FR3108253A1 - Mousse de lysat plaquettaire pour la culture cellulaire, la thérapie cellulaire et la régénération tissulaire et procédé d’obtention - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne une mousse de lysat plaquettaire obtenue à partir de dérivé sanguin (allogénique ou autologue) qui conserve les propriétés biologiques des lysats plaquettaires et possède des propriétés, notamment mécaniques mais également de conservation, optimales qui permettent sa commercialisation et facilitent sa manipulation. La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire à des fins thérapeutiques, de culture cellulaire et de thérapie cellulaire. La présente invention concerne également un procédé d’obtention d’une mousse de lysat plaquettaire par un procédé de séchage en atmosphère CO2 supercritique.

Description

Mousse de lysat plaquettaire pour la culture cellulaire, la thérapie cellulaire et la régénération tissulaire et procédé d’obtention
La présente invention concerne l’élaboration d’un biomatériau obtenu par séchage d’un hydrogel de lysat plaquettaire (LP) par CO2supercritique.
Le lysat plaquettaire (LP) est un dérivé sanguin riche en facteurs de croissance. Il est utilisé en routine pour la culture cellulaire et des pistes existent pour son éventuelle utilisation en thérapeutique humaine. Le lysat plaquettaire obtenu par simple destruction de la membrane plasmique des plaquettes circulantes du sang offre actuellement de nouvelles stratégies pour la culture cellulaire, la cicatrisation et la régénération tissulaire.
En effet, la présence dans les lysats plaquettaires, de facteurs de croissance et cytokines tels que le VEGF, le PDGF, l'EGF et le TGF-β qui seront libérés lors de l’implantation du concentré dans le milieu (contribuant ainsi à la croissance des tissus) constitue un argument important pour l’utilisation « biomédicale » des concentrés plaquettaires (Amable PR et al., Mesenchymal stromal cell proliferation, gene expression and protein production in human platelet-rich plasma-supplemented media.PloS One2014;9(8):e104662).
Il a été proposé dans l’état de la technique, des hydrogels de lysat plaquettaire. Cependant, la présence d’eau dans le lysat plaquettaire et le gel ne permet pas une bonne conservation ni une bonne manipulation pour l’implantation in vivo.
Des systèmes alternatifs ont été proposés, comme une mousse d’un mélange de fibrine et d’autres substances telles que de la thrombine, de la prothrombine, des extraits de plaquettes sanguines, des inhibiteurs de protéases, des antibiotiques, pour absorber des substances biochimiques et des substrats pour une hémostase accélérée et un contrôle biochimique optimisé de la fermeture de la plaie. La mousse est obtenue par lyophilisation (US4442655). Cependant, la lyophilisation nécessite une étape de congélation du réseau de fibres qui, lorsqu’elle est mal contrôlée, entraine l’éclatement de la mousse et la rend inutilisable. De plus, la lyophilisation, sauf si elle est effectuée en salle blanche, ne permet pas la fabrication de biomatériaux stériles. La lyophilisation en salle blanche impose par ailleurs, une contrainte et des coûts supplémentaires.
Des mousses et matrices de fibrines à délivrance contrôlée améliorée sont également décrites dans le document US20130183279. Des facteurs bioactifs tels que des facteurs de croissance sont additionnés avant la polymérisation de la fibrine. Ces facteurs bioactifs sont donc ajoutés et ne sont pas naturellement présents dans la composition de précurseur.
Problème technique
Il est ainsi nécessaire de concevoir un biomatériau d’origine naturelle qui soit aisément manipulable, présente une bonne conservation, et qui soit également capable d’induire une régénération tissulaire chez l’hôte par la constitution d’une matrice qui favorise l’envahissement, le développement, la prolifération et l’activité des cellules du receveur. Il est également nécessaire de proposer un procédé simple à mettre en œuvre et permettant d’obtenir un biomatériau stérile.
La présente invention concerne une mousse de lysat plaquettaire obtenue à partir de dérivé sanguin (allogénique ou autologue) qui conserve les propriétés biologiques des lysats plaquettaires et possède des propriétés, notamment mécaniques mais également de conservation, optimales qui permettent sa commercialisation et facilitent sa manipulation.
La mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention peut être utilisée directement à l’état sec autorisant ainsi une pénétration immédiate des cellules, facteurs de croissance et fluides biologiques présents sur le site d’implantation, ou hydratée pour retrouver la forme gélifiée. Elle permet également une libération lente et prolongée de facteurs de croissance naturellement présents dans la mousse de lysat plaquettaire.
De par la libération lente et prolongée des facteurs de croissance, la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention favorise avantageusement l’envahissement, le développement et la prolifération cellulaire.
Ainsi, la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention est avantageusement utilisée à des fins thérapeutiques, de culture cellulaire et peut être envisagée à des fins de thérapie cellulaire.
La présente invention concerne également un procédé d’obtention d’une mousse de lysat plaquettaire par un procédé de séchage en atmosphère CO2supercritique et une mousse de lysat plaquettaire susceptible d’être obtenue par ce procédé.
Description Détaillée
La présente invention concerne une mousse de lysat plaquettaire caractérisée en ce qu’elle comprend du TGF-beta, de l’EGF, du PDGF-AB, de l’IGF-1, du VEGF et du bFGF, au sein d’une matrice de fibrine polymérisée.
Les mousses de lysat plaquettaires selon la présente invention sont directement obtenues à partir de lysats plaquettaires et conservent avantageusement les propriétés biologiques des lysats plaquettaires.
Lysat plaquettaire
On entend par « lysat plaquettaire », le produit de la lyse de plaquettes, c’est-à-dire le produit obtenu après désintégration de la membrane cellulaire qui conduit à la libération des molécules telles que les facteurs de croissance et les cytokines normalement contenues à l’intérieur des plaquettes.
