FR3112939A1 - Produit universel de thérapie cellulaire et son utilisation - Google Patents

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Abstract

Produit universel de thérapie cellulaire et son utilisation Composition pharmaceutique comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur. Figure pour l’abrégé : Néant

Description

Produit universel de thérapie cellulaire et son utilisation
La présente invention relève du domaine du traitement thérapeutique, en particulier de la thérapie cellulaire basée sur les cellules NK (Natural Killer). Plus particulièrement, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant comprenant une région Fc modifiée.
Le développement des thérapies cellulaires est en plein expansion pour le traitement de maladies progressives telles que le cancer, les infections sévères ou le rejet de greffe après transplantation d’organe ou de cellules souches. C’est principalement contre le cancer que le plus d’avancées scientifiques et cliniques ont été obtenues. La thérapie cellulaire émerge comme une option thérapeutique très prometteuse contre le cancer depuis les succès cliniques obtenus avec des cellules T modifiées génétiquement par un récepteur chimérique appelé CAR (récepteur antigénique chimérique) (cellules CAR-T), en particulier dans le traitement des pathologies cancéreuses des cellules B.
A l’heure actuelle, les produits de types cellules CAR-T approuvées par la FDA (« Agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux ») sont basées sur des cellules T autologues (provenant du patient) modifiées génétiquement dans des centres de références certifiées avant libération puis infusion au patient. Cependant, chez un nombre significatif de patients, le traitement par cellules CAR-T est associé à des effets secondaires conséquents, voire léthaux (Santomasso B, Bachier C, Westin J, Rezvani K, Shpall EJ. The Other Side of CAR T-Cell Therapy: Cytokine Release Syndrome, Neurologic Toxicity, and Financial Burden. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2019;39:433-444. doi:10.1200/EDBK_238691). Par ailleurs, la logistique et le coût de ce type de traitement sont antinomiques avec leur utilisation à grande échelle. Ainsi, pour qu’un nombre plus élevé de patients puisse bénéficier de ces thérapies cellulaires, il est primordial de concevoir des alternatives permettant de surmonter les inconvénients rencontrés avec les cellules CAR-T actuelles.
Une des solutions étudiées est l’utilisation des cellules NK (Natural Killer) : des lymphocytes cytotoxiques dérivés de la moelle osseuse capables de détruire des cellules cibles sans stimulation antigénique préalable. Cependant de nombreux résultats fondamentaux, pré-cliniques et cliniques indiquent que les cellules NK seules ne sont pas efficaces pour le traitement de différentes pathologies malignes hématologiques et non hématologiques. Spécifiquement, ces cellules NK ne sont pas assez efficaces pour reconnaitre leur cible et/ou ne sont pas suffisamment cytotoxiques pour générer l’effet thérapeutique recherché. En vue d’accroître leur efficacité, ces cellules NK peuvent être « armées » afin de reconnaitre des antigènes spécifiques des cellules cibles (Sanchez-Martinezet al.,Theranostics8(14):3856-3869, June 2018).
Il demeure toutefois un besoin de disposer de nouvelles compositions en thérapie cellulaire, n’induisant pas ou peu d’effets secondaires, moins onéreuses, hautement stables dans le temps et adaptées à tous les patients et pour toutes les pathologies.
La présente invention a pour objet de satisfaire tout ou partie de ces besoins.
La présente invention concerne des cellules NK ou un précurseur de cellules NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc modifiée, de préférence avec au moins une modification dans un domaine CH2, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc modifiée étant capable de se lier auxdites cellules NK ou à leurs précurseurs.
Comme détaillé dans les exemples ci-après, il a été observé par les inventeurs que des cellules NK en combinaison avec un polypeptide recombinant capable de se lier à un ligand, restaient stablesin vitroetin vivopendant plusieurs jours. Par ailleurs, il a été observé que ces cellules NK armées étaient ainsi capables de cibler spécifiquement des cellules cibles.
Selon un de ces premiers objets, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de la cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou au précurseur de la cellule NK.
De manière inattendue, les inventeurs ont observé qu’une cellule NK prélevée chez un individu et arméein vitroavec un polypeptide recombinant tel que défini dans la présente invention, permet d’accroître la cytotoxicité des cellules NK à l’égard d’une cellule cible. De manière surprenante, et contrairement à l’enseignement de Moore et al. 2010, la liaison entre le récepteur Fc d’une cellule NK et un polypeptide recombinant selon l’invention reste stable et spécifique plusieurs jours, en particulier jusqu’à au moins 7 jours,in vitroetin vivo. Ainsi cette combinaison d’une cellule NK et d’un polypeptide recombinant tel que défini dans la présente description, que l’on nommera « cellule NK armée », s’avère constituer une solution thérapeutique efficace contre toute maladie dont le traitement implique la destruction de cellules cibles d’intérêts. Cette solution thérapeutique ne nécessite pas de modification de la cellule NK, contrairement aux cellules NK-CAR décrites notamment dans la revue de Wang et al (Luyao Wang, Mei Dou, Qingxia Ma, Ruixue Yao, Jia Liu ; Chimeric antigen receptor (CAR)-modified NK cells against cancer: Opportunities and challenges ; International Immunopharmacology 74 (2019) 105695), ce qui rend cette combinaison bien plus simple d’utilisation que les cellules NK-CAR. En effet, un seul échantillon de cellules NK, par exemple prélevé dans du sang de cordon, suffit à traiter tout individu pour n’importe quelle spécificité de ciblage.
Selon un autre de ces objets, l’invention concerne également une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant, dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc modifiée, capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; pour utilisation comme médicament.
Selon un autre de ces objets, l’invention concerne un kit comprenant :
- une première partie incluant une cellule NK, de préférence allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK ;
- une deuxième partie incluant un polypeptide recombinant comprenant (i) une région Fc, modifiée et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à un précurseur de cellule NK ;
pour une utilisation en tant que médicament.
Selon un autre de ces objets, l’invention concerne également l’utilisation de la composition pharmaceutique selon l’invention, pour utilisation en tant que médicament.
Selon un autre de ces objets, l’invention a aussi trait à l’utilisation de la composition pharmaceutique, la cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou précurseur de cellule NK ou le kit selon l’invention, dans une méthode de traitement ou de prévention d’une maladie dans laquelle il est bénéfique de rapprocher ladite cellule NK allogénique ou autologue ou précurseur de cellule NK d’une cellule cible afin de détruire ladite cellule cible.
Selon un autre de ces objets, l’invention concerne également l’utilisation de la composition pharmaceutique, la cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou précurseur de cellule NK ou le kit selon l’invention, dans une méthode de traitement ou de prévention d’un cancer, d’une maladie auto-immune et de ses dérivés ou d’une maladie infectieuse chez un individu en ayant besoin.
Selon un autre de ces objets, l’invention concerne une méthodein vitroouex vivopour la préparation d’une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK ou un précurseur de cellule NK, comprenant les étapes suivantes ; a) fournir une cellule NK, de préférence allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK ; b) mise en contact de ladite cellule NK ou dudit précurseur de cellule NK avec un polypeptide recombinant, dans lequel ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à un précurseur de cellule NK.
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprenant une cellule NK ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, peut comprendre en outre un excipient ou un véhicule pharmacologiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation, la région Fc modifiée peut comprendre une séquence d’acides aminés de l’une quelconque des SEQ ID N° 2 à 13.
Selon un mode de réalisation, la région Fc modifiée peut comprendre une séquence d’acides aminés ayant une identité de séquence d’au moins 70 % avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N° 2, en particulier une identité de séquence d’au moins 80 % avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N° 2, en particulier une identité de séquence d’au moins 90 % avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N° 2, et de préférence la région Fc modifiée comprend une séquence d’acides aminés ayant 100 % d’identité avec SEQ ID N° 2.
Selon un mode de réalisation, la région Fc modifiée du polypeptide recombinant peut comprendre au moins un domaine CH2 modifié.
Selon un mode de réalisation particulier, le domaine CH2 modifié de la région Fc du polypeptide recombinant peut comprendre une séquence d’acides aminés de l’une quelconque des SEQ ID N° 2 à 13 ou une séquence d’acides aminés ayant une identité de séquence d’au moins 70 % avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N° 2, en particulier une identité de séquence d’au moins 80 % avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N° 2, en particulier une identité de séquence d’au moins 90 % avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N° 2, et de préférence le domaine CH2 modifié comprend une séquence d’acides aminés ayant 100 % d’identité avec SEQ ID N° 2.
Selon un mode de réalisation, la cellule NK peut être allogénique vis-à-vis d’un individu en ayant besoin.
représente la spécificité de liaison des polypeptides et Anticorps Fc SDH, Fc LALA et Fc WT en combinaison avec des cellules eNK (cellules NKin vitroprovenant de sang de cordon) CD45+/CD56+/CD3-,
représente la stabilité de liaison entre les polypeptides Fc SDH, Fc LALA et Fc WT avec le récepteur Fc (CD16A) de cellules eNK CD16+/CD56+/CD45+/CD3-,
représente les conditions de saturation du récepteur Fc sur des cellules eNK CD45+/CD56+/CD3-par les polypeptides Fc SDH et Fc WT,
représente la cytotoxicité et le niveau de dégranulation des cellules eNK armées avec des Anticorps Fc SDH ou Fc WT sur la survie cellulaire de cellules issues de la lignée cellulaire BT20 de cancer du sein,
représente la présence des Anticorps (trastuzumab) Fc SDH et Fc WT à la surface membranaire des cellules eNK armées,
représente l’expression du récepteur CD16 à la surface de cellules eNK armées avec (i) aucun Fc, (ii) Anticorps Fc LALA A647, (iii) Anticorps Fc WT A647 ou (iv) Anticorps Fc SDH A647,
représente la stabilité de liaison cellules eNK - Fc SDHin vivodans un échantillon de liquide péritonéal prélevé sur une souris adulte Swiss-nude,
représente la stabilité de liaison cellules eNK - Fc SDHin vivodans un échantillon de liquide péritonéal prélevé sur une souris adulte Swiss-nude,
représente la stabilité de la liaison cellules eNK - Fc SDHin vivodans des échantillons de sang, moelle osseuse et rate d’une souris adulte Swiss-nude,
représente la stabilité de la liaison cellules eNK - Fc SDHin vivodans des échantillons de sang, moelle osseuse et rate d’une souris adulte Swiss-nude,
représente deux modes de réalisation illustratifs d’un polypeptide recombinant selon l’invention.
Dans la qui représente la spécificité de liaison des polypeptides et Anticorps Fc SDH, Fc LALA et Fc WT en combinaison avec des cellules eNK (cellules NK in vitro provenant de sang de cordon) CD45+/CD56+/CD3- : Le graphe 1A haut est un histogramme représentant les résultats du marqueur Fc A647 sur des cellules eNK. Ordonnée : Nombre de cellules eNK liées avec (de haut en bas) (i) aucun Fc (cellules seules), (ii) Fc LALA A647, (iii) Fc WT A647, (iv) Fc SDH A647. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de A647. Le graphe 1A bas. Ordonnée : Intensité de fluorescence moyenne (MFI) des Fc modifiés A647 normalisée par rapport au Fc WT A647. Abscisse : (de gauche à droite) cellules eNK armées avec les polypeptides (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647 et (iii) Fc SDH A647. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes utilisant des cellules eNK provenant de 4 donneurs. * = p < 0,05. ANOVA à sens unique. Le graphe 1B haut est un histogramme représentant les résultats du marqueur Anti-Fc IgG FITC. Ordonnée : Nombre de cellules eNK liées avec (de haut en bas) (i) aucun Anticorps (cellules seules), (ii) Anticorps Trastuzumab Fc WT et (iiii) Anticorps Trastuzumab Fc SDH. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de FITC. Le graphe 1B bas. Ordonnée : Intensité de fluorescence moyenne de FITC. Abscisse : Cellules eNK liées à des (i) Anticorps Trastuzumab Fc WT et (ii) Anticorps Trastuzumab Fc SDH. Résultats représentatifs de 2 expériences indépendantes utilisant des eNK provenant de 3 donneurs. Le graphe 1C milieu. Ordonnée : Intensité de fluorescence moyenne du marqueur A647 sur des cellules eNK. Abscisse : Cellules eNK liées à des polypeptides (de gauche à droite) (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647 ou (iii) Fc SDH A647. Le graphe 1C droite. Ordonnée : Pourcentage de cellules eNK Fc+ dans un échantillon de cellules eNK CD16- et dans un échantillon de cellules CD16 +. Abscisse : Cellules eNK liées à des polypeptides (de gauche à droite) (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647 ou (iii) Fc SDH A647. Résultats représentatifs de 3 expériences indépendantes utilisant des eNK provenant de 4 donneurs. * = p < 0,05 ; *** = p < 0,001 ; **** = p < 0,0001 ; ANOVA bidirectionnelle,
Dans la qui représente la stabilité de liaison entre les polypeptides Fc SDH, Fc LALA et Fc WT avec le récepteur Fc (CD16A) de cellules eNK CD16+/CD56+/CD45+/CD3- : Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes utilisant les cellules NK de 4 donneurs au jour 2 et 3, 3 donneurs au jour 7. Le graphe 2A est un histogramme représentant les résultats du marqueur A647. Ordonnée : Nombre de cellules eNK liées avec les polypeptides (de haut en bas) (i) aucun Fc (cellules seules), (ii) Fc LALA A647, (iii) Fc WT A647, (iv) Fc SDH A647. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de A647. Le graphe 2B. Ordonnée : Pourcentage des cellules eNK Fc+ (CD16+) après 2 jours (gris clair), 3 jours (gris moyen) et 7 jours (gris foncé) d’incubation. Abscisse : Cellules eNK liées à des polypeptides (de gauche à droite) (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647 et (iii) Fc SDH A647. Le graphe 2C. Ordonnée : Intensité de fluorescence moyenne de A647 après 2 jours (gris clair), 3 jours (gris moyen) et 7 jours (gris foncé) d’incubation à 37°C. Abscisse : Cellules eNK liées à des polypeptides (de gauche à droite) (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647 et (iii) Fc SDH A647,
Dans la qui représente les conditions de saturation du récepteur Fc sur des cellules eNK CD45+/CD56+/CD3- par les polypeptides Fc SDH et Fc WT : Le graphe 3A est un histogramme représentant les conditions de saturation du récepteur Fc des cellules eNK par le polypeptide Fc WT A647 ou Fc SDH A647 à 0, 1, 10, 20, 30 ou 40 μg/ml. Ordonnée : Nombre des cellules eNK liées à (de haut en bas) (i) aucun Fc (cellules seules) (ii) 1 μg/ml, (iii) 10 μg/ml, (iv) 20 μg/ml, (v) 30 μg/ml ou (vi) 40 μg/ml de polypeptide Fc WT A647 ou Fc SDH A647. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de A647. Le graphe 3B est un histogramme représentant les conditions de saturation du récepteur Fc des cellules eNK par le polypeptide Fc SDH A488 à 0, 1, 10, 20, 30 ou 40 μg/ml. Ordonnée : Nombre des cellules eNK liées à (de haut en bas) (i) aucun Fc (cellules seules), (ii) 1 μg/ml, (iii) 10 μg/ml, (iv) 20 μg/ml, (v) 30 μg/ml ou (vi) 40 μg/ml de Fc SDH A488. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de A488. Les résultats sont représentatifs d’une expérience utilisant des eNK provenant d’un donneur (2 pseudo-répliques). Le graphe 3C est un histogramme représentant les conditions de compétition du récepteur Fc, sur des cellules eNK armées avec des polypeptides Fc SDH A488, par des polypeptides compétiteurs non marqués Fc WT, Fc SDH, Fc block et Anticorps anti-CD16 à 20 μg/ml. Ordonnée : Nombre des cellules eNK armées avec des polypeptides Fc SDH A488 incubées avec (de haut en bas) (i) aucun Fc (cellules seules), (ii) aucun compétiteur, (iii) Fc block, (iv) Fc WT, (v) Fc SDH et (vi) anticorps anti-CD16 à 20 μg/ml pendant 1 h à 37 °C. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de A488. Le graphe 3D est un histogramme représentant les conditions de compétition du récepteur Fc des cellules eNK armées avec des polypeptides Fc SDH A647, par des polypeptides compétiteurs non marqués Fc SDH, Fc block et anticorps anti-CD16 à 20 μg/ml. Ordonnée : Nombre des cellules eNK armées avec des polypeptides Fc SDH A647 incubées avec (de haut en bas) (i) aucun Fc (cellules seules), (ii) aucun compétiteur, (iii) Fc block, (iv) Fc SDH et (v) anticorps anti-CD16 à 20 μg/ml. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de A647. Les résultats sont représentatifs d’une expérience utilisant les eNK d’un donneur en 2 réplicats,
Dans la qui représente la cytotoxicité et le niveau de dégranulation des cellules eNK armées avec des Anticorps Fc SDH ou Fc WT sur la survie cellulaire de cellules issues de la lignée cellulaire BT20 de cancer du sein : Le graphe 4A. Ordonnée : Survie cellulaire exprimée en pourcentage des cellules cibles BT20 après 1 h d’incubation avec des cellules eNK armées depuis 1 h et qui ont subi un cycle de lavage afin de ne visualiser que les cellules eNK armées. Abscisse : Cellules cibles BT20 incubées avec (de gauche à droite) (i) aucune cellule eNK armée, (ii) cellules eNK non armées, (iii) cellules eNK armées Anticorps WT 10 μg/ml, (iv) cellules eNK armées Anticorps SDH 10 μg/ml, (v) cellules eNK armées Anticorps WT 1 μg/ml et (vi) cellules eNK armées Anticorps SDH 1 μg/ml, non lavées (c’est-à-dire que des anticorps libres sont présents). Le graphe 4B. Ordonnée : Pourcentage de survie cellulaire de cellules BT20 après 1 h d’incubation avec des cellules eNK armées depuis 1 h et non lavées (permet de visualiser l’effet des cellules eNK armées mais également des Fc libres). Abscisse : Cellules cibles BT20 incubées avec (de gauche à droite) (i) aucune cellule eNK armée, (ii) cellules eNK non armées, (iii) cellules eNK armées Anticorps WT 10 μg/ml, (iv) cellules eNK armées avec Anticorps SDH 10 μg/ml, (v) cellules eNK armées avec Anticorps WT 1 μg/ml, (vi) cellules eNK armées avec Anticorps SDH 1 μg/ml. Le graphique est représentatif de 3 expériences indépendantes utilisant des eNK provenant de 4 donneurs. Le graphe 4C. Ordonnée : Survie cellulaire exprimée en pourcentage des cellules cibles BT20 après 1 h d’incubation avec des cellules eNK armées depuis 24 h. Abscisse : Cellules cibles BT20 incubées avec (de gauche à droite) (i) aucune cellule eNK armée, (ii) cellules eNK non armées, (iii) cellules eNK armées Anticorps WT 10 μg/ml, (iv) cellules eNK armées Anticorps SDH 10 μg/ml, (v) cellules eNK armées Anticorps WT 1 μg/ml et (vi) cellules eNK armées Anticorps SDH 1 μg/ml. Le graphe 4D. Les cellules eNK armées ont été mises en présence des cellules cibles (Le graphe bas) ou sans cellules cibles (Le graphe 4D bhaut). Ordonnée : Expression de CD107a à la surface des cellules eNK armées, exprimée en pourcentage. Abscisse (de gauche à droite) : Cellules eNK armées avec (i) aucun Anticorps, (ii) Anticorps Fc WT 10 μg/ml, (iii) Anticorps Fc SDH 10 μg/ml, (iv) Anticorps Fc WT 1 μg/ml, (v) Anticorps Fc SDH 1 μg/ml. Les résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes utilisant des eNK provenant de 3 donneurs,
