FR3111904A1

FR3111904A1 - Bioencre pour bioimpression d’un modèle de jonction dermo-épidermique invaginée

Info

Publication number: FR3111904A1
Application number: FR2006875A
Authority: FR
Inventors: Mailé RIELLAND; Xavier Schultze; Jean-Philippe BELAIDI
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: FR3111904B1

Abstract

Bioencre pour bioimpression d’un modèle de jonction dermo-épidermique invaginée La présente invention concerne une bioencre comprenant dans une phase aqueuse : (i) au moins un polymère de nanocellulose, et (ii) au moins un polymère d’acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide. Figure pour l'abrégé : néant

Description

Bioencre pour bioimpression d’un modèle de jonction dermo-épidermique invaginée

La présente invention concerne une bioencre pour bioimpression d’un équivalent de peau à jonction dermo-épidermique invaginée.

La bioimpression est un domaine de recherche et d’ingénierie qui met en œuvre des dispositifs d’impression capables de déposer du matériel biologique. L’un des principaux avantages de cette technologie est la possibilité de créer du relief dans de nouveaux modèles de tissus avec une complexité qui ne peut pas être atteinte seulement avec la main humaine. Dans cette optique, il existe un besoin de biomatériel ou bioencre qui peut être imprimé à une haute résolution et qui est biocompatible.

Dans la peau jeune, la jonction dermo-épidermique (JDE) consiste en des papilles dermiques définies, légèrement espacées. A l’inverse, la JDE de la peau s’aplatit avec l’âge (Levakovet al.(2012)Med Pregl 65:191-195 ; Dos Santoset al.(2015)Matrix Biol 47:85-97). La rétraction des invaginations épidermiques est associée à une altération de la différentiation terminale des kératinocytes.

Les modèles de peauin vitroexistants et commercialement disponibles présentent uniquement un profil de JDE aplatée associée à une peau âgée.

Il existe donc un besoin important de modèles de peau plus représentatifs d’une peau jeune à JDE invaginée.

La présente invention répond à ce besoin.

Les inventeurs ont en effet mis au point une bioencre permettant de former un modèle de peau reconstruite bioimprimée unique et accordable, incorporant ou non le profil de type «rete ridges» ou invaginé de la JDE.

Cette bioencre est particulièrement utile pour accroitre la compréhension de l’impact de la JDE sur la peau, en comparant des modèles de peau entière bioimprimée plate et des modèles de peau entière bioimprimée à JDE invaginée, bioimprimés en utilisant la même bioencre.

Elle est également utile pour fournir de nouveaux modèles de testsin vitroavec une approximation améliorée de la structure de la peau humaine.

Il est également possible d’avoir sur un même échantillon, à la fois une partie avec JDE plate et une partie avec JDE invaginée, facilitant ainsi la compréhension de l’impact du microrellief de la JDE, mais permettant également de diminuer le nombre d’échantillons testés.

La bioencre mise au point par les inventeurs comprend les composés suivants, indispensables pour l’efficacité de bioimpression de la bioencre :

de la nanocellulose, permettant typiquement d’apporter la texture imprimable à la bioencre grâce à des liaisons réversibles, et étant également capable, grâce à son caractère rhéofluidique, de prendre rapidement une consistance de gel ;
de l’acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide, pouvant être réticulé par des liaisons covalentes après impression.
Selon le type de réticulation choisie, la bioencre peut en outre comprendre un agent réticulant tel qu’un composé aminé, thiolé, ou un photoinitiateur.

La bioencre comprend également avantageusement des composés permettant l’adhésion, la croissance, la différentiation, la prolifération, la migration cellulaire, et/ou des composés chémoattractifs de cellules de la peau et/ou du cheveu, notamment de fibroblastes, de mélanocytes ou de kératinocytes.

La présente invention concerne ainsi une bioencre comprenant dans une phase aqueuse :

au moins une nanocellulose, et
au moins un acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide.

La présente invention a également pour objet un kit pour bioimpression comprenant :

une bioencre selon l’invention, et
des cellules cutanées et/ou du cheveu, en particulier de type fibroblastes, mélanocytes, kératinocytes, et leurs mélanges.

Un autre objet de l’invention a trait à un procédé de préparation d’un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :

fournir une bioencre selon l’invention comprenant des cellules cutanées et/ou du cheveu, dans laquelle les cellules cutanées comprennent des cellules de type fibroblaste,
bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface, ladite au moins une couche correspondant à un compartiment dermique,
optionnellement, réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),
bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points correspondant à une jonction derrmo-épidermique invaginée ,
réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d),
incuber la ou les couche(s) formée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou points formés à l’étape d) pendant 2 à 7 jours, de manière à ce que les cellules présentes se multiplient pour former un équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique,
optionnellement, recouvrir l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique formé à l’étape f) avec du collagène, et
reconstituer, sur l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique, un équivalent d’épiderme comprenant au moins des kératinocytes.

Dans un mode de réalisation, le procédé de préparation selon l’invention est pour préparer un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée sur une partie et une jonction dermo-épidermique plate sur une autre partie, et les filaments et/ou les points de la bioencre ne sont imprimés, à l’étape d), que sur une partie de la couche formée à l’étape b).

La présente invention concerne également un équivalent de peau à jonction dermo-épidermique invaginée et un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée sur une partie et une jonction dermo-épidermique plate sur une autre partie, susceptibles d’être obtenus par les procédés de préparation selon l’invention.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d’un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique invaginée, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :

fournir une bioencre selon l’invention comprenant des cellules cutanées et/ou du cheveu, dans laquelle les cellules cutanées comprennent des cellules de type fibroblaste,
bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface, ladite au moins une couche correspondant à un compartiment dermique,
optionnellement, réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),
bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points mimant une jonction derrmo-épidermique invaginée ,
réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d), et
incuber la ou les couche(s) formée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou points formés à l’étape d) pendant 2 à 7 jours, de manière à ce que les cellules présentes se multiplient pour former un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique invaginée.

La présente invention concerne également un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique invaginée, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation selon l’invention.

Un autre objet de l’invention concerne également un procédé de préparation d’un équivalent d’épiderme sur un support présentant un microrelief, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :

fournir une bioencre selon l’invention ne comprenant pas de cellules cutanées et/ou du cheveu,
bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface,
optionnellement, réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),
bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points formant un microrelief ,
réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d), de manière à obtenir un support présentant un microorelief
optionnellement, recouvrir le support présentant un microrelief avec du collagène, et
reconstituer, sur le support présentant un microrelief, un équivalent d’épiderme comprenant au moins des kératinocytes.

La présente invention concerne également un équivalent d’épiderme sur un support présentant un microrelief, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation selon l’invention.

Description détaillée de l’invention

Bioencre

La présente invention concerne une bioencre comprenant dans une phase aqueuse :

Par « nanocellulose », aussi appelée « cellulose nanofibrillaire » ou « nanofibrille de cellulose », on entend ici des fibrilles de cellulose ayant une longueur supérieure à 1 µm et de préférence allant de 5 à 40 µm et un rapport longueur/diamètre égal ou supérieur à 30. Le diamètre des nanocelluloses utilisées peut aller par exemple de 2 à 100 nm (0,002 à 0,1 µm).

Les nanocelluloses utilisées selon l’invention sont de préférence amorphes, c’est-à-dire qu’elles présentent de préférence un taux de cristallinité inférieur ou égal à 50 %, et de préférence allant de 15 à 50 %.

En outre, les nanocelluloses utilisées selon l’invention peuvent être obtenues soit par extraction mécanique ou chimique à partir de végétaux ou d’algues, soit par fermentation bactérienne. Par ailleurs, elles peuvent se présenter sous forme de matière sèche ou en dispersion notamment aqueuse.

Les nanocelluloses utilisées dans le cadre de l’invention peuvent se présenter telles quelles ou modifiées. Ainsi, elles peuvent être en mélange avec un additif et notamment avec de la cellulose carboxylée, comme décrit dans les documents WO98/02486 et WO98/02487. Elles peuvent être également sous forme modifiée, par exemple modifiées par des acides carboxyliques comme décrit par exemple dans le document EP726356, et/ou modifiées à leur surface par ajout de groupes sulfatés, ce qui est avantageux pour lier les facteurs de croissance et ainsi stimuler la différenciation cellulaire, et/ou être associées à un composé organique polyhydroxylé comme décrit par exemple dans le document FR2,769,836.

On peut notamment utiliser comme nanocellulose celles commercialisées sous les dénominations « Cellulon » par la société Kelco, celle commercialisée sous la dénomination « Fibriliance » par la société Soliance, et celles commercialisées sous la dénomination « CNF » par les sociétés VTT ou CELLINK.

Dans un mode de réalisation particulier, la nanocellulose utilisée est une nanocellulose modifiée à sa surface par ajout de groupes sulfatés.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la nanocellulose utilisée est une nanocellulose modifiée à sa surface par ajout de groupes acrylates ou méthacrylates.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la nanocellulose utilisée est une nanocellulose modifiée à sa surface par ajout de groupes carboxylés.

La bioencre de l’invention peut contenir une quantité de nanocellulose, allant de 1 à 3% en poids, de préférence de 1,5 à 2,8% en poids, plus préférentiellement de 1,8 à 2,5% en poids, avantageusement 2% en poids par rapport au poids total de la bioencre.

Par « acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide », également appelé ici « acide hyaluronique greffé », on entend ici un acide hyaluronique dont tous ou certains groupes hydroxyle libres ont été estérifiés pour former des groupes esters acrylate et/ou méthacrylate, et/ou dont tous ou certains groupes amines obtenus par désacétylation de motifs N-acetyl-D-glucosamine ont été amidifiés par de l’acide acrylique et/ou méthacrylique, les anhydrides correspondants ou les esters activés correspondants, pour conduire à des fonctions acrylamide et/ou méthacrylamide.

L'acide hyaluronique est un glycosaminoglycane linéaire composé d'unités répétitives de D-acide glucuronique et de N-acetyl-D-glucosamine liés entre eux par des liaisons glycosidiques alternées beta-1,4 et beta-1,3.

De préférence, l’acide hyaluronique greffé a un poids moléculaire moyen en poids allant de 5000 à 1 000 000 daltons, plus préférentiellement allant de 10 000 à 500 000 daltons, et encore plus préférentiellement allant de 15 000 à 350 000 daltons, typiquement un poids moléculaire moyen de 40 000 daltons.