Le lysat plaquettaire utilisé pour la fabrication de la mousse pourra être obtenu par achat de pools de lysats plaquettaires conçus à partir d’échantillons sanguins de plusieurs donneurs ou par conception directe à partir de prélèvements chez un patient. Le sang, recueilli dans des tubes citratés est centrifugé pour séparer les phases de globules rouges, de globules blancs et du plasma. L’isolation du plasma concentré en plaquettes permet ensuite de lui faire subir des cycles de congélation-décongélation ou de sonication pour détruire la membrane des plaquettes et aboutir au lysat plaquettaire. Une phase de déleucocytation est applicable pour éliminer tout résidu de leucocytes dans la solution.
Naturellement présents
Les facteurs de croissance présents dans la mousse de lysat plaquettaire sont les facteurs de croissance naturellement présents dans le lysat plaquettaire (Fekete et al. “Platelet lysate from whole blood-derived pooled platelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for the isolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells: production process, content and identification of active components. Cytotherapy. 2012 May;14(5):540-54. doi: 10.3109/14653249.2012.655420. Epub 2012 Feb 2).
Ainsi, on entend par « naturellement présents », le fait d’obtenir des mousses de lysats plaquettaires comprenant les facteurs de croissance présents dans les lysats plaquettaires.
« Naturellement présents » s’oppose à « additionnés ». En effet, les facteurs de croissance présents dans la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention sont présents dans la composition du précurseur c’est à dire dans le lysat plaquettaire utilisé pour l’obtention de la mousse de lysat plaquettaire.
En effet, le procédé selon l’invention permet avantageusement de conserver les éléments présents dans le lysat plaquettaire, précurseur de la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention.
On opposera le terme « naturellement présents» aux termes « additionnés », « ajoutés » ou tout autre synonyme, ou encore au terme « facteur bioactif ajouté », tel qu’utilisé dans l’état de la technique, par exemple dans la demande US20130183279. Un « facteur bioactif ajouté » ou « additionné » désigne, dans l’état de la technique un facteur bioactif (par exemple un facteur de croissance et/ou une cytokine et/ou des ions bioactifs) qui n’est pas présent dans la composition du précurseur, la formulation de fibrine et/ou la matrice de fibrine, mais qui est ajouté en laboratoire à la composition de précurseur et/ou à la formulation et/ou matrice de fibrine. Ces facteurs bioactifs sont donc « artificiellement » incorporés dans la formulation lors de la formation de la mousse.
Avantageusement, la présence de facteurs de croissance d’origine humaine en quantités naturelles dans le précurseur est compatible avec les mécanismes de cicatrisation et de régénération tissulaires chez l’Homme.
Il n’est ainsi pas nécessaire d’ajouter des facteurs de croissance, contrairement au biomatériau de l’état de la technique pour obtenir les propriétés biologiques des lysats plaquettaires.
Le lysat plaquettaire contient entre 110 et 150 pg/mL de β FGF (déviation standard relative : 8.09%), entre 550 et 600 pg/mL de VEGF (déviation standard relative : 5.03%), entre 25 et 29 ng/mL de PDGF-AB (déviation standard relative : 7.77%), entre 70 et 75 ng/mL de TGF-beta (déviation standard relative : 4.34%), environ 2 ng/mL de EGF (déviation standard relative : 6.02%), entre 60 et 80ng/mL d’IGF-1 (d’après la composition du lysat plaquettaire LP100 commercialisé par la société MACOPHARMA).
Par exemple, le lysat plaquettaire, précurseur de la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention comprend environ 2 ng/mL de EGF, 26,5 ng/mL de PDGF-AB, 72,5 ng/mL d’IGF-1, 575 pg/mL de VEGF, 125 pg/mL de β FGF, 70 ng/mL de TGF-beta.
Les concentrations en facteurs de croissance des mousses de lysat plaquettaire selon la présente invention sont proportionnelles à la quantité de lysat introduite pour créer la mousse. Avantageusement, les concentrations des facteurs de croissance dans la mousse finale ne sont pas affectées par le procédé d’élaboration.
Typiquement, la concentration en TGF-beta dans la mousse selon la présente invention est comprise entre 1,84.10-3% massique et 1,84.10- 5%massique, et est préférentiellement d’environ 7.10-7g dans 3,8.10-2g de mousse soit 1,84.10-4% massique.
Typiquement, la concentration en EGF dans la mousse selon la présente invention est comprise entre 3,63 10-5et 3,63 10-7% massique et est préférentiellement d’environ 1,38 10-9g dans 3,8 10-2g de mousse soit 3,63 10-6% massique.
Typiquement, la concentration en PDGF-AB dans la mousse selon la présente invention est comprise entre 4,79 10- 4% massique et 4,79 10-6% massique et est préférentiellement d’environ 1,82 10-8g dans 3,8 10-2g de mousse soit 4,79 10-5% massique.
Typiquement, la concentration en IGF-1dans la mousse selon la présente invention est comprise entre 1,31 10-3% massique et 1,31 10-5% massique et est préférentiellement d’environ 4,99 10-8g dans 3,8 10-2g de mousse soit 1,31 10-4% massique.
Typiquement, la concentration en VEGF dans la mousse selon la présente invention est comprise entre 1,04 10-5% massique et 1,04 10-7% massique et est préférentiellement d’environ 3,95 10-10g dans 3,8 10-2g de mousse soit 1,04 10-6% massique.
Typiquement, la concentration en bFGF dans la mousse selon la présente invention est comprise entre 2,26 10-6% massique et 2,26 10-8% massique et est préférentiellement d’environ 8,6 10-11g dans 3,8 10-2g de mousse soit 2,26 10-7% massique.
Selon un mode de réalisation, la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention comprend en outre de l’acide tranexamique et/ou du calcium.
Selon un mode de réalisation, la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention comprend en outre de l’acide tranexamique et/ou du calcium, et/ou du chlorure, et/ou du sodium.
