FR3123570A3 - Composition et matériau d'échafaudage pour régénérer des cartilages - Google Patents
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Abstract
Il est mis à disposition une composition pour produire un matériau d'échafaudage adapté à la régénération de cartilage, le matériau comprenant :• une cellulose nanocristalline fonctionnalisée comprenant une pluralité de premiers fragments réactifs,• des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée comprenant une pluralité de deuxièmes fragments réactifs adaptés pour réagir avec les premiers fragments réactifs. Référence : Figure 4.
Description
La présente invention concerne le domaine de l'ingénierie tissulaire et divulgue des compositions, matériaux et procédés qui peuvent être adaptés à la régénération de cartilages.
Du fait de la fréquence des lésions des cartilages et des ménisques, l'importance de l'ingénierie tissulaire (TE) dans leur traitement augmente de manière significative. Comme les capacités d'auto–régénération du cartilage sont plutôt limitées, des lésions conduisent souvent à des changements dégénératifs. Dans de nombreux cas, une méniscectomie totale ou partielle est la seule option de traitement disponible, et présente un mauvais pronostic sur le long terme avec un fort risque de dégénérescence du cartilage. Par conséquent, la nécessité de procédés de traitement innovants est urgente.
L'impression 3D est une technique avantageuse pour cet objectif puisqu'elle permet la réplication de la forme globale d'un ménisque pour la génération d'échafaudages spécifiques du patient et le contrôle fin de l'architecture fibreuse interne.
Toutefois, les échafaudages actuels obtenus par impression 3D produisent habituellement des tissus régénérés de mauvaise qualité et ont des dimensions médiocrement définies. On a donc besoin d'améliorer la situation actuelle.
La présente divulgation concerne une composition pour produire un matériau d'échafaudage adapté à la régénération de cartilages, la composition contenant :
• une cellulose nanocristalline fonctionnalisée comprenant une pluralité de premiers fragments réactifs,
• des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée comprenant une pluralité de deuxièmes fragments réactifs adaptés pour réagir avec les premiers fragments réactifs.
• une cellulose nanocristalline fonctionnalisée comprenant une pluralité de premiers fragments réactifs,
• des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée comprenant une pluralité de deuxièmes fragments réactifs adaptés pour réagir avec les premiers fragments réactifs.
Une telle composition présente une performance supérieure en tant que bio–encre pour impression 3D. En particulier, elle permet l'obtention de propriétés rhéologiques (c'est–à–dire des caractéristiques d'écoulement) présentant une fluidification par cisaillement et des comportements thixotropiques, permettant l'obtention de formes imprimées avec un contrôle dimensionnel élevé. En outre, la cellulose nanocristalline fonctionnalisée renforce les chaînes peptidiques de gélatine en servant à la fois de nanocharge et d'agent de réticulation covalent. En outre, une telle forme imprimée peut être aisément réticulée en un échafaudage ayant une porosité élevée et un degré élevé d'interconnectivité des pores, pouvant permettre un niveau élevé de régénération des cartilages.
De préférence, les premiers fragments réactifs et les deuxièmes fragments réactifs sont adaptés pour réagir au moyen d'une réaction photo–clic. Une telle réaction photo–clic permet une vitesse de réaction très élevée, par exemple inférieure à 180 secondes. Une telle réaction photo–clic rapide peut avoir pour résultat des vitesses de traçage (c'est–à–dire une vitesse de déplacement de la buse du bio–traceur 3D) plus élevée, allant par exemple jusqu'à 1000 mm/s avec une excellente fidélité des formes et une viabilité cellulaire élevée inhabituelle, par exemple supérieure à 85 %.
Avantageusement, le premier fragment réactif est un nucléophile, par exemple choisi parmi une amine, un carbanion stabilisé, une thiolactone et de préférence un thiol. Un tel nucléophile peut être stable avant réticulation et peut conduire à une réaction de réticulation efficace.
Avantageusement, la cellulose nanocristalline fonctionnalisée comprend une pluralité de lieurs portant les premiers fragments réactifs et choisis parmi un acide aminé, un peptide, une cystéamine, le 3–amino–1,2,4–triazole–5–thiol et le 6–amino–1–hexanethiol ; on préfère une cystéamine. Ces lieurs sont aisément disponibles et forment une liaison efficace au premier fragment réactif. Ils peuvent être aisément couplés à la cellulose nanocristalline par une extrémité des chaînes de cellulose, peuvent contribuer aux propriétés de gélification de la composition, et présentent une bonne biocompatibilité.
Avantageusement, le lieur est un acide aminé et de préférence une cystéine, par exemple une L–cystéine. Un tel lieur présente une bonne biocompatibilité et contribue aux propriétés de gélification de la composition.