Le poids moléculaire peut être notamment déterminé par chromatographie phase liquide, éluant chlorure de sodium 0,1 M et 330 mg/l d’azoture de sodium dans l’eau, étalon dextran, détecteurs Réfractomètre OPTILAB T-Rex de WYATT et Diffusion de lumière DAWN-HELEOS II – WYATT.

Selon une forme particulière de l’invention, l’acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide ne comporte que des résidus acrylates ou méthacrylates, plus préférentiellement que des résidus acrylates.

Selon une autre forme de l’invention, l’acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide ne comporte que des résidus acrylamides ou méthacrylamides, plus préférentiellement que des résidus acrylamides.

Avantageusement, l’acide hyaluronique greffé a un taux de greffage en groupements acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide allant de 10 à 80 % ou 20 à 80 %, de préférence allant de 40 à 70 %, et préférentiellement allant de 45 à 65 %, typiquement de 40%. Le taux de greffage correspond au pourcentage molaire de groupes hydroxyle de l’acide hyaluronique qui sont greffés par un groupement acrylate, méthacrylate, et/ou de motifs glucosamine fonctionnalisés par des groupements acrylamide et/ou méthacrylamide. A titre d’exemple, un taux de greffage de 50 % correspond à 2 groupes acrylate et/ou méthacrylate et/ou acrylamide et/ou méthacrylamide greffés sur les 4 fonctions choisies parmi hydroxyle et/ou amine du motif de répétition de l’acide hyaluronique.

Le greffage de l’acide hyaluronique par les groupements acrylate ou méthacrylate, résulte de la présence de groupe respectivement ester acrylate, ester méthacrylate formés avec les hydroxyles libres. Le greffage de l’acide hyaluronique par les groupements acrylamide ou méthacrylamide résulte de la présence de groupes amides formés avec les amines issues de la désacétylation des motifs glucosamine de l’acide hyaluronique.

De préférence, l’acide hyaluronique présente au moins un résidu acrylate ou méthacrylate, plus préférentiellement acrylate.

L’acide hyaluronique greffé par des groupements acrylate ou méthacrylate peut être obtenu par réaction de l’acide hyaluronique avec l’acide acrylique et/ou méthacrylique, avec les anhydrides correspondants, ou avec les esters activés correspondants. L’acide hyaluronique greffé par des groupements acrylamide ou méthacrylamide peut être obtenu par désacétylation des motifs glucosamine, suivie d’une réaction d’amidification avec de l’acide acrylique et/ou méthacrylique, les anhydrides correspondant, ou les esters activés correspondants. La réaction est avantageusement conduite en milieu aqueux basique, notamment en présence d’une base organique ou minérale comme par exemple la soude. De préférence, la réaction est conduite à une température allant de 5 à 10 °C, notamment pendant une durée allant de 24 heures à 48 heures. Différents taux de greffage avec les groupements acrylate, méthacrylate, acrylamide, ou méthacrylamide peuvent être obtenus en faisant varier la quantité de réactif acrylant mis en œuvre proportionnellement à l’acide hyaluronique, ce réactif acrylant étant choisi parmi l’anhydride acrylique, l’anhydride méthacrylique, l’acide acrylique, l’acide méthacrylique ou les esters activés correspondants.

L’acide hyaluronique greffé peut également être obtenu en utilisant la méthode définie dans Sigenet al.(2020)Biomacromolecules 21:2229-2235.

L’acide hyaluronique acrylé peut typiquement être obtenu par le procédé décrit dans l’exemple 1.

L’acide hyaluronique greffé tel que défini précédemment peut être présent dans la bioencre selon l'invention en une teneur allant de 0,1 à 10% en poids, par rapport au poids total de la bioencre, de préférence de 0,5 % à 5% en poids, préférentiellement allant de 1 % à 2% en poids, typiquement en une teneur de 1,25% en poids par rapport au poids total de la bioencre.

Dans un mode de réalisation particulier, la bioencre selon l’invention comprend en outre (iii) au moins un agent réticulant choisi parmi les composés aminés, thiolés, et les photoinitiateurs.

L’agent réticulant utilisé dans le cadre de l’invention peut être un composé aminé, en particulier un composé aminé choisi parmi les composés aminés ayant un ou plusieurs groupes amine primaire et/ou amine secondaire. Il peut donc être choisi parmi les composés monoaminés, diaminés, triaminés ou polyaminés.

Selon un mode de réalisation particulier, le composé aminé est un composé comprenant de 2 à 20 atomes de carbone, en particulier un composé non polymérique. Par « composé non polymérique », on entend un composé qui n’est pas directement obtenu par une réaction de polymérisation de monomères.

Comme composés aminés, on peut citer la n-butylamine, la tertiobutylamine, l’isobutylamine, la propylamine, la n-hexylamine, la glycine, l’éthanolamine, le 3-aminopropanol, la dopamine, la 7-amino 4-méthylcoumarine, le 1,4-bis(3-aminopropyl)pipérazine, le 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), l’acide 3-aminophényl boronique, le N-méthyl-1,3-diaminopropane, le N-propyl 1,3-diaminopropane, le N-isopropyl 1,3-diaminopropane, le N-cyclohexyl 1,3-diaminopropane, le 2-(3-aminopropylamino) éthanol, le 3-(2-aminoéthyl)aminopropylamine, le bis(3-aminopropyl)amine, la méthyl bis(3-aminopropyl)amine, le N-(3-aminopropyl)-1,4-diaminobutane, la N,N-diméthyldipropylène triamine, le 1,2-bis(3-aminopropylamino)éthane, la N,N’-bis(3-aminopropyl)-1,3-propanediamine, l’éthylène diamine, la 1,3-propylènediamine, la 1,4-butylènediamine, la lysine, la cystamine , la xylène diamine, la tris(2-aminoéthyl)amine, la spermidine.

De préférence, le composé aminé est choisi parmi la n-butylamine, le 3-aminopropanol, la dopamine, la 7-amino 4-méthylcoumarine, le 1,4-bis(3-aminopropyl)pipérazine, le 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), l’acide 3-amino phényl boronique, le N-méthyl-1,3-diaminopropane, le N-propyl 1,3-diaminopropane, le N-isopropyl 1,3-diaminopropane, le N-cyclohexyl 1,3-diaminopropane, le 2-(3-aminopropylamino) éthanol, le 3-(2-aminoéthyl)aminopropylamine, le bis(3-aminopropyl)amine, la méthyl bis(3-aminopropyl)amine, le N-(3-aminopropyl)-1,4-diaminobutane, la N,N-diméthyldipropylène triamine, le 1,2-bis(3-aminopropylamino)éthane, la N,N’-bis(3-aminopropyl)-1,3-propanediamine, l’éthylène diamine, la lysine.

Le composé aminé peut également être choisi parmi les polymères aminés, notamment ayant un poids moléculaire moyen en poids allant de 500 à 1 000 000, de préférence allant de 500 à 500 000, et préférentiellement allant de 500 à 100 000.

Comme polymère aminé on peut utiliser :

les poly(alkylène (C₂-C₅) imines), en particulier les polyéthylèneimines et les polypropylèneimines, notamment les poly(éthylène imine) (par exemple celui vendu sous la référence 46,852-3 par la société Aldrich Chemical) ;
la poly(allylamine) (par exemple celle vendue sous la référence 47,913-6 par la société Aldrich Chemical) ;
les polyvinylamines et leurs copolymères notamment avec des vinylamides; on peut notamment citer les copolymères vinylamine/vinylformamide tels que ceux commercialisés sous la dénomination LUPAMIN® 9030 par la société BASF ;
les polyacides aminés présentant des groupes NH₂comme la polylysine, par exemple celle vendu par la société JNC Corporation (anciennement Chisso) ;
l’amino dextrane, tel que celui vendu par la société CarboMer Inc ;
l’amino alcool polyvinylique tel que celui vendu par la société CarboMer Inc, les copolymères à base d'acrylamidopropylamine; les chitosanes ;
les polydiméthylsiloxanes comprenant des groupes amines primaires en bout de chaine ou sur des chaines latérales, par exemple des groupes terminaux ou latéraux aminopropyl, comme par exemple ceux de formule (A) ou (B) ou (C) :

(A),

dans laquelle la valeur de n est telle que le poids moléculaire moyen en poids de la silicone est compris entre 500 et 55 000, ces composés incluant par exemple les silicones aminée vendues sous les dénominations « DMS-A11 », « DMS-A12 », « DMS-A15 », « DMS-A21 », « DMS-A31 », « DMS-A32, « DMS-A35 » par la société GELEST ;

(B),

dans laquelle les valeurs de n et m sont telles que le poids moléculaire moyen en poids de la silicone est compris entre 1 000 et 55 000, ces composés incluant par exemple les silicones vendues sous les dénominations «AMS-132 », « AMS-152 », « AMS-162 », « AMS-163 », « AMS-191 », «AMS-1203 » par la société GELEST ;

H₂NCH₂CH₂CH₂-Si(CH₃)₂-O-[Si(CH₃)₂-O]_n-Si(CH₃)₂C₄H₉(C)

dans laquelle la valeur de n est telle que le poids moléculaire moyen en poids de la silicone est compris entre 500 et 3 000, ces composés incluant par exemples les silicones vendues sous les dénominations « MCR-A11 », « MCR-A12 » par la société GELEST ;

les amodiméthicones de formule (D) :

(D)

dans laquelle R, R' et R", identiques ou différents, représentent chacun un groupe alkyle en C₁-C₄ou hydroxyle, A représente un groupe alkylène en C₃et m et n sont tels que la masse moléculaire moyenne en poids du composé est comprise entre 5 000 et 500 000 environ ;

les polyéthers amines notamment connues sous la référence JEFFAMINE de la société HUNSTMAN ; et notamment :

les polyéthylèneglycol et/ou polypropylèneglycol à fonction amine en bout de chaine (monamine ou diamine) comme celles vendues sous les dénominations JEFFANINE M-600, M-1000, M-2005, M-2070, D-230, D-400, D-2000, D-4000, ED-600, ED-9000, ED-2003,
les polytétrahydrofurane (ou polytétraméthylèneglycol) à fonction amine en bout de chaine (monoamine ou diamine), les polybutadiènes à fonction amine en bout de chaine (monoamine ou diamine) ;

les dendrimères et les polymères hyperbranchés à fonction amine primaire ou secondaire (PAMAM) ;
les poly(méth) acrylates ou poly(méth)acrylamides porteurs de fonctions amines primaires ou secondaires latérales telles que le poly(3-aminopropyl)méthacrylamide, le poly(2-aminoéthyl) méthacrylate.