Avantageusement, la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention conserve les éléments introduits pour former l’hydrogel de lysat et notamment les éléments préférentiellement introduits que sont le sodium, le chlorure, l’acide tranexamique et le calcium. Ainsi, à l’exception des solvants, tous les éléments introduits dans la formule de l’hydrogel qui après séchage formeront la mousse sont conservés dans le matériau sec final. Ces éléments sont ensuite susceptibles d’être libérés dans le milieu environnant et capables d’apporter une activité supplémentaire. L’acide tranexamique étant un anti-fibrinolytique il pourra entre autre permettre de stabiliser le caillot sanguin autour du matériau greffé. Le calcium possède un rôle non négligeable dans les phénomènes de coagulation (en participant notamment à l’activation des facteurs X et II) jusqu’à l’étape de transformation du fibrinogène en monomères de fibrine prêts à polymériser.
Le diamètre des pores majoritairement présents de la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention est compris entre 0,1 et 100µm.
Cette taille de pore est discriminante de la méthode d’obtention de la mousse de lysat plaquettaire. Le procédé de séchage en atmosphère CO2supercritique permet d’obtenir une mousse ayant un diamètre des pores majoritairement présents compris entre 0,1 et 100 µm.
Par exemple, le diamètre des pores majoritairement présents est compris entre 3,2 et 4µm et est d’environ 3,5µm.
Le diamètre des pores majoritaires présents peut être mesuré par toute technique connue de l’homme du métier. Typiquement, on citera la porosimétrie mercure ou porométrie au mercure qui est un instrument d’investigation des milieux poreux, connu de l’homme du métier.
Cette méthode consiste à utiliser la pression pour faire pénétrer le mercure (liquide non mouillant) à l’intérieur du réseau poreux du matériau et d’en mesurer le taux d’intrusion en relation avec la pression appliquée. Cette méthode permet de déterminer le pourcentage de porosité mesuré entre 3nm et 360µm ainsi que la dimension des pores qui constituent le réseau (brochure « AutoPore™ IV Series, Automated Mercury Porosimeters, de la société Micromeritics® »).
On entend par diamètre des pores majoritairement présents, le diamètre des pores pour lesquels le porosimètre à mercure enregistre les taux d’intrusion de mercure les plus importants. Le diamètre des pores majoritairement présents est donc mesuré à partir du volume de mercure introduit.
L’homme du métier pourra, par exemple, utiliser l’appareil AutoPore IV, de la société Mircomeritics® (voir par exemple le manuel d’utilisation Autopore IV Operator’s manual, Micromeritics 2004) pour mesurer le diamètre des pores majoritairement présents.
Avantageusement, ce diamètre de pores majoritairement présents permet une colonisation du matériau par les cellules ainsi qu’une diffusion des fluides, des ions et des molécules environnantes jusqu’au cœur du biomatériau.
Selon un mode de réalisation, la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention possède une porosité moyenne comprise entre 70% et 95%, préférentiellement entre 75% et 90%, de manière encore plus préférée entre 75% et 82%, préférentiellement encore entre 79% et 89%, et de manière encore plus préférée, entre 77 et 89%,.
Préférentiellement, la mousse possède une porosité moyenne d’environ 80%.
On entend par porosité moyenne, ou taux de porosité, le volume du réseau poreux moyen du matériau correspondant au volume non-occupé par la matière qui constitue le matériau. Elle indique les espaces dans lesquels les fluides, les molécules et plus tardivement les cellules pourront s’insinuer entre les fibres du réseau. Un taux de porosité, également une porosité de dimension trop faible limitera les phénomènes de diffusion et la colonisation par les cellules de la mousse et/du gel correspondant à la mousse hydratée.
La porosité de la mousse peut être mesurée par toute technique connue de l’homme du métier. On citera également à titre illustratif, la porosimétrie au mercure.
L’homme du métier pourra, par exemple, utiliser l’appareil AutoPore IV, de la société Mircoeritics® (voir par exemple le manuel d’utilisation Autopore IV Operator’s manual, Micromeritics 2004) pour mesurer la porosité moyenne de la mousse.
La mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention conserve avantageusement l’agencement tridimensionnel de son réseau de fibrine et permet de libérer des facteurs de croissance dans le milieu au cours du temps. Les facteurs de croissance sont en effet enchâssés dans le réseau de fibrine (i.e ; au sein de la matrice de fibrine). Ce réseau va permettre de libérer de manière prolongée les facteurs de croissance.
Avantageusement encore, la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention est une mousse solide du fait de la polymérisation.
Ces mousses solides de lysat plaquettaire présentent une nette augmentation de leur résistance à la compression par rapport aux hydrogels de lysat plaquettaire, mais également par rapport à certaines mousses de lysat plaquettaire de l’état de la technique qui ne sont pas à l’état solide.
Les mousses de lysat plaquettaire selon l’invention ont donc des propriétés mécaniques supérieures et peuvent facilement se manipuler à la pince ou à la main sans se déliter.
Procédé d’obtention de la mousse de lysat plaquettaire
La présente invention concerne également un procédé d’obtention d’une mousse de lysat plaquettaire comprenant les étapes:
- d’obtention d’un hydrogel par polymérisation d’un lysat plaquettaire ;
- substitution par lavage du solvant aqueux par un solvant polaire ;
- puis séchage par un procédé de séchage en atmosphère CO2supercritique.
Obtention d’un hydrogel par polymérisation d’un lysat plaquettaire
L’hydrogel de lysat plaquettaire est obtenu par polymérisation d’un lysat plaquettaire ou par polymérisation de fibrinogène, le lysat plaquettaire ou le fibrinogène étant combiné avec au moins un élément choisi parmi un initiateur de la polymérisation, un facteur favorisant la polymérisation, un stabilisateur de la coagulation, un agent permettant le maintien de l’isotonie et le gonflement du gel, un agent favorisant la dégradation du réseau, un agent favorisant les liaisons dans le réseau.
On citera parmi les initiateurs de la polymérisation, le chlorure de calcium (CaCl2), la thrombine, la genepine.
Avantageusement, le chlorure de calcium aura également un pouvoir gélifiant.
On citera parmi les facteurs favorisant la polymérisation le facteur XIII, le 1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide;
Avantageusement, le 1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide favorise également la création de liaisons à l’intérieur du réseau.