Avantageusement, la cellulose nanocristalline fonctionnalisée est sous la forme de cristaux comprenant des faces, et les premiers fragments réactifs sont situés sur une seule face de chacun des cristaux. Ces cristaux assurent des propriétés rhéologiques supérieures et peuvent contribuer à la porosité de l'échafaudage après réticulation. En variante ou en combinaison, la cellulose nanocristalline peut être oxydée afin que soit obtenu un grand nombre de premiers fragments réactifs, de préférence de fragments aldéhyde.
Avantageusement, chacun des deuxièmes fragments réactifs des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée comprend une double liaison ou une triple liaison, par exemple une double liaison carbone–carbone ou une triple liaison carbone–carbone, de préférence activée. Ces deuxièmes fragments réactifs permettent une réaction clic ou photo–clic efficace avec les premiers fragments réactifs.
Avantageusement, les deuxièmes fragments réactifs des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée sont choisis parmi un norbornène, un dérivé de norbornène, un acrylate, un méthacrylate, un aldéhyde ou une cétone à insaturation α,β, un ester de vinyle, une vinylsulfone, un imidazole et un maléimide. De préférence, les deuxièmes fragments réactifs sont ou consistent essentiellement en un norbornène.
Avantageusement, le pourcentage en poids des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée, par rapport à la composition, est d'au plus 10 %, de préférence d'au plus 5 %.
Avantageusement, le pourcentage en poids de la cellulose fonctionnalisée, par rapport à la composition, est de 0,1 à 15 %, de préférence de 0,5 à 10 % et mieux encore de 1 à 5 %.
Un autre aspect de la présente divulgation est un matériau d'échafaudage adapté à la régénération de cartilages, le matériau comprenant :
• des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée
• de la cellulose nanocristalline fonctionnalisée
• une pluralité de ponts réticulant la cellulose nanocristalline fonctionnalisée et la chaîne peptidique de gélatine fonctionnalisée.
• des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée
• de la cellulose nanocristalline fonctionnalisée
• une pluralité de ponts réticulant la cellulose nanocristalline fonctionnalisée et la chaîne peptidique de gélatine fonctionnalisée.
Avantageusement, chaque pont comprend au moins un atome de soufre et/ou au moins un acide aminé, par exemple au moins une cystéine. De préférence, les ponts sont obtenus par une réaction clic ou photo–clic.
Un tel matériau d'échafaudage pour cartilage peut permettre une porosité élevée avec un réseau de pores interconnectés qui assure une croissance cellulaire et un transport de nutriments optimaux. De plus, une telle porosité élevée peut être obtenue par utilisation d'une faible concentration de composition d'hydrogel tout en maintenant de bonnes dimensions d'une forme imprimée.
Par exemple, les ponts résultent du couplage des premiers fragments réactifs, éventuellement connectés aux chaînes de cellulose par un lieur, avec les deuxièmes fragments réactifs, comme décrit ci–dessus. De préférence, l'échafaudage ci–dessus peut être obtenu à partir de la composition ci–dessus.
Avantageusement, la cellulose nanocristalline fonctionnalisée est sous la forme de cristaux comprenant des faces, et les ponts sont connectés à une seule face de chacun des cristaux.
Un autre aspect de la présente divulgation est un procédé pour former un échafaudage adapté à la régénération de cartilage, le procédé comprenant :
• l'obtention d'une composition telle que décrite ci–dessus,
• la formation d'une forme d'échafaudage,
• la réticulation de la forme d'échafaudage formée en un échafaudage.
• l'obtention d'une composition telle que décrite ci–dessus,
• la formation d'une forme d'échafaudage,
• la réticulation de la forme d'échafaudage formée en un échafaudage.
Avantageusement, l'étape de formation d'une forme d'échafaudage est effectuée par impression 3D et l'étape de réticulation est effectuée par une réaction clic ou photo–clic, permettant une production rapide et efficace de l'échafaudage.
Un autre aspect de la présente divulgation est un procédé pour former un échafaudage adapté à la régénération de cartilage, le procédé comprenant :
• l'obtention d'une composition telle que décrite ci–dessus,
• la réticulation de la composition en un matériau d'échafaudage,
• la formation d'un échafaudage à partir du matériau d'échafaudage.
• l'obtention d'une composition telle que décrite ci–dessus,
• la réticulation de la composition en un matériau d'échafaudage,
• la formation d'un échafaudage à partir du matériau d'échafaudage.
Par exemple, l'étape de formation de l'échafaudage pourrait être effectuée par découpage, moulage ou extrusion du matériau d'échafaudage.