Dans la qui représente la présence des Anticorps (trastuzumab) Fc SDH et Fc WT à la surface membranaire des cellules eNK armées : Le graphe 5A. Ordonnée : Nombres de cellules eNK (de haut en bas) (i) en combinaison avec des anticorps présents à la surface membranaire et (ii) en combinaison avec des anticorps présents dans le domaine intracellulaire. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne (MFI) du marqueur Anti-Fc IgG FITC lié à (de gauche à droite) (i) aucun Anticorps, (ii) Anticorps Fc WT, (iii) Anticorps Fc SDH. Les graphes 5B et 5C sont des histogrammes représentant les conditions de compétition du récepteur Fc (CD16A) de cellules eNK armées avec les Anticorps marqués A488 (Le graphe 5B) ou A647 (Le graphe 5C) Fc SDH contre (i) le polypeptide Fc block ; (ii) Anticorps anti-CD32 ; (iii) Anticorps clone B73.1 anti-CD16 ; (iv) Anticorps anti-CD16 Ordonnée : Nombre des cellules eNK armées avec le polypeptide Fc SDH, incubées avec (de haut en bas) (i) aucun Fc, (ii) aucun compétiteur, (iii) polypeptide Fc block, (iv) Anticorps anti-CD32, (v) Anticorps clone B73.1 anti-CD16 et (vi) Anticorps anti-CD16. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne (MFI) du Fc A488 (Le graphe 5B) et Fc A647 (Le graphe 5C). Les résultats sont représentatifs d’une expérience utilisant les cellules eNK d’un donneur (2 pseudo-répliques par donneur),
Dans la qui représente l’expression du récepteur CD16 à la surface de cellules eNK armées avec (i) aucun Fc, (ii) Anticorps Fc LALA A647, (iii) Anticorps Fc WT A647 ou (iv) Anticorps Fc SDH A647 : Les résultats sont représentatifs de 3 expériences utilisant les cellules eNK d’un donneur. Le graphe 6A est un histogramme représentant les résultats des marqueurs de surface CD16 sur des cellules NK CD56+/CD45+/CD3- armées. Ordonnée : Nombre de cellules eNK armées avec (de haut en bas) (i) aucun Fc, (ii) Anticorps Fc LALA A647, (iii) Anticorps Fc WT A647, (iv) Anticorps Fc SDH A647. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de CD16. Le graphe 6B est un graphique représentant l’expression des marqueurs de surface CD16 sur des cellules eNK CD56+/CD45+/CD3- armées. Ordonnée : Expression en pourcentage du marqueur CD16 sur des cellules eNK armées. Abscisse : Cellules eNK armées avec (de gauche à droite) (i) aucun Anticorps Fc, (ii) Anticorps Fc LALA A647, (iii) Anticorps Fc WT A647, (iv) Anticorps Fc SDH A647 à 2, 3 et 7 jours pour chaque condition,
Dans la qui représente la stabilité de liaison cellules eNK - Fc SDH in vivo dans un échantillon de liquide péritonéal prélevé sur une souris adulte Swiss-nude : Ordonnée : Nombre de cellules eNK armées CD45+ (gauche), CD56+ (milieu), CD16-/low ou CD16+ (droite). Abscisse : mesure de la granulométrie des cellules de (i) SSC-A (gauche), CD16 (milieu), Fc A647 (droite),
Dans la qui représente la stabilité de liaison cellules eNK - Fc SDH in vivo dans un échantillon de liquide péritonéal prélevé sur une souris adulte Swiss-nude : Comparaison des cellules Fc A647+ au sein des cellules eNK CD45+/CD56+ totales avant et après injection in vivo. Ordonnée : Nombre de cellules eNK liées avec (de haut en bas), (i) Aucun polypeptide Fc, (ii) polypeptide Fc SDH A647 avant injection, (iii) polypeptide Fc SDH A647 24 h après injection. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de A647,
Dans la qui représente la stabilité de la liaison cellules eNK - Fc SDH in vivo dans des échantillons de sang, moelle osseuse (Le graphe 7C) et rate (Le graphe 7D) d’une souris adulte Swiss-nude : Ordonnée : Nombre de cellules CD45+ dans un échantillon de sang (gauche) ou moelle osseuse (droite). Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de SSC-A,
Dans la qui représente la stabilité de la liaison cellules eNK - Fc SDH in vivo dans des échantillons de sang, moelle osseuse (Le graphe 7C) et rate (Le graphe 7D) d’une souris adulte Swiss-nude : Ordonnée : Nombre de cellules CD45+ (gauche), et CD16-/low ou CD16+ marqués A647 (count, droite) dans un échantillon de rate. Abscisse : Intensité de fluorescence moyenne de SSC-A (gauche), Fc A647 (droite),
La représente deux modes de réalisation illustratifs d’un polypeptide recombinant selon l’invention.
Description détaillée
Comme détaillé dans les exemples ci-après, les inventeurs ont observé qu’une cellule NK armée d’un polypeptide recombinant comprenant (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée et (ii) un domaine de liaison à un ligand était stable dans le temps dans des conditions physiologiquesin vitromais égalementin vivochez la souris. Notamment, il a été démontré que le polypeptide recombinant ne pouvait être déplacé ou remplacé dans des conditions physiologiques, lorsque le polypeptide recombinant est armé sur des cellules NK. Plus particulièrement, les inventeurs ont démontré la capacité de ces cellules NK armées d’un polypeptide recombinant selon l’invention à induire une forte cytotoxicité contre des cellules cibles BT20 de cancer du sein.
Avantageusement, des cellules NK allogéniques ou autologues, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, selon l’invention peuvent être mises en œuvre pour traiter ou prévenir toutes maladies liées à un dysfonctionnement des cellules de l’organisme.
Les termes utilisés dans la présente description sont utilisés avec leur signification habituelle dans le domaine technique considéré, et au regard du contexte de la description dans lesquelles les termes sont utilisés. Certains termes sont davantage discutés ci-dessous, ou ailleurs dans la description, pour fournir des indications supplémentaires au regard de l’invention et de sa mise en œuvre. Les définitions qui suivent sont fournies pour la description et les revendications.
La description des différents modes de réalisation de l’invention comprend les modes de réalisation incluant « comprenant », « ayant », « consistant en » et « consistant essentiellement en ». Les mots « avoir » et « comprendre », ou des variantes telles que « a », « ont », « comprend » ou « comprenant » doivent être compris comme impliquant l’inclusion du ou des éléments indiqués (comme un élément d’une composition ou une étape de méthode) mais pas l’exclusion d’autres éléments. Le terme « consistant en » implique l’inclusion du ou des éléments indiqués, à l’exclusion de tout élément supplémentaire. L’expression « consistant essentiellement en » implique l’inclusion des éléments indiqués, et éventuellement d’autres éléments lorsque les autres éléments n’affectent pas matériellement les caractéristiques fondamentales et nouvelles de l’invention. Selon le contexte, le terme « comprendre » peut également indiquer strictement les caractéristiques indiquées, les nombres entiers, les étapes ou les composants indiqués et, par conséquent, dans ce cas, il peut être remplacé par « consister en ».
Le terme « environ » ou « approximativement » tel qu’utilisé ici au regard d’une valeur numérique se réfère à la plage d’erreur habituelle pour la valeur considérée, telle qu’elle habituellement identifiée par l’homme du métier dans le domaine technique considéré. La mention du terme « environ » au regard d’une valeur ou d’un paramètre spécifique inclut et décrit en tant que tel cette valeur ou ce paramètre. Le terme « environ » fait référence à ± 10 % d’une valeur donnée. Cependant, chaque fois que la valeur en question se réfère à un objet indivisible qui perdrait son identité une fois subdivisé, alors « environ » fait référence à ± 1 de l’objet indivisible.
Le terme « individu » ou « patient » tel qu’utilisé dans le présent texte désigne en particulier un mammifère. Les mammifères considérés incluent les, mais ne sont pas limités aux, animaux domestiques (par exemple, bovins, ovins, chats, chiens, et chevaux), les primates (par exemple humains et non-humains), les lapins et les rongeurs (par exemple, les souris et les rats). Selon un mode de réalisation particulier, un individu, ou patient, est un être humain.
Dans le contexte de la présente invention, les termes « prévenir », « prévention » (et les variantes de ces expressions) au regard d’un désordre physiologique ou d’une maladie concerne le traitement prophylactique de la maladie ou du désordre, par exemple chez un individu suspecté d’avoir cette maladie ou ce désordre, ou étant à risque de développer cette maladie ou ce désordre. Prévenir inclut, mais n’est pas limité à, la prévention ou le ralentissement du développement de la maladie, et/ou le maintien d’un ou plusieurs symptômes de maladie à un niveau désiré ou un niveau moindre. Le terme « prévenir » ne requiert pas l’élimination à 100 % de la possibilité ou de la probabilité de survenue de la maladie ou du désordre. Ce terme désigne plutôt la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d’occurrence d’un phénomène donné. Comme indiqué, la prévention peut être complète, c’est-à-dire l’absence de symptômes ou de maladie détectable, ou partielle, de telle qu’il y ait moins de symptômes ou que les symptômes soient d’intensité moindre.
Dans le contexte de la présente invention, les termes « quantité thérapeutiquement efficace » et « quantité prophylactiquement efficace » se réfèrent à une quantité qui fournit un avantage thérapeutique dans le traitement, la prévention ou la gestion des processus pathologiques considérés. La quantité spécifique qui est thérapeutiquement efficace peut être facilement déterminée par un médecin et peut varier en fonction de facteurs tels que le type et le stade des processus pathologiques considérés, les antécédents médicaux, le sexe, le poids et l’âge du patient, son régime alimentaire, et l’administration d’autres agents thérapeutiques.
Au sens de l’invention, le terme « significativement » ou tous termes dérivés, utilisé dans le contexte d’un changement, signifie que le changement observé est notable ou qu’il a une signification statistique.
Dans le contexte de la présente invention, les termes « traiter », « traitement », « thérapie » ou « thérapeutique » se réfèrent à l’administration ou la consommation d’un actif, c’est-à-dire une cellule NK armée selon l’invention, ou d’une composition pharmaceutique comprenant un tel actif à des fins curatives, de soulagement, de réduction, d’atténuation, ou d’amélioration d’une maladie ou d’un désordre pathologique, ou d’un ou plusieurs symptômes associés, ou pour prévenir ou ralentir la progression de ce ou ces symptômes ou de cette maladie, ou pour arrêter le développement de ce ou ces symptômes, ou de cette maladie ou de ce désordre pathologique d’une manière statistiquement significative. Plus particulièrement, « traiter » ou « traitement » incluent toute approche pour obtenir un effet bénéfique ou un résultat désiré à l’égard d’une maladie chez un individu. Les résultats cliniques bénéfiques ou souhaités peuvent inclure, mais sans s’y limiter, l’atténuation ou l’amélioration de la maladie ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie ; la diminution ou la réduction de l’étendue de la maladie, la stabilisation, c’est-à-dire l’absence d’aggravation d’une maladie, ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie ; la prévention d’une maladie, ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie ; la prévention de la propagation d’une maladie, ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie ; le ralentissement d’une maladie, ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie ou de la progression d’un ou des symptômes d’un telle maladie ; la diminution de la réapparition d’une maladie associée, ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie ; et l’interruption d’une maladie, ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie. En d’autres termes, le « traitement » tel qu’utilisé ici comprend toute guérison, amélioration, réduction ou interruption d’une maladie, ou d’un ou de plusieurs symptômes d’une telle maladie. Une « réduction » d’un symptôme ou d’une maladie signifie une diminution de la gravité ou de la fréquence de la maladie ou du symptôme, ou l’élimination de la maladie ou du symptôme.
Par « pharmaceutiquement acceptable » ou « physiologiquement acceptable » on entend signifier que le véhicule (support, diluant, ou excipient) doit être compatible avec les autres ingrédients de la formulation, et non nocif pour l’individu à qui la composition le comprenant est administrée. Un véhicule pharmaceutiquement acceptable est un véhicule reconnu comme satisfaisant, notamment, aux critères d’innocuité, de compatibilité, et d’inertie requis pour une mise en œuvre dans le domaine pharmaceutique. A titre d’exemples de véhicule pharmaceutiquement acceptable, il est possible de citer l’eau stérile, les saccharides tels que le sucrose ou le saccharose, les amidons, les sucres alcools tels que le sorbitol, les polymères tels que le PVP ou le PEG, les agents lubrifiants, tels que le stéarate de magnésium, les conservateurs, les agents colorants ou de saveurs.
Dans le contexte de la présente invention, l’expression « véhicule physiologiquement acceptable » vise à désigner toute substance ou composition compatible avec l’organisme de l’individu auquel un actif de l’invention doit être administré. En particulier, un véhicule physiologiquement acceptable est une substance ou composition dont l’administration à un individu ne s’accompagne pas d’effets délétères significatifs. Il peut s’agir, par exemple, d’un solvant non toxique tel que l’eau ou une solution aqueuse saline. En particulier, un tel véhicule est compatible avec une administration orale ou rectale, et de préférence est adapté à une administration par la voie orale.
La liste des sources, ingrédients et composants indiqués ci-après sont compris comme étant décrits de telle sorte que toutes combinaisons et mélanges de ceux-ci sont également envisagés dans le cadre de la présente invention.
Il est entendu que chaque limitation numérique maximale donnée dans la description comprend chaque limitation numérique inférieure, comme si ces limitations numériques inférieures étaient expressément écrites. Chaque limitation numérique minimale donnée dans cette description comprend toute limitation numérique supérieure, comme si ces limitations numériques supérieures étaient expressément écrites ici. Chaque plage numérique donnée tout au long de la description comprend chaque plage numérique plus étroite incluse dans une telle plage numérique plus large, comme si ces plages numériques plus étroites étaient toutes expressément écrites.
Toutes les listes indiquées dans la description, telles que, par exemple, les listes d’ingrédients, sont destinées et doivent être interprétées comme des groupes Markush. Ainsi, toutes les listes peuvent être lues et interprétées comme des éléments « sélectionnés dans le groupe constitué de » ... liste des éléments ... « et leurs combinaisons et mélanges ».
Il peut être fait référence ci-après à des noms commerciaux de composants comprenant divers ingrédients utilisés dans la présente description. Les inventeurs n’ont pas l’intention d’être limités à des matériaux sous un nom commercial particulier. Des matériaux équivalents (par exemple, ceux obtenus d’une source différente sous un nom ou un numéro de référence différent) à ceux indiqués ici par un nom commercial peuvent être substitués et utilisés dans la description ci-après.
Le terme "administration parentérale" désigne les modes d’administration autres que l’administration entérale et topique, généralement par injection, intraveineuse, intramusculaire, intra-artérielle, intrathécale, intracapsulaire, intra-orbitale, intracardiaque, intradermique, intrapéritonéale, transtrachéale, sous-cutanée, épidermique, intra-articulaire, sous-capsulaire, sous-arachnoïdienne, intraspinale, épidurale et intrasternale, y compris, mais sans s’y limiter, les injections et perfusions.
Dans le contexte de la présente invention, par « pourcentage d’identité » entre deux séquences d’acide nucléique ou d’acide aminé au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d’acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d’acide nucléique ou d’acide aminé sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison ». L’alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen des logiciels de comparaison de type BLAST.
Ainsi, un « pourcentage d’identité de séquence d’au moins environ 70 % » inclut notamment un pourcentage d’identité de séquence d’au moins 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 % 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 %.
Dans le contexte de la présente invention, par « cellule NK armée » on entend une cellule NK, de préférence allogénique ou autologue vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; comprenant (i) une région Fc modifiée ou une variante de celle-ci, de préférence comprenant un domaine CH2 modifié, et (ii) un domaine de liaison à un ligand. Par « cellule NK armée » on entend un composé de construction (A) tel que : [Cellule NK] – [polypeptide recombinant de formule (I)]. Ainsi, par « cellule NK armée » on englobe un composé de construction (B) : [Cellule NK] – [[Région Fc modifiée] – [Liaison]x– [Domaine de liaison à un ligand]]. Dans chacune des constructions A ou B, le polypeptide recombinant de formule (I) n’est pas lié à la cellule NK par une liaison covalente. Au contraire, dans chacune des constructions (A) ou (B) le peptide de formule (I) est lié à la cellule NK de manière non covalente, en particulier par une association du type récepteur/ligand du récepteur.
Dans un polypeptide de formule (I), qui comprend une entité « domaine de liaison à un ligand », ledit « ligand » peut être de tout type, dès lors que (i) ledit domaine de liaison à un ligand compris dans le polypeptide recombinant de formule (I) est capable de se lier audit ligand.
Dans certains modes de réalisation d’un polypeptide formule (I), le domaine de liaison à un ligand peut consister en une molécule reconnue par un récepteur, par exemple une molécule reconnue par un récepteur exprimé par une cellule cible, ou encore une molécule reconnue par le domaine de fixation à l’antigène d’un anticorps. Dans ce dernier cas, le domaine de liaison à un ligand compris dans un polypeptide recombinant de formule (I), qui est reconnu par le domaine de fixation à l’antigène d’un anticorps, peut être aussi appelé « antigène ».
Dans d’autres modes de réalisation d’un polypeptide de formule (I), le domaine de liaison à un ligand comprend un domaine de liaison à l’antigène d’un anticorps. Dans ces autres modes de réalisation, le ligand est une molécule reconnue par ledit domaine de liaison à l’anticorps, tel qu’une molécule exprimée par une cellule cible, par exemple un antigène tumoral cible, une protéine marqueur cellulaire cible, ou encore un récepteur cellulaire cible.