Comme polymère aminé, on utilise de préférence la polyéthylène imine, la polylysine, les chitosanes, les poly oxyde d’éthylène et/ou oxyde de propylène à groupes amine terminaux.

Préférentiellement, les composés aminés utilisés dans le cadre de l’invention sont choisis parmi l’éthylène diamine, la lysine, le 3-aminopropyltriethoxy-silane (APTES). Plus préférentiellement, on utilise l’éthylènediamine.

Avantageusement, le composé aminé utilisé dans cadre de l’invention est mis en œuvre selon un ratio molaire composé aminé/groupe (méth)acrylate de l’acide hyaluronique greffé allant de 0,1 à 10, de préférence allant de 0,1 à 5, et préférentiellement allant de 0,1 à 2.

Le composé aminé au contact avec l’acide hyaluronique greffé réagit avec les insaturations éthyléniques des groupes (méth)acrylates greffés sur l’acide hyaluronique pour former des liaisons amines avec le carbone terminal de l’insaturation éthylénique du groupement (méth)acrylate (cette réaction est connue sous le nom de réaction de Michael).

Dans un autre mode de réalisation, l’agent réticulant est un composé thiolé.

Le composé thiolé pouvant être utilisé dans le cadre de l’invention peut être un composé comprenant un ou plusieurs groupes thiols (SH) et éventuellement une autre fonction apte à réagir avec l’insaturation éthylénique des groupes (méth)acrylates ou (méth)acrylamides greffés sur l’acide hyaluronique, comme une fonction amine primaire ou secondaire, de préférence amine primaire.

Le composé thiolé peut être un polythiol ou un monothiol réticulant tels que décrits ci-après.

Par « composé polythiol », on entend tout composé porteur de deux ou plus de deux groupements thiol SH. Il peut s’agir d’une molécule organique non polymérique porteuse de deux ou plus de deux groupements thiol, ou d’un polymère porteur de deux ou plus de deux groupements thiol.

Le composé polythiol pouvant être utilisé dans le cadre de l’invention ne doit pas renfermer de fonctions vinyliques (C=C) (non aromatique) ou acétyléniques (CΞC). Le composé polythiol peut être aromatique, ou hétéroaromatique, ou renfermer un radical aromatique.

Le composé polythiol pouvant être utilisé dans le cadre l’invention peut en outre contenir un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, S et/ou une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions esters, cétones, amides, urées et isocyanurate.

De préférence, le composé polythiol utilisé dans le cadre de l’invention peut en outre contenir un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, S et/ou une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions esters et cétones.

Selon une première variante, le composé polythiol utilisé dans le cadre de la présente invention désigne un composé organique non polymérique et peut être représenté par la formule (I)

W(SH)n

(I)

dans laquelle n désigne un entier supérieur ou égal à 2, de préférence compris entre 2 et 10, de préférence entre 2 et 5,

et W désigne un radical multivalent (au moins divalent) C₂-C₈₀linéaire ou ramifié ou (hétéro)cyclique, saturé, un radical aromatique, un radical cyclique hétéroaromatique, W pouvant en outre contenir un ou plusieurs hétéroatomes tels que O, N, S, et/ou une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions esters, cétones, amides, urées, de préférence esters ou cétones, et/ou être substitué par un ou plusieurs groupements alkyles C₁-C₁₀linéaires ou ramifiés, hydroxyle, amino, (alkyl C₁-C₆) amino, carboxylique, carboxylate, alcoxy C₁-C₁₀linéaires ou ramifiés, étant entendu que lorsque le radical W est substitué, les fonctions thiols peuvent être portées par le/les substituant(s).

Par radical cyclique on entend un radical monocyclique saturé, hydrocarboné ou hétérocyclique, un radical polycyclique saturé ou aromatique par exemple biphényl ou des cycles condensés comme par exemple le radical naphtyl.

La masse molaire des composés de formule (I) est généralement comprise entre 70 et 1500 g/mole et de préférence entre 70 et 500 g/mole.

Selon un premier mode de réalisation, le composé polythiol de formule (I) est tel que n=2 (dithiol) et W désigne un radical divalent saturé hydrocarboné C₂-C₂₀linéaire ou ramifié, de préférence C₂-C₁₂.

Selon ce mode de réalisation, le composé à polythiol de l’invention désigne par exemple le 1,2-ethanedithiol, le 1,2-propanedithiol, le 1,3-propanedithiol, le 1,4-butanedithiol, le 1,6-hexanedithiol, le 1,7-heptanedithiol, le 1,8-octanedithiol, le 1,9-nonanedithiol, le 1,10-decanedithiol, le 1,12-dodecanedithiol, le 2,2-dimethyl-1,3-propanedithiol, le 3-methyl-1,5-pentanedithiol ou le 2-methyl-1,8-octanedithiol.

Selon un second mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n = 3 et W désigne un radical trivalent hydrocarboné saturé C₃-C₂₀linéaire ou ramifié, de préférence C₂-C₁₂linéaire ou ramifié.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi le 1,1,1-tris(mercaptomethyl)ethane, le 2-ethyl-2-mercaptomethyl-1,3-propanedithiol, le 1,2,3-propanetrithiol.

Selon un troisième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n = 2 ou 3 et W désigne un radical divalent ou trivalent saturé hydrocarboné C₃-C₂₀linéaire ou ramifié, de préférence C₂-C₁₂linéaire ou ramifié, ledit radical renfermant un ou plusieurs hétéroatome(s) non adjacents choisis parmi O et S.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi les éthers et sulfures de bis mercaptoalkyle en C₂-C₁₂tels que le bis(2-mercaptoethyl)ether, le bis(2-mercaptoethyl)sulfure, le bis-(2-mercaptoethylthio-3-mercaptopropane)sulfide, les alcanes (C₁-C₅) bis (2-mercapto alkyl (C₁-C₃)thio) ou mercaptoalcanes (C₁-C₅) bis (2-mercapto alkyl (C₁-C₃)thio) comme par exemple le bis(2-mercaptoethylthio)methane, le 1,2-bis(2-mercaptoethylthio)ethane, le 1,3-bis(2-mercaptoethylthio)propane, le 1,2-bis(2-mercaptoethylthio)propanethiol, le 1,2-bis(2-mercaptoethyl)thio-3-mercaptopropane ou le 1,2,3-tris(2-mercapto ethylthio) propane.

De préférence, selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est choisi parmi le 1,2-bis(2-mercaptoethylthio)propanethiol, le 1,2,3-tris(2-mercapto ethylthio) propane et le tetrakis(2-mercaptoethylthiométhyl) méthane.

Selon un quatrième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n désigne un entier supérieur ou égal à 2 et W désigne un radical multivalent (au moins divalent) hydrocarboné saturé C₃-C₂₀linéaire ou ramifié, de préférence C₂-C₁₂linéaire ou ramifié, ledit radical renfermant au moins une fonction ester.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi les esters de polyols (glycols, triols, tetraols, pentaols, hexaols) et d’acide mercaptocarboxylique en C₁-C₆tels que l’ethylene glycol bis(2-mercaptoacetate), l’ethylene glycol bis(3-mercaptopropionate), l’ethylene glycol bis(thioglycolate), le trimethylolpropane tris (thioglycolate), le trimethylolpropane tris (beta-mercaptopropionate), le pentaerythritol tetrakis (thioglycolate), le pentaerythritol tetrakis (beta-mercaptopropionate), le dipentaerylthritol hexakis (beta-mercaptoproprionate), le trimethylolpropane tris(2-mercaptoacetate), le trimethylolpropane tris(3-mercaptopropionate), le pentaerythritol tetrakis(2-mercaptoacetate), le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate), le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptobutanate) et le dipentaerythritol hex-3-mercaptopropionate.

De préférence, selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol est choisi parmi le trimethylolpropane tris(2-mercaptoacetate), le trimethylolpropane tris(3-mercaptopropionate), le pentaerythritol tetrakis(2-mercaptoacetate), le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate), le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptobutanate) et le dipentaerythritol hex-3-mercaptopropionate.

De façon particulièrement préférée, le composé à motif thiol est le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate).

Selon un cinquième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n =4 et W désigne un radical tétravalent hydrocarboné saturé C₄-C₂₀, de préférence C₈-C₁₄, ramifié interrompu par un ou plusieurs atomes de soufre non adjacents.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi le tétrakis(2-mercaptoethylthiomethyl) méthane et le bis-(2-mercaptoethylthio-3-mercaptopropane)sulfure.

Selon un sixième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n =2 et W désigne un radical divalent cyclique hydrocarboné renfermant éventuellement un ou plusieurs atomes de soufre non adjacents, éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyles C₁-C₁₀linéaires ou ramifiés.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi le 1,4-cyclohexane dithiol, le 1,4-bis(mercaptomethyl) cyclohexane, le 1,1-cyclohexane dithiol, le 1,2-cyclohexane dithiol, le 1,1-bis(mercaptomethyl)cyclohexane et le 2,5-dimercapto-1,4-dithiane.

Selon un septième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n =3 et W désigne un radical cyclique de type isocyanurate substitué.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi les polythiols de la classe isocyanurates décrits dans les brevets US 3,676,440 et US20110230585, tels que le tris((mercaptopropionyloxy)-ethyl)isocyanurate.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol désigne le tris((mercaptopropionyloxy)-ethyl)isocyanurate.

Selon un huitième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n = 2 ou 3 ou 4 et W désigne un radical aromatique éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux identiques ou différents de type alkyle C₁-C₁₀, alcoxy C₁-C₁₀, étant entendu que lorsque le radical W est substitué, les fonctions thiols peuvent être portées par le/les substituants(s).