On citera parmi les stabilisateurs de la coagulation, l’acide tranexamique, qui est un stabilisateur de la coagulation par action anti-fibrinolytique, l’acide amino-caproique, qui est un stabilisateur par action anti-dégradation du réseau de fibres, la fibronectine, qui est un stabilisateur de la coagulation par adhésion des cellules à la matrice extracellulaire.
On citera parmi les agents permettant le maintien de l’isotonie et le gonflement du gel le chlorure de sodium (NaCl).
On citera parmi les agents favorisant la dégradation du réseau le plasminogène. Cette dégradation du réseau s’effectue une fois le biomatériau implanté.
On citera parmi les agents favorisant les liaisons dans le réseau le N-hydroxysuccinimide.
D’autres facteurs tels que les facteurs permettant de donner de l’élasticité au réseau de fibres, des facteurs ayant des propriétés stimulatrices des cellules de l’hôte et/ou antibactériennes et/ou anti-inflammatoires, des facteurs permettant de stimuler les cellules de l’hôte, des facteurs permettant d’entraîner une précipitation de cristaux et de créer des structures proches de celle des tissus naturels minéralisés, des facteurs de croissances ou cytokines supplémentaires, des facteurs de la coagulation, des facteurs stabilisateurs du caillot pourront être combinés avec le lysat plaquettaire pour l’obtention d’une mousse de lysat plaquettaire.
Parmi les facteurs permettant de donner de l’élasticité au réseau de fibres et d’accentuer encore son biomimétisme, on citera le collagène ;
Parmi les facteurs permettant de donner de l’élasticité au réseau de fibres on citera l’acide hyaluronique ;
Ces facteurs permettront de rendre le biomatériau final plus élastique.
Parmi les facteurs ayant des propriétés stimulatrices des cellules de l’hôte et/ou antibactériennes et/ou anti-inflammatoires), on citera les ions bioactifs.
Les ions bioactifs correspondent à des cations connus pour leur activité biologique tels que Sr2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Ag+.
Parmi les facteurs permettant de stimuler les cellules de l’hôte on citera la BMP-2 recombinante.
Les facteurs tels que la BMP-2 recombinante, permettront de conférer au biomatériau une fonction de stimulation de la régénération osseuse.
Parmi les facteurs permettant d’entraîner une précipitation de cristaux et de créer des structures proches de celle des tissus naturels minéralisés, on citera le phosphate de calcium.
Typiquement, ces facteurs permettent de précipiter des cristaux de phosphate de calcium analogues aux cristaux qui constituent la phase minérale de l’os naturel.
Les facteurs de croissances ou cytokines supplémentaires sont choisis parmi des membres de la superfamille du TGFβ (transforming growth factor β), les isoformes du facteur de croissance d’origine plaquettaire (le platelet-derived growth factor ou PDGF), les facteurs de croissance de la famille de l’EGF (epithelial growth factor), le VEGF (vascular endothelial growth factor).
Parmi les membres de la superfamille du TGFβ, on citera les membres de la sous famille des activines tels que l’inhibine A et l’inhibine B, les membres de la sous-famille du gène de la Drosophile Decapentaplegic (dpp) qui comprend les gènes codant pour les facteurs de la morphogenèse osseuse, le facteur BMP4, les facteurs ostéogénétiques BMP3, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 de la sous-famille 60A. Tous ces facteurs ont une activité inductrice, sur la formation du cartilage et de l’os.
Parmi les membres de la famille de l’EGF, on citera l’amphiréguline (AR), le TGF-α (transforming growth factor α), l’épigène (EPG), la betacelluline (BTC), l’HB-RGF (heparin-binding EGF), l’épiréguline (EPR), les neurégulines (NRG).
Parmi les isoformes du PDGF, on citera le PDGF-AA et le PDGF-BB.
Parmi les membres de la famille des peptides VEGF, on citera le PIGF, le VEGF-C et le VEGF-B.
Parmi les facteurs de la coagulation, on citera la thrombine
Parmi les facteurs stabilisateurs du caillot, on citera l’alpha-1 antitrypsine (inhibiteur de la sérine protéase), l’aprotinine (anti-fibrinolytique) ou encore l’acide amino-caproïque (inhibiteur de la plasmine).
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de lysat plaquettaire est obtenu par polymérisation d’un lysat plaquettaire, le lysat plaquettaire étant combiné avec au moins un élément choisi parmi le chlorure de calcium (CaCl2), le chlorure de sodium (NaCl), la thrombine, l’acide amino-caproïque, le facteur XIII, la fibronectine, le plasminogène, le 1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, le N-hydroxysuccinimide, la genepine, l’acide tranexamique (ou acide 4-(méthylamino)cyclohexanecarboxylique).
Dans un mode de réalisation, l’hydrogel de lysat plaquettaire est obtenu à partir de fibrinogène combiné avec au moins l’un des éléments choisi parmi le chlorure de calcium (CaCl2), le chlorure de sodium (NaCl), la thrombine, l’acide amino-caproïque, le facteur XIII, la fibronectine, le plasminogène, le 1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, le N-hydroxysuccinimide, la genepine, l’acide tranexamique,
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel est obtenu par polymérisation d’un lysat plaquettaire, ledit lysat plaquettaire étant combiné avec du chlorure de calcium, du chlorure de sodium, et de l’acide tranexamique.
Selon un mode de réalisation, le lysat plaquettaire représente entre 60 et 80% en volume, le chlorure de calcium représente entre 2 et 3% en volume, le chlorure de sodium représente entre 20 et 30% en volume et l’acide tranexamique représente entre 0,1 et 0,5% en volume.
Avantageusement, l’hydrogel ainsi obtenu permet d’obtenir un réseau tridimensionnel de fibrine qui possède un maillage serré dans lequel il a été montré que des cellules stromales mésenchymateuses humaines pouvaient proliférer et se différencier.