Le terme "anticorps" utilisé ici est une forme spécifique d’un polypeptide comprenant un domaine Fc comprenant au moins un ligand se liant au domaine qui contient, ou conserve une homologie substantielle avec au moins un des domaines variables d’un anticorps à chaîne lourde ou légère d’au moins une espèce d’anticorps animal. Les séquences constantes de la sous-classe IgG humaine de type sauvage sont cataloguées dans la base de données UniProt disponible en ligne sous les noms P01857 (IgG1), P01859 (IgG2), P01860 (IgG3) et P01861 (IgG4). Dans le présent document, l’expression « région Fc des IgG1 humaines de type sauvage » fait référence à la région Fc des IgG1 humaines qui peut être illustrée par la séquence d’acides aminés de la SEQ ID N°15 ou un fragment de cette SEQ ID N° 15.
Dans le présent document, l’expression « domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage » fait référence à une partie de la région Fc des IgG1 humaines qui peut être illustrée par la séquence d’acides aminés de la SEQ ID N° 1 ou un fragment de cette SEQ ID N°1. Notamment, la SEQ ID N°15 comprend la SEQ ID N°1.
Par « ligand de région Fc d’une IgG » on entend une molécule, de préférence un polypeptide, apte à lier la région Fc d’un anticorps de type IgG, en particulier de type IgG1, pour former un complexe non-covalent. De manière non limitative, de tels ligands Fc incluent les polypeptides FcγRs, FcRn, C1q, C3, mannan binding lectin, mannose receptor, staphylococcal protein A, streptococcal protein G, et FcγR d’origine virale. Les ligands Fc incluent en particulier les homologues de récepteur Fc (FcRH), (Daviset al., 2002,Immunological Reviews190:123-136).
Par « récepteur Fcγ » ou « récepteur Fc » ou « FcγR », ou « FcgammaR », on entend tout membre de la famille de protéines encodé par un gène FcγR et apte à lier la région Fc d’un anticorps de type IgG, et tout particulièrement de type IgG1. Chez les humains, cette famille inclut, sans y être limitée, à FcγRI (CD64), ce qui inclut les isoformes FcγRIa, FcγRIb, et FcγRIc; FcγRII (CD32), incluant les isoformes FcγRIIa (incluant les allotypes H131 et R131), FcγRIIb (incluant FcγRIIb-1 et FcγRIIb-2), et FcγRIIc; et FcγRIII (CD16), incluant les isoformes FcγRIIIa (incluant les allotypes V158 et F158) et FcγRIIIb (incluant les allotypes FcγRIIb-NA1 et FcγRIIb-NA2). Un FcγR peut être issu de tout type d’organisme, incluant notamment les humains, les souris, les rats et les singes.
Tout particulièrement les récepteurs FcγR aptes à reconnaitre une région Fc modifiée selon l’invention sont les récepteurs FcγRIII (CD16) et leurs isoformes.
Par « région Fc » on entend tout ou partie d’un fragment Fc d’un anticorps, dit fragment cristallisable, ou «fragment crystallizable region ( Fc region )», lequel est généralement constitué de la partie constante de chaines lourdes au-delà de la partie charnière (« hinge »), comprenant un domaine CH2 et CH3, soit respectivement «heavy chain constant domain2 » et «heavy chain constant domain 3». Aussi, ce terme englobe les deux dernières régions constantes d’immunoglobulines de type IgA, IgD et IgE, les trois dernières régions constantes d’immunoglobulines de type IgM et IgE ainsi que la partie charnière N-terminale des dites régions.
En particulier, on entend tout ou partie d’un fragment Fc d’un anticorps de type IgG humaine, et tout particulièrement d’un anticorps de type IgG1.
Selon certains modes de réalisation particuliers, ladite région Fc peut comprendre tout ou partie d’une région CH2 - CH3, d’une région CH2, ou d’une région CH3.
Par « région Fc modifiée », ou « région Fc variante », on entend une séquence polypeptide correspondant à une forme modifiée d’une région Fc de référence, telle qu’une région Fc de référence d’une IgG1 humaine. Ainsi, une région Fc modifiée au sens de l’invention diffère d’une séquence référence de fragment Fc d’un anticorps, en particulier de fragment Fc d’une IgG1 humaine, par une ou plusieurs modifications d’acide aminé. Une telle région modifiée peut faire référence indifféremment à un polypeptide recombinant, à une composition (par exemple pharmaceutique) comprenant ledit polypeptide recombinant.
Selon certains modes de réalisation, ladite région Fc modifiée à au moins une modification d’acide aminé par rapport à ladite séquence de référence (en particulier ladite séquence de référence d’IgG1 humaine), ce qui englobe au moins une, deux, trois, quatre, cinq, ou plus de cinq modifications par rapport à ladite séquence de référence.
Selon certains modes de réalisation, ladite région Fc modifiée comprend au moins 70 % d’identité de séquence par rapport à ladite référence (en particulier ladite séquence de référence d’IgG1 humaine).
Selon certains modes de réalisation préférés et exemplifiés, ladite région Fc modifiée présente une affinité modulée à l’égard de la protéine de surface FcγRIII (CD16) exprimée par les cellules NK, ou le cas échéant tout précurseur de celles-ci.
En particulier, selon certains de ces modes de réalisation, ladite région Fc modifiée présente une affinité augmentée à l’égard de la protéine de surface FcγRIII (CD16) exprimée par les cellules NK, ou le cas échéant tout précurseur de celles-ci.
Selon certains modes de réalisation alternatifs, ladite région Fc modifiée présente une affinité réduite à l’égard de la protéine de surface FcγRIII (CD16) exprimée par les cellules NK, ou le cas échéant tout précurseur de celles-ci.
Pour toutes les positions discutées dans le cadre de la précédente invention, et relatives à des modifications au sein de la région Fc, telles que celles définies en séquences SEQ ID N°2 à 14, par rapport à SEQ ID N°1, et sauf indication contraire, il sera fait référence à la numérotation UE par référence à Edelman (Edelmanet al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85). En particulier, ladite modification peut être une addition, une délétion ou une substitution. Une substitution peut inclure notamment tout acide aminé naturel ou non-naturel.
Une séquence polypeptidique comprenant « 1 à 100 acides aminés » inclut, notamment, une séquence d’acides aminés de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 et 100 acides aminés.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par "modification d’un acide aminé", une substitution, une insertion et/ou une délétion d’un acide aminé dans une séquence polypeptidique. Par "substitution d’acide aminé" ou "substitution", on entend le remplacement d’un acide aminé à une position particulière dans une séquence polypeptidique sauvage avec un autre acide aminé. Par exemple, la substitution S239D fait référence à un polypeptide variant, dans ce cas un variant Fc, dans lequel la sérine en position 239 est remplacée par l’acide aspartique. Par "insertion d’un acide aminé" ou "insertion" au sens du présent document, l’ajout d’un acide aminé à un endroit particulier dans une séquence polypeptidique parentale. Par exemple, l’insert G > 235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236. Par "délétion d’un acide aminé" ou "délétion", on entend ici l’élimination d’un acide aminé à un niveau dans une séquence polypeptidique parentale. Par exemple, G236 désigne la délétion de la glycine à la position 236.
Par "position", on entend ici un emplacement dans la séquence d’une protéine ou d’un polypeptide. Les positions peuvent être numérotées de manière séquentielle ou selon un format établi, par exemple l’index de l’UE comme dans Kabat. Pour toutes les positions abordées dans la présente invention, la numérotation est conforme à la numérotation UE se référant à la numérotation de l’anticorps UE (Edelmanet al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85). La correspondance avec la numérotation Kabat peut être établie grâce au tableau de correspondance ; IMGT unique numbering for C-DOMAIN (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html).
Par "IgG" on entend ici un polypeptide appartenant à la classe des anticorps qui sont essentiellement codés par un gène gamma d’immunoglobuline reconnu. Chez l’homme, cette IgG comprend les sous-classes ou isotypes IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4. Chez la souris, les IgG comprennent les IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Par "isotype", on entend ici toute sous-classe d’immunoglobuline définie par les caractéristiques chimiques et antigéniques de leurs régions constantes. Les isotypes connus des immunoglobulines humaines sont les suivants : IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD et IgE.
Par « cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps » ou « ADCC », on désigne une forme de cytotoxicité dans laquelle les Ig sécrétées sont liées aux récepteurs Fc (FcγR) présents sur certaines cellules cytotoxiques (par exemple, Natural Killer (NK)) et permet à ces cellules cytotoxiques de se lier spécifiquement à un antigène pour ensuite tuer la cellule cible avec des cytotoxines. Les anticorps IgG, spécifiques aux ligands dirigés à la surface des cellules cibles, stimulent les cellules cytotoxiques et sont nécessaires pour cette mise à mort. La lyse de la cible est extracellulaire, nécessite un contact direct de cellule à cellule, et n’implique pas de complément. La capacité de n’importe quel anticorps ou polypeptide à médier la lyse de la cellule cible par l’ADCC peut être testée. Pour évaluer l’ADCC, un anticorps d’intérêt est ajouté à des cellules cibles, présentant le ligand cible, en combinaison avec des cellules effectrices qui peuvent être activées par les complexes antigène-anticorps (par exemple, des cellules NK), ce qui entraîne la cytolyse de la cellule cible. La cytolyse est généralement détectée par la libération de marqueurs (par exemple, des substrats radioactifs, des colorants fluorescents (A647 ou A688) ou des protéines intracellulaires naturelles) des cellules lysées. Les cellules effectrices utiles pour ces analyses comprennent les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) et les cellules NK. Des exemples spécifiques de tests ADCCin vitrosont décrits dans Wisecarveret al, 1985, 19:211 ; Bruggemannet al, 1987,J Exp Med166:1351 ; Wilkinsonet al, 2001,J Immunol Methods258:183 ; Patelet al, 1995J Immunol Methods184:29 Alternativement, ou en complément, l’activité ADCC de l’anticorps d’intérêt peut être évaluéein vivo, par exemple, dans un modèle animal tel que celui divulgué dans Clyneset al, 1998,PNAS USA95:652.
Par "cellule cible", on entend ici une cellule qui exprime un antigène cible capable d’être reconnu par une cellule NK armée selon l’invention ou une cellule qui exprime un anticorps capable de reconnaitre un antigène présenté par une cellule NK armée selon l’invention. Par exemple, une cellule cible peut être une cellule cancéreuse, une cellule infectée par un agent pathogène, une cellule B auto réactive, une cellule T auto-réactive.
Par « type sauvage ou WT », on entend ici une séquence d’acides aminés que l’on trouve dans la nature, y compris les variations alléliques. Une protéine WT, un polypeptide, un anticorps, une immunoglobuline, une IgG, etc. une séquence d’acides aminés ou une séquence de nucléotides qui n’a pas été modifiée intentionnellement.
Polypeptide recombinant
La présente invention met en œuvre un polypeptide recombinant apte à lier une cellule NK ou un précurseur de cellule NK.
Ce polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, qui améliore les propriétés de liaison du polypeptide recombinant par rapport au même polypeptide sous une forme sauvage, et (ii) un domaine de liaison à un ligand. Par exemple, un polypeptide comprenant une telle région Fc modifiée présente une stabilité et une spécificité de liaison accrue à l’égard d’un récepteur Fc, plus particulièrement du récepteur FcγRIII (CD16). Par ailleurs, un polypeptide recombinant comprenant une telle région Fc modifiée permet une stabilisation dudit polypeptide à la membrane des cellules en inhibant son internalisation. Ainsi, les polypeptides recombinants de la présente invention sont des versions optimisées du polypeptide original non modifié, c’est à dire sauvage. Plus précisément, le polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc constituée de la partie constante de chaines lourdes au-delà de la partie charnière comprenant deux domaines CH2 et CH3 (domaine CH2 et/ou domaine CH3), permettant la liaison aux récepteurs Fc et (ii) une région capable de se lier à un ligand, permettant la reconnaissance des cellules cibles.
Dans le contexte des anticorps IgG, les isotypes IgG ont chacun trois régions CH. En conséquence, les domaines "CH" dans le contexte des IgG sont les suivants : "CH1" se réfère aux positions 118-215 selon la numérotation UE. "CH2" se réfère aux positions 231-340 selon la numérotation UE, et "CH3" se réfère aux positions 341-446 selon la numérotation UE.
Selon certains modes de réalisation, un polypeptide recombinant selon l’invention est de formule (I) :
dans laquelle :
- la [Région Fc modifiée] est choisie parmi les différents modes de réalisation de la région Fc modifiée et/ou domaine CH2 modifié de la région Fc modifiée, tel que défini dans la présente description,
- X est un entier égal à 0 ou 1 ;
- [Liaison] comprend une séquence polypeptide de 1 à 100 acides aminés ;
- [Domaine de liaison à un ligand] comprend une séquence capable de se lier à un ligand cible, telle qu’une substance cible, un composé cible, une molécule cible ou encore une cellule cible, (i) par exemple un domaine de liaison à un ligand qui est capable de se lier à un antigène spécifique d’une cellule cible, ou une séquence capable de se lier à un antigène naturel ou tumoral, tel que le domaine de liaison à l’antigène d’un anticorps, qui est capable de se lier à ladite cible ou (ii) par exemple un domaine de liaison à un ligand qui est capable de se lier à un récepteur cellulaire ou de se lier au domaine de liaison à l’antigène d’un anticorps, auquel cas le domaine de liaison à un ligand comprend, ou consiste en, un antigène reconnu par le domaine de liaison à l’antigène dudit anticorps.
La région Fc modifiée peut-être une séquence d’acides aminés de type sauvage ayant une ou plusieurs (par exemple 1 à 10 ou plus) substitutions ou délétions d’acides aminés par rapport à la séquence d’acides aminés de type sauvage, par exemple, dans la région charnière ou CH2 ou CH3. Ainsi, la séquence d’acides aminés de la région Fc a une identité de séquence en acides aminés d’au moins environ 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou plus (c’est-à-dire 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) avec la séquence d’acides aminés de la région Fc du polypeptide de type sauvage (par exemple par référence à un domaine CH2 d’IgG1 humaine, dite « Fc WT » et comprenant la SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée comprend une séquence d’acides aminés ayant au moins 90 % d’identité de séquence avec la séquence d’acides aminés de la région Fc du polypeptide de type sauvage (par exemple la SEQ ID N°16). La séquence d’acides aminés peut en outre comprendre d’autres modifications, par exemple, réduire la formation de liaisons disulfures. Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend la substitution d’un ou plusieurs acides aminés par rapport à une région Fc d’une IgG humaine de type sauvage.
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée comprend une séquence d’acides aminés ayant au moins 95 % d’identité de séquence avec un domaine CH2 d’une IgG humaine, par exemple, un domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage. Le domaine CH2 peut contenir d’autres modifications (par exemple, réduire ou éliminer la fonction effectrice).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée comprend une séquence d’acides aminés ayant au moins 95 % d’identité de séquence avec un domaine CH3 d’IgG, par exemple un domaine CH3 d’IgG1 humaine de type sauvage. Le domaine CH3 peut en outre comporter d’autres modifications pour conférer des allotypes spécifiques. D’une part, le domaine CH3 peut comprendre des modifications, par rapport à un allotype différent de l’IgG1 humaine de type sauvage. Dans certains cas, le domaine CH3 correspond à la séquence d’acides aminés du domaine CH3 des IgG1 humaines de type sauvage.
Dans certains modes de réalisation, une région Fc modifiée comprend au moins une substitution d’acide aminé à une position choisie dans le groupe constitué par : 230, 233, 234, 235, 236, 239, 240, 243, 264, 266, 268, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332 et 335, où la numérotation des acides aminés dans la région Fc étant celle de la numérotation UE. Dans certains modes de réalisation préférés, ladite région Fc modifiée comprend une substitution d’acide aminé choisie dans le groupe constitué par de : P230E, P230Y, P230G, E233N, E233Q, E233K, E233R, E233S, E233T, E233H, E233A, E233V, E233L, E233I, E233F, E233M, E233Y, E233W, E233G, L234K, L234R, L234S, L234A, L234M, L234W, L234P, L234G, L234A, L235E, L235K, L235R, L235A, L235A, L235M, L235W, L235P, L235G, G236D, G236E, G236A, G236N, G236Q, G236K, G236R, G236S, G236T, G236H, G236A, G236V, G236L, G236I, G236F, G236M, G236Y, G236W, G236P, S239Q, S239K, S239R, S239V, S239L, S239I, S239M, S239D, S239W, S239P, S239G, F243E, V264D, V264E, V264N, V264Q, V264K, V264R, V264S, V264H, V264W, V264P, V264G, H268D, H268E, H268Q, H268K, H268R, H268T, H268V, H268L, H268I, H268F, H268M, H268W, H268P, H268G, E272D, E272R, E272T, E272H, E272V, E272L, E272F, E272M, E272W, E272P, E272G, K274D, K274N, K274S, K274H, K274V, K274I, K274F, K274M, K274W, K274P, K274G, F275L, N276D, N276T, N276H, N276V, N276I, N276F, N276M, N276W, N276P, N276G, 278D, Y278N, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278H, Y278V, Y278L, Y278I, Y278M, Y278P, Y278G, E318Q, E318H, E318L, E318Y, S324H, S324F, S324M, S324W, S324P, S324G, S324T, N325K, N325R, N325S, N325F, N325M, N325Y, N325W, N325P, N325G, K326P, A327E, A327K, A327R, A327H, A327V, A327I, A327F, A327M, A327Y, A327W, A327P, L328D, L328Q, L328K, L328R, L328S, L328T, L328V, L328I, L328Y, L328W, L328P, L328G, P329D, P329E, P329N, P329Q, P329K, P329G, P329R, P329S, P329T, P329H, P329V, P329L, P329I, P329M, P329Y, P329W, P329G, A330E, A330L, A330N, A330T, A330P, A330G, P331D, P331Q, P331R, P331T, P331L, P331I, P331F, P331M, P331Y, P331W, I332K, I332R, I332S, I332E, I332V, I332L, I332F, I332M, I332W, I332P, I332G, E333L, E333F, E333M, E333P, K334P, T335N, T335S, T335H, T335V, T335L, T335I, T335F, T335M, T335W, T335P, T335G, où la numérotation des acides aminés dans la région Fc est celle de la numérotation UE.