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi :

le 1,2-dimercaptobenzene, le1,3-dimercaptobenzene,

le 1,4-dimercaptobenzene, le 1,2-bis(mercaptomethyl)benzene,

le 1,3-bis(mercaptomethyl)benzene,

le 1,4-bis(mercaptomethyl)benzene,

le 1,2-bis(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,3-bis(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,4-bis(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,2-bis(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,3-bis(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,4-bis(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,2,3-trimercaptobenzene,

le 1,2,4-trimercaptobenzene,

le 1,3,5-trimercaptobenzene,

le 1,2,3-tris(mercaptomethyl)benzene,

le 1,2,4-tris(mercaptomethyl)benzene,

le 1,3,5-tris(mercaptomethyl)benzene,

le 1,2,3-tris(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,2,4-tris(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,3,5-tris(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,2,3-tris(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,2,4-tris(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,3,5-tris(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,2,3,4-tetramercaptobenzene,

le 1,2,3,5-tetramercaptobenzene,

le 1,2,4,5-tetramercaptobenzene,

le 1,2,3,4-tetrakis(mercaptomethyl)benzene,

le 1,2,3,5-tetrakis(mercaptomethyl)benzene,

le 1,2,4,5-tetrakis(mercaptomethyl)benzene,

le 1,2,3,4-tetrakis(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,2,3,5-tetrakis(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,2,4,5-tetrakis(2-mercaptoethyl)benzene,

le 1,2,3,4-tetrakis(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,2,3,5-tetrakis(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 1,2,4,5-tetrakis(2-mercaptoethyleneoxy)benzene,

le 2,2'-dimercaptobiphenyl,

le 4,4'-dimercaptobiphenyl,

le 4,4'-dimercaptobibenzyl,

le 2,5-toluenedithiol,

le 3,4-toluenedithiol,

le 1,4-naphthalenedithiol,

le 1,5-naphthalenedithiol,

le 2,6-naphthalenedithiol,

le 2,7-naphthalenedithiol,

le 2,4-dimethylbenzene-1,3-dithiol,

le 4,5-dimethylbenzene-1,3-dithiol,

le 9,10-anthracenedimethanethiol,

le 1,3-bis(2-mercaptoethylthio)benzene,

le 1,4-bis(2-mercaptoethylthio)benzene,

le 1,2-bis(2-mercaptoethylthiomethyl)benzene,

le 1,3-bis(2-mercaptoethylthiomethyl)benzene,

le 1,4-bis(2-mercaptoethylthiomethyl)benzene,

le 1,2,3-tris(2-mercaptoethylthio)benzene,

le 1,2,4-tris(2-mercaptoethylthio)benzene,

le 1,3,5-tris(2-mercaptoethylthio)benzene,

le 1,2,3,4-tetrakis(2-mercaptoethylthio)benzene,

le 1,2,3,5-tetrakis(2-mercaptoethylthio)benzene,

le 1,2,4,5-tetrakis(2-mercaptoethylthio)benzene, et

le 3,4-thiophenedithiol.

Selon ce mode de réalisation, le composé (I) est choisi parmi le 1,2,3-trimercaptobenzene, le 1,2,4-trimercaptobenzene, le 1,3,5-trimercaptobenzene, le 1,2,3-tris(mercaptomethyl)benzene, le 1,2,4-tris(mercaptomethyl)benzene, le 1,3,5-tris(mercaptomethyl)benzene, le 1,2,3-tris(2-mercaptoethyl)benzene, le 1,2,4-tris(2-mercaptoethyl)benzene, le 1,3,5-tris(2-mercaptoethyl)benzene, le 1,2,3-tris(2-mercaptoethyleneoxy)benzene, le 1,2,4-tris(2-mercaptoethyleneoxy)benzene, le 1,3,5-tris(2-mercaptoethyleneoxy)benzene, le 1,2,3,4-tetramercaptobenzene, le 1,2,3,5-tetramercaptobenzene, le 1,2,4,5-tetramercaptobenzene, le 1,2,3,4-tetrakis(mercaptomethyl) benzene, le 1,2,3,5-tetrakis(mercaptomethyl) benzene, le 1,2,4,5-tetrakis(mercaptomethyl) benzene, le 1,2,3,4-tetrakis(2-mercaptoethyl) benzene, le 1,2,3,5-tetrakis(2-mercaptoethyl) benzene, le 1,2,4,5-tetrakis(2-mercaptoethyl) benzene, le 1,2,3,4-tetrakis(2-mercaptoethyleneoxy) benzene, le 1,2,3,5-tetrakis(2-mercaptoethyleneoxy) benzene, le 1,2,4,5-tetrakis(2-mercaptoethyleneoxy) benzene, le 1,2,3-tris(2-mercaptoethylthio)benzene, le 1,2,4-tris(2-mercaptoethylthio) benzene, le 1,3,5-tris(2-mercaptoethylthio) benzene,le 1,2,3,4-tetrakis(2-mercaptoethylthio) benzene, le 1,2,3,5-tetrakis(2-mercaptoethylthio) benzene, le 1,2,4,5-tetrakis(2-mercaptoethylthio) benzene et le 3,4-thiophenedithiol.

Selon un neuvième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n = 2 ou 3 ou 4 et W désigne un triglycéride d’acide gras ou une huile végétale, éventuellement substitués, étant entendu que lorsque le radical W est substitué, les fonctions thiols peuvent être portées par le/les substituants(s).

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi : les triglycérides d’acides gras ou les huiles végétales modifiées par des groupes thiols par réaction chimique comme par exemple les huiles de soja thiolées et les huiles de soja hydroxylées et thiolées notamment les produits polymercaptan® de la société Chevron Phillips tel que le polymercaptan 358 («mercaptanised soybean oil») dont la formule est présentée ci-dessous et le polymercaptan 407 («mercapto hydroxy soybean oil»).

Polymercaptan 358

Selon un dixième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n = 2 et W désigne un radical divalent hydrocarboné saturé en C₂-C₆, substitué par un ou plusieurs groupe hydroxyle.

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol peut être choisi par exemple parmi le dithiothréitol et le 2,3-dimercapto-1-propanol.

Selon un onzième mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) est tel que n = 2 et W désigne un radical divalent hydrocarboné saturé en C₂-C₆, substitué par un ou plusieurs groupe(s) acide carboxylique ou carboxylate (groupe ester en C₂-C₅).

Selon ce mode de réalisation, le composé à motif thiol de formule (I) peut être l’acide méso-2,3-dimercaptosuccinique et ses esters d’alcool en C₁-C₄.

Selon cette première variante, on préférera les composés de formule (I) pour lesquels n désigne un entier allant de 2 à 4.

De préférence, selon cette variante, les composés de formule (I) sont choisis parmi les composés du quatrième mode de réalisation ; comme en particulier le trimethylolpropane tris(2-mercaptoacetate), le trimethylolpropane tris(3-mercaptopropionate), le pentaerythritol tetrakis(2-mercaptoacetate), le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate), le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptobutanate), le dipentaerythritol hex-3-mercaptopropionate, et plus particulièrement le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) ; ou parmi les composés du dixième mode de réalisation comme en particulier le dithiothréitol.

De façon particulièrement préférée, selon cette variante, les composés de formule (I) désignent le pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) ou le dithiothréitol.

Selon une seconde variante, le composé polythiol mis en œuvre selon l’invention désigne un composé polymérique et peut être représenté par la formule (II)

POL(SH)_n

(II)

dans laquelle n désigne un entier supérieur ou égal à 5, de préférence compris entre 5 et 5000, de préférence entre 5 et 1000,

et POL désigne un radical polymèrique multivalent (au moins pentavalent) carboné ou silicone, POL pouvant en outre renfermer un ou plusieurs hétéroatomes tels que O, N, S, et/ou une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions esters, cétones, amides, urées, carbamates, et/ou être substitué par un ou plusieurs groupements alkyles C₁-C₁₀linéaires ou ramifiés, alcoxy C₁-C₁₀linéaires ou ramifiés, étant entendu que lorsque POL est substitué, les fonctions thiols peuvent être portées par le/les substituant(s).

La masse molaire des composés de formule (II) est généralement comprise entre 500 et 400000 g/ mole, de préférence entre 500 et 150000 g/mole.

POL peut désigner un radical multivalent de type homopolymère ou copolymère ; POL peut désigner un radical polymérique de type étoile, peigne, brosse ou dendritique.

Le radical POL peut être d’origine naturelle (tel que les polysaccharides, peptides) ou synthétique (tel que les polymères acryliques, polyesters, polyglycols).

Les fonctions thiols (-SH) peuvent être des groupements terminaux et/ou pendants.

Selon un premier mode de réalisation de cette seconde variante, le composé thiolé de formule (II) est tel que POL désigne un radical polymérique hydrocarboné.

On peut citer comme exemple les polymères décrits dans les articles Overbergeret al.(1962)Pure Appl. Chem. 4:521-540 et Mercaptan-containing polymers, Advances in Polymer Science Volume 15, 1974, pp 61-90.

En particulier on peut citer les composés à motif thiol de formule (II) tels que poly(vinylmercaptan), poly(4-mercaptostyrene), poly(vinylbenzylmercaptan), poly(4-mercaptostyrene)-co-poly(methylmethacrylate), ainsi que les polymères contenant les fonctions amides dans le polymère tels que le poly(hexamethylene adipamide thiolé).

Les composés de formule (II) désignent également les protéines et peptides avec des motifs thiols comme par exemple les structures représentées ci-dessous :

Les composé thiolé de formule (II) désignent également les composés de formule (II) tels que POL désigne un radical dit dendrimère, polymère ramifié ou hyper ramifiés et les groupements thiols sont terminaux. On peut citer comme exemples les polymères décrits dans l’article Progress in Organic Coatings, Volume 63, Issue 1, July 2008, Pages 100–109.

Comme exemple de synthèse de tels polymères on peut citer la synthèse décrite dans cet article où le polymère Boltorn H40 est transformé en polymère thiolé de formule (II) selon le schéma ci-dessous :

La structure du polymère thiolé (II) obtenu est donnée ci-dessous :

Le composé à motif thiol de formule (II) peut également désigner un polymère hyperbranché ou dendritique modifié par des fonctions thiols tels que décrit dans la demande FR 2761691.

Des polymères de type polypropylène éther glycol bis(beta-mercaptopropionate) sont aussi utilisables. Ils sont préparés à partir de polypropylène éther glycol (e.g., Pluracol P201, Wyandotte Chemical Corp.) et l’acide beta-mercaptopropionique par réaction d’estérification et connus par l’homme de l’art.

Certains polymères à motif thiol de formule (II) sont également disponibles dans le commerce tels que les produits THIOCURE® de la société Bruno Brock, THIOCURE® ETTMP 1300 (Ethoxylated-Trimethylolpropan Tri-3-Mercaptopropionate (CAS# 345352-19-4) et THIOCURE® ETTMP 700 (Ethoxylated-Trimethylolpropan Tri-3-Mercaptopropionate (CAS# 345352-19-4).