Selon un mode de réalisation, le temps de polymérisation de l’hydrogel est compris entre 10 minutes et 12 heures, préférentiellement 15 minutes et 1 heure, et de manière encore préféré, le temps de polymérisation est d’environ 30 minutes, la polymérisation étant réalisée à température ambiante .
Avantageusement, ce temps de polymérisation permet d’obtenir un hydrogel de qualité et la formation du réseau fibreux.
Les hydrogels de lysat plaquettaires ainsi obtenus sont utilisés pour obtenir des mousses de lysat plaquettaire capables de fournir les mêmes propriétés biologiques que les lysats plaquettaires tout en démontrant des qualités supérieures en vue d’une commercialisation.
Substitution par lavage du solvant aqueux par un solvant polaire
Selon un mode de réalisation, le solvant polaire est un solvant polaire miscible au CO2 ,choisi parmi l’éthanol, l’acétone, le benzène, le butane, le dioxane, l’éthane, l’ethylacétoacétate, l’isopropanol.
Préférentiellement, le solvant polaire est l’acétone ou l’éthanol.
Typiquement, l’hydrogel va être trempé dans un bain de solvant polaire afin de retirer l’eau contenue dans l’hydrogel de lysat plaquettaire.
A titre illustratif, l’hydrogel est trempé dans le bain de solvant polaire pendant une durée comprise entre 24h et 96h, préférentiellement 36h et 72h. Selon un mode de réalisation, l’hydrogel est trempé dans le bain de solvant organique pendant une durée d’environ 48 heures.
Après l’étape de trempage, l’hydrogel est séparé de son support avant d’être placé dans le réacteur fermé du sécheur pour le séchage par CO2 supercritique.
Procédé de s échage en atmosphère CO 2 supercritique
Selon un mode de réalisation, l’étape de séchage par CO2supercritique comprend une étape de rinçage préalable, cette étape comprenant avantageusement entre 1 et 5 rinçages en CO2liquide ou avec le CO2à l’état supercritique.
L’étape de rinçage en CO2permet l’élimination du solvant polaire piégé dans l’hydrogel et sa substitution par du CO2liquide, ou à l’état supercritique. Les rinçages en CO2permettent de supprimer tous résidus de solvant et empêchent la rétractation du réseau fibreux tridimensionnel obtenu. L’architecture de l’hydrogel est ainsi maintenue.
Typiquement, l’étape de rinçage en CO2à l’état supercritique est réalisée par circulation dans le réacteur de CO2à l’état supercritique.
Typiquement, 3 étapes de rinçages en CO2liquide ou à l’état supercritique pourront être réalisées.
A titre illustratif, les étapes de rinçage en CO2liquide sont réalisées à une température de 5°Celsius et une pression de 40 à 50 bars, la durée de chaque rinçage étant d’environ 1 heure.
Selon un mode de réalisation, l’atmosphère supercritique est atteinte par une montée en température au-delà de 39°C et en pression au-delà de 90bars, puis maintenue entre 10min et 12h, préférentiellement entre 30 min et 10h, de manière préférée entre 1h et 8h, préférentiellement entre 2h et 6h, préférentiellement encore entre 3h et 5h, préférentiellement pendant 4heures.
Le maintien de l’atmosphère supercritique pendant une durée d’environ 4 heures permet la pénétration du CO2au cœur du réseau.
Avantageusement, le maintien de l’atmosphère supercritique permet le maintien de la structure en trois dimensions et le séchage jusqu’au cœur du réseau.
Typiquement, le maintien de l’atmosphère supercritique est réalisé à une température d’environ 40° Celsius et une pression de 90 bars environ.
Selon un mode de réalisation le gradient de dépression est compris entre 1bar/s et 20bars/min, et est préférentiellement de 1bar/s.
Avantageusement, le dégazage rapide de 1 bar/s permet d’obtenir la structure poreuse de la mousse de lysat plaquettaire. Ainsi, la mousse va être figée. Un dégazage trop rapide, i.e., supérieur à 1bar/s entraine l’éclatement de la mousse. Un dégazage trop lent, supérieur à 20bars/min entraine une perte de volume de la mousse qui va se rétracter et se tasser.
L’étape de séchage au CO2supercritique permet avantageusement un maintien de la structure tridimensionnelle de l’hydrogel au cours de l’opération de séchage et permet d’obtenir une mousse de lysat plaquettaire possédant des propriétés mécaniques supérieures à celles de l’hydrogel initial. Le matériau, grâce à ce procédé est avantageusement stérile sans recours à une salle blanche, contrairement au procédé de lyophilisation utilisé dans l’état de la technique.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne également une mouse de lysat plaquettaire susceptible d’être obtenue par le procédé de l’invention.
La mousse de lysat plaquettaire obtenue conserve avantageusement son agencement fibreux tridimensionnel et également ses facteurs de croissance permettant d’obtenir des propriétés biologiques identiques à celles des lysats plaquettaires et ses éléments majeurs tels que l’acide tranexamique, le sodium, le chlore, et le calcium.
Utilisation à des fins thérapeutiques et de culture cellulaire
La présence naturelle de facteurs de croissance tels que le TGF-β, l’EGF, le PDGF-AB, l’IGF-1, le VEGF et le bFGF et leur libération prolongée du fait de l’agencement tridimensionnel fibreux de la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention et son délitement progressif constitue un argument important pour l’utilisation thérapeutique et à des fins de culture et thérapie cellulaire, des mousses de lysat plaquettaire selon l’invention.
En effet, les mousses de lysat plaquettaire selon l’invention sont un support qui permet une libération ciblée et prolongée des facteurs de croissancein situet ainsi favorise la réparation ou la régénération de tissus endommagés.
De plus, les facteurs de croissance étant nécessaires à la croissance, la prolifération et la différenciation cellulaire, ils présentent un intérêt thérapeutique important et permettent l’utilisation du matériau à des fins de thérapie cellulaire.