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend la substitution d’acides aminés S239D, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend la substitution d’acides aminés I332E, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend la substitution d’acides aminés S324T, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend la substitution d’acides aminés H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend la substitution d’acides aminés A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend la substitution d’acides aminés G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D et I332E, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D et S324T, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E et S324T, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S324T et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S324T et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S324T et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés H268FL et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés H268F et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés A330L et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E et S324T, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, S324T et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, S324T et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, S324T et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, H268F et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, H268F et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, A330L et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E, S324T et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E, S324T et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E, S324T et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S324T, H268F et S239D, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S324T, H268F et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S324T, H268F et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés H268F, A330L et S239D, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés H268F, A330L et I332E, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés H268F, A330L et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés A330L, G236A et S239D, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés A330L, G236A et I332E, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés A330L, G236A et S324T, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés A330L, G236A et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E, S324T et H268F, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E, S324T et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E, S324T et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E, H268F et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E, H268F et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S239D, I332E, A330L et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E, S324T, H268F et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E, S324T, H268F et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés S324T, H268F, A330L et G236A, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée comprend les substitutions d’acides aminés I332E, S324T, H268F et A330L, selon la numérotation EU, par rapport à la région Fc WT, c’est à dire domaine CH2 d’une IgG1 humaine de type sauvage (par exemple SEQ ID N°1).
Dans certains modes de réalisation, les variantes de la région Fc modifiée sont sélectionnées dans le groupe constitué par S239D/H268F/S324T/I332E, S239D, I332E, S239D/I332E, S239D/S324T/I332E, S239D/H268F/I332E, A330L, A330L/I332E, G236A/S239D, G236A/S239D/A330L/I332E, G236A/S239D/I332E, L234A/L235A/P329G, où la numérotation des résidus dans la région Fc sont ceux de la numérotation UE.
Dans certains modes de réalisation, la séquence d’acides aminés de la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée correspond à la séquence d’acides aminés présentée dans l’une quelconque des SEQ ID N° 2 à 13.
De préférence, la [Région Fc modifiée] du polypeptide de formule (I) est choisie parmi la séquence d’acides aminés présentée dans l’une quelconque des SEQ ID N° 2 à 13.
Dans un mode de réalisation préféré, la séquence d’acides aminés de la région Fc modifiée et/ou le domaine CH2 de la région Fc modifiée correspond à la séquence d’acides aminés présentée dans la SEQ ID N° 2, appelée région Fc SDH.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide recombinant selon l’invention comprend une région Fc modifiée, dans laquelle le domaine CH2 contient ou ne contient pas d’autres modifications.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide recombinant selon l’invention comprend une région Fc modifiée, dans laquelle le domaine CH3 inclut ou n’inclut pas de modifications.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide recombinant selon l’invention comprend une région Fc modifiée, dans laquelle la région charnière peut être une région charnière d’IgG1 de type sauvage avec ou sans substitutions.
Dans certains modes de réalisation, le polypeptide recombinant selon l’invention comprend une région Fc modifiée, dans laquelle (a) le domaine CH2 comprend une ou plusieurs modifications par rapport au domaine CH2 d’IgG1 humaine de type sauvage, ou (b) le domaine CH3 comprend une ou plusieurs modifications par rapport au domaine CH3 d’IgG1 humaine de type sauvage ou (c) les deux domaines CH2 et CH3 comprennent une ou plusieurs modifications par rapport au domaine CH2 et CH3 d’IgG1 humaine de type sauvage, respectivement.
Dans certains modes de réalisation d’un polypeptide recombinant selon l’invention le domaine de liaison à un ligand compris dans celui-ci, contient, y compris, mais sans s’y limiter, les protéines, sous-unités, domaines, motifs et/ou épitopes appartenant à la liste de cibles suivantes : 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 Adenosine Receptor, A33, ACE, ACE-2, Activin, Activin A, Activin AB, Activin B, Activin C, Activin RIA, Activin RIA ALK-2, Activin RIB ALK-4, Activin RIIA, Activin RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Addressins, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alpha-1-antitrypsine, alpha-V/beta-1 antagonist, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artémine, anti-Id, ASPARTIC, Atrial natriuretic factor, av/b3 integrin, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-lymphocyte Stimulator (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 Osteogenin, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, BOK, Bombesin, Facteur neurotrophique dérivé des os, BPDE, BPDE-ADN, BTC, facteur 3 du complément (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, Calcitonine, cAMP, antigène carcino-embryonnaire (CEA), antigène associé aux carcinomes, Cathepsine A, Cathepsine B, Cathepsine C/DPPI, Cathepsine D, Cathepsine E, Cathepsine H, Cathepsine L, Cathepsine O, Cathepsin S, Cathepsin V, Cathepsin X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 proteins), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, Clostridium botulinum toxin, Clostridium perfringens toxin, CKb8-1, CLC, CMV, CMVUL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cytokeratin tumor-associated antigen, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Decay accelerating factor, des(1-3)-IGF-I (brain IGF-1), Dhh, digoxin, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, endothelin receptor, Enkephalinase, eNOS, Eot, eotaxin1, EpCAM, Ephrin B2/ EphB4, EPO, ERCC, E-selectin, ET-1, Factor IIa, Factor VII, Factor VIIIc, Factor IX, fibroblast activation protein (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, Ferritin, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, Fibrin, FL, FLIP, FIt-3, FIt-4, Follicle stimulating hormone, Fractalkine, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (Myostatin), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alpha1, GFR-alpha2, GFR-alpha3, GITR, Glucagon, Glut 4, glycoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, Growth hormone releasing factor, Hapten (NP-cap or NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB envelope glycoprotein, HCMV) gH envelope glycoprotein, HCMV UL, Hemopoietic growth factor (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), herpès simplex virus (HSV) gB glycoprotein, HSV gD glycoprotein, HGFA, High molecular weight melanoma-associated antigen (HMWMAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, human cardiac myosin, human cytomegalovirus (HCMV), human growth hormone (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA receptor, IgE, IGF, IGF binding proteins, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alpha, INFbeta, INF-gamma, Inhibin, iNOS, Insulin A-chain, Insulin B-chain, Insulin-like growth factor 1, integrin alpha2, integrin alpha3, integrin alpha4, integrin alpha4/beta1, integrin alpha4/beta7, integrin alpha5 (alphaV), integrin alpha5/beta1, integrin alpha5/beta3, integrin alpha6, integrin beta1, integrin beta2, interferon gamma, IP-10, I-TAC, JE, Kallikrein 2, Kallikrein 5, Kallikrein 6,, Kallikrein 11, Kallikrein 12, Kallikrein 14, Kallikrein 15, Kallikrein L1, Kallikrein L2, Kallikrein L3, Kallikrein L4, KC, KDR, Keratinocyte Growth Factor (KGF), laminin 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), Latent TGF-1, Latent TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, Lewis-Y antigen, Lewis-Y related antigen, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteins, LIX, LKN, Lptn, L-Selectin, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, Lung surfactant, Luteinizing hormone, Lymphotoxin Beta Receptor, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF receptor, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alpha, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucin (Muc1), MUC18, Muellerian-inhibitin substance, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-Cadherin, NCA 90, NCAM, NCAM, Neprilysin, Neurotrophin-3,-4, or -6, Neurturin, Neuronal growth factor (NGF), NGFR, NGFbeta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, Parathyroid hormone, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cadherin, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, placental alkaline phosphatase (PLAP), PIGF, PLP, PP14, Proinsulin, Prorelaxin, Protein C, PS, PSA, PSCA, prostate specific membrane antigen (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, Relaxin A-chain, Relaxin B-chain, renin, respiratory syncytial virus (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Rheumatoid factors, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, Serum albumin, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARC, TCA-3, T-cell receptors (e.g., T-cell receptor alpha/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, testicular PLAP-like alkaline phosphatase, TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF-beta RI (ALK-5), TGF-beta RII, TGF-beta Rllb, TGF-beta RIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, Thrombin, Thymus Ck-1, Thyroid stimulating hormone, Tie, TIMP, TIQ, Tissue Factor, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alpha, TNF-alpha beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (Ligand Apo-2 TRAIL, TL2), TNFSF11 (Ligand TRANCE/RANK ODF, OPG Ligand), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 Ligand, DR3 Ligand), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGAND HVEM LIGHT, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR Ligand AITR Ligand, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectine, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 Ligand gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 Ligand CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas Ligand Apo-1 Ligand, APT1 Ligand), TNFSF7 (CD27 Ligand CD70), TNFSF8 (CD30 Ligand CD153), TNFSF9 (4-1 BB Ligand CD137 Ligand), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, transfert récepteur, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antigène associé à la tumeur CA 125, antigène associé à la tumeur exprimant Lewis Hydrate de carbone lié à l’Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urokinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VEcadherin- 2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, Antigènes viraux, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR intégrine, facteur von Willebrands, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, et les récepteurs des hormones et des facteurs de croissance, etc.
Dans certains modes de réalisation d’un polypeptide recombinant selon l’invention, le domaine de liaison à un ligand compris dans celui-ci, est capable de se lier à un ligand défini, mais sans s’y limiter, par les protéines, sous-unités, domaines, motifs et/ou épitopes appartenant à la liste de cibles suivantes : 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 Adenosine Receptor, A33, ACE, ACE-2, Activin, Activin A, Activin AB, Activin B, Activin C, Activin RIA, Activin RIA ALK-2, Activin RIB ALK-4, Activin RIIA, Activin RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Addressins, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alpha-1-antitrypsine, alpha-V/beta-1 antagonist, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artémine, anti-Id, ASPARTIC, Atrial natriuretic factor, av/b3 integrin, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-lymphocyte Stimulator (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 Osteogenin, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, BOK, Bombesin, Facteur neurotrophique dérivé des os, BPDE, BPDE-ADN, BTC, facteur 3 du complément (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, Calcitonine, cAMP, antigène carcino-embryonnaire (CEA), antigène associé aux carcinomes, Cathepsine A, Cathepsine B, Cathepsine C/DPPI, Cathepsine D, Cathepsine E, Cathepsine H, Cathepsine L, Cathepsine O, Cathepsin S, Cathepsin V, Cathepsin X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 proteins), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, Clostridium botulinum toxin, Clostridium perfringens toxin, CKb8-1, CLC, CMV, CMVUL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cytokeratin tumor-associated antigen, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Decay accelerating factor, des(1-3)-IGF-I (brain IGF-1), Dhh, digoxin, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, endothelin receptor, Enkephalinase, eNOS, Eot, eotaxin1, EpCAM, Ephrin B2/ EphB4, EPO, ERCC, E-selectin, ET-1, Factor IIa, Factor VII, Factor VIIIc, Factor IX, fibroblast activation protein (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, Ferritin, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, Fibrin, FL, FLIP, FIt-3, FIt-4, Follicle stimulating hormone, Fractalkine, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (Myostatin), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alpha1, GFR-alpha2, GFR-alpha3, GITR, Glucagon, Glut 4, glycoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, Growth hormone releasing factor, Hapten (NP-cap or NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB envelope glycoprotein, HCMV) gH envelope glycoprotein, HCMV UL, Hemopoietic growth factor (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), herpès simplex virus (HSV) gB glycoprotein, HSV gD glycoprotein, HGFA, High molecular weight melanoma-associated antigen (HMWMAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, human cardiac myosin, human cytomegalovirus (HCMV), human growth hormone (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA receptor, IgE, IGF, IGF binding proteins, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alpha, INFbeta, INF-gamma, Inhibin, iNOS, Insulin A-chain, Insulin B-chain, Insulin-like growth factor 1, integrin alpha2, integrin alpha3, integrin alpha4, integrin alpha4/beta1, integrin alpha4/beta7, integrin alpha5 (alphaV), integrin alpha5/beta1, integrin alpha5/beta3, integrin alpha6, integrin beta1, integrin beta2, interferon gamma, IP-10, I-TAC, JE, Kallikrein 2, Kallikrein 5, Kallikrein 6,, Kallikrein 11, Kallikrein 12, Kallikrein 14, Kallikrein 15, Kallikrein L1, Kallikrein L2, Kallikrein L3, Kallikrein L4, KC, KDR, Keratinocyte Growth Factor (KGF), laminin 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), Latent TGF-1, Latent TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, Lewis-Y antigen, Lewis-Y related antigen, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteins, LIX, LKN, Lptn, L-Selectin, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, Lung surfactant, Luteinizing hormone, Lymphotoxin Beta Receptor, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF receptor, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alpha, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucin (Muc1), MUC18, Muellerian-inhibitin substance, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-Cadherin, NCA 90, NCAM, NCAM, Neprilysin, Neurotrophin-3,-4, or -6, Neurturin, Neuronal growth factor (NGF), NGFR, NGFbeta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, Parathyroid hormone, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cadherin, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, placental alkaline phosphatase (PLAP), PIGF, PLP, PP14, Proinsulin, Prorelaxin, Protein C, PS, PSA, PSCA, prostate specific membrane antigen (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, Relaxin A-chain, Relaxin B-chain, renin, respiratory syncytial virus (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Rheumatoid factors, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, Serum albumin, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARC, TCA-3, T-cell receptors (e.g., T-cell receptor alpha/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, testicular PLAP-like alkaline phosphatase, TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF-beta RI (ALK-5), TGF-beta RII, TGF-beta Rllb, TGF-beta RIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, Thrombin, Thymus Ck-1, Thyroid stimulating hormone, Tie, TIMP, TIQ, Tissue Factor, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alpha, TNF-alpha beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (Ligand Apo-2 TRAIL, TL2), TNFSF11 (Ligand TRANCE/RANK ODF, OPG Ligand), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 Ligand, DR3 Ligand), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGAND HVEM LIGHT, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR Ligand AITR Ligand, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectine, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 Ligand gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 Ligand CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas Ligand Apo-1 Ligand, APT1 Ligand), TNFSF7 (CD27 Ligand CD70), TNFSF8 (CD30 Ligand CD153), TNFSF9 (4-1 BB Ligand CD137 Ligand), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, transfert récepteur, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antigène associé à la tumeur CA 125, antigène associé à la tumeur exprimant Lewis Hydrate de carbone lié à l’Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urokinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VEcadherin- 2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, Antigènes viraux, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR intégrine, facteur von Willebrands, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, et les récepteurs des hormones et des facteurs de croissance, etc.
Selon un mode de réalisation préféré du polypeptide recombinant, le domaine de liaison à un ligand est capable de se lier à une molécule cible telle qu’un anticorps. Selon ce mode de réalisation, le domaine de liaison à un ligand est apte à se lier à un anticorps, et tout particulièrement à la région variable d’un anticorps.
Selon un mode de réalisation, un polypeptide recombinant de l’invention, c’est-à-dire un polypeptide ayant une (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand qui est capable de se lier à un ligand, qui n’est pas un anticorps.
En particulier, selon un mode de réalisation, un polypeptide recombinant de l’invention, c’est-à-dire un polypeptide ayant une (i) une région Fc modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ne présente pas de région variable ou hypervariable d’un anticorps.
Selon un mode de réalisation, un polypeptide recombinant de l’invention, c’est-à-dire un polypeptide ayant une (i) une région Fc modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, peut être un anticorps.
Dans un mode de réalisation, un polypeptide recombinant de l’invention peut être un anticorps entièrement humain ou un anticorps humanisé, et en outre comparé au même anticorps qui n’a pas de région Fc modifiée, il peut présenter une ou plusieurs propriétés améliorées ou modifiées. Ces propriétés comprennent la spécificité de liaison avec le récepteur FcγRIII des cellules NK ou toute cellule exprimant ce récepteur FcγRIII ou l’amélioration de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps.
Dans certains modes de réalisation dans lesquels un polypeptide recombinant selon l’invention est un anticorps, il peut s’agir d’un anticorps de départ de structure connue et dont la partie Fc a été modifiée comme défini dans la présente description. L’anticorps de départ de structure connue peut être choisi parmi Abagovomab, Abatacept, Abciximab, Abituzumab, Abrilumab, Actoxumab, Adalimumab, Adecatumab, Aducanumab, Aflibercept, Afutuzymab, Alacizumab, Alefacept, Alemtuzumab, Alirocumab, Altumomab, Amatixumab, Anatumomab, Anetumab, Anifromumab, Anrukinzumab, Apolizumab, Arcitumomab, Ascrinvacumab, Aselizumab, Atezolizumab, Atinumab, Altizumab, Atorolimumab, Bapineuzumab, Basiliximab, Bavituximab, Bectumomab, Begelomab, Belatacept, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Bezlotoxumab, Biciromab, Bimagrumab, Bimekizumab, Bivatuzumab, Blinatumomab, Blosozumab, Bococizumab, Brentuximab, Briakimumab, Brodalumab, Brolucizumab, Bronticizumab, Canakinumab, Cantuzumab, Caplacizumab, Capromab, Carlumab, Catumaxomab, Cedelizumab, Certolizumab, Cetixumab, Citatuzumab, Cixutumumab, Clazakizumab, Clenoliximab, Clivatuzumab, Codrituzumab, Coltuximab, Conatumumab, Concizumab, Crenezumab, Dacetuzumab, Daclizumab, Dalotuzumab, Dapirolizumab, Daratumumab, Dectrekumab, Demcizumab, Denintuzumab, Denosumab, Derlotixumab, Detumomab, Dinutuximab, Diridavumab, Dorlinomab, Drozitumab, Dupilumab, Durvalumab, Dusigitumab, Ecromeximab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Eldelumab, Elgemtumab, Elotuzumab, Elsilimomab, Emactuzumab, Emibetuzumab, Enavatuzumab, Enfortumab, Enlimomab, Enoblituzumab, Enokizumab, Enoticumab, Ensituximab, Epitumomab, Epratuzomab, Erlizumab, Ertumaxomab, Etanercept, Etaracizumab, Etrolizumab, Evinacumab, Evolocumab, Exbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab, Farletuzomab, Fasimumab, Felvizumab, Fezkimumab, Ficlatuzumab, Figitumumab, Firivumab, Flanvotumab, Fletikumab,Fontolizumab, Foralumab, Foravirumab, Fresolimumab, Fulramumab, Futuximab, Galiximab, Ganitumab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab, Gevokizumab, Girentuximab, Glembatumumab, Golimumab, Gomiliximab, Guselkumab, Ibalizumab, Ibritumomab, Icrucumab, Idarucizumab, Igovomab, Imalumab, Imciromab, Imgatuzumab, Inclacumab, Indatuximab, Indusatumab, Infliximab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab, Ipilimumab, Iratumumab, Isatuximab, Itolizumab, Ixekizumab, Keliximab, Labetuzumab, Lambrolizumab, Lampalizumab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lenzilumab, Lerdelimumab, Lexatumumab, Libivirumab, Lifastuzumab, Ligelizumab, Lilotomab, Lintuzumab, Lirilumab, Lodelcizumab, Lokivetmab, Lorvotuzumab, Lucatumumab, Lulizumab, Lumiliximab, Lumretuzumab, Mapatumumab, Margetuximab, Maslimomab, Mavrilimumab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minetumomab, Mirvetuximab, Mitumomab, Mogamulizumab, Morolimumab, Motavizumab, Moxetumomab, Muromonab-CD3, Nacolomab, Namilumab, Naptumomab, Narnatumab, Natalizumab, Nebacumab, Necitumumab, Nemolizumab, Nerelimomab, Nesvacumab, Nimotuzumab, Nivolumab, Nofetumomab, Obiltoxaximab, Obinutuzumab, Ocaratuzumab, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Olokizumab, Omalizumab, Onartuzumab, Ontuxizumab, Opicinumab, Oportuzumab, Oregovomab, Orticumab, Otelixizumab, Oltertuzumab, Oxelumab, Ozanezumab, Ozoralizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Panitumumab, Pankomab, Panobacumab, Parsatuzumab, Pascolizumab, Pasotuxizumab, Pateclizumab, Patritumab, Pembrolizumab, Pemtumomab, Perakizumab, Pertuzumab, Pexelizumab, Pidilizumab, Pinatuzumab, Pintumomab, Polatuzumab, Ponezumab, Priliximab, Pritumumab, Quilizumab, Racotumomab, Radretumab, Rafivirumab, Ralpancizumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raxibacumab, Refanezumab, Regavirumab, Reslizumab, Rilonacept, Rilotumumab, Rinucumab, Rituximab, Robatumumab, Roledumab, Romosozumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Sacituzumab, Samalizumab, Sarilumab, Satumomab, Secukimumab, Seribantumab, Setoxaximab, Sevirumab, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuximab, Siplizumab, Sirukumab, Sofituzumab, Solanezumab, Solitomab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulesomab, Suvizumab, Tabalumab, , Tacatuzumab, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab, Tarextumab, Tefibazumab, Telimomab aritox, Tenatumomab, Teneliximab, Teplizumab, Tesidolumab, TGN 1412, Ticlimumab, Tildrakizumab, Tigatuzumab, TNX-650, Tocilizumab, Toralizumab, Tosatoxumab, Tositumomab, Tovetumab, Tralokimumab, Trastuzumab, TRBS07, Tregalizumab, Tremelimumab, Trevogrumab, Tucotuzumab, Tuvirumab, Ublituximab, Ulocuplumab, Urelumab, Urtoxazumab, Ustekimumab, Vandortuzumab, Vantictumab, Vanucizumab, Vapaliximab, Varlimumab, Vatelizumab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab, Vesencumab, Visilizumab, Volocixumab, Vorsetuzumab, Votumumab, Zalutumimab, Zanolimumab, Zatuximab, Ziralimumab, Ziv-Aflibercept, and Zolimomab.