Un autre aspect de la présente divulgation est un procédé pour régénérer le cartilage, comprenant la formation d'un échafaudage comme décrit ci–dessus et l'implantation de cet échafaudage dans un corps, tel qu'un corps de mammifère, par exemple dans une articulation abîmée. L'échafaudage peut ensuite constituer un support structurel efficace pour une prolifération cellulaire, un maintien de la fonction cellulaire, et une formation extracellulaire (ECM). Par exemple, l'étape d'implantation est effectuée par arthroscopie.
D'autres avantages et modes de réalisation préférés de la présente divulgation apparaîtront de façon évidente à partir de la description détaillée qui suit et des dessins, dans lesquels :
La présente divulgation comprend une composition pour ingénierie tissulaire, en particulier une composition qui peut être adaptée à l'impression 3D d'un échafaudage ou à la production d'un matériau d'échafaudage.
La composition peut comprendre au moins deux composants : la cellulose et la gélatine. Toutefois, d'autres composants peuvent être ajoutés, tels que de l'eau purifiée, des facteurs de croissance, des protéines, de l'acide hyaluronique et/ou de la polycaprolactone.
La cellulose peut être une cellulose nanocristalline, sous la forme de cristaux de cellulose. Les cristaux de cellulose peuvent avoir une forme de barre comprenant des faces distinctes, telles que six faces, et des dimensions de 100 à 900 nm de longueur, de préférence 150 à 850 nm, mieux encore 240 à 760 nm, 370 à 620 nm, 410 à 580 nm et tout spécialement environ 500 nm. La largeur et la hauteur des cristaux peuvent être de 5 à 40 nm, de préférence 9 à 32 nm, mieux encore 10 à 25 nm, et tout spécialement 15 à 20 nm. Ces dimensions peuvent être obtenues par une microscopie électronique, telle qu'une microscopie électronique à balayage (MEB) ou de préférence une microscopie électronique à transmission (MET).
La cellulose nanocristalline peut être obtenue par hydrolyse conformément à la réaction 1 ci–dessous et à la .
[Réaction 1]
[Réaction 1]
Sur la , la cellulose 10, par exemple extraite à partir d'une source de biomasse telle que le coton ou à partir d'une source bactérienne, peut comprendre des domaines cristallins et amorphes, et les domaines amorphes peuvent être coupés par hydrolyse acide, utilisant par exemple de l'acide sulfurique, afin que soient obtenus uniquement les domaines cristallins, de préférence sous la forme de nanocristaux 11. En fonction des conditions réactionnelles, différentes formes de nanocristaux peuvent être obtenues, tandis que la forme de barre peut offrir des propriétés rhéologiques favorables à la composition.
La cellulose peut être fonctionnalisée par l'addition de premiers fragments réactifs. Par conséquent, les premiers fragments réactifs peuvent différer des fragments réactifs de cellulose naturelle et/ou nanocristalline. De préférence, les premiers fragments réactifs sont insérés à une extrémité des chaînes de cellulose, par exemple sur les extrémités aldéhyde des chaînes de cellulose (appelées extrémités réductrices). Comme les chaînes de cellulose peuvent être alignées à l'intérieur d'un nanocristal, ces extrémités peuvent correspondre à une seule face de chaque nanocristal, par exemple une face externe des nanocristaux en forme de barre. Les chaînes de cellulose peuvent être maintenues à l'intérieur des nanocristaux par des liaisons hydrogène intra– et inter–moléculaires, par exemple comme le montre la .
En variante ou en combinaison, des fragments aldéhyde additionnels peuvent être insérés dans la cellulose nanocristalline, par exemple par oxydation. Cette oxydation peut être effectuée au moyen d'un periodate, tel que le periodate de sodium, par un procédé connu. Grâce à ces fragments aldéhyde additionnels, un degré de réticulation plus élevé peut être obtenu.
Les premiers fragments réactifs peuvent être un nucléophile, par exemple choisi parmi une amine, un carbanion stabilisé, une thiolactone et de préférence un thiol. De préférence, les premiers fragments réactifs permettent ou sont adaptés à la réalisation d'une réaction photo–clic. Les premiers fragments réactifs peuvent être insérés au niveau des extrémités aldéhyde des chaînes de cellulose par réaction des fragments aldéhyde avec un ou plusieurs lieurs, par exemple comprenant un acide aminé ou un peptide. L'acide aminé ou le peptide peut être naturel ou artificiel. De préférence, le premier fragment réactif est un groupe thiol –SH et est inséré par couplage de cystéine ou de cystéamine aux extrémités aldéhyde par une réaction de couplage, par exemple une amination réductrice, conformément aux Réactions 2.