Le VEGF (Vascular Endothelium Growth Factor) est une protéine qui est principalement responsable de l'initiation de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Il stimule également la perméabilité des micro-vaisseaux et semble être impliqué dans la migration des monocytes / macrophages (Ehrbar M, et al., Endothelial cell proliferation and progenitor maturation by fibrin-bound VEGF variants with differential susceptibilities to local cellular activity.J Control Release Off J Control Release Soc2005;101(1–3):93–109). Il est ainsi impliqué dans la néoangionenèse, la prolifération et la migration des cellules endothéliales
Le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes), en interaction avec le récepteur de la tyrosine kinase, est également impliqué dans la croissance et la multiplication cellulaire durant l'angiogenèse, la formation cutanée ou même le développement rénal (Andrae J, et al. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine.Genes Dev2008;22(10):1276–1312).
L’EGF (Epidermal Growth Factor) favorise la prolifération cellulaire, la migration et la différenciation au cours de la formation du système épithélial, cardiovasculaire et nerveux (Zeng F, Harris RC. Epidermal growth factor, from gene organization to bedside.Semin Cell Dev Biol2014;28:2–11).
Le TGF-β (Transforming Growth Factor) est classé comme une cytokine et est principalement impliqué dans la croissance des tissus lors de la liaison à son récepteur lié à la voie Smad (hi Y, Massagué J. Mechanisms of TGF-β Signaling from Cell Membrane to the Nucleus.Cell2003;113(6):685–700).
L’IGF1 (insulin-like growth factor) permet notamment la croissance par la stimulation de la formation du cartilage (Wang J, Zhou J, Bondy CA. Igf1 promotes longitudinal bone growth by insulin-like actions augmenting chondrocyte hypertrophy. FASEB J 1999; 13:1985-90; PMID:10544181).
Le bFGF (basic fibroblast growth factor ou FGF2) est impliqué dans de très nombreux processus de prolifération cellulaire, cicatrisation, régénération et même dès l’embryogenèse (Dvorak et al. Expression and Potential Role of Fibroblast Growth Factor 2 and Its Receptors in Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells 2005;23:1200–1211)
Utilisation pour la culture cellulaire
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation de mousse de lysat plaquettaire selon l’invention pour la culture cellulaire.
En effet, le lysat plaquettaire a été proposé comme une alternative à l’utilisation du sérum de veau fœtal (SVF), le plus utilisé des adjuvants pour milieux de culture cellulaire (Shanbhag S et al., Efficacy of Humanized Mesenchymal Stem Cell Cultures for Bone Tissue Engineering: A Systematic Review with a Focus on Platelet Derivatives.Tissue Eng Part B Rev2017;23(6):552–569.), en raison de la présence potentielle d’agents pathogènes xénogènes (le risque de contamination par les prions ou les virus n'est pas nul) dans le SVF. En effet, les lysats plaquettaires humains regroupés (hLP) ne présentent pas de risque de rejet immunitaire ou de transmission de pathogènes xénogènes. La culture de cellules souches en milieux enrichis de lysat plaquettaire permet d’une part de valider l’utilisation thérapeutique chez l’Homme de ces cellules et d’autre part il a été montré que d’une manière générale les cellules stromales mésenchymateuses présentaient de meilleurs taux de prolifération et une plus importante activité métabolique en présence de lysat plaquettaire (Ma J, et al. Osteogenic capacity of human BM-MSCs, AT-MSCs and their co-cultures using HUVECs in FBS and PL supplemented media.J Tissue Eng Regen Med2015;9(7):779–788).
Utilisation à des fins de thérapie cellulaire
La réalisation d’une mousse qui possède les mêmes propriétés biologiques que les lysats plaquettaires et qui est constituée d’un réseau tridimensionnel poreux qui favorise l’envahissement, la prolifération et la différenciation cellulaire constitue un intérêt important pour son utilisation dans le domaine de la thérapie cellulaire.
Utilisation à des fins thérapeutiques
Utilisation pour favoriser la cicatrisation cutanée et la régénération du derme
Pour traiter les ulcères cutanés chroniques et favoriser la cicatrisation cutanée, des particules d’alginate de calcium (Mori M, et al. Calcium alginate particles for the combined delivery of platelet lysate and vancomycin hydrochloride in chronic skin ulcers.Int J Pharm2014;461(1–2):505–513), des gels de collagène (Lima AC, Mano JF, Concheiro A, Alvarez-Lorenzo C. Fast and mild strategy, using superhydrophobic surfaces, to produce collagen/platelet lysate gel beads for skin regeneration.Stem Cell Rev2015;11(1):161–179.), des pansements spongieux à base de glutamate de chitosan et d’hyaluronate de sodium (Rossi S, Faccendini A, Bonferoni MC, Ferrari F, Sandri G, Del Fante C, et al. “Sponge-like” dressings based on biopolymers for the delivery of platelet lysate to skin chronic wounds.Int J Pharm2013;440(2):207–215), des microparticules poreuses de silice (Fontana F, Mori M, Riva F, Mäkilä E, Liu D, Salonen J, et al. Platelet Lysate-Modified Porous Silicon Microparticles for Enhanced Cell Proliferation in Wound Healing Applications.ACS Appl Mater Interfaces2016;8(1):988–996) et des micelles ioniques de chitosan et d’acide oléique chargées en sulfadiazine argentique (Dellera E, Bonferoni MC, Sandri G, Rossi S, Ferrari F, Del Fante C, et al. Development of chitosan oleate ionic micelles loaded with silver sulfadiazine to be associated with platelet lysate for application in wound healing.Eur J Pharm Biopharm Off J Arbeitsgemeinschaft Pharm Verfahrenstechnik EV2014;88(3):643–650) ont été proposés. Ces matériaux ont été conçus afin de permettre l’absorption de lysat plaquettaire et la libération progressive de facteurs de croissance à la surface de la peau et ainsi que la prolifération des fibroblastes dans le réseau créé par le lysat plaquettaire.