Cellules NK (Natural Killer)
Dans un de ces objets, la présente invention met en œuvre une cellule NK (Natural Killer), de préférence allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK.
Une cellule NK est un lymphocyte capable de tuer des cellules cibles de manière spontanée, en faisant intervenir les molécules de classe 1 du CMH. La spécificité de ces cellules NK est d’être capable de lyser des cellules malades sans nécessiter d’activation préalable et sans rentrer en contact avec l’agent pathogène.
Les cellules NK de la présente invention peuvent être dérivées de toute source qui comprend de telles cellules. Les cellules NK se trouvent dans de nombreux tissus et peuvent être obtenues, par exemple, à partir des ganglions lymphatiques, de la rate, du foie, des poumons, des intestins, des caduques et peuvent également être obtenues à partir de cellules iPS ou de cellules souches embryonnaires (ESC). Généralement, le sang du cordon, le sang périphérique, le sang périphérique mobilisé et la moelle osseuse, qui contiennent des populations hétérogènes de cellules lymphocytaires, sont utilisés pour fournir un grand nombre de cellules NK pour la recherche et l’utilisation clinique.
Ainsi, selon certains modes de réalisation de la présente invention, la méthode comprend la culture d’une population de cellules NK, de préférence allogéniques ou autologues vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, dérivées de l’un des éléments suivants : sang de cordon, sang périphérique ou moelle osseuse et de préférence de sang de cordon. Dans certains modes de réalisation, les cellules NK sont cultivées à partir d’une population cellulaire hétérogène comprenant des cellules NK, des cellules CD3-et des cellules CD3+. Dans une autre variante, la population de cellules NK est sélectionnée ou enrichie pour les cellules NK. Dans certains cas, les cellules NK peuvent être propagées à partir de populations de cellules fraîches, tandis que d’autres cas propagent des cellules NK à partir de populations de cellules stockées (telles que les cellules cryopréservées et décongelées) ou de populations de cellules cultivées précédemment.
Les cellules NK sont associées à la fraction de cellules mononucléaires du sang de cordon ou du sang périphérique ou de la moelle osseuse.
Dans un mode de réalisation, la population de cellules comprenant lesdites cellules NK est une population de cellules mononucléaires ou de cellules nucléaires totales appauvries en cellules CD3+, ou en cellules CD3+/CD19+.
Dans un autre mode de réalisation, la population de cellules comprenant les cellules NK est une population de cellules NK non sélectionnées.
Dans un autre mode de réalisation, les cellules sont sélectionnées et les cellules NK comprennent des cellules CD45+/CD56+/CD3-et/ou CD45+/CD56+/CD3-/CD16+. Les méthodes de sélection des cellules NK en fonction du phénotype (par exemple, immunodétection et analyse par cytométrie de flux) sont bien connues de l’homme du métier.
Le plus souvent, les échantillons de sang de cordon ou de moelle osseuse sont ensuite traités pour obtenir des populations de cellules avant de placer les cellules NK dans le milieu de culture (ou tampon). Par exemple, l’échantillon de sang de cordon peut être traité pour enrichir ou purifier ou isoler des populations spécifiques de cellules définies. Les termes "purifier" et "isoler" n’exigent pas une pureté absolue ; il s’agit plutôt de termes relatifs. Ainsi, par exemple, une population de cellules NK purifiée est une population dans laquelle les cellules spécifiées sont plus enrichies que celles qui se trouvent dans son tissu d’origine. Une préparation de cellules NK sensiblement pures peut être enrichie de telle sorte que les cellules souhaitées représentent au moins 50 % du total des cellules présentes dans la préparation. Dans certains types de préparations, une population de cellules NK substantiellement pures représente au moins 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % ou plus du total des cellules présentes dans la préparation.
Les méthodes d’enrichissement et d’isolement des lymphocytes (cellules CD45+) sont bien connues dans le domaine. Par exemple, selon un mode de réalisation, les globules rouges sont éliminés de l’échantillon biologique afin de garder que les lymphocytes. Dans sa forme la plus simple, l’élimination des globules rouges peut impliquer la centrifugation de sang entier ou de moelle osseuse non coagulé. En fonction de la densité, les globules rouges sont séparés des lymphocytes et des autres cellules. Les fractions riches en lymphocytes peuvent ensuite être récupérées de manière sélective. Les lymphocytes et leurs progéniteurs peuvent également être enrichis par centrifugation en utilisant des milieux de séparation tels que le milieu de séparation des lymphocytes (MSL) standard disponible auprès de diverses sources commerciales. Les lymphocytes et leurs progéniteurs peuvent également être enrichis en utilisant diverses procédures basées sur l’affinité. De nombreuses méthodes de préparation par affinité à base d’anticorps sont connues dans l’art, comme les billes magnétiques conjuguées à des anticorps. L’enrichissement des lymphocytes peut également être réalisé à l’aide de préparations disponibles dans le commerce pour la sélection négative de cellules indésirables, telles que FICOLL-HYPAQUE™ et d’autres milieux à gradient de densité formulés pour l’enrichissement de cellules NK.
Les méthodes de sélection des cellules NK à partir d’échantillons de sang, de moelle osseuse ou de tissus sont bien connues dans le domaine (voir, par exemple, US5770387 de Litwinet al). Les protocoles les plus couramment utilisés sont basés sur l’isolement et la purification des cellules CD56+, généralement après fractionnement des cellules mononucléaires, et l’épuisement des cellules non-NK telles que CD3+, CD34+, CD133+etc. Des combinaisons de deux ou plusieurs protocoles peuvent être utilisées pour fournir des populations de cellules NK ayant une plus grande pureté par rapport aux contaminants non-NK. Les kits disponibles dans le commerce pour l’isolement des cellules NK comprennent des procédures en une étape (par exemple, les microbilles CD56 et les kits d’isolement de CD56+, CD56+/CD16+de Miltenyi Biotec, Auburn CA), et des procédures en plusieurs étapes, y compris la déplétion, ou la déplétion partielle, de CD3+ou la déplétion avec des anticorps de cellules non-NK reconnaissant et éliminant les cellules T (par exemple, OKT-3), les cellules B, les cellules souches, les cellules dendritiques, les monocytes, les granulocytes et les cellules érythroïdes. Ainsi, dans certaines incarnations, les cellules NK sont sélectionnées CD45+/CD56+CD3-, CD45+/CD56+/ CD3-/CD16+, CD45+/CD56+/CD3-/CD16-, de préférence CD45+/CD56+/CD3-/CD16+.
Les cellules NK sont ensuite mises en cultures et conservées par toutes méthodes connues par l’homme du métier, avant d’être incubées avec les polypeptides recombinants de l’invention, obtenant des cellules NK armées. Les cellules NK peuvent être conservées jusqu’à 7 jours, ou jusqu’à 3 semaines avant d’être « armées ». Ainsi, dans certains modes de réalisation, la culture de la population de cellules NK dure au moins 3, au moins 5, au moins 7, éventuellement 10, éventuellement 12, éventuellement 14, éventuellement 16, éventuellement 18, éventuellement 20 et éventuellement 21 jours, ou 1, 2 ou 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, ou plus.
Les populations de cellules NK peuvent être cultivées à l’aide de diverses méthodes et dispositifs. Le choix des appareils de culture est généralement basé sur l’échelle et l’objectif de la culture. La mise à l’échelle de la culture de cellules implique de préférence l’utilisation d’appareils dédiés. Les appareils pour la production de cellules NK à grande échelle et de qualité clinique sont détaillés, par exemple, dans Spanholtzet al.(PLoS ONE 2010;5:e9221) et Sutluet al.(Cytotherapy 2010, Early Online 1-12).
Dans un certain mode de réalisation, les cellules NK mises en œuvre dans l’invention sont des cellules provenant d’un autre organisme humain que l’individu à traiter, dites allogéniques.
Dans un certain mode de réalisation, les cellules NK mises en œuvre dans l’invention sont des cellules provenant de l’individu à traiter lui-même, dites autologues.
Cellule NK en combinaison avec un polypeptide recombinant
Selon un de ces objets, la présente demande concerne une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant, dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc modifiée, capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, et (ii) un domaine capable de se lier à un antigène ; pour utilisation comme médicament.
Deux modes de réalisation d’un polypeptide recombinant selon l’invention sont illustrés en . Sur la partie gauche de la est représenté un polypeptide recombinant selon l’invention comprenant (i) une région Fc modifiée et (ii) un domaine de liaison à un ligand, dans lequel le domaine de liaison à un ligand comprend, ou consiste en, un antigène. Sur la partie droite de la est représenté un polypeptide recombinant selon l’invention comprenant (i) une région Fc modifiée et (ii) un domaine de liaison à un ligand, dans lequel le domaine de liaison à un ligand comprend, ou consiste en, le domaine de liaison à l’antigène d’un anticorps.
Ainsi, les inventeurs ont mis en œuvre un produit universel de thérapie cellulaire basé sur les cellules NK. Contrairement aux cellules CAR-T, la spécificité pour détruire les cellules cibles n’est pas obtenue par les cellules NK elles-mêmes mais par des peptides spécifiques reconnaissant ces cellules cibles. La présente combinaison cellule NK – polypeptide recombinant peut donc être élargie à toutes sortes de pathologies, par la conception de polypeptides spécifiques, notamment en combinant un antigène spécifique au polypeptide recombinant de l’invention.
La présente invention fournit des composés de construction (A) tel que :
La présente invention englobe les composés de construction (B) :
dans lesquelles [Cellule NK] est une cellule NK telle que définie précédemment dans la présente demande, [polypeptide recombinant de formule (I)] est un polypeptide ou un anticorps tel que défini précédemment dans la présente demande.
Dans un mode de réalisation, le domaine de liaison à un ligand est capable de se lier à un ligand de type antigène, lequel antigène peut être choisi parmi les antigènes viraux, les antigènes tumoraux, les antigènes de maladies infectieuses, les antigènes auto-immuns, les toxines ou des combinaisons de ceux-ci.
Dans certains modes de réalisation, le domaine de liaison à un ligand est capable de se lier à un ligand qui est un concatémère peptidique.
Dans certains modes de réalisation, le domaine de liaison à un ligand est capable de se lier à un ligand choisi parmi laglutamate décarboxylase 65 (GAD 65), l’ADN naturel, la protéine basique de la myéline, la protéine protéolipidique de la myéline, le composant récepteur de l’acétylcholine, la thyroglobuline, le récepteur de l’hormone thyréostimulante (TSH) et des peptides citrullinés.
Dans certains autres modes de réalisation, le domaine de liaison à un ligand est capable de se lier à un ligand du type antigène, lequel antigène est sélectionné à partir d’un antigène de cancer, de maladie infectieuse choisi parmi les antigènes bactériens, viraux, parasitaires et fongiques, de maladie auto-immune et ses dérivés.
Selon un mode de réalisation, un antigène du cancer, auquel est capable de se lier le domaine de liaison à un ligand d’un polypeptide recombinant selon l’invention, peut être un antigène d’un cancer sélectionné parmi : mélanome, cancer du rein, cancer de la prostate, cancer du sein, cancer du côlon, cancer de l’ovaire, cancer du poumon, cancer des os, cancer du pancréas, cancer de la peau, cancer de la tête ou du cou, mélanome malin cutané ou intraoculaire, cancer de l’utérus, cancer rectal, cancer de la région anale, cancer de l’estomac, cancer du testicule, cancer de l’utérus, carcinome de la trompe de Fallope, carcinome de l’endomètre, carcinome du col de l’utérus, carcinome du vagin, carcinome de la vulve, maladie de Hodgkin, lymphome non hodgkinien, cancer de l’oesophage, cancer de l’intestin grêle, cancer du système endocrinien, cancer de la glande thyroïde, cancer de la glande parathyroïde, cancer de la glande surrénale, sarcome des tissus mous, cancer de l’urètre, cancer du pénis, leucémies chroniques ou aiguës y compris leucémie myéloïde aiguë, leucémie myéloïde chronique, leucémie aiguë lymphoblastique, leucémie lymphoïde chronique, tumeurs solides de l’enfance, lymphome lymphoïde, cancer de la vessie, cancer du rein ou de l’uretère, carcinome du pelvis rénal, néoplasme du système nerveux central (SNC), lymphome primaire du SNC, angiogenèse tumorale, tumeur de l’axe rachidien, gliome du tronc cérébral, adénome de l’hypophyse, sarcome de Kaposi, cancer épidermoïde, cancer à cellules squameuses, lymphome à lymphocytes T, cancers induits par l’environnement et des combinaisons desdits cancers.
Selon certains modes de réalisation, un antigène d’une maladie infectieuse, auquel est capable de se lier le domaine de liaison à un ligand d’un polypeptide recombinant selon l’invention, peut être un antigène d’une maladie infectieuse sélectionnée parmi : (a) une maladie choisie parmi grippe, herpès, giardiose, paludisme et leishmaniose; (b) une infection pathogène par un virus choisi parmi le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), le virus de l’hépatite, le virus de l’herpès, l’adénovirus, le virus de la grippe, les flavivirus, l’écho virus, le rhinovirus, le coxsachie virus, les cornovirus, le virus respiratoire syncytial, virus des oreillons, rotavirus, virus de la rougeole, virus de la rubéole, parvovirus, virus de la vaccine, virus HTLV, virus de la dengue, papillomavirus, virus molluscum, virus de la poliomyélite, virus de la rage, virus JC et virus de l’encéphalite arbovirale; (c) une infection pathogène par une bactérie choisie parmi Chlamydia, bactéries ricketsies, mycobactéries, staphylocoques, streptocoques, pneumocoques, méningocoques et gonocoques, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Diphteria, Salmonella, Bacilli, choléra, tétanus, botulisme, maladie du charbon, peste, leptospirose et les bactéries de la maladie de Lyme; (d) une infection pathogène par un champignon choisi parmi Candida, Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Genus Mucorales, Sporothrix schenkü, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis et Histoplasma capsulatum; ou (e) une infection pathogène par un parasite choisi parmi Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lamblia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinü, Plasmodium virax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondü et Nippostrongylus brasiliensis.
Selon certains modes de réalisation, un antigène d’une maladie auto-immune ou un de ses dérivés, auquel est capable de se lier le domaine de liaison à un ligand d’un polypeptide recombinant selon l’invention, peut être un antigène sélectionné parmi les maladies ou dérivés suivants : le rejet de greffe d’organes, la maladie du greffon contre l’hôte, la polyarthrite rhumatoïde le lupus érythémateux disséminé, la sclérodermie, le syndrome de Sjôgren primitif (ou Syndrome de Gougerot -Sjôgren), les polyneuropathies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto-immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l’arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite d’Hashimoto, la maladie d’Addison, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow, la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associés aux ANCA (anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles), les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l’adulte et de l’enfant, telles que les thrombopénies auto-immunes aiguës ou chroniques, les anémies hémolytiques auto-immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN), la maladie des agglutinines froides, le purpura thrombotique thrombocytopénique et l’hémophilie acquise auto-immune, le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses, les affections cutanées huileuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l’arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites et les affections systémiques auto-immunes de l’enfant incluant le syndrome des antiphospholipides.
Selon certains modes de réalisation, l’antigène, auquel est capable de se lier le domaine de liaison à un ligand d’un polypeptide recombinant selon l’invention, peut-être un antigène sélectionné parmi les maladies ou dérivés suivants : la thrombocytémie, les syndromes myélodysplasiques, les tumeurs bénignes et pour l’élimination des cellules sénescentes.
Dans certains modes de réalisation, les cellules NK armées de la présente invention sont utilisées pour lyser les cellules cibles qui portent l’antigène capable d’être reconnu par le polypeptide recombinant de l’invention, par exemple les cellules cancéreuses.
Dans certains modes de réalisation, les cellules NK armées de la présente invention sont utilisées pour lyser les cellules cibles qui reconnaissent l’antigène lié au polypeptide recombinant de l’invention, par exemple les cellules B autoréactives.