[Réactions 2]
[Réactions 2]
Conformément aux Réactions 2, une amination réductrice peut être effectuée au moyen de triacétate borohydrure à un pH alcalin, par exemple supérieur à 8 ou supérieur à 9 et à une température supérieure à la température ambiante, par exemple 50 °C ou plus, 60 ou 70 °C. Le tampon alcalin peut être le carbonate de sodium. Le temps de réaction peut être long et peut être supérieur à 24 heures, par exemple supérieure à 38 heures, de préférence d'environ 48 heures ou 50 heures et jusqu'à 64 heures. La purification peut être effectuée par des cycles de centrifugation et de lavage, ou d'autres procédés connus dans la technique. Ces conditions réactionnelles peuvent permettre l'obtention de cellulose nanocristalline fonctionnalisée sans destruction des nanocristaux. De préférence, le degré de fonctionnalisation, c'est–à–dire la teneur en thiol de la cellulose nanocristalline fonctionnalisée, tel que déterminé par dosage d'Ellman, est de 1 à 10 µmol/g.
D'autres lieurs peuvent aussi être utilisés, sous forme de molécule ou sous forme d'un sel tel qu'un sel biocompatible, par exemple un sel chlorhydrate. Par exemple, l'acide aminé peut être choisi dans la liste comprenant la cystéine, l'homocystéine et l'homocystéine thiolactone. Des lieurs non acides aminés peuvent comprendre de préférence la cystéamine mais aussi le 3–amino–1,2,4–triazole–5–thiol ou le 6–amino–1–hexanethiol. De préférence, le lieur comprend au moins un fragment amine et un fragment nucléophile en tant que premier fragment réactif, séparés par au moins un atome de carbone, de préférence au moins 2 atomes de carbone et de préférence jusqu'à 10 atomes de carbone, jusqu'à 8 atomes de carbone, jusqu'à 6 atomes de carbone et tout spécialement jusqu'à 4 atomes de carbone. Le fragment nucléophile est de préférence un fragment thiol.
La gélatine peut comprendre des chaînes peptidiques de gélatine, de préférence obtenues à partir de gélatine bovine parce que le point isoélectrique de la gélatine bovine est proche du point isoélectrique du corps humain. Toutefois, d'autres types de gélatine peuvent être utilisés, en particulier pour des applications non humaines. La montre une structure de gélatine, montrant par exemple l'arginine, la glycine et la proline. Toutefois, d'autres acides aminés naturels peuvent être présents dans la gélatine, comme le sait l'homme du métier.
La gélatine peut être fonctionnalisée pour que des deuxièmes fragments réactifs soient insérés. Par conséquent, les deuxièmes fragments réactifs peuvent différer des fragments réactifs de la gélatine. Par exemple, le deuxième fragment réactif est ou comprend une double liaison ou une triple liaison, telle qu'une liaison insaturée carbone–carbone, de préférence activée, par exemple par hyperconjugaison ou conjuguée avec une autre liaison insaturée. De préférence, le deuxième fragment réactif est adapté à ou permet une réaction photo–clic. La liaison carbone–carbone insaturée peut être contrainte, par exemple grâce à un cycle. Par exemple, le deuxième fragment réactif est de préférence le norbornène ou un dérivé de norbornène, mais peut aussi comprendre un acrylate, un méthacrylate, un aldéhyde ou une cétone à insaturation α,β, un ester de vinyle, une vinylsulfone, un imidazole, et un maléimide.
Du norbornène peut être ajouté à de la gélatine par utilisation d'acide 5–norbornène–2–carboxylique, conformément à la Réaction 3 ci–dessous. Dans une première étape, de l'acide 5–norbornène–2–carboxylique peut être mis à réagir avec de l'EDC (1–éthyl–3–(3–diméthylaminopropyl)carbodiimide et du NHS (N–hydroxysuccinimide) dans du DMSO (diméthylsulfoxyde). Cette réaction peut se dérouler à la température ambiante pendant quelques heures ou plus et/ou 8 heures ou moins, par exemple 5 heures.
Dans une deuxième étape, le produit de la première étape peut être couplé à de la gélatine, par exemple dans du DMSO à une température de 40 °C ou plus, telle que 50 °C ou plus, pendant un temps de réaction de 8 heures ou plus, tel que 12 heures ou 15 heures.
[Réaction 3]
[Réaction 3]
A la fin de la Réaction 3, de la gélatine fonctionnalisée avec du norbornène peut être obtenue. Le norbornène est bien adapté à une réaction avec les groupes thiol de la cellulose nanocristalline. Ici, le norbornène et le thiol ne constituent que des exemples des premier et deuxième fragments réactifs, et d'autres types de fragments réactifs peuvent être utilisés, du moment qu'ils réagissent entre eux, de préférence par une réaction clic ou photo–clic. De préférence, le deuxième fragment réactif peut être d'un type réagissant avec un fragment thiol qui est un premier fragment réactif préférable. Une étape de purification peut être effectuée après la Réaction 3 de fonctionnalisation ci–dessus par n'importe quels procédés connus, par exemple par dialyse.
La composition peut être utilisée en tant qu'encre ou matériau de départ pour que soient obtenus des échafaudages imprimés en 3D. Par exemple, la composition est une encre structurelle et fonctionnelle. Une forme correspondant à une partie rompue d'un cartilage d'un corps peut être formée, par exemple imprimée en 3D, par utilisation de la composition ci–dessus, et réticulée, afin de former un échafaudage ayant une géométrie adaptée au support de cellules et/ou de cartilage, comme cela est connu dans la technique. Grâce à la composition spécifique et en particulier à la cellulose nanocristalline, la composition peut avoir des propriétés optimales pour l'impression 3D ou un autre procédé de formation, par exemple des propriétés rhéologiques optimales. De préférence, la composition peut avoir une propriété thixotropique et une aptitude à une restauration rapide de la viscosité.
Par exemple, la composition peut comprendre une cellulose nanocristalline fonctionnalisée à raison de 1 à 15 %, de préférence 2 à 13 %, mieux encore 5 à 11 %, 7 à 10 % ou environ 8 % en poids, par rapport au poids total de la composition. En outre, la composition peut comprendre des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée à raison de 1 à 20 %, de préférence 3 à 18 %, mieux encore 5 à 13 %, 7 à 12 %, ou environ 10 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
La caractérisation rhéologique de la composition a été réalisée par utilisation d'un rhéomètre Anton Paar MCR 302e en combinaison avec une source de lumière UV Omnicure S1500. Test de balayage de contraintes dynamiques : à une fréquence fixe, on a appliqué un balayage des contraintes de 0,1 à 100 % pour déterminer la plage viscoélastique linéaire. Test de balayage de fréquences dynamiques : contrainte constante à 1 % et balayage des fréquences de 0,1 à 100 rad.s–1. Les tests de vitesse de cisaillement à l'état stable ont été effectués à 5–25 °C, et la vitesse de cisaillement allait de 0,01 à 100 s–1, et de préférence était égale à ou proche de 20 s–1.
Les viscosités des échantillons ont été mesurées par mesure continue à différents point de temps et avec un test de restauration de la viscosité. La viscosité de la composition peut être comprise entre 10 et 300 000 mPa.s, de préférence entre 1 700 à 240 000 mPa.s, mieux encore entre 11 000 et 160 000 mPa.s, entre 48 000 et 115 000 mPa.s, entre 82 000 et 104 000 mPa.s.
La composition peut aussi comprendre de l'eau distillée ou purifiée, ainsi que des additifs habituels tels que des facteurs de croissance et des protéines qui peuvent contribuer à une régénération des cartilages, par exemple des facteurs de croissance humains, le facteur de croissance du tissu conjonctif humain (CTGF), le facteur de croissance transformant β3, la fibrine riche en plaquettes (PRF) et/ou la polycaprolactone. En particulier, la PRF peut amplifier la migration cellulaire et promouvoir tant la prolifération de méniscocytes que la sécrétion d'ECM de méniscocytes. De préférence, les additifs sont choisis de façon à ne pas altérer les propriétés rhéologiques de l'encre et/ou les propriétés du matériau d'échafaudage.
L'étape d'impression impliquant la composition ci–dessus en tant qu'encre peut être effectuée avec n'importe quelle imprimante 3D adaptée, en particulier comprenant une ou deux buses. La pression d'impression peut être de 400 à 1 000 kPa, de préférence 520 à 870 kPa, mieux encore 660 à 740 kPa. La vitesse d'impression peut être de 0,2 à 150 mm/s, de préférence 8 à 130 mm/s, mieux encore 21 à 104 mm/s, 43 à 87 mm/s et par exemple environ 72 mm/s. N'importe quelle forme adaptée peut être imprimée, de préférence une forme adaptée, proche de ou identique à la forme d'une partie du cartilage à régénérer. La forme peut aussi complémenter la partie du cartilage à régénérer.
Par exemple, une imprimante 3D avec une buse double et supportant des températures multiples peut être utilisée pour coextruder la composition avec de la polycaprolactone afin que les propriétés mécaniques de la forme imprimée soient amplifiées. En variante ou en combinaison, un autre procédé de formation connu dans la technique peut être utilisé.
La réticulation de la forme imprimée peut être effectuée de préférence au moyen d'une réaction clic, afin que soit obtenu un échafaudage ou au moins un matériau d'échafaudage. Par exemple, la réaction clic peut être une réaction clic ou photo–clic déclenchée par une lumière UV. N'importe quel type de procédé de réticulation UV adapté peut être utilisé, par exemple une simple exposition à une lampe UV émettant des UVA, par exemple avec une longueur d'onde de 365 nm. Les techniques à base de lumière ou de laser peuvent comprendre une stéréolithographie (SLA), une projection par traitement numérique de la lumière (DLP), et une polymérisation biphotonique (2PP).
On peut par exemple utiliser un photoamorceur tel qu'un photoamorceur de type I tel que le LAP ((2,4,6–triméthylbenzoyl)phénylphosphinate de lithium, CAS : 85073–19–4). Le LAP peut être coupé conformément à la Réaction 4 ci–dessous, en donnant ainsi un radical réactif favorisant la réaction de réticulation entre les premiers fragments réactifs et les deuxièmes fragments réactifs. Un autre photoamorceur peut être l'Irgacure 2959 (2–hydroxy–4'–(2–hydroxyéthoxy)–2–méthylpropiophénone, CAS : 106797–53–9).
[Réaction 4]
[Réaction 4]
Un exemple d'une réaction de réticulation UV en tant que réaction photo–clic est présenté dans la Réaction 5 ci–dessous, dans laquelle R1 est la cellulose ou une cellulose fonctionnalisée et R2 est la gélatine ou une gélatine fonctionnalisée.
[Réaction 5]
[Réaction 5]
Par exemple, l'étape de réticulation peut être effectuée au moyen d'une lumière UV de 300 à 600 nm et de préférence 365 nm dans le cas du LAP, avec une puissance de 2 mW à 6 W et pendant une période de 10 secondes à 30 minutes, de préférence 45 secondes à 23 minutes, mieux encore 76 secondes à 18 minutes, 3 minutes à 11 minutes et par exemple 7 minutes à 9 minutes. Par exemple, l'étape de réticulation a pour résultat une efficacité de réticulation qui peut être d'au moins 76 %, de préférence au moins 82 %, mieux encore au moins 93 %. Au moins 85 % d'efficacité de réticulation peuvent être obtenus après 180 secondes. Une réaction de réticulation rapide et une efficacité de réticulation élevée peuvent permettre l'obtention d'un échafaudage imprimé ayant une excellente fidélité de forme.
Grâce à la réticulation, des ponts sont formés entre la cellulose nanocristalline et la gélatine, par exemple comme le montre la . Ceci peut former un réseau tridimensionnel qui peut renfermer un liquide tel que de l'eau ou de l'eau tamponnée. Les ponts peuvent comprendre les premier et deuxième fragments réactifs et le lieur. Le lieur peut avoir 3 à 20 atomes, de préférence 5 à 15 atomes, 6 à 12 atomes, 7 à 10 atomes, par exemple 8 ou 9 atomes. Le lieur peut comprendre un atome de thiol et/ou un fragment cyclique ou bicyclique, par exemple de 4 à 12 atomes de carbone, de préférence saturé.
Des exemples de ponts préférés sont présentés sur les Figures 5A–5B et peuvent comprendre l'extrémité réductrice de cellulose ("Cell" sur les Figures 5), cystéine ( ) ou cystéamine ( ) et norbornane.
En variante, la composition peut être réticulée en un matériau d'échafaudage avant l'étape de formation d'un échafaudage. L'échafaudage peut ensuite être formé par n'importe quel procédé connu tel qu'un moulage, un découpage ou une extrusion.
Après la réticulation, un échafaudage ou un matériau d'échafaudage est obtenu, de préférence sous la forme d'un matériau semi–solide. Ce matériau peut former un échafaudage poreux favorisant la croissance cellulaire, afin de régénérer un tissu ou des cartilages.
Une machine de test de traction universelle a été utilisée pour mesurer la résistance mécanique d'hydrogel via une méthode de test de compression uniaxiale. Les échantillons d'hydrogel pour le module élastique ont été obtenus par le rapport de la contrainte et de la déformation avec une plage de déformation linéaire. Les échantillons d'hydrogel étaient cylindriques et avaient un diamètre de 15 ± 1 mm. Les tests ont été effectués à une vitesse de compression de 0,5 mm.s–1.
La résistance à la traction ultime UTS peut être de 40 à 500 kPa, de préférence 72 à 460 kPa, mieux encore 105 à 380 kPa et par exemple 225 à 318 kPa. La contrainte à la compression du matériau d'échafaudage peut être de 10 à 4 100 kPa, de préférence 81 à 3 600 kPa, mieux encore 230 à 2 900 kPa, 540 à 2 100 kPa, 680 à 1 600 kPa, 980 à 1 350 kPa. Le module élastique de Young peut être de 100 à 4 000 kPa, de préférence 185 à 3 450 kPa, mieux encore 260 à 2 900 kPa, 580 à 2 200 kPa et par exemple 890 à 1 750 kPa.