Selon un second mode de réalisation de cette seconde variante, le composé de formule (II) est tel que POL désigne un radical polymérique siliconé.

Parmi les polymères inorganiques polythiols on peut citer les silicones polythiols

Les silicones polythiols sont notamment des polydiméthylsiloxanes comportant deux ou plus de deux groupements thiols tels que par exemple les produits SMS-022, SMS 042 et SMS 992 vendus par la société Gelest Inc.

Le thiol réticulant peut être également un composé monothiol comprenant une autre fonction apte à réagir avec l’insaturation éthylénique des groupes (méth)acrylates greffés sur la polysaccharide, comme une fonction amine primaire ou secondaire, de préférence amine primaire.

Le thiol réticulant peut être notamment un aminothiol, notamment un composé de formule (III) :

HS-L-(NHR)b (III)

dans laquelle b désigne un nombre entier allant de 1 à 5, de préférence allant de 1 à 3, et plus préférentiellement égal à 1 ;

L désigne un radical multivalent (au moins divalent) C₂-C₈₀linéaire ou ramifié ou (hétéro)cyclique, saturé, un radical aromatique, un radical cyclique hétéroaromatique, L pouvant en outre contenir un ou plusieurs hétéroatomes non adjacents tels que O, N, S, et/ou une ou plusieurs fonctions choisies parmi les fonctions esters, cétones, amides, urées, carbamates, de préférence esters, cétones) et/ou être substitué par un ou plusieurs groupements alkyles C₁-C₁₀linéaires ou ramifiés, hydroxyle, carboxylique, carboxylate, alcoxy C₁-C₁₀linéaires ou ramifié, étant entendu que lorsque le radical L est substitué, les fonctions thiols peuvent être portées par le/les substituant(s) ;

R désigne un atome d’hydrogène ou un radical alkyle en C₁-C₆, ou CH₃CO- ou C₂H₅-CO-, et de préférence un atome d’hydrogène.

Comme composé aminothiol, on peut citer la cystéamine, la cystéine, l’homocystéine, les composés de formule HS-(CH₂)_n-NH-(CH₂)_m-NH₂, n et m étant des entiers allant de 1 à 4, l’ortho-aminothiophénol, le méta-aminothiophénol, le para-aminothiophénol.

De préférence le thiol réticulant est choisi parmi : la cystéamine, le dithiothréitol, le pentaerhytritol tetra(3-mercaptopropionate). Préférentiellement, le thiol réticulant est la cystéamine.

Avantageusement, le composé thiolé utilisé dans le cadre de l’invention est mis en œuvre selon un ratio molaire composé thiolé / acide hyaluronique greffé allant de 0,01 à 10, de préférence allant de 0,01 à 5.

Le composé thiolé peut être présent dans la bioencre de l’invention en une teneur allant de 0,01 à 50 % en poids, par rapport au poids total de la bioencre, et de préférence allant de 0,01% à 10 % en poids.

Le composé thiolé réticulant au contact avec l’acide hyaluronique greffé de groupements (méth)acrylate réagit avec les insaturations éthyléniques des groupes (méth)acrylates greffés sur l’acide hyaluronique pour former des liaisons thio avec le carbone terminal de l’insaturation éthylénique du groupement (méth)acrylate (cette réaction est connue sous le nom de réaction de Michael).

Lorsque l’acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide comprend des groupes méthacrylates, un catalyseur peut être utilisé en présence du composé thiol. Ce catalyseur permet d’obtenir une bonne réactivité du composé thiol sur l’insaturation éthylénique du groupe méthacrylate.

Le catalyseur peut être choisi parmi les catalyseurs décrits dans les articles « Tetrahedron Letters 48 (2007) pages 141-143 » et « Tetrahedron Letters 46 (2005) pages 8329-8331 » ainsi que les articles cités dans ces deux articles.

Comme exemple de catalyseur on peut citer les acides de Lewis tel que l’acide borique, le chlorure d’aluminium ou le chlorure de cérium, ainsi que les phosphines tels que triméthylphosphine (trialkylphosphine), phényldiméthylphosphine (dialkylarylphosphine), diphénylméthylphosphine (alkyldiarylphosphine), triphénylphosphine (triarylphosphine), tricarboxyethylphosphine, et les équivalents en oxyde.

Dans un autre mode de réalisation, l’agent réticulant est notamment un agent de réticulation photosensible, aussi appelé photoinitiateur.

Comme exemple de photoinitiateur, on peut citer le composé Irgacure 2959, notamment utilisé à une masse volumique de 0,5% (p/v) dans le mélange, et activé par lumière UV-visible (λ=305 - 405 nm, notamment à 305 nm). Dans une autre variante, le photoinitiateur peut être notamment choisi parmi le phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate de lithium (LAP) et la riboflavine. La concentration de LAP peut varier de 0,0025% à 0,1% (p/v) dans le mélange, et sa photoinitiation peut être déclenchée à une longueur d’onde comprise entre 365 et 475 nm. Dans une autre variante, le photoinitiateur peut être le 2-2-azobis (2-méthyl-N-(2-hydroxyéthyl)propionamide) (VA-086), dont la photoinitiation peut être déclenchée à une longueur d’onde de 365-385 nm. La concentration de VA-086 peut varier de 0,03% à 1,4% (p/v) dans le mélange.

De préférence, le photoinitiateur est le LAP ou le VA-086, plus préférentiellement le VA-086.

Dans un mode de réalisation, la bioencre selon l’invention comprend en outre (iv) au moins un composé favorisant l’attachement, la croissance, la migration, la différentiation, la prolifération, le recrutement des cellules cutanées et/ou du cheveu, en particulier de type fibroblastes, mélanocytes, kératinocytes, et leurs mélanges.

Comme exemple de composé favorisant l’attachement, la croissance, la migration, la différentiation, la prolifération, le recrutement des cellules cutanées et/ou du cheveu, on peut citer le collagène, en particulier le collagène 1, le peptide RGD éventuellement thiolé, le peptide GRGDS éventuellement thiolé, la gélatine, des facteurs de croissance, ainsi que les protéines et peptides décrits dans Yamada (1991) J. Biol. Chem.266:12809-128012, tels que la fibronectine ou des peptides dérivés de la fibronectine tels que les peptides I et II, la laminine ou les peptides dérivés de la laminine tels que les peptides YIGSR, PDSGR, F9, LGTIPG, p20 ou PA22-2, la vitronectine, le fibrinogène, le facteur de von Willebrand, l’entactine, la protéine circumsporozoïte, la thrombospondine ou le composant amyloïde P.

Quand le composé favorisant l’attachement, la croissance, la migration, la différentiation, la prolifération, le recrutement des cellules cutanées est le collagène, en particulier le collagène 1, il est présent de préférence dans la bioencre en une teneur comprise entre 0,023% à 1,5% en poids par rapport au poids total de la bioencre, en particulier en une teneur de 0,065% en poids par rapport au poids total de la bioencre.

Quand le composé favorisant l’attachement, la croissance, la migration, la différentiation, la prolifération, le recrutement des cellules cutanées et/ou du cheveu est le peptide RGD éventuellement thiolé ou le peptide GRGDS éventuellement thiolé, il est présent de préférence dans la bioencre en une teneur comprise entre 1 et 5% en poids par rapport au poids total de la bioencre.

Quand le composé favorisant l’attachement, la croissance, la migration, la différentiation, la prolifération, le recrutement des cellules cutanées est la gélatine, il est présent de préférence dans la bioencre en une teneur comprise entre 0,1% et 0,3% en poids par rapport au poids total de la bioencre.

Dans un autre mode de réalisation, la bioencre selon l’invention comprend en outre (v) des cellules cutanées et/ou de cheveu en particulier de type fibroblastes, mélanocytes, kératinocytes, et leurs mélanges.

Dans un mode de réalisation particulier, la bioencre selon l’invention comprend en particulier des fibroblastes, typiquement des fibroblastes dermiques, en particulier des fibroblastes humains, plus particulièrement des fibroblates humains primaires.

De préférence, les cellules cutanées, typiquement les fibroblastes, sont présentes dans la bioencre à une concentration de 0,5 à 5 millions de cellules par ml de bioencre, par exemple à une concentration de 2 millions de cellules par ml de bioencre.

Kit

La présente invention a également pour objet un kit pour bioimpression comprenant : une bioencre selon l’invention, de préférence sans cellules cutanées, et des cellules cutanées, en particulier de type fibroblastes, mélanocytes, kératinocytes, et leurs mélanges.

Dans un mode de réalisation particulier, le kit selon l’invention comprend en outre une seringue. Une telle seringue permet typiquement de fournir la bioencre dans un dispositif de bioimpression.

Procédé de préparation d’équivalent de peau à JDE invaginée

Un autre objet de l’invention concerne un procédé de préparation d’un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :

a) fournir une bioencre selon l’invention comprenant des cellules cutanées, dans laquelle les cellules cutanées comprennent des cellules de type fibroblaste,

b) bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface, ladite au moins une couche correspondant à un compartiment dermique,

c) optionnellement, réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),

d) bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points correspondant à une jonction dermo-épidermique invaginée,

e) réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d),

f) incuber la ou les couche(s) formée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou points formés à l’étape d) pendant 2 à 7 jours, de manière à ce que les cellules présentes se multiplient pour former un équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique,

g) optionnellement recouvrir l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique formé à l’étape f) avec du collagène, et

h) reconstituer, sur l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique, un équivalent d’épiderme comprenant au moins des kératinocytes.

Etape a)

La bioencre fournie à l’étape a) peut être fournie sous une forme comprenant déjà les cellules de type fibroblaste, comme décrit dans la section «Bioencre» ci-dessus.

Alternativement, les cellules de type fibroblaste peuvent être ajoutées à la bioencre juste avant l’étape b) de bioimpression. Dans ce cas, les cellules sont typiquement mises en suspension dans du milieu de culture approprié à la culture de fibroblastes, par exemple dans du milieu FHN2D (correspondant à du milieu DMEM supplémenté avec de la glutamine et 10% de sérum de veau fœtal), par exemple dans 50 µl de milieu de culture par ml de bioencre, puis la suspension est typiquement mélangée à la bioencre pour obtenir de préférence une concentration finale de 0,5 à 5 millions de cellules par ml de bioencre ou de 2 millions de cellules par ml de bioencre.

Etape b)

Par « bioimpression », on entend ici l’utilisation d’un dépôt précis, en trois dimensions de cellules (e.g.des solutions cellulaires, des gels contenant des cellules, des suspensions cellulaires des pâtes de cellules, des concentrations cellulaires, des agrégats multicellulaires, des corps cellulaires, etc) par une méthodologie qui est compatible avec un dispositif de prototypage à trois dimensions, automatisé ou semi-automatisé, implémenté par ordinateur (e.g.une bioimprimante). La bioimpression englobe les méthodes compatibles avec l’impression de cellules vivantes telles que l’extrusion (ou la microextrusion) en mode continu et/ou discontinu. Dans ce contexte, l’extrusion signifie forcer une bioencre semi-solide ou solide à travers un orifice, dans lequel la bioencre conserve sa forme à un certain degré et pendant une période de temps après avoir été forcée à travers l’orifice. La bioimpression englobe également les méthodes de vaporisation d’aérosols dans lesquelles les cellules sont appliquées en éjectant un liquide de viscosité substantiellement faible sous forme de fines gouttelettes, d’aérosol ou de gouttes sur une surface, par exemple à l’aide d’une imprimante à jet d’encre.

Dans un mode de réalisation particulier, la bioimpression est mise en œuvre par impression à jet d’encre ou par impression par microextrusion, de préférence avec un diamètre interne d’aiguille compris entre 150 µm et 300 µm.

La bioimpression peut être réalisée en suivant tout schéma d’impression adapté pour obtenir une couche de bioencre, qui correspondra au compartiment dermique. Typiquement, le schéma d’impression peut être tel que représenté sur la , dans laquelle le cercle a un diamètre de 1,2 cm, les lignes d’impression à l’intérieur du cercle sont comme suit :

F illing tool path :offset : 0,03 cm ; line space : 0,05 cm ; horizontal

Epaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU.

La couche de bioencre peut être imprimée sur toute surface appropriée à la bioimpression et l’adhésion cellulaire, ladite surface pouvant présenter toute taille de pores appropriée, et pouvant être recouverte d’un matériau support de matrice, tel que du collagène.

L’étape b) peut être répétée afin d’augmenter le nombre de couches formant le compartiment dermique et/ou l’épaisseur de l’équivalent de peau préparé.

Ainsi, dans un mode de réalisation, l’étape b) est répétée 2, 3, 4, 5 ou 6 fois pour obtenir un compartiment dermique plus épais.

Etape c)

La ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) peuvent être ensuite réticulés.

Dans un mode de réalisation préféré, l’étape c) est répétée autant de fois que l’étape b). En d’autres termes l’étape c) est réalisée entre chacune des couches imprimées à l’étape b).

L’étape de réticulation peut être mise en œuvre par toute technique appropriée bien connue de l’homme du métier.

Ainsi, si un agent réticulant de type photoinitiateur est présent dans la bioencre, la réticulation peut typiquement être mise en œuvre par exposition à une lumière UV appropriée.

Lorsque l’impression de la couche à l’étape b) a été effectuée en suivant le schéma représenté sur la , l’exposition aux UV peut typiquement être mise en œuvre suivant le schéma représenté sur la , dans laquelle le cercle a un diamètre de 1,2 cm, les lignes d’exposition aux UV sont comme suit :

F illing tool path :offset : 0,09 cm ; line space : 0,09 cm ; horizontal

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU, les lignes d’exposition aux UV étant représentées en gras dans la .

Etape d )

L’étape d) de bioimpression vise à créer des microreliefs qui correspondront à une jonction dermo-épidermique invaginée entre le compartiment dermique et le compartiment épidermique.

Dans un mode de réalisation particulier, la bioimpression à l’étape d) est mise en œuvre par impression à jet d’encre ou par impression par microextrusion, de préférence avec un diamètre interne d’aiguille compris entre 150 µm et 300 µm, sur la couche imprimée l’étape b).

La bioimpression des filaments et/ou des points peut être réalisée en suivant tout schéma d’impression adapté pour obtenir une couche de bioencre, qui correspondra à une jonction dermo-épidermique invaginée. Typiquement, le schéma d’impression des filaments peut être tel que représenté sur la , dans laquelle les lignes d’impression sont réalisées sur le derme à l’intérieur d’un cercle a un diamètre de 1,2 cm, comme suit :

F illing tool path :offset : 0,03 cm ; line space : 0,05 cm ; vertical

Epaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention est pour préparer un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée sur une partie et une jonction dermo-épidermique plate sur une autre partie.

Dans ce mode de réalisation particulier les filaments et/ou les points de la bioencre ne sont imprimés, à l’étape d), que sur une partie de la couche formée à l’étape b).

Dans ce mode de réalisation, le schéma d’impression des filaments peut être tel que représenté sur la , dans laquelle les lignes d’impression sur le derme sont réalisées sur un demi-cercle de 0,6 cm de rayon comme suit :

F illing tool path :offset : 0,06 cm ; line space : 0,06 cm ; vertical

Epaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU.

Alternativement, typiquement, le schéma d’impression des points peut être tel que représenté sur la , dans laquelle les points sont représentés par des croix sur le derme et sont réalisés sur un demi-cercle de 0,6 cm de rayon comme suit :

les croix sont séparées de 0,08 cm sur une ligne horizontale et les lignes sont séparées de 0,04 cm ;

la hauteur de la croix est d’environ 0,05 cm

épaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU.

Etape e )

La couche imprimée à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d) sont ensuite réticulés.

Lorsque l’impression des filaments à l’étape d) a été effectuée en suivant le schéma représenté sur la , l’exposition aux UV peut être typiquement mise en œuvre suivant le schéma représenté sur la , dans laquelle le cercle a un diamètre de 1,2 cm, les lignes d’exposition aux UV sont comme suit :

F illing tool path :offset : 0,09 cm ; line space : 0,09 cm ; vertical

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU,

les lignes d’exposition aux UV étant représentées en pointillé sur la .

Alternativement, lorsque l’impression des points à l’étape d) a été effectuée en suivant le schéma représenté sur la , l’exposition aux UV peut être typiquement mise en œuvre suivant le schéma représenté sur la , dans laquelle le cercle a un diamètre de 1,2 cm, les lignes d’exposition aux UV sont comme suit :

Filling tool path :offset : 0,09 cm ; line space : 0,09 cm ; vertical

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU,

les lignes d’exposition aux UV étant représentées en gras sur la .

Alternativement, l’étape de réticulation peut être mise en œuvre en mettant en contact la couche imprimée et les filaments et/ou points imprimés avec un agent réticulant tel que défini dans la section «Bioencre» ci-dessus, en particulier avec un agent réticulant thiolé ou aminé. La mise en contact peut être mise en œuvre par toute technique appropriée, par exemple par immersion dans un bain d’agent réticulant.

Etape f )

L’étape f) consiste à incuber la couche formée à l’étape b) et les filaments et/ou points formés à l’étape d) pendant 2 à 7 jours, de manière à ce que les cellules présentes se multiplient pour former un équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique.

L’incubation peut être mise en œuvre par toute technique appropriée bien connue de l’homme du métier, et dans des conditions de culture adaptées à la croissance des cellules cutanées, en particulier des fibroblates.

Le compartiment dermique et la jonction dermo-épidermique peuvent ainsi être cultivés dans du milieu de culture approprié pour la culture des cellules cutanées, en particulier pour la culture des fibroblastes, tel que le milieu FHN2D (correspondant à du milieu DMEM supplémenté avec de la glutamine et 10% de sérum de veau fœtal), de préférence à 37°C et sous 5% CO₂, pendant une période comprise entre 2 et 7 jours, typiquement pendant 3 jours.

Etape f)

L’étape optionnelle f) consiste à recouvrir l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique formé à l’étape e) avec du collagène ou de la fibrine, de préférence avec du collagène.

La présence de collagène ou de fibrine sur le dessus du derme favorise typiquement l’accrochage des kératinocytes utilisés à l’étape g) pour reconstituer un équivalent d’épiderme.

Dans un mode de réalisation particulier, le collagène utilisé est du collagène 1, du collagène 4 ou du collagène 7, de préférence du collagène 1.

Dans un mode de réalisation particulier, le collagène est utilisé à une concentration comprise entre 0,3% et 0,5% en poids.

Avantageusement, l’épaisseur de collagène sur le dessus du derme ne dépasse pas 10 µm.

Etape g)

Afin d’obtenir un équivalent de peau complet, l’étape g) du procédé selon l’invention consiste à reconstituer, sur l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique, un équivalent d’épiderme comprenant au moins des kératinocytes.

Cette étape de reconstitution d'un équivalent d'épiderme peut être réalisée par toute technique bien connue de l'homme du métier, telle que les techniques décrites dans les demandes de brevet EP 285471, EP285474, EP789074, EP502172, EP418035, WO91/16010, EP197090, EP20753, FR2665175, FR2689904 ou celle décrite dans Asselineauet al.(1985)Exp. Cell. Res. 159:536-539 ou dans Asselineauet al.(1987), Models in dermato., col III, Ed. Lowe&Mailbach, 1-7.

De préférence, l'étape de reconstitution est mise en œuvre par ensemencement de kératinocytes sur l'équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique.

Dans un mode de réalisation, un mélange de kératinocytes et de mélanocytes est ensemencé.

Cette étape d’ensemencement peut être réalisée manuellement ou par bioimpression.

De préférence, les kératinocytes sont ensemencés à une concentration comprise entre 50 000 et 600 000 kératinocytes / cm², par exemple à une concentration de 400 000 kéératinocytes / cm².

Avantageusement, après ensemencement des kératinocytes sur l'équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique, la culture peut être maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Rheinwald et Green (1975)Cell 6:317-330, milieu qui permet la prolifération des kératinocytes.

Après un temps d'incubation de préférence de 0 à 7 jours, de manière davantage préférée de 3 à 7 jours, l'équivalent de peau est de préférence maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt dans un insert, sur une grille métallique, ou tout autre dispositif de culture cellulaire connu de l’homme de l’art permettant l’interface air/liquide. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que précédemment.

L'incubation se poursuit alors ensuite de préférence jusqu'à l'obtention d'un équivalent de peau présentant les caractéristiques d'une peau, à savoir un équivalent de derme recouvert d'un équivalent d'épiderme présentant les quatre types de couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit de préférence pendant une durée comprise entre 7 et 21 jours, de préférence entre 7 et 10 jours.

Equivalent de peau à JDE invaginée

La présente invention a également pour objet un équivalent de peau à jonction dermo-épidermique invaginée, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation tel que défini dans la section «Procédé de préparation d’équivalent de peau à JDE invaginée» ci-dessus.

Un autre objet de l’invention concerne un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée sur une partie et une jonction dermo-épidermique plate sur une autre partie, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation tel que défini dans la section «Procédé de préparation d’équivalent de peau à JDE invaginée» ci-dessus, dans lequel les filaments et/ou les points de la bioencre ne sont imprimés, à l’étape d), que sur une partie de la couche formée à l’étape b).

Equivalent de derme présentant un microrelief et équivalent d’épiderme sur support présentant un microrelief

Les étapes a) à f) sont telles que décrites dans la section «Procédé de préparation d’équivalent de peau à JDE invaginée» ci-dessus.

La présente invention concerne également un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique invaginée, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation défini ci-dessus.

Un autre objet de l’invention concerne un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique sur une partie seulement, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation tel que défini ci-dessus, dans lequel les filaments et/ou les points de la bioencre ne sont imprimés, à l’étape d), que sur une partie de la couche formée à l’étape b).

fournir une bioencre selon l’invention ne comprenant pas de cellules cutanées et/ou du cheveu,
bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface,
optionnellement, réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),
bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points formant un microrelief ,
réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d), de manière à obtenir un support présentant un microrelief
optionnellement, recouvrir le support présentant un microrelief avec du collagène, et
reconstituer, sur le support présentant un microrelief, un équivalent d’épiderme comprenant au moins des kératinocytes.

Les étapes a) à e) sont telles que décrites dans la section «Procédé de préparation d’équivalent de peau à JDE invaginée» ci-dessus, à l’exception du fait que la bioencre ne comprend pas de cellules cutanées et/ou du cheveu.

Les étapes f) et g) sont telles que sont décrites respectivement les étapes g) et h) dans la section «Procédé de préparation d’équivalent de peau à JDE invaginée» ci-dessus.

La présente invention concerne également un équivalent d’épiderme sur un support présentant un microrelief, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation défini ci-dessus.

Un autre objet de l’invention concerne un équivalent d’épiderme sur un support présentant, seulement sur une partie, un microrelief, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation défini ci-dessus, dans lequel les filaments et/ou les points de la bioencre ne sont imprimés, à l’étape d), que sur une partie de la couche formée à l’étape b).

La présente invention sera décrite plus en détail dans les exemples ci-dessous.

Exemple 1 : Préparation d’acide hyaluronique acrylé pour utilisation dans la bioencre selon l’invention.

Procédé de synthèse d’acide hyaluronique acrylé de masse proche de 40 kDa et avec un taux de greffage de 40%

L’acide hyalyuronique a été fourni par Evonik (HyaCare® 50), et l’anhydride acrylique par Chemrio.

Dans un réacteur à double enveloppe de 50 l, on dissout 1490 g d’acide hyaluronique dans 30 l d’eau osmosée à température ambiante. Une fois la dissolution complète, on refroidit le milieu réactionnel à 2°C et on introduit 4990 g d’anhydride acrylique préalablement refroidi à 4°C. Le pH du milieu réactionnel descend à 3,5. La température du milieu réactionnel est conservée à 2°C pendant toute la durée de la réaction. De la soude est ajoutée tout au long de la réaction pour conserver un pH compris entre 5,5 et 6, ce pH diminuant par libération d’acide acrylique lors du greffage de l’anhydride acrylique sur l’acide hyaluronique. Après 48 h de réaction, 9668 g de soude 30% ont été ajoutés et le pH est proche de 7 et n’évolue plus ce qui indique la fin de la réaction de greffage. Le milieu réactionnel est ensuite purifié par ultrafiltration (membrane organique HFK de 5,5 m², koch membrane system), et l’acide hyaluronique à fonctions acrylates est obtenu sous forme de poudre par lyophilisation (masse obtenue 1440 g). Le taux de greffage mesuré par RMN est de 40% (1,57 unités acrylates pour chaque motif d’acide glucuronique-N-acétylglucosamine).

Procédé de synthèse d’acide hyaluronique acrylé de masse proche de 140 k Da et avec un taux de greffage de 75% :

Cette synthèse est effectuée en 2 étapes : la 1^èreconsiste à obtenir un acide hyaluronique de masse proche de 140 kDa par hydrolyse en conditions acides d’un acide hyaluronique de haut poids moléculaire, la 2^èmeétape consistant à greffer des fonctions acrylates sur cet acide hyaluronique 140 kDa.

1 ^ère étape : procédé de synthèse d’acide hyaluronique de masse proche de 140 kDa par hydrolyse acide d’acide hyaluronique de haut poids moléculaire

L’acide hyaluronique a été fourni par Neore Chemical Numéro de Batch HA 2014122702 (Masse Molaire = 800-1500 kDa)

Dans un réacteur à double enveloppe de 6 l, 3160 g d’éthanol sont chauffés à 70°C sous agitation. 500 g d’acide hyaluronique sous forme d’une poudre fine blanche sont ajoutés suivis de 458 g d’acide chlorhydrique 1N. Le milieu hétérogène sous forme d’une poudre en suspension avec un pH de 3.7 est agité pendant 23h30 à 70°C. Après quoi 51,3 g d’une solution d’hydroxyde de sodium 30% sont ajoutés progressivement pour atteindre un pH proche de 7. Le chauffage est stoppé et le milieu une fois à température ambiante est filtré sur Fritté Type 3. Sont obtenus après séchage 480 g d’acide hyaluronique hydrolysé sous forme d’une fine poudre blanche dont la distribution en masse est donnée dans le tableau 1.

Mn (g/mole)	Mw	Mp	IPD
141 575	433 320	298 212	3.06

GPC

2 ^ème étape : procédé de synthèse de l’acide hyaluronique greffé : greffage de fonctions acrylates sur l’acide hyaluronique obtenu à l’étape 1

L’acide hyalyuronique préalablement hydrolysé obtenu à l’étape précédente (Mn = 141 kDa, Mw = 433 kDa), a été mis en œuvre avec l’anhydride acrylique fourni par Chemrio.

Dans un réacteur à double enveloppe de 6 l, on dissout 100 g d’acide hyaluronique dans 1,9 l d’eau osmosée à température ambiante. Une fois la dissolution complète, le pH proche de 4 est ramené à 8 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (30%). Le milieu réactionnel est refroidi à 4°C. On coule simultanément dans deux ampoules d’addition 166 g d’anhydride acrylique et une solution d’hydroxyde de sodium (30%) de telle sorte que le pH dans le milieu soit légèrement au-dessus de 7. Après 80 min, 289 g d’hydroxyde de sodium (30%) ont été ajoutés jusqu’à obtenir un pH stable dans le milieu proche de 7. La réaction se poursuit encore pendant 1h40 puis le refroidissement est stoppé. Le milieu réactionnel à température ambiante est purifié par ultrafiltration (Polyether Sulfone/PESU/30kDa / 0.1m² SARTOCON SLICE), et l’acide hyaluronique à fonctions acrylates est obtenu sous forme d’un solide cotonneux par lyophilisation (masse obtenue 103 g). Le taux de greffage mesuré par RMN est de 75% (3 unités acrylates pour chaque motif d’acide glucuronique-N-acétylGlucosamine).

Exemple 2 : Bioencre selon l’invention

La bioencre de composition suivante a été préparée par les inventeurs.

2% en poids de nanofibrilles de cellules CNF (commercialisées par VTT ou CELLINK),
1,25% en poids d’acide hyaluronique acrylé (HAA) à 40 000 Da avec 40% de fonction acrylée, préparé par le procédé décrit dans l’exemple 1,
0,065% en poids de collagène 1,
0,03% en poids de photoinitiateur VA-086, activable par UV à 365 nm, 880 W/m², 5,3 J/cm²,

par rapport au poids total de la bioencre.

Exemple 3 : Préparation d’un équivalent de peau selon l’invention

Les inventeurs ont mis en œuvre le procédé suivant, utilisant la bioencre décrite dans l’exemple 2, pour préparer un équivalent de peau à JDE invaginée.

Les composés ont été pesés avec une balance de précision dans un conteneur de mélange pour SpeedMixer^TM, dilués à la bonne concentration en ajoutant du milieu DMEM (ou du milieu pour fibroblaste FHN2D correspondant à du DMEM avec de la glutamine et 10% de sérum de veau fœtal) ou du milieu G7F, puis mélangés avec un « SpeedMixer^TM» à 3500 rpm pendant 5 min à température ambiante.

A partir de ce moment le mélange peut être conservé à 4-5°C pendant 2-3 jours ou utilisé immédiatement par ajout des cellules.

Des fibroblastes humains normaux (NHF) ont été décollés de leur support par action de la trypsine (3 min à l’incubateur à CO₂5%). La trypsine a ensuite été neutralisée par ajout de milieu G7F. L’ensemble des cellules a alors été introduit dans un flacon stérile contenant du G7F neuf. La densité cellulaire a été évaluée par comptage.

Un volume X correspondant à 10 à 15 millions de cellules a été prélevé et introduit dans un tube stérile neuf pour centrifugation (5 min, 1000 rpm). Après centrifugation le milieu a été jeté et le culot cellulaire a été re-suspendu avec du G7F pour arriver à un volume final de 50 µl par ml de bioencre. La suspension cellulaire a alors été transférée dans le flacon contenant la bioencre. L’ensemble a été mis sous agitation dans le SpeedMixer^TMpendant 30 s à 1000 rpm.

3 ml de bio-encre avec cellules ont été introduits dans une cartouche avec protection UV de 3 ml.

Dans la partie basse de la tête d’impression (PH) de la bioimprimante a été introduite une microvalve (MICROVALVE NEEDLE CF-300 ID=0.3/L=2.4), par-dessus a été vissée une aiguille (NEEDLE CF-300 ID=0.15/L=2.4 ou NEEDLE CF-300 ID=0.3/L=2.4). En partie haute une cartouche de 3 ml a été vissée. 3 lavages successifs à l’éthanol 70% ont été réalisés pour stériliser l’ensemble puis un lavage au PBS a été réalisé en dernier.

La cartouche contenant la bioencre a été placée sur l’imprimante sur la tête d’impression et reliée à l’air comprimé par l’adaptateur de cartouche.

Le protocole correspondant à l’impression souhaitée a été chargé. Avant de lancer l’impression, il a été vérifié que l’écoulement de l’encre à travers l’aiguille s’effectue correctement en augmentant doucement la pression avec le manomètre correspondant jusqu’à obtenir un écoulement convenable (0.03;0.08mPa).

Une plaque 6 puits avec des inserts a été positionnée dans l’emplacement prévu à cet effet.

Le programme d’impression a été lancé.

La bioimpression a été réalisée en suivant le schéma d’impression tel que représenté sur la , dans laquelle le cercle a un diamètre de 1,2 cm, les lignes d’impression à l’intérieur du cercle sont comme suit :

F illing tool path :offset : 0,03 cm ; line space : 0,05 cm ; horizontal

Epaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU.

Une fois la couche correspondant au compartiment dermique imprimée, les filaments formant la JDE invaginée ont été bioimprimés en suivant le schéma d’impression des filaments représenté sur la , dans laquelle les lignes d’impression sont réalisées sur le derme à l’intérieur d’un cercle a un diamètre de 1,2 cm, comme suit :

F illing tool path :offset : 0,03 cm ; line space : 0,05 cm ; vertical

Epaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU.

La couche imprimée et les filaments imprimés ont ensuite été réticulés par exposition à une lumière UV, l’exposition aux UV étant mise en œuvre suivant le schéma représenté sur la , dans laquelle le cercle a un diamètre de 1,2 cm, les lignes d’exposition aux UV sont comme suit :

F illing tool path :offset : 0,09 cm ; line space : 0,09 cm ; vertical

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU,

les lignes d’exposition aux UV étant représentées en pointillé sur la .

Une fois les impressions terminées, 10 ml de milieu FNH2D ont été introduits en dessous de chaque insert et 2 ml de ce même milieu a été déposé délicatement dans l’insert. La plaque a ensuite été mise à l’incubateur à CO₂5%, 95% d’humidité pendant 3 jours.

Des kératinocytes (NHK) ont été isolés de chirurgies plastiques obtenues après consentement éclairé des patients, puis amplifiées en milieu d’amplification G7F (Blacket al.(2005)Tissue Eng. 11 :723-733).

Les NHK ont été trypsinisées (0.05%, 7 min à 37°C), comptées et culottées par centrifugation 4 min à 1000 rpm. Le culot a été resuspendu en milieu G7F puis manuellement ensemencé ou transféré dans une seringue et imprimé par jet d’encre à une concentration finale comprise entre 50 000 et 600 000 NHK/cm².

La peau complète a ensuite été immergée dans du milieu G7F à 37°C, 5% CO₂et incubée jusqu’à 7 jours, de préférence 3 jours, à 37°C, 5% CO_2.

La peau a ensuite été émergée à l’interface air-liquide dans du milieu G3F (Blacket al.(2005)Tissue Eng. 11:723-733) pendant 7 à 21 jours, de préférence 10 jours, à 37°C, 5% CO₂.

La montre les résultats d’une coloration histologique à l’hématoxyline et à l’éosine d’un équivalent de peau ainsi obtenu.

Les inventeurs ont ainsi formulé une bioencre avec une nouvelle composition qui correspond aux critères recherchés pour bioimprimer des équivalents de peau (rhéologie, résolution lors de l'impression, comportement de l'encre dans le temps, culture, fixation cellulaire et biocompatibilité).

En utilisant la technique de bio-impression et la nouvelle composition d'encre, les inventeurs ont pu imprimer un derme avec différentes topographies, et déposer des kératinocytes humains sur la structure imprimée.

Les modèles produits (avec ou sans microrelief) conservent leurs designs pendant la durée de la culture, présentent une histologie correcte et expriment les principaux marqueurs cutanés (épidermiques et dermiques).

Dans le compartiment dermique avec ou sans relief, les fibroblastes humains peuvent se fixer, vivre et proliférer pendant au moins 21 jours à l'intérieur de la bioencre et la structure imprimée est stable sur la période de culture, ce qui est cohérent avec la dynamique de la topographie conduisant à encore plus de possibilités de personnalisation.

La bioencre selon l’invention a aussi une très bonne résolution d'impression car les inventeurs ont pu imprimer une structure aussi haute que 3 mm (ce qui est plus que suffisant pour un derme humain d'environ 1 à 2 mm d'épaisseur) et dessiner des reliefs sur le haut de la structure dermique (sous forme de filaments ou de micropiliers).

Les microreliefs produits étaient de 60 à 80 µm de haut, ce qui est cohérent avec la moyenne des tailles des «rete ridges»in vivo(40 à 80 µm), et étaient reproductibles.

Les inventeurs ont également déposé des kératinocytes humains manuellement ou par bio-impression sur le dessus de la structure dermique. Ils ont montré que le processus d'impression n'affectait pas leur capacité de prolifération et de différenciation.

Exemple 4 : Préparation d’un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une JDE invaginée selon l’invention

Les inventeurs ont mis en œuvre le procédé suivant, utilisant la bioencre décrite dans l’exemple 2, pour préparer un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une JDE invaginée selon l’invention.

Le programme d’impression a été lancé.

F illing tool path :offset : 0,03 cm ; line space : 0,05 cm ; horizontal

Epaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU.

Une fois la couche correspondant au compartiment dermique imprimée, les points formant le mmicrorelief ont été bioimprimés sur une partie du derme en suivant le schéma d’impression représenté sur la , dans laquelle les points sont représentés par des croix sur le derme et sont réalisés sur un demi-cercle de 0,6 cm de rayon comme suit :

la hauteur de la croix est d’environ 0,05 cm

épaisseur des lignes: 300 µm;

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU

La couche imprimée et les points imprimés ont ensuite été réticulés par exposition à une lumière UV, l’exposition aux UV étant mise en œuvre suivant le schéma représenté sur la , dans laquelle le cercle a un diamètre de 1,2 cm, les lignes d’exposition aux UV sont comme suit :

Filling tool path :offset : 0,09 cm ; line space : 0,09 cm ; vertical

le logiciel utilisé étant typiquement le logiciel BIOCAD de regenHU,

les lignes d’exposition aux UV étant représentées en gras sur la .

La montre une photo d’un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une JDE invaginée ainsi obtenu.

Claims

Bioencre comprenant dans une phase aqueuse :
au moins une nanocellulose, et

au moins un acide hyaluronique présentant au moins un résidu acrylate, méthacrylate, acrylamide ou méthacrylamide.
Bioencre selon la revendication 1, comprenant en outre (iii) au moins un agent réticulant choisi parmi les composés aminés, thiolés, et les photoinitiateurs, de préférence les photoinitiateurs.
Bioencre selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre (iv) au moins un composé favorisant l’attachement, la croissance, la migration, la différentiation, la prolifération, le recrutement des cellules cutanées, en particulier de type fibroblastes, mélanocytes, kératinocytes, et leurs mélanges.
Bioencre selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre (v) des cellules cutanées et/ou de cheveu, en particulier de type fibroblastes, mélanocytes, kératinocytes, et leurs mélanges.
Kit pour bioimpression comprenant :
une bioencre selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, et

des cellules cutanées, en particulier de type fibroblastes, mélanocytes, kératinocytes, et leurs mélanges.
Procédé de préparation d’un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
fournir une bioencre selon la revendication 4, dans laquelle les cellules cutanées comprennent des cellules de type fibroblaste,

bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface, ladite au moins une couche correspondant à un compartiment dermique,

optionnellement réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),

bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points correspondant à une jonction derrmo-épidermique invaginée,

réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d),

incuber la couche formée à l’étape b) et les filaments et/ou points formés à l’étape d) pendant 2 à 7 jours, de manière à ce que les cellules présentes se multiplient pour former un équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique,

optionnellement recouvrir l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique formé à l’étape f) avec du collagène, et

reconstituer, sur l’équivalent de derme et de jonction dermo-épidermique, un équivalent d’épiderme comprenant au moins des kératinocytes.
Procédé de préparation selon la revendication 6, pour préparer un équivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée sur une partie et une jonction dermo-épidermique plate sur une autre partie, dans lequel les filaments et/ou les points de la bioencre ne sont imprimés, à l’étape d), que sur une partie de la couche formée à l’étape b).
Equivalent de peau à jonction dermo-épidermique invaginée, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation selon la revendication 6.
Equivalent de peau comprenant une jonction dermo-épidermique invaginée sur une partie et une jonction dermo-épidermique plate sur une autre partie, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation selon la revendication 7.
Procédé de préparation d’un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique invaginée, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
fournir une bioencre selon la revendication 4, dans laquelle les cellules cutanées comprennent des cellules de type fibroblaste,

bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface, ladite au moins une couche correspondant à un compartiment dermique,

optionnellement, réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),

bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points mimant une jonction derrmo-épidermique invaginée,

réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d), et

incuber la ou les couche(s) formée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou points formés à l’étape d) pendant 2 à 7 jours, de manière à ce que les cellules présentes se multiplient pour former un équivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique invaginée.
Equivalent de derme présentant un microrelief mimant une jonction dermo-épidermique invaginée, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation selon la revendication 10.
Procédé de préparation d’un équivalent d’épiderme sur un support présentant un microrelief, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
fournir une bioencre selon l’une des revendications 1 à 3 ne comprenant pas de cellules cutanées et/ou du cheveu,

bioimprimer au moins une couche de la bioencre fournie à l’étape a) sur une surface,

optionnellement, réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b),

bioimprimer des filaments et/ou des points de la bioencre fournie à l’étape a) sur au moins une partie de la couche imprimée à l’étape b), lesdits filaments et/ou points formant un microrelief ,

réticuler la ou les couche(s) imprimée(s) à l’étape b) et les filaments et/ou les points imprimés à l’étape d), de manière à obtenir un support présentant un microorelief

optionnellement, recouvrir le support présentant un microrelief avec du collagène, et

reconstituer, sur le support présentant un microrelief, un équivalent d’épiderme comprenant au moins des kératinocytes.
Equivalent d’épiderme sur un support présentant un microrelief, susceptible d’être obtenu par le procédé de préparation selon la revendication 12.