Selon certains modes de réalisation, les cellules NK armées peuvent être conservées jusqu’à 7 jours, ou jusqu’à 3 semaines avant d’être injectées chez un individu en ayant besoin. Ainsi, dans certains modes de réalisation, la culture de la population de cellules NK armées dure au moins 3, au moins 5, au moins 7, éventuellement 10, éventuellement 12, éventuellement 14, éventuellement 16, éventuellement 18, éventuellement 20 et éventuellement 21 jours, ou 1, 2 ou 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, ou plus. Les durées de culture exemplaires et non limitatives, telles que détaillées dans les exemples de la demande, sont de au moins 3 jours et au moins 7 jours.
Composition pharmaceutique
Il est également prévu des compositions, notamment des compositions pharmaceutiques, comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, formulées avec un excipient ou un véhicule pharmacologiquement ou pharmaceutiquement acceptable.
Ces compositions peuvent comprendre une ou plusieurs combinaisons des cellules NK armées de polypeptides recombinant selon l’invention (par exemple, deux ou plusieurs différents). Par exemple, une composition pharmaceutique décrite ici peut comprendre une combinaison de cellules NK armées qui se lient à différents épitopes sur l’antigène cible ou des anticorps ayant des activités complémentaires (ou des immunoconjugués ou bispécifiques).
Dans certains cas, la composition comporte au moins 1 mg / ml, 5 mg / ml, 10 mg / ml, 50 mg / ml, 100 mg / ml, 150 mg / ml, 200 mg / ml, 1-300 mg / ml ou 100-300 mg / ml de cellules NK armées.
Les compositions pharmaceutiques décrites ici peuvent également être administrées en thérapie combinée, c’est-à-dire en combinaison avec d’autres agents. Par exemple, la thérapie combinée peut inclure une cellule NK armée décrite ici en combinaison avec au moins un autre agent antipathogène et/ou un agent stimulant les cellules NK (par exemple, un activateur) Des exemples d’agents thérapeutiques qui peuvent être utilisés en combinaison sont décrits plus en détail ci-dessous dans la section sur l’utilisation des cellules NK armées décrites dans la présente demande.
Dans certains cas, les compositions pharmaceutiques décrites ici peuvent inclure d’autres composés, agents et/ou médicaments utilisés pour traiter des pathologies telles qu’un cancer, une maladie auto-immune et ses dérivés ou une maladie infectieuse. Ces composés, agents et/ou médicaments peuvent inclure, par exemple, des agents chimiothérapeutiques, des agents à petites molécules ou des anticorps qui stimulent une réponse immunitaire contre un cancer donné.
Les compositions pharmaceutiques décrites ici peuvent comprendre un ou plusieurs sels pharmaceutiquement acceptables. Par « sel pharmaceutiquement acceptable », on entend un sel qui conserve l’activité biologique souhaitée du composé d’origine et qui ne communique pas d’effets toxiques indésirables. Les sels d’addition d’acide et les sels d’addition de base sont des exemples de tels sels. Les sels d’addition d’acide comprennent les acides inorganiques non toxiques tels que l’acide chlorhydrique, l’acide nitrique, l’acide phosphorique, l’acide sulfurique, l’acide bromhydrique, l’acide iodhydrique, l’acide phosphorique, et les acides mono- et dicarboxyliques aliphatiques, les acides alcanoïques substitués par un phényle, les hydroxyalcanes Les sels dérivés d’acides organiques non toxiques tels que les acides, les acides aromatiques, les acides sulfoniques aliphatiques et aromatiques sont inclus. Les sels d’addition aux bases comprennent, par exemple, les métaux alcalino-terreux tels que le sodium, le potassium, le magnésium et le calcium, ainsi que le N,N′-dibenzyléthylènediamine, N-méthylglucamine, chloroprocaïne, choline, diéthanolamine, éthylènediamine, procaïne et autres. Les sels dérivés d’amines organiques toxiques sont inclus.
Les compositions pharmaceutiques décrites ici peuvent également inclure un antioxydant pharmaceutiquement acceptable. Les exemples d’antioxydants pharmaceutiquement acceptables comprennent (1) les antioxydants hydrosolubles tels que l’acide ascorbique, le chlorhydrate de cystéine, le bisulfate de sodium, le métabisulfite de sodium, le sulfite de sodium, etc. (2) les antioxydants solubles dans l’huile, les agents oxydants tels que le palmitate d’ascorbyle, l’hydroxyanisole butylé (BHA), l’hydroxytoluène butylé (BHT), la lécithine, le gallate de propyle, l’alpha-tocophérol et autres ; et (3) les chélateurs de métaux tels que l’acide citrique, l’acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), le sorbitol, l’acide tartrique, l’acide phosphorique et autres sont inclus.
Les exemples de supports aqueux ou non aqueux appropriés qui peuvent être utilisés dans les compositions pharmaceutiques décrites ici comprennent l’eau, l’éthanol, les polyols (par exemple, glycérol, propylène glycol, polyéthylène glycol, etc.) et leurs mélanges appropriés, les huiles végétales telles que l’huile d’olive et les esters organiques injectables tels que l’oléate d’éthyle. La fluidité appropriée peut être maintenue, par exemple, en conservant la taille de particules requise dans le cas d’une dispersion et en utilisant des agents de surface.
Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants tels que des conservateurs, des agents mouillants, des agents émulsifiants et des agents dispersants. La prévention de la présence de micro-organismes peut être assurée à la fois par les méthodes de stérilisation décrites ci-dessus et par l’inclusion de divers agents antibactériens et antifongiques tels que les parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l’acide sorbique et autres. Il peut également être souhaitable d’inclure dans la composition des agents isotoniques tels que les sucres, le chlorure de sodium. En outre, l’inclusion d’agents qui retardent l’absorption, tels que le monostéarate d’aluminium et la gélatine, peut retarder l’absorption de formes pharmaceutiques injectables.
Les supports pharmaceutiquement acceptables comprennent les solutions ou dispersions aqueuses stériles et les poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions ou dispersions injectables stériles. L’utilisation de tels supports et agents pour les substances pharmaceutiquement actives est bien connue dans le domaine. Sauf dans la mesure où un milieu ou agent conventionnel est incompatible avec le principe actif, son utilisation dans les compositions pharmaceutiques décrites ici est envisagée. Des substances actives supplémentaires peuvent également être incorporées dans les compositions.
Une composition pharmaceutique doit généralement être stérile et stable dans les conditions de fabrication et de stockage. La composition peut être formulée sous forme de solution, microémulsion, solution, microémulsion, liposome ou autre structure ordonnée adaptée à une concentration élevée de médicament. Le support peut être un solvant ou un milieu de dispersion contenant, par exemple, de l’eau, de l’éthanol, du polyol (par exemple, du glycérol, du propylène glycol et du polyéthylène glycol liquide, et autres), et des mélanges appropriés de ceux-ci. La fluidité appropriée peut être maintenue, par exemple, par l’utilisation d’un revêtement tel que la lécithine, par le maintien de la taille de particules requise dans le cas d’une dispersion et par l’utilisation d’agents de surface. Dans de nombreux cas, il sera préférable d’inclure des agents isotoniques, par exemple des sucres, des polyalcools tels que le mannitol et le sorbitol, ou du chlorure de sodium dans la composition. L’absorption retardée des compositions injectables peut être provoquée par l’inclusion dans la composition d’un agent qui retarde l’absorption, par exemple, les sels de monostéarate et la gélatine.
Les solutions injectables stériles peuvent être préparées en incluant le composé actif, c’est à dire des cellules NK armées, en quantité requise dans un solvant approprié, éventuellement avec un ou une combinaison des ingrédients énumérés ci-dessus, puis en stérilisant par microfiltration. En général, les dispersions sont préparées en incorporant le composé actif dans un véhicule stérile qui contient un milieu de dispersion de base et les autres ingrédients nécessaires parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas des poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, la méthode de préparation préférée est une méthode de séchage sous vide, dans laquelle une poudre du principe actif plus tout autre ingrédient souhaité est produite à partir de la solution filtrée préalablement stérilisée, et la lyophilisation.
La quantité de principe actif qui peut être combinée avec les matériaux de support pour produire une forme de dosage unique peut varier selon le sujet traité et le mode d’administration particulier. La quantité de principe actif, c’est à dire des cellules NK armées, qui peut être combinée avec un matériau de support pour produire une forme de dosage unique sera généralement la quantité de la composition qui produit un effet thérapeutique. Selon certains modes de réalisation, la quantité de principe actif, c’est à dire des cellules NK armées, est d’environ 0,01 % à environ 99 % par rapport à la quantité de composition finale, de préférence d’environ 0,1 % à environ 70 % par rapport à la quantité de composition finale, la plupart du temps combinée avec un support pharmaceutiquement acceptable.
Les schémas posologiques sont ajustés pour obtenir la réponse optimale souhaitée (par exemple, une réponse thérapeutique). Selon certains modes de réalisation, une seule administration en bolus est possible et plusieurs doses divisées peuvent être administrées sur une longue période de temps, ou la dose peut être réduite ou augmentée proportionnellement comme indiqué dans une situation de traitement imminent. De préférence, la formulation de compositions parentérales est sous forme de doses unitaires, notamment pour faciliter l’administration et l’uniformité du dosage.
Selon certains modes de réalisation, une forme de dosage unitaire désigne une unité physiquement qui convient comme dose unique pour l’individu à traiter ; chaque unité, associée au support pharmaceutique requis, produit l’effet thérapeutique souhaité.
Selon certains modes de réalisation, pour l’administration de cellules NK armées combinées avec ou sans antigène, le dosage varie entre environ 0,0001 et 100 mg, plus généralement entre 0,01 et 5 mg par kg de poids corporel de l’hôte. Par exemple, la posologie est comprise entre 0,3 mg / kg de poids corporel, 1 mg / kg de poids corporel, 3 mg / kg de poids corporel, 5 mg / kg de poids corporel ou 10 mg / kg de poids corporel, ou 1-10 mg / kg.
Selon certains modes de réalisation, un régime de traitement peut être une administration une fois par semaine, une fois toutes les deux semaines, une fois toutes les trois semaines, une fois toutes les quatre semaines, une fois par mois, une fois tous les trois mois, ou une fois tous les trois mois à six mois.
Selon certains modes de réalisation, les schémas posologiques préférés pour l’administration des compositions pharmaceutiques selon l’invention comprennent 1 mg / kg de poids corporel ou 3 mg / kg de poids corporel par administration intraveineuse. Notamment, la composition est administrée (i) 1 fois toutes les 4 semaines, suivies de (ii) 1 fois tous les 3 mois.
Dans certains modes de réalisation, deux ou plusieurs cellules NK armées ayant des spécificités de liaison différentes sont administrées simultanément, auquel cas la dose de chaque cellule NK armée administrée se situe dans les fourchettes indiquées. La cellule NK armée est généralement administrée à plusieurs reprises. L’intervalle entre les doses uniques peut être, par exemple, une fois par semaine, une fois par mois, tous les trois mois ou une fois par an. De plus, les intervalles peuvent être irréguliers. Dans certains modes de réalisation, le dosage est ajusté de manière à obtenir une concentration plasmatique de cellule NK armée d’environ 1-1000 μg / ml, et dans certains modes de réalisation, une concentration plasmatique de cellule NK armée d’environ 25-300 μg / ml.
La cellule NK armée peut être administrée sous forme de formulation à libération prolongée, auquel cas une administration moins fréquente est nécessaire. Le dosage et la fréquence varient en fonction de la demi-vie de cellule NK armée chez le patient. Les cellules NK armées de l’invention ont un temps de demi-vie la plus longue, d’environ 3 jours, et jusqu’à environ 7 joursin vivo.
Selon certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique est utilisée pour un traitement prophylactique ou thérapeutique. Le dosage et la fréquence d’administration peuvent varier selon que le traitement est prophylactique ou thérapeutique. Dans les applications prophylactiques, des doses relativement faibles sont administrées sur de longues périodes à des intervalles relativement peu fréquents. Certains patients continuent à recevoir un traitement pour le reste de leur vie. Dans les applications thérapeutiques, des doses relativement élevées à des intervalles relativement courts peuvent être nécessaires jusqu’à ce que la progression de la maladie soit réduite ou interrompue, de préférence jusqu’à ce que le patient présente une amélioration partielle ou complète des symptômes de la maladie. Par la suite, le patient peut se voir administrer un régime prophylactique.
Les niveaux de dosage réels des principes actifs des compositions pharmaceutiques selon l’invention ne sont pas toxiques pour le patient afin d’obtenir la réponse thérapeutique souhaitée pour l’individu, en particulier la composition et le mode d’administration. Il est possible de les faire varier pour obtenir une quantité efficace de principe actif. Le niveau de dosage sélectionné dépend de la composition particulière utilisée, ou de l’activité de son ester, sel ou amide, de la voie d’administration, du temps d’administration, du taux d’élimination du composé particulier utilisé, de la durée du traitement, des autres médicaments, composés et/ou substances utilisés en combinaison avec une composition particulière, de l’âge, du sexe, du poids, de l’état, de la santé générale et des antécédents médicaux de l’individu à traiter, ainsi que de facteurs similaires bien connus dans le domaine médical. Le niveau de dosage peut également varier en fonction de divers facteurs pharmacocinétiques.
Selon certains modes de réalisation, une dose thérapeutiquement efficace peut prévenir ou retarder l’apparition d’une pathologie. Par exemple, les tests de laboratoire utilisés pour diagnostiquer une maladie comprennent la chimie, l’hématologie, la sérologie et la radiologie. En conséquence, les essais cliniques ou biochimiques qui surveillent l’un des éléments ci-dessus peuvent être utilisés pour déterminer si un traitement particulier est une dose thérapeutiquement efficace pour traiter la maladie. Un homme de l’art peut déterminer de telles quantités en fonction de facteurs tels que la taille de l’individu, la gravité des symptômes de l’individu, et la composition particulière ou la voie d’administration choisie.
Les compositions pharmaceutiques selon l’invention peuvent être administrées selon une ou plusieurs méthodes connues dans le domaine, par une ou plusieurs voies d’administration. Comme l’appréciera l’homme du métier, la voie d’administration et/ou le mode d’administration variera en fonction du résultat souhaité.
Selon certains modes de réalisation préférées, les voies d’administration pour les cellules NK armées selon l’invention comprennent l’administration par voie intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, sous-cutanée, rachidienne ou toute autre voie d’administration parentérale telle que l’injection ou la perfusion.
Les cellules NK armées selon l’invention peuvent également être administrées par une voie d’administration topique, épithéliale ou muqueuse, par exemple une voie qui n’est pas parentérale, telle qu’intranasale, orale, vaginale, rectale, sublinguale ou topique.
Les composés actifs peuvent être préparés avec des supports qui protégeront le composé contre une libération rapide, comme une formulation à libération contrôlée, y compris les implants, les timbres transdermiques et les systèmes de délivrance microencapsulés. Des polymères biodégradables et biocompatibles peuvent être utilisés, tels que l’éthylène-acétate de vinyle, les polyanhydrides, l’acide polyglycolique, le collagène, les polyorthoesters et l’acide polylactique. De nombreuses méthodes pour la préparation de ces formulations sont brevetées ou généralement connues des spécialistes (Voir, par exemple, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, éd., Marcel Dekker, Inc, New York, 1978).
La composition thérapeutique peut être administrée à l’aide de dispositifs médicaux connus dans le domaine. Selon certains modes particuliers de l’invention, les compositions thérapeutiques selon l’invention incluent les dispositifs décrits dans US 5,399,163 ; US 5,383,851 ; US 5,312,335 ; US 064,413 ; US4,941,880 ; US 4,790,824 ; ou un dispositif d’injection hypodermique sans aiguille tel que le dispositif décrit dans US 4,596,556.
Parmi les exemples d’implants et de modules bien connus utilisés avec les cellules NK armées selon l’invention, on peut citer US 4,487,603 qui divulgue une pompe à microperfusion implantable pour l’administration de médicaments à un débit contrôlé. U.S 4,486,194 qui divulgue un dispositif thérapeutique pour administrer un médicament à travers la peau ; US 4,447,233 qui divulgue une pompe à perfusion pour administrer un médicament à un taux de perfusion précis ; US 4,447,224 qui divulgue un dispositif de perfusion implantable à débit variable pour l’administration continue d’un médicament ; US 4,439,196 qui divulgue un système osmotique d’administration de médicament ayant un compartiment multichambre; et US 4,475,196 qui divulgue des systèmes d’administration de médicaments osmotiques. De nombreux autres implants, systèmes d’administration et modules de ce type sont connus des spécialistes.
Dans certains cas, les cellules NK armées selon l’invention peuvent être formulées pour assurer une bonne distributionin vivo. Par exemple, la barrière hémato-encéphalique (BHE) exclut de nombreux composés hautement hydrophiles. Pour garantir que les composés thérapeutiques selon l’invention traversent la BHE (si on le souhaite), ils peuvent être formulés, par exemple, dans des liposomes. (Voir, par exemple, US 4,522,811, US 5,374,548 et US 5,399,331 pour les méthodes de fabrication des liposomes). Les liposomes peuvent contenir une ou plusieurs substances qui sont transportées de manière sélective vers des cellules ou des organes spécifiques, et peuvent donc améliorer l’administration ciblée de médicaments (voir, par exemple, VV Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 : 685).
Méthodes thérapeutiques
Comme indiqué précédemment, ladite combinaison d’une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK capable de lier un polypeptide recombinant selon l’invention, et dudit polypeptide recombinant sont des actifs qui peuvent être mis en œuvre comme médicament.
Selon un mode de réalisation ladite cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK, et le dit polypeptide recombinant peuvent être co-administrés.
Selon un mode de réalisation ladite cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK, et ledit polypeptide recombinant peuvent être administrés de manière séquentielle.
Selon un mode de réalisation ladite cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK, et ledit polypeptide recombinant peuvent être administrés au sein d’un complexe non-covalent.
Ainsi, selon un mode de réalisation principal, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur ; pour utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant liée à ladite cellule NK ou à son précurseur ; pour utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc modifiée comprenant un domaine CH2 modifié, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur ; pour utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc modifiée comprenant un domaine CH2 modifié, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant liée à ladite cellule NK ou à son précurseur ; pour utilisation comme médicament.
Selon un autre mode de réalisation principal, l’invention concerne une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant, dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; pour utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant, dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, liée à ladite cellule NK ou à son précurseur, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; pour utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant, dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée comprenant un domaine CH2 modifié, capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; pour utilisation comme médicament.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant, dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée comprenant un domaine CH2 modifié, liée à ladite cellule NK ou à son précurseur, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; pour utilisation comme médicament.
Selon un autre mode de réalisation principal, l’invention concerne un kit comprenant :
- une première partie incluant une cellule NK ou un précurseur de cellule NK ;
- une deuxième partie incluant un polypeptide recombinant comprenant (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à un précurseur de cellule NK ;
pour une utilisation en tant que médicament.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention concerne un kit comprenant :
- une première partie incluant une cellule NK ou un précurseur de cellule NK ;
- une deuxième partie incluant un polypeptide recombinant comprenant (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée comprenant un domaine CH2 modifié, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à un précurseur de cellule NK ;
pour une utilisation en tant que médicament.
Selon un autre objet de la présente invention, une composition pharmaceutique selon l’invention, une cellule NK allogénique ou autologue ou précurseur de cellule NK selon l’invention ou un kit selon l’invention est notamment utilisé dans une méthode thérapeutique pour traiter ou prévenir un cancer, une maladie auto-immune et ses dérivés ou une maladie infectieuse chez un individu en ayant besoin.
Un individu ou patient considéré selon l’invention peut être un mammifère. Un mammifère visé par l’invention peut être, par exemple, choisi parmi des animaux domestiques, (tels que les bovins, les ovins, les chats, les chiens, et les chevaux), notamment les chats et les chiens, les primates, tels que les primates humains et non-humains, les lapins, et les rongeurs, tels que les souris et les rats. Selon un mode de réalisation, un individu ou patient visé par l’invention peut être un être humain.
Une cellule NK, de préférence allogénique ou autologue vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK en combinaison avec un polypeptide recombinant selon l’invention peut convenir en particulier pour une utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un cancer, notamment pour inhiber la croissance de cellules tumorales chez un individu en ayant besoin.
Selon un mode de réalisation, un cancer ou des cellules tumorales liées au cancer peuvent faire partie du ; mélanome, cancer du rein, cancer de la prostate, cancer du sein, cancer du côlon, cancer de l’ovaire, cancer du poumon, cancer des os, cancer du pancréas, cancer de la peau, cancer de la tête ou du cou, mélanome malin cutané ou intraoculaire, cancer de l’utérus, cancer rectal, cancer de la région anale, cancer de l’estomac, cancer du testicule, cancer de l’utérus, carcinome de la trompe de Fallope, carcinome de l’endomètre, carcinome du col de l’utérus, carcinome du vagin, carcinome de la vulve, maladie de Hodgkin, lymphome non hodgkinien, cancer de l’œsophage, cancer de l’intestin grêle, cancer du système endocrinien, cancer de la glande thyroïde, cancer de la glande parathyroïde, cancer de la glande surrénale, sarcome des tissus mous, cancer de l’urètre, cancer du pénis, leucémies chroniques ou aiguës y compris leucémie myéloïde aiguë, leucémie myéloïde chronique, leucémie aiguë lymphoblastique, leucémie lymphoïde chronique, tumeurs solides de l’enfance, lymphome lymphoïde, cancer de la vessie, cancer du rein ou de l’uretère, carcinome du pelvis rénal, néoplasme du système nerveux central (SNC), lymphome primaire du SNC, angiogenèse tumorale, tumeur de l’axe rachidien, gliome du tronc cérébral, adénome de l’hypophyse, sarcome de Kaposi, cancer épidermoïde, cancer à cellules squameuses, lymphome à lymphocytes T, cancers induits par l’environnement et des combinaisons desdits cancers.
Une cellule NK allogénique ou autologue, vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant selon l’invention peuvent convenir en particulier pour une utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’une maladie infectieuse, notamment pour inhiber ou détruire les cellules infectées par un pathogène infectieux.
Selon un mode de réalisation, une maladie infectieuse peut être (a) une maladie choisie parmi grippe, herpès, giardiose, paludisme et leishmaniose; (b) une infection pathogène par un virus choisi parmi le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), le virus de l’hépatite, le virus de l’herpès, l’adénovirus, le virus de la grippe, les flavivirus, l’écho virus, le rhinovirus, le coxsachie virus, les cornovirus, le virus respiratoire syncytial, virus des oreillons, rotavirus, virus de la rougeole, virus de la rubéole, parvovirus, virus de la vaccine, virus HTLV, virus de la dengue, papillomavirus, virus molluscum, virus de la poliomyélite, virus de la rage, virus JC et virus de l’encéphalite arbovirale; (c) une infection pathogène par une bactérie choisie parmi Chlamydia, bactéries ricketsies, mycobactéries, staphylocoques, streptocoques, pneumocoques, méningocoques et gonocoques, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Diphteria, Salmonella, Bacilli, choléra, tétanus, botulisme, maladie du charbon, peste, leptospirose et les bactéries de la maladie de Lyme; (d) une infection pathogène par un champignon choisi parmi Candida, Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Genus Mucorales, Sporothrix schenkü, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis et Histoplasma capsulatum; ou (e) une infection pathogène par un parasite choisi parmi Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lamblia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinü, Plasmodium virax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondü et Nippostrongylus brasiliensis.
Notamment, le virus de l’hépatite est l’hépatite A, l’hépatite B ou l’hépatite C ; le virus de l’herpès est le VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II et CMV ou le virus d’Epstein Barr ; le champignon Candida est le Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata ou Candida tropicalis ; le champignon Aspergillus est l’Aspergillus fumigatus ou l’Aspergillus niger ; et le champignon Mucorales est le mucor, absidia ou rhizophus.
Une cellule NK, de préférence allogénique ou autologue vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK lié à un polypeptide recombinant selon l’invention peuvent convenir également en particulier pour une utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’une maladie auto-immune ou ses dérivés, notamment une maladie auto-immune et/ou inflammatoire primitive ou secondaire, spécifique d’organes ou systémiques et associée ou non à des auto-anticorps pathogènes.
A titre d’exemple, peuvent être cités le rejet de greffe d’organes, la maladie du greffon contre l’hôte, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, la sclérodermie, le syndrome de Sjôgren primitif (ou Syndrome de Gougerot -Sjôgren), les polyneuropathies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto-immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l’arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite d’Hashimoto, la maladie d’Addison, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow, la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associés aux ANCA (anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles), les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l’adulte et de l’enfant, telles que les thrombopénies auto-immunes aiguës ou chroniques, les anémies hémolytiques auto-immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN), la maladie des agglutinines froides, le purpura thrombotique thrombocytopénique et l’hémophilie acquise auto-immune, le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses, les affections cutanées huileuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l’arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites et les affections systémiques auto-immunes de l’enfant incluant le syndrome des antiphospholipides.
Il est également prévu une méthode de traitement et/ou de prévention d’un cancer, d’une maladie auto-immune et ses dérivés ou d’une maladie infectieuse chez un individu en ayant besoin, comprenant l’administration à l’individu d’une cellule NK armée selon l’invention en combinaison avec ou sans antigène spécifique du cancer, de la maladie auto-immune et ses dérivés ou de la maladie infectieuse à soigner chez l’individu.
En plus des thérapies selon l’invention, les cellules NK armées selon l’invention peuvent également être utilisées en combinaison avec une autre thérapie. Par exemple, pour le traitement du cancer, les cellules NK armées selon l’invention peuvent être administrées à un individu recevant également un autre traitement contre le cancer, comme la chimiothérapie, la radiothérapie, la chirurgie ou la thérapie génique.
Dans les exemples ci-après, il est montré la spécificité de liaison entre des cellules eNK et un polypeptide Fc modifié, en particulier un polypeptide Fc SDH (Fc-SDHTSFTIE), et sa capacité à cibler des cellules impliquées dans des maladies.
Exemple 1 : Matériel et méthodes
Préparation des cellules PBMCs
Les cellules PBMCs (cellules T, B, NK et monocytes) ont été obtenues auprès de donneurs sains du CHU de Montpellier . Les cellules ont été prélevées dans des échantillons de sang périphérique (cellules B, T, et monocytes) et de sang de cordon ombilical (cellules NK) (Sanchez-Martinezet al.2016, Sanchez-Martinezet al.2018).
Marqueurs des cellules PBMCs
CD45+est un marqueur général des lymphocytes. CD56+est un marqueur spécifique des cellules NK. CD3-est un marqueur écartant les lymphocytes T. CD16+est un marqueur spécifique des cellules NK, permettant la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC).
Isolation et activation des cellules NK
Dans un premier temps, les lymphocytes ont été obtenus auprès de donneurs sains du CHU de Montpellier. PBMC et UCB (UCBMC) ont été respectivement prélevées dans des échantillons de sang périphérique et Unités UCB utilisant Histopaque -1077 (Sigma). En substance, 13 ml d’Histopaque ont été ajoutés à 50 ml des tubes de centrifugation et 30 ml de 1/2 sang dilué en RPMI (Invitrogen) ont été lentement ajoutés par le haut. Les tubes ont été centrifugés à 1600 tours/minute pendant 30 minutes à 20 °C sans interruption.
A la suite de la centrifugation, les cellules mononucléaires ont été prélevées de l’anneau blanc intercouche, lavées en RPMI et en suspension dans le milieu RPMI complété par 10 % de FBS (Invitrogène). Les lymphocytes ont ensuite été congelés avec de l’azote liquide.
Les lymphocytes congelés ont ensuite été dépourvues de cellules T en utilisant le kit de sélection positive CD3 EasySepTM (technologies STEMCELL). Les cellules ont été cultivées pendant 10 à 20 jours avec des cellules PLH irradiées par γ à un rapport cellules NK/cellules PLH irradiées de 1:1 en présence d’IL-2 (100 U/ml) et d’IL-15 (5 ng/ml), ou avec IL-2 seul (1000 U/ml). Des cellules de PLH ont été ajoutées tous les quatre jours et des cytokines fraîches tous les deux jours. À la fin du traitement, la pureté des cellules NK (CD56+/CD3-) était toujours supérieure à 90 %.
Anticorps IgG1 comprenant une région Fc modifiée
L’anticorps IgG1 utilisé est le trastuzumab (Herceptin). Les régions Fc modifiées sont listées dans le tableau ci-dessous.
Marquages des polypeptides Fc et des Anticorps Fc avec des molécules fluorescentes
Afin de marquer les polypeptides Fc et les Anticorps Fc et étudier leur liaison avec les cellules NK, les polypeptides et anticorps sont liés à une molécule fluorescence. Les molécules fluorescentes utilisées sont ; AlexaFluors 647 (A647) et AlexaFluors 488 (A488), Isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
Analyse par cytométrie en flux
Pour l’analyse du phénotype, les cellules ont été colorées au 7AAD (Beckman) afin d’identifier les cellules viables et des anticorps contre les marqueurs de surface CD25-FITC, CD45RO-FITC, CD69-PE, CD62L-PE, CD19-PE, CD3-PE, CD19-ECD, CD56-PECy7, CD56-APC, CD3-APC, CD45-APCAlexaFluor750, CD45RA-APCAlexaFluor750, CD16-PacificBlue, CD57-PacificBlue, CD45-KromeOrange, CD16-KromeOrange (Beckman), CD158b-FITC, CD158a-PE, CD107a-HV500 (BD Biosciences), CD158e-Vioblue (Miltenyi). 1x105-3x105cellules étaient incubé pendant 20-30 minutes à 4 °C avec différents anticorps dans du PBS contenant 2,5 % de PBS. Les cellules ont ensuite été lavées et mises en suspension dans 200-250 μl du même milieu. La coloration a été analysée par cytomètre de flux Gallios (Beckman) à l’aide du logiciel Kaluza. Les lymphocytes vivants ont été soumis à une coloration FSC/SSC et 7AAD. Les lymphocytes B (CD19+), les lymphocytes T (CD3+/CD56-) et les cellules NK (CD56+/CD3-) ont été distingués en utilisant respectivement les anticorps CD19, CD3 et CD56.
Test MTT
Les cellules NK fraîchement prélevées ou congelées (conservées dans l’azote liquide) ont été étiquetées avec 3 μM de CellTracker™ Violet BMQC Dye (Life Technologies) et incubées pendant la nuit avec des cellules cibles BT20 à différents Ratios E:T. Par la suite, la translocation de la phosphatidylsérine (PS) et l’endommagement de la membrane ont été analysés dans la population de cellules cibles négatives à la fluorescence violette par cytométrie de flux en utilisant de l’Annexin V-FITC (Immunostep) et 7AAD (BD Biosciences) ou de l’iodure de propidium (PI). Nous considérons toutes les cellules positives pour l’Annexine-V et/ou PI (ou 7- AAD) comme mortes (ou en train de mourir).
Dans les expériences ADCC, il a été incubé des cellules cibles BT20 avec des anticorps trastuzumab à 5 μg/ml pendant 30 minutes à 37°C. Lorsque les cellules NK sont armées avec les anticorps, les cellules sont incubées à la même concentration d’anticorps avant de les laver et de les incuber avec les cellules cibles BT20. L’EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether) -N,N,N′,N′-tetraacetic acid) a été utilisé à 1 mM pour bloquer la voie d’exocytose granulaire et le MgCl2 à 1,5 mM pour maintenir la pression osmotique. Il a été utilisé le colorant tétrazolium MTT (3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazomium bromure) pour déterminer la viabilité cellulaire. Ensuite sont ajoutés 10 μL de MTT (5 mg/ml) aux cellules adhérentes (100 μL de milieu après 2 lavages au PBS) et les cellules sont ensuite incubées pendant 1 h à 37°C. Après 1 h, est ajouté 100 μL de 0,05 M HCL dans de l’isopropanol pour dissoudre les cristaux et quantifier la couleur à 550 nm dans un spectrophotomètre. Dans toutes les expériences, il a été calculé la mort de la cellule basale en l’absence et en présence des anticorps monoclonaux. Ces valeurs ont été soustraites de celles obtenues après la cellule NK ou traitement avec cellules NK armées des anticorps pour générer l’ADCC spécifique, respectivement.
Analyse statistique
Toutes les expériences ont été réalisées avec un BD FACSCANTO II et analysées avec le logiciel Flowjo.
Design de l ’ étude de l ’ exemple 2
- Combinaison polypeptide Fc et cellules eNK (Graphe 1A)
Des cellules NKin vitroprovenant de sang de cordon (eNK) ont été incubées avec des polypeptides (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647, (iii) Fc SDH A647 à 10 μg/ml ou sans Fc pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK ont ensuite été lavées et colorées pour les marqueurs NK. Les cellules eNK armées ont ensuite été identifiées par les marqueurs de surface CD45+/CD56+/CD3-à l’aide de la cytométrie de flux. L’intensité de fluorescence moyenne (MFI) des différents polypeptides Fc marqués avec A647 (Fc A647) a été analysée et normalisée par rapport au polypeptide Fc WT.
- Combinaison anticorps Trastuzumab Fc et cellules eNK (Graphe 1B)
Des cellules eNK ont été incubées avec des Anticorps Trastuzumab Fc WT, des Anticorps Trastuzumab Fc SDH à 10 μg/ml, ou sans Anticorps Fc pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK ont ensuite été lavées et marquées avec un Anticorps secondaire anti-Fc IgG humaines couplés FITC (Anti-Fc IgG FITC). Les cellules eNK armées ont ensuite été identifiées par les marqueurs de surface CD45+/CD56+/CD3-à l’aide de la cytométrie de flux. La MFI des différents Anti-Fc IgG FITC a été analysée et normalisée par rapport à Fc WT.
- Spécificité de liaison polypeptide Fc et récepteur Fc (CD16) des cellules eNK (Graphe 1C)
Des cellules eNK ont été incubées avec des polypeptides (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647, (iii) Fc SDH A647 à 10 μg/ml ou sans Fc pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK ont ensuite été lavées ] et colorées pour les marqueurs NK. Les cellules eNK armées ont ensuite été identifiées par les marqueurs de surface CD45+/CD56+/CD3-et CD16+ou CD16-à l’aide de la cytométrie de flux.
La fréquence des cellules eNK Fc+et la MFI (normalisée à Fc WT) ont été analysées dans les cellules NK CD16-et NK CD16+.
Design de l ’ étude de l ’ exemple 3
Des cellules eNK ont été incubées avec des polypeptides (i) Fc LALA A647, (ii) Fc WT A647, (iii) Fc SDH A647 à 10 μg/ml ou sans Fc pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK ont ensuite été lavées et incubées à 37 °C pendant 2, 3 ou 7 jours. Aux jours indiqués, la liaison du polypeptide Fc sur les cellules eNK CD16+/CD56+/CD45+/CD3-a été analysée par cytométrie de flux (Graphe 2A). La fréquence des cellules eNK Fc+et la MFI (normalisée à Fc WT) de Fc A647 (Graphe 2B) ont été mesurées sur les cellules eNK.
Design de l ’ étude de l ’ exemple 4
- Dose de Fc SDH pour une liaison efficace (Graphe 3A et Graphe 3B)
Pour tester si tous les récepteurs CD16A (ou FcγRIIIa) peuvent être saturés par le polypeptide Fc SDH, des cellules eNK ont été incubées avec des concentrations croissantes de polypeptide Fc WT ou de polypeptide Fc SDH.
Notamment, des cellules eNK ont été incubées avec des polypeptides (i) Fc WT A647, (ii) Fc SDH A647 ou (iii) Fc SDH A488 à 1, 10, 20, 30, 40 μg/ml, ou sans Fc pendant 1 h à 37 °C . Les cellules eNK une fois armées des polypeptides Fc ont été lavées et colorées pour les marqueurs NK. Les cellules eNK armées ont été identifiées comme CD45+/CD56+/CD3-par cytométrie de flux. La MFI du Fc A647 (Graphe 3A) ou Fc A488 (Graphe 3B) a été analysée.
- Combinaison du polypeptide Fc SDH et compétiteurs (Graphe 3C et Graphe 3D)
Les précédents exemples décris ci-dessus montrent la stabilité à long terme du polypeptide Fc SDH sur les cellules eNK, mais cette liaison peut-elle être déplacée par un autre polypeptide Fc lorsqu’elle est injectéein vivo? Afin d’étudier cette condition, des cellules eNK ont été incubées en conditions de saturation avec des polypeptides Fc SDH A488 (Graphe 3C) ou Fc SDH A647 (Graphe 3D) à 20 μg/ml, ou sans Fc pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK, une fois armées des polypeptides Fc, ont ensuite été lavées et des ligands du récepteur CD16A compétiteurs ont été ajoutés pendant 1 h à 37 °C : (i) Fc block ; (ii) Fc WT ; (iii) Fc SDH ; anticorps anti-CD16. Les cellules eNK ont ensuite été colorées pour les marqueurs NK. Les cellules eNK ont été définies comme CD45+/CD56+/CD3-par cytométrie de flux. La MFI de Fc A488 (Graphe 3C) ou le Fc A647 (Graphe 3D) a été analysée.
Design de l ’ étude de l ’ exemple 5
- Survie des cellules cancéreuses en présence de cellules eNK armées d’anticorps Fc SDH (Graphes 4A, 4B et 4C)
Les cellules eNK ont été incubées avec des Anticorps Trastuzumab Fc WT ou Anticorps Trastuzumab Fc SDH à 10 μg/ml ou 1 μg/ml, ou sans Anticorps pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK armées des Anticorps Fc ont ensuite été lavées (Graphe 4B et 4C) ou non lavées (Graphe 4A), incubées pendant 1 h (Graphe 4A et 4B) ou pendant 24 h (Graphe 4C) à 37 °C, puis mises en présence de cellules BT20 au ratio 1:1 pendant 24 h à 37 °C. La viabilité des cellules, représentée par le pourcentage de survie, a été mesurée à l’aide d’un test MTT.
- Activation non spécifique par des cellules eNK armées (Graphe 4D)
Les cellules eNK ont été incubées avec des Anticorps Trastuzumab WT ou Anticorps Trastuzumab SDH à 10 μg/ml ou 1 μg/ml, ou d’aucun Anticorps pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK armées des Anticorps ont ensuite été lavées, incubées pendant 1 h à 37 °C, puis mises en présence de cellules BT20 au ratio 1:1 avec des anticorps de détection de CD107a 37 °C Après 1 h d’incubation, des composés de type monensine et brefeldine A ont été ajoutés pendant 5 h supplémentaires pour bloquer la dégradation du CD107a. L’analyse de l’expression de CD107a sur les cellules eNK CD56+/ CD45+/ CD3-a été réalisée par cytométrie de flux.
Design de l ’ étude de l ’ exemple 6
Des cellules eNK ont été incubées avec des Anticorps Fc WT ou Fc SDH à 10 μg/ml ou sans Anticorps pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK ont ensuite été lavées et divisées en 2 échantillons. Les cellules eNK armées du premier échantillon ont été marquées avec une IgG anti-Fc pour la détection des Anticorps présents à la surface membranaire. Les cellules eNK du second échantillon ont été fixées et perméabilisées avant d’être marquées avec une IgG anti-Fc afin de détecter les anticorps présents à la surface membranaire et dans le milieu intracellulaire. Les cellules eNK armées ont ensuite été identifiées par les marqueurs de surface CD45+/CD56+/CD3-à l’aide de la cytométrie de flux. L’intensité de fluorescence moyenne (MFI) des différents Anticorps Fc marqués avec les IgG anti-Fc a été mesurée (Graphe 5A).
Les cellules eNK ont été incubées avec des polypeptides Fc SDH A488 (Graphe 5B) ou Fc SDH A647 (Graphe 5C) à 20 μg/ml, ou sans Fc pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK ont ensuite été lavées et incubées à 37 °C pendant 3 jours. Ensuite, les ligands CD16A compétiteurs ont été ajoutés pendant 1 h à 37 °C : (i) Fc block ; (ii) Anticorps anti-CD32 ; (iii) clone anti-CD16 B73.1, (iv) Anticorps anti-CD16. Les cellules ont été colorées pour les marqueurs NK. Les cellules eNK ont été définies comme CD45+/CD56+/CD3-par la cytométrie de flux et la MFI de Fc A488 (Graphe 5B) ou Fc A647 (Graphe 5C) a été analysée.
Design de l ’ étude de l ’ exemple 7
Les cellules eNK préalablement congelées ont été incubées avec des polypeptides Fc SDH A647 à 10 μg/ml, pendant 1 h à 37 °C. Les cellules eNK ont ensuite été lavées et 15.106 eNK ont été injectées par voie intrapéritonéale à une souris adulte Swiss-nude. La souris a été euthanasiée 24 heures plus tard et du liquide péritonéal et plusieurs organes (sang, moelle osseuse et rate) ont été prélevés pour être analysés (Figures 7A, 7B, 7C et 7D). Les cellules ont été colorées pour détecter les marqueurs de NK. En utilisant la cytométrie de flux, les cellules eNK ont été définies comme CD45+/CD56+/CD16low ou CD16+ et la fluorescence Fc A647 a été analysée dans les cellules de la cavité péritonéale. Comparaison des cellules eNK Fc A647+ au sein des cellules eNK CD56+ totales avant et après injection in vivo ( ).
Résultats
Exemple 2 : La liaison du polypeptide Fc SDH est plus efficace que celle du Fc sauvage (WT)
Il a été observé que le polypeptide Fc LALA est faiblement lié aux cellules eNK (Graphe 1A) ainsi que les Anticorps Fc WT aux cellules eNK (Graphe 1B). En revanche, le polypeptide Fc SDH est fortement lié aux cellules eNK comparé au contrôle positif (Fc WT) que ce soit pour le polypeptide isolé (Graphe 1A) ou la région Fc d’un anticorps IgG (Graphe 1B).
Par ailleurs, il a été observé que l’intensité de fluorescence du polypeptide Fc SDH est significativement plus élevée dans la population de cellules eNK CD16 + (30) par rapport à la population de cellules eNK CD16-(3) (Graphe 1C, gauche). Également, le pourcentage de cellules eNK Fc+est significativement plus élevé dans la population de cellules eNK CD16+armées de Fc SDH (100 %) par rapport à la population de cellules eNK CD16-armées de Fc SDH (40 %). Ainsi, la liaison de la région Fc SDH d’un polypeptide est largement spécifique à la population de cellules eNK CD16+(Graphe 1C), ce qui suggère que le principal récepteur du Fc utilisé par la Fc WT ou le Fc SDH est le CD16A.
La spécificité de liaison du polypeptide Fc SDH - cellules eNK est fortement améliorée par rapport à la liaison du polypeptide Fc WT grâce aux mutations SDH (40 % de cellules eNK CD16+armées Fc WT contre 100 % des cellules eNK CD16+ armées Fc SDH, Graphe 1C, droite).
Les cellules eNK armées Fc SDH liées à des molécules fluorescentes illustrent la capacité de ces cellules eNK armées à se lier à toutes les petites molécules, par exemple des antigènes d’intérêt permettant la reconnaissance et l’élimination de cellules cibles impliquées dans des maladies.
Exemple 3 : La liaison du polypeptide Fc SDH est stable dans le temps
L’analyse par cytométrie de flux révèle que les cellules eNK sont pratiquement dépourvues du polypeptide Fc LALA et Fc WT au bout de 2 jours d’incubation comparés au contrôle négatif (aucun Fc). A l’inverse, le polypeptide Fc SDH reste fortement lié aux cellules eNK au bout des 7 jours d’incubation (Graphe 2A).
Par ailleurs, il est observé que plus de 80 % des cellules eNK portent encore le polypeptide Fc SDH après 7 jours alors que la liaison du polypeptide Fc WT est très faible dès le 2ejour d’incubation avec environ 10 % des cellules portant encore le polypeptide Fc WT (Graphe 2B).
En conclusion, la liaison Fc SDH - cellules eNK reste fortement stable au moins jusqu’à 7 jours d’incubation.
Exemple 4 : La combinaison Fc SDH-cellules NK est saturante et ne peut être déplacée dans des conditions physiologiques normales
Une faible dose de polypeptide Fc SDH est nécessaire pour saturer les récepteurs des cellules NK.
Le polypeptide Fc SDH A647 sature rapidement les sites CD16A à partir de 10 μg/ml alors que le polypeptide Fc WT A647 n’atteint pas la saturation même à 40 μg/ml (Graphe 3A). De même, le polypeptide Fc SDH lié à une molécule fluorescente différente A488, sature les cellules eNK à partir de 10 μg/ml (Graphe 3B).
Ainsi, une faible dose de polypeptide Fc SDH est nécessaire pour saturer les cellules NK.
La liaison du polypeptide Fc SDH ne peut pas être retirée dans des conditions physiologiques
Les données montrent que deux formes de polypeptide Fc de type sauvage (le Fc block et le Fc WT A647) n’ont pas modifié le niveau de polypeptide Fc SDH lié. A l’inverse, un autre polypeptide Fc SDH a abaissé le niveau de Fc SDH initialement lié avec les deux combinaisons de fluorochromes A488 et A647, en raison de la même affinité pour le CD16A. Le déplacement le plus élevé a été observé lorsque l’Anticorps anti-CD16 a été utilisé, ce qui implique que la liaison du Fc SDH est dépendante du récepteur CD16A (Graphes 3C et 3D).
Ainsi, une fois liée à CD16A, le polypeptide Fc SDH ne peut pas être éliminé par les polypeptides Fc WT, ce qui suggère que lorsque la cellule eNK armée du polypeptide Fc SDH est injectéein vivo, le polypeptide Fc SDH reste stable et lié à la cellule NK.
Exemple 5 : Les cellules eNK armées d’Anticorps Fc SDH sont plus cytotoxiques et présentent des niveaux de dégranulation élevés
La cytotoxicité des cellules eNK armées d’Anticorps Fc SDH est plus efficace qu’une cellule eNK seule ou armées d’Anticorps Fc WT
Pour tester la cytotoxicité de cellules eNK armées, il a été choisi d’utiliser un Anticorps Trastuzumab modifié qui est spécifique de la protéine HER2 exprimée à la surface des cellules cancéreuses, y compris la lignée cellulaire BT20 du cancer du sein. Ces lignées cellulaires seront la cible des cellules eNK armées. Les résultats montrent que les cellules eNK armées avec un Anticorps Fc SDH à 10 μg/ml sont davantage cytotoxiques que les cellules eNK seules ou armées avec d’Anticorps Fc WT à 10 μg/ml (Graphes 4A et AB). Les mêmes résultats sont obtenus avec des cellules eNK armées depuis 24 h avec des Anticorps Fc SDH (Graphe 4C). Le dosage de l’Anticorps à 1 μg/ml a montré un effet moins puissant. L’Anticorps Fc WT ne semble pas avoir d’effet par rapport à la cellule eNK seule (aucun Anticorps). Ainsi, le niveau de cytotoxicité des cellules eNK est amélioré avec des anticorps Fc SDH.
Niveau de dégranulation élevé pour les cellules eNK armées d’Anticorps Fc SDH
La cytotoxicité des cellules eNK est médiée par la dégranulation. Ce mécanisme peut être mesuré par l’expression de CD107a. L’expression de CD107a à la membrane est un marqueur de l’activité cytotoxique des cellules NK. Il a ainsi été analysé l’expression de CD107a par cytométrie de flux sur des cellules eNK armées d’anticorps Fc WT ou d’anticorps Fc SDH en présence ou non de cellules cibles (cellules BT20). Les résultats montrent que CD107a n’est pas induite sur les cellules eNK armées sans cellules cibles (Graphe 4C haut), ce qui suggère que la liaison des Anticorps à CD16A n’entraîne pas d’activation des cellules eNK armées en absence de cellules cibles. Deuxièmement, les cellules eNK armées d’Anticorps Fc SDH à 10 μg/ml montrent une expression de CD107a plus élevée que d’Anticorps Fc WT ou pas d’Anticorps (Graphe 4D, bas).
L’un des mécanismes utilisés par les cellules eNK armées d’Anticorps Fc est la dégranulation et ce mécanisme est plus efficace sur des cellules eNK armées d’Anticorps Fc SDH.
Exemple 6 : L’anticorps Fc SDH lié au récepteur Fc (CD16) des cellules eNK n’est pas internalisé
Il a été observé qu’après 3 jours d’incubation, l’Anticorps Fc SDH A647 ou l’Anticorps Fc SDH A488 est éliminé par un Anticorps anti-CD16 compétiteur. En revanche, l’Anticorps anti-CD32 ne déplace pas l’Anticorps Fc SDH initialement lié au récepteur Fc. Ainsi, il a été observé que l’Anticorps Fc SDH reste présent à la surface des cellules eNK et n’est donc pas internalisé ( ).
De plus, plusieurs études ont fait état d’une excrétion ou d’une internalisation des récepteurs CD16 lors de l’activation des cellules NK (Romee et al., 2013 ; Capuano et al., 2017). Afin de mesurer si la liaison à la région Fc altérait l’expression du récepteur CD16A, nous avons utilisé le clone anti-CD16 B73.1 dont la liaison n’est pas supposée être affectée par le masquage du Fc car son épitope se trouve dans le premier domaine membranaire distal de type Ig de la molécule CD16 (Grier et al., 2012). Cependant, nous avons vu dans les Graphe s 3C et 3D que cet Anticorps peut déplacer l’Anticorps Fc SDH. Ainsi, les résultats de la montrent que la fréquence des cellules eNK CD16+ ne varie pas avec le temps et les conditions de Fc.
Exemple 7 : La liaison de la région Fc SDH sur les cellules eNK est stablein vivo
Pour garantir la stabilité de la liaison Fc SDH - cellules eNK dans des conditions in vivo, des cellules eNK armées avec des polypeptides Fc SDH ont été injectées par voie intrapéritonéale à une souris adulte Swiss-nude. Il a été observé que de nombreuses cellules eNK (15 % de toutes les cellules) ont été trouvées dans la cavité péritonéale ( ). Ces cellules étaient encore largement CD16+ (79 %), et la plupart des cellules eNK CD16+ étaient armées de polypeptides Fc SDH A647 (87 %). Avant l’injection, 84 % des cellules eNK totales étaient dotées de polypeptides Fc SDH A647, et 73 % d’entre elles restaient positives après 24 h in vivo ( ). Par ailleurs, 24 h après l’injection, il a été observé qu’un faible nombre de cellules eNK sont présentes dans le sang ou la moelle osseuse ( ). Quelques cellules eNK CD16+ ont cependant migré vers la rate, et restent armées de Fc SDH A647 (88 %) dans la rate ( ).
Ainsi, ces résultats démontrent que la liaison Fc SDH reste stable sur les cellules eNK après injectionin vivo.
Capuano, C., C. Pighi, R. Molfetta, R. Paolini, S. Battella, G. Palmieri, G. Giannini, F. Belardinilli, A. Santoni & R. Galandrini (2017) Obinutuzumab-mediated high-affinity ligation of FcγRIIIA/CD16 primes NK cells for IFNγ production. Oncoimmunology, 6, e1290037.
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Liste des séquences
SEQ ID N° 1 (= region Fc WT (IgG1-CH2))
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
SEQ ID N° 2 (= région Fc SDH (IgG1-CH2.S239D.H268F.S324T.I332E))
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPAPEEKTISKAK
SED ID N° 3 (= région Fc SD (IgG1-CH2.S239D))
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
SEQ ID N° 4 (= région Fc IE (IgG1-CH2.I332E))
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAK
SEQ ID N° 5 (= région Fc SDIE (IgG1-CH2.S239D.I332E))
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAK
SEQ ID N° 6 (= région Fc SDSTIE (IgG1-CH2.S239D.S324T.I332E))
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPAPEEKTISKAK
SEQ ID N° 7 (= région Fc SDHFIE (IgG1-CH2.S239D.H268F.I332E))
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAK
SEQ ID N° 8 (= région Fc AL (IgG1-CH2.A330L))
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPIEKTISKAK
SEQ ID N° 9 (= région Fc ALIE (IgG1-CH2.A330L.I332E))
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAK
SEQ ID N° 10 (= région Fc GASD (IgG1-CH2.G236A.S239D))
APELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
SEQ ID N° 11 (= région Fc GASDALIE (IgG1-CH2.G236A.S239D.A330L.I332E))
APELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAK
SEQ ID N° 12 (= région Fc GASDIE (IgG1-CH2.G236A.S239D.I332E))
APELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAK
SEQ ID N° 13 (= région Fc SDALIE (IgG1-CH2.S239D.A330L.I332E))
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAK
SEQ ID N° 14 (= région Fc LALA (IgG1-CH2. L234A.L235A))
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
SEQ ID N°15 (= région Fc WT (IgG1))
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims (10)

  1. Composition pharmaceutique comprenant une cellule NK (Natural Killer) ou un précurseur de cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur.
  2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, comprenant en outre un excipient ou un véhicule pharmacologiquement acceptable.
  3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2 ; pour une utilisation en tant que médicament.
  4. Cellule NK allogénique ou autologue isolée, ou un précurseur isolé de ladite cellule NK, en combinaison avec un polypeptide recombinant ; dans laquelle ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; pour utilisation en tant que médicament.
  5. Composition pharmaceutique ou cellule NK allogénique ou autologue isolée, ou son précurseur selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 ; dans laquelle la région Fc du polypeptide recombinant modifiée comprend au moins un domaine CH2 modifié.
  6. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, ou cellule NK allogénique ou autologue isolée ou son précurseur, selon la revendication 4 ; dans laquelle la région Fc du polypeptide recombinant modifiée comprend une séquence d’acides aminés de l’une quelconque des SEQ ID N° 2 à 13.
  7. Composition pharmaceutique ou cellule NK allogénique ou autologue isolée ou son précurseur selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la région Fc modifiée du polypeptide recombinant comprend une séquence d’acides aminés ayant une identité de séquence d’au moins 70 %, en particulier 80 %, plus particulièrement de 90 %, avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N° 2, de préférence la région Fc modifiée comprend une séquence d’acides aminés ayant 100 % d’identité avec SEQ ID N° 2.
  8. Kit comprenant :
    - une première partie incluant une cellule NK ou un précurseur de cellule NK ;
    - une deuxième partie incluant un polypeptide recombinant comprenant (i) une région Fc (fragment cristallisable) modifiée, et (ii) un domaine de liaison à un ligand ; ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à un précurseur de cellule NK ;
    pour une utilisation en tant que médicament.
  9. Composition pharmaceutique, cellule NK allogénique ou autologue isolée, ou précurseur de ladite cellule NK, ou kit selon l’une quelconque des revendications précédentes ; pour utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un cancer, d’une maladie auto-immune, d’une maladie infectieuse chez un individu en ayant besoin.
  10. Méthodein vitroouex vivopour la préparation d’une composition pharmaceutique comprenant une cellule NK ou un précurseur de cellule NK, comprenant les étapes suivantes ;
    a) fournir une cellule NK, de préférence allogénique ou autologue vis-à-vis d’un individu en ayant besoin, ou un précurseur de cellule NK;
    b) mise en contact de ladite cellule NK ou dudit précurseur avec un polypeptide recombinant, dans lequel ledit polypeptide recombinant comprend (i) une région Fc (fragment cristallisable), modifiée et (ii) un domaine de liaison à un ligand, ladite région Fc étant capable de se lier à ladite cellule NK ou à son précurseur.
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