Les microstructures des échafaudages poreux ont été observées au microscope électronique à balayage. Les sections transversales des échafaudages poreux ont été revêtues au moyen d'un pulvérisateur cathodique avant observation. La taille de pore moyenne et la densité des pores des échafaudages poreux ont été mesurées à partir de leurs images au microscope électronique à balayage (MEB). La porosité des échafaudages a été mesurée conformément au principe d'Archimède. Le matériau d'échafaudage peut avoir de préférence une porosité de 40 à 65 %, de préférence 45 à 55 %, et une interconnectivité élevée des pores, de préférence supérieure à 80 %, mieux encore supérieure à 92 % ou supérieure à 97 %, de préférence de 99 ou 100 %. Ces paramètres sont pertinents pour favoriser une croissance cellulaire optimale sur l'échafaudage.
Les propriétés mécaniques des échafaudages poreux ont été mesurées par une machine de test mécanique de compression statique. Avant le test, les échantillons ont été estampés en échantillons cylindriques (diamètre 8 mm x hauteur 4 mm) avec un poinçon de biopsie. Chaque échantillon de test a été comprimé à une vitesse de 2,0 mm min–1 à la température ambiante. Le module de compression a été calculé à partir des courbes et des dimensions des échantillons. Le module de compression peut être de 100 à 60 000 kPa, de préférence 320 à 52 000 kPa, mieux encore 640 à 32 500 kPa, 1 260 à 26 000 kPa, 5 680 à 21 600 kPa, 8 900 à 17 000 kPa, 10 100 à 14 500 kPa.
Après la formation de l'échafaudage, l'échaudage peut être implanté dans l'emplacement approprié d'un corps, par exemple par une chirurgie telle qu'une arthroscopie. L'échafaudage peut ensuite recruter des cellules souches et/ou cellules progénitrices endogènes in vivo, c'est–à–dire à partir du corps de l'hôte, afin de régénérer le cartilage. Par conséquent, aucune injection de cellules et/ou aucune croissance cellulaire in vitro peut n'être nécessaire, et le procédé de régénération de cartilage peut donc être acellulaire.
Exemples
Dans les exemples qui suivent, la cellulose nanocristalline a été achetée chez Nanografi. L'acide acétique, l'hydroxyde de sodium, le periodate de sodium (NaIO4, 99 %), le cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN, 95 %), la 2–hydroxy–4'–(2–hydroxyéthoxy)–2–méthylpropiophénone (Irgacure 2959, 98 %), le phényl–2,4,6–triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP, 95 %), la L–cystéine (98 %) ont été achetés chez Sigma Aldrich
Exemple 1 : Synthèse de cellulose nanocristalline fonctionnalisée
Exemple 1 : Synthèse de cellulose nanocristalline fonctionnalisée
On obtient comme suit une composition pour produire un matériau d'échafaudage conformément à la présente divulgation. On oxyde de la cellulose nanocristalline avec du NaIO4 conformément au procédé de Sun, afin d'obtenir des fonctionnalités aldéhyde supplémentaires. On met la cellulose nanocristalline en suspension dans de l'eau et on ajuste le pH de la suspension à 3,5 en utilisant de l'acide acétique (à 36 % dans l'eau). Le temps de réaction est de 4 heures à une température de 45 °C en l'absence de lumière.
On détermine la teneur en fragments aldéhyde de la cellulose nanocristalline oxydée par spectrophotométrie UV/visible (dosage BCA) contre du D–(+)–glucose servant d'étalon. On obtient une concentration totale de 2 000 µmol d'aldéhydes par gramme de cellulose nanocristalline avec 1,75 équivalents de NaIO4 par rapport aux motifs glucose de la cellulose nanocristalline.
On greffe de la cystéine racémique sur la cellulose nanocristalline oxydée obtenue ci–dessus, par l'intermédiaire d'une réaction d'amination réductrice. On ajoute de la cystéine et du NaBH3CN dans une suspension de cellulose nanocristalline oxydée obtenue ci–dessus. On établit le pH de la suspension à 4,5 en utilisant de l'acide acétique, puis on fait réagir à 45 °C pendant 20 heures sans lumière. On dialyse encore (SpecPor 12–14 kDa) la cellulose nanocristalline greffée de cystéine ainsi obtenue et on la stocke dans une atmosphère d'azote. On détermine le degré de substitution (DS) par RMN à l'état liquide, et il est de 0,02 à 5,50 mmol de fragments thiol par gramme de cellulose nanocristalline, de préférence 1,10 à 4,80 mmol/g, tout spécialement 2,20 à 3,50 mmol/g.
Exemple 2 : synthèse de cellulose nanocristalline fonctionnalisée
Exemple 2 : synthèse de cellulose nanocristalline fonctionnalisée
On répète le protocole ci–dessus avec de la L–cystéine à la place de la cystéine racémique.
Exemple 3 : Obtention d'un échafaudage imprimé 3D
On met en suspension de la gélatine fonctionnalisée et l'une des celluloses nanocristallines fonctionnalisées obtenues ci–dessus dans de l'eau purifiée avec le photoamorceur Irgacure 2959. La viscosité mesurée de l'hydrogel obtenu est de 0,3 à 30 Pa.s dans les conditions susmentionnées. On réticule les deux compositions par photopolymérisation au moyen d'une LED à UV (365 nm) pendant 180 secondes pour obtenir un matériau d'échafaudage réticulé.
L'efficacité de réticulation mesurée du matériau d'échafaudage ci–dessus est de 86,8 % pour le matériau d'échafaudage comprenant la cystéine racémique et de 85,4 % pour le matériau d'échafaudage comprenant la L–cystéine. L'efficacité de réticulation est déterminée par le rapport de la quantité de substance de fragments aldéhyde ayant réagi de la cellulose nanocristalline fonctionnalisée après l'étape de réticulation à la quantité de substance de fragments aldéhyde de la cellulose nanocristalline fonctionnalisée avant l'étape de réticulation.
On détermine en outre la cytotoxicité in vitro conformément au procédé présenté dans la norme ISO 10993–5:2009 pour les deux matériaux d'échafaudage obtenus ci–dessus. On détermine que la réduction de la viabilité cellulaire est de 9 % seulement pour le matériau d'échafaudage comprenant la cystéine racémique, et de 10 % seulement pour le matériau d'échafaudage comprenant la L–cystéine.
Bien que la présente invention ait été décrite et illustrée en détail, on comprend clairement que celle–ci a une vocation d'illustration et d'exemple uniquement et ne doit pas être comprise dans un sens limitatif, la portée de la présente invention n'étant limitée que par les termes des revendications annexées.
Claims (13)
- Composition pour produire un matériau d'échafaudage adapté à la régénération de cartilage, la composition comprenant :
• de la cellulose nanocristalline fonctionnalisée comprenant une pluralité de premiers fragments réactifs,
• des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée comprenant une pluralité de deuxièmes fragments réactifs adaptés pour réagir avec les premiers fragments réactifs par une réaction photo–clic. - Composition selon la revendication précédente, dans laquelle le premier fragment réactif est un nucléophile, par exemple choisi parmi une amine, un carbanion stabilisé, une thiolactone et de préférence un thiol.
- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la cellulose nanocristalline fonctionnalisée comprend une pluralité de lieurs portant les premiers fragments réactifs et choisis parmi un acide aminé, un peptide, une cystéamine, le 3–amino–1,2,4–triazole–5–thiol et le 6–amino–1–hexanethiol.
- Composition selon la revendication précédente, dans laquelle le lieur est un acide aminé et de préférence une cystéine.
- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la cellulose nanocristalline fonctionnalisée est sous la forme de cristaux comprenant des faces et dans laquelle les premiers fragments réactifs sont situés sur une seule face de chacun des cristaux.
- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle chacun des deuxièmes fragments réactifs des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée comprend une double liaison ou une triple liaison, par exemple une double liaison carbone–carbone ou une triple liaison carbone–carbone, de préférence activée.
- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les deuxièmes fragments réactifs des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée sont choisis parmi un norbornène, un dérivé de norbornène, un acrylate, un méthacrylate, un aldéhyde ou une cétone à insaturation α,β, un ester de vinyle, une vinylsulfone, un imidazole et un maléimide.
- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le pourcentage en poids des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée par rapport à la composition est d'au plus 10 %, de préférence d'au plus 5 %.
- Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le pourcentage en poids de la cellulose fonctionnalisée par rapport à la composition est de 0,1 à 15 %, de préférence de 0,5 à 10 % et mieux encore de 1 à 5 %.
- Matériau d'échafaudage adapté à la régénération de cartilages, le matériau comprenant :
• des chaînes peptidiques de gélatine fonctionnalisée,
• de la cellulose nanocristalline fonctionnalisée,
• une pluralité de ponts réticulant la cellulose nanocristalline fonctionnalisée et la chaîne peptidique de gélatine fonctionnalisée, chaque pont comprenant au moins un atome de soufre et/ou au moins un acide aminé. - Matériau d'échafaudage selon la revendication précédente, dans lequel la cellulose nanocristalline fonctionnalisée est sous la forme de cristaux comprenant des faces, et dans lequel les ponts sont connectés à une seule face de chacun des cristaux.
- Procédé pour former un échafaudage adapté à la régénération de cartilages, le procédé comprenant :
• l'obtention d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9,
• la formation d'une forme d'échafaudage,
• la réticulation de la forme d'échafaudage formée en un échafaudage par une réaction photo–clic. - Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'étape de formation d'une forme d'échafaudage est effectuée par impression 3D.
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