et 100 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence 10 µs et 100 ms.
- Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit moyen de caractérisation de ladite au moins une cellule est choisi parmi : un cytomètre, un microscope, un moyen d’analyse du contenu protéique de la cellule, un moyen d’analyse et de séquençage des acides nucléiques de ladite cellule, et un moyen de capture d’image combiné avec un moyen d’analyse d’image.
- Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit moyen d’analyse d’image comprend ou est constitué par : une unité centrale informatique comprenant un moyen logiciel adapté pour l’analyse d’image.
- Dispositif selon l’une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que ledit moyen d’analyse d’image comprend en outre un premier modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage, et comprenant un algorithme d’apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé, ledit premier modèle de classification étant adapté pour la prédiction de l’état physiologique d’une cellule donnée à partir de caractéristiques de ladite cellule.
- Dispositif selon l’une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que ledit moyen d’analyse d’image comprend en outre un deuxième modèle de classification, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage, et comprenant un algorithme d’apprentissage automatique supervisé, non-supervisé ou semi-supervisé, ledit deuxième modèle de classification étant adapté pour la détection et le suivi de la déformation d’une cellule donnée en réponse à au moins une contrainte physique.
- Procédé pour l’application d’au moins une contrainte physique d’intensité et de durée déterminées à au moins une cellule en suspension, et pour la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après ladite application, le procédé comprenant les étapes suivantes :
a) le dépôt et la mise en circulation d’un fluide contenant ladite au moins une cellule en suspension dans un circuit microfluidique comprenant au moins un segment, ledit segment comprenant au moins : i) un canal principal configuré pour la circulation d’un fluide contenant ladite cellule , ii) une entrée de fluide et une sortie de fluide, iii) un moyen pour introduire et établir un flux dudit fluide à l’intérieur dudit canal, et
b) la caractérisation de ladite cellule pendant et/ou après l’application de ladite au moins une contrainte,
caractérisé en ce que ledit au moins un segment est configuré pour l’application à ladite cellule d’au moins une contrainte physique choisie parmi : un impact mécanique et/ou une contrainte hydrodynamique de compression et/ou une contrainte hydrodynamique de cisaillement et/ou une contrainte hydrodynamique d’extension. - Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la caractérisation de ladite cellule a pour objet au moins un critère choisi parmi : la taille, la forme, l’aspect de la membrane externe, l’aspect du cytoplasme et la présence d’au moins un marqueur de surface.
- Procédé selon l’une des revendications 17 ou 18, dans lequel la cellule est soumise à :
- au moins un impact mécanique d’intensité comprise entre 1 et 300 m/s et/ou pendant une durée de moins de 1 µs et/ou
- au moins une contrainte de cisaillement d’intensité comprise entre 10-3kPa et 105kPa, de préférence entre 10-3kPa et 104kPa, de préférence entre 0,1 kPa et 103kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10.000 s, de préférence entre 1 µs et 100 s, de préférence entre 10 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 10 ms, et/ou
- au moins une contrainte de compression d’intensité comprise entre 10-3kPa et 103kPa, de préférence entre 10-3kPa et 102kPa, de préférence entre 10-3kPa et 10 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 10 ms et/ou
- au moins une contrainte d’extension d’intensité comprise entre 10-3kPa et 103kPa, de préférence entre 10-3kPa et 102kPa, de préférence entre 10-3et 10 kPa et/ou pendant une durée comprise entre 1 µs et 10 s, de préférence entre 1 µs et 1 s, de préférence entre 10 µs et 10 ms. - Procédé selon l’une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape de prédiction de l’état physiologique d’une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape b).
- Procédé selon l’une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape de prédiction de l’état physiologique d’une cellule par un premier modèle de classification préalablement entraîné, caractérisé en ce que ledit premier modèle de classification comprend : un algorithme d’apprentissage automatique, un réseau neuronal à apprentissage supervisé ou un algorithme de classification probabiliste multi-classes, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage.
- Procédé selon l’une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape de suivi de la déformabilité d’une cellule à différents instants de son séjour dans ledit canal microfluidique, par un deuxième modèle de classification préalablement entraîné, à partir des caractéristiques déterminées lors de l’étape b).
- Modèle de classification, propre à être mis en œuvre par un ordinateur, préalablement entraîné sur un jeu de données d’apprentissage pour prédire, dans un procédé selon l’une quelconque des revendications 17 à 22, un état physiologique d’une cellule pendant et/ou après l’application d’au moins une contrainte physique.
- Utilisation d’un dispositif selon l’une des revendications 1 à 16, ou d’un procédé selon l’une des revendications 17 à 22 ou d’un modèle de classification selon la revendication 23 pour la caractérisation de cellules de type suivant : cellule procaryote, cellule eucaryote, cellule animale, cellule végétale, cellule humaine, cellule souche, cellule épithéliale, fibroblaste, cellule sanguine, cellule génétiquement modifiée ou mime cellulaire synthétique.
- Utilisation d’un dispositif selon l’une des revendications 1 à 16, d’un procédé selon l’une des revendications 17 à 22 ou d’un modèle de classification selon la revendication 23, pour la détermination de la capacitance d’une cellule.
- Utilisation d’un dispositif selon l’une des revendications 1 à 16, d’un procédé selon l’une des revendications 17 à 22 ou d’un modèle de classification selon la revendication 23 pour la définition d’au moins un paramètre d’un bioprocédé.
- Utilisation selon la revendication 26, caractérisée en ce que ledit bioprocédé est choisi parmi : la bioimpression, la thérapie cellulaire et la bioproduction.
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Non-Patent Citations (1)
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| KIM ET AL: "Microfluidic biomechanical device for compressive cell stimulation and lysis", SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL, ELSEVIER BV, NL, vol. 128, no. 1, 7 November 2007 (2007-11-07), pages 108 - 116, XP022335650, ISSN: 0925-4005, DOI: 10.1016/J.SNB.2007.05.050 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024062094A1 (fr) | 2024-03-28 |
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