Pour la réparation du derme cutané, des solutions de lysat plaquettaire ont été testées en application directe sur des plaies de rat, concluant que de tels traitements étaient favorables à la cicatrisation, avec un effet qui croit en rapport avec la concentration des solutions en lysat plaquettaire (Sergeeva NS, Shanskii YD, Sviridova IK, Karalkin PA, Kirsanova VA, Akhmedova SA, et al. Analysis of Reparative Activity of Platelet Lysate: Effect on Cell Monolayer Recovery In Vitro and Skin Wound Healing In Vivo.Bull Exp Biol Med2016;162(1):138–145).
D’autres matériaux préalablement imprégnés de lysat plaquettaire ont été proposés afin d’augmenter le temps de persistance du lysat plaquettaire au niveau de la plaie et augmenter ainsi l’efficacité du traitement. Ainsi, une matrice collagène/gélatine a été testée chez la souris (Ito R, Morimoto N, Pham LH, Taira T, Kawai K, Suzuki S. Efficacy of the controlled release of concentrated platelet lysate from a collagen/gelatin scaffold for dermis-like tissue regeneration.Tissue Eng Part A2013;19(11–12):1398–1405) et des particules de pectine/chitosan (Tenci M, Rossi S, Bonferoni MC, Sandri G, Boselli C, Di Lorenzo A, et al. Particulate systems based on pectin/chitosan association for the delivery of manuka honey components and platelet lysate in chronic skin ulcers.Int J Pharm2016;509(1–2):59–70) ont été appliquées sur des plaies de rats.
Dans le domaine de la chirurgie plastique, les implants en polyéthylène poreux synthétiques (PP) sont largement utilisés pour la reconstruction en trois dimensions des tissus perdus ou fortement déformés. Le lysat plaquettaire est alors utilisé associé aux implants PP tridimensionnels en vue de réduire les complications post-opératoires (Ozturk S, Sahin C, Tas AC, Muftuoglu T, Karagoz H. Effect of Allogeneic Platelet Lysate and Cyanoacrylate Tissue Glue on the Fibrovascularization of the Porous Polyethylene Implant.J Craniofac Surg2016;27(1):253–257).
La présente invention concerne donc une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation dans une méthode pour favoriser la cicatrisation cutanée et la régénération du derme.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour favoriser la cicatrisation cutanée et la régénération du derme.
La présente invention concerne également une méthode de traitement pour favoriser la cicatrisation cutanée et la régénération du derme comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné à favoriser la cicatrisation cutanée et la régénération du derme.
Le terme « favoriser » n’est pas un terme absolu, et, lorsqu’il est appliqué à la cicatrisation cutanée et la régénération du derme, il désigne une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité faible de succès, mais devant induire un effet bénéfique global tel que la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes ou la stabilisation.
Typiquement, « favoriser la cicatrisation cutanée et la régénération du derme » s’entend de l’amélioration de l’hémostase plaquettaire, de la formation du caillot, de la stabilisation du caillot et du recrutement cellules inflammatoires sous l’influence de la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention, mais également de l’amélioration du remodelage de la matrice extracellulaire et du bon déroulé des mécanismes de cicatrisation.
Selon un mode de réalisation, la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention est utilisée pour son utilisation dans le traitement de l’ulcère cutané chronique.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour le traitement de l’ulcère cutané chronique.
La présente invention concerne également une méthode de traitement de l’ulcère cutané chronique comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement de l’ulcère cutané chronique.
Utilisation pour favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse
Des évaluations de la formation osseuse dans des sites sous-cutanés ectopiques ou directement sur des modèles osseux ont été menées depuis environ dix ans. La capacité du lysat plaquettaire à favoriser la différenciation des CSM en cellules de la lignée ostéoblastique est évidente et leur permet de générer une formation osseuse même sur des sites non osseux (Chevallier N, Anagnostou F, Zilber S, Bodivit G, Maurin S, Barrault A, et al. Osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells with platelet lysate. Biomaterials 2010;31(2):270–278). L'association de lysat plaquettaire avec des cellules stromales mésenchymateuses est prometteuse et nécessite de trouver une matrice approprié. Des matrices constituées de collagène et de fibrine ont ainsi été testées avec succès sur un modèle de prothèse de hanche chez le mouton (Dozza B, Di Bella C, Lucarelli E, Giavaresi G, Fini M, Tazzari PL, et al. Mesenchymal stem cells and platelet lysate in fibrin or collagen scaffold promote non-cemented hip prosthesis integration.J Orthop Res Off Publ Orthop Res Soc2011;29(6):961–968). Chakar et al. ont étudié le potentiel ostéogénique du lysat plaquettaire seul, respectivement avec des fémurs et des calvaria chez le lapin, et ont montré que le lysat plaquettaire autologue permettait d'obtenir une régénération osseuse (Chakar C, Naaman N, Soffer E, Cohen N, El Osta N, Petite H, et al. Bone formation with deproteinized bovine bone mineral or biphasic calcium phosphate in the presence of autologous platelet lysate: comparative investigation in rabbit.Int J Biomater2014;2014:367265; Chakar C, Soffer E, Cohen N, Petite H, Naaman N, Anagnostou F. Vertical bone regeneration with deproteinised bovine bone mineral or biphasic calcium phosphate in the rabbit calvarium: effect of autologous platelet lysate.J Mater Sci Mater Med2015;26(1):5339).
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation dans une méthode pour favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse.
La présente invention concerne également une méthode pour favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné à favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse.
Le terme « favoriser » n’est pas un terme absolu, et, lorsqu’il est appliqué à l’ostéogenèse et la régénération osseuse, il désigne une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité faible de succès, mais devant induire un effet bénéfique global tel que la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes ou la stabilisation.
Typiquement, « favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse » s’entend de la capacité de la mousse de lysat plaquettaire à améliorer la différenciation des CSM en cellules de la lignée ostéoblastique, par la libération constante et progressive de facteurs de croissance et de cytokines et ainsi générer une formation osseuse, pour augmenter la quantité d’os et favoriser sa minéralisation.
Dans le traitement de l’arthrose, des injections intra-articulaires de lysats plaquettaires autologues ont été réalisées chez des chevaux arthrosiques améliorant ainsi significativement les performances physiques des animaux (Tyrnenopoulou P, Diakakis N, Karayannopoulou M, Savvas I, Koliakos G. Evaluation of intra-articular injection of autologous platelet lysate (PL) in horses with osteoarthritis of the distal interphalangeal joint.Vet Q2016;36(2):56–62). Les auteurs ont conclu que le lysat plaquettaire autologue injecté par voie intra-articulaire est une méthode efficace pour gérer temporairement l'arthrose de l'articulation interphalangienne distale chez les chevaux de sport.
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation pour le traitement de l’arthrose.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour le traitement de l’arthrose.
La présente invention concerne également une méthode de traitement de l’arthrose comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement de l’arthrose.
Utilisation pour la régénération cartilagineuse
Dans le cadre de la régénération cartilagineuse, la libération in situ de lysat plaquettaire est utilisée pour favoriser la différenciation des cellules stromales mésenchymateuses vers un phénotype chondroblastique et favoriser ainsi la réparation/régénération du cartilage déficient ou endommagé. Un hydrogel de chitosan et de chondroïtine sulfate capable d’absorber du lysat plaquettaire a ainsi été proposé (Santo VE, Popa EG, Mano JF, Gomes ME, Reis RL. Natural assembly of platelet lysate-loaded nanocarriers into enriched 3D hydrogels for cartilage regeneration.Acta Biomater2015;19:56–65).
Basé sur le même principe, dans la réparation des tendons, les biomatériaux proposés sont destinés à servir de réservoir de biomolécules imprégnées au moment de l’utilisation et capables de soutenir/favoriser l’activité des cellules présentent in situ ou celle de cellules dérivées de tendons humains (hTDC) associées au moment de l’implantation.
Les matériaux sont alors des patches de lysats de plaquettes réticulés par la génipine (Costa-Almeida R, Franco AR, Pesqueira T, Oliveira MB, Babo PS, Leonor IB, et al. The effects of platelet lysate patches on the activity of tendon-derived cells.Acta Biomater2018. doi:10.1016/j.actbio.2018.01.006), des hydrogels d’alginate de sodium et de sulfate de chondroïtine (Sandri G, Bonferoni MC, Rossi S, Ferrari F, Mori M, Cervio M, et al. Platelet lysate embedded scaffolds for skin regeneration.Expert Opin Drug Deliv2015;12(4):525–545) ou des hydrogels photoréticulables composés de sulfate de chondroïtine méthacrylé (MA-CS) enrichis en nanoparticules magnétiques à base de fer (Silva ED, Babo PS, Costa-Almeida R, Domingues RMA, Mendes BB, Paz E, et al. Multifunctional magnetic-responsive hydrogels to engineer tendon-to-bone interface.Nanomedicine Nanotechnol Biol Med2017. doi:10.1016/j.nano.2017.06.002).
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation dans une méthode pour favoriser la régénération cartilagineuse.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour favoriser la régénération cartilagineuse.
La présente invention concerne également une méthode de traitement pour favoriser la régénération cartilagineuse comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné à la régénération cartilagineuse.
Le terme « favoriser » n’est pas un terme absolu, et, lorsqu’il est appliqué à la régénération cartilagineuse, il désigne une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité faible de succès, mais devant induire un effet bénéfique global tel que la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes ou la stabilisation.
Typiquement, « favoriser la régénération cartilagineuse» s’entend de la capacité de la mousse de lysat plaquettaire à favoriser la différenciation des cellules stromales mésenchymateuses vers un phénotype chondroblastique et favoriser ainsi la réparation/régénération du cartilage déficient ou endommagé.
Utilisation pour le traitement des lésions cornéennes telles que les lésions chroniques de la cornée
Dans le traitement des plaies chroniques de la cornée, les dispositifs doivent permettre d’augmenter le temps de persistance précornéale des facteurs de croissance contenus dans le lysat plaquettaire réduit en raison d’un drainage important par le flux lacrymal déclenché par le larmoiement.
Des collyres thermosensibles et mucoadhésifs obtenus à base de chondroïtine sulfate de sodium (CS) et d'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC) (Sandri G, Bonferoni MC, Rossi S, Ferrari F, Mori M, Del Fante C, et al. Thermosensitive eyedrops containing platelet lysate for the treatment of corneal ulcers.Int J Pharm2012;426(1–2):1–6), des gels de chitosan ou des supports en acide polyacrylique (Sandri G, Bonferoni MC, Rossi S, Ferrari F, Mori M, Del Fante C, et al. Platelet lysate formulations based on mucoadhesive polymers for the treatment of corneal lesions.J Pharm Pharmacol2011;63(2):189–198) ou le traitement de divers types de lentilles de contact par du sulfate de chondroïtine destiné à favoriser le maintien du lysat plaquettaire instillé dans l’œil et d’améliorer ainsi le traitement des lésions cornéennes (Sandri G, Bonferoni MC, Rossi S, Delfino A, Riva F, Icaro Cornaglia A, et al. Platelet lysate and chondroitin sulfate loaded contact lenses to heal corneal lesions.Int J Pharm2016;509(1–2):188–196).
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation pour le traitement des lésions cornéennes, telles que les lésions chroniques de la cornée.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour le traitement des lésions cornéennes, telles que les lésions chroniques de la cornée.
La présente invention concerne également une méthode de traitement des lésions cornéennes, telles que les lésions chroniques de la cornée, comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement des lésions cornéennes, telles que les lésions chroniques de la cornée.
Le terme « traitement » n’est pas un terme absolu, et, lorsqu’il est appliqué au traitement des lésions cornéennes, il désigne une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité faible de succès, mais devant induire un effet bénéfique global tel que le retard d’apparition de la pathologie ou la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes ou la stabilisation.
Typiquement, le traitement d’une lésion cornéenne s’entend de la capacité de la mousse de lysat plaquettaire à maintenir le lysat plaquettaire instillé dans l’œil et augmenter le temps de persistance précornéale des facteurs de croissance contenus dans le lysat plaquettaire du fait de la libération prolongée.
Utilisation dans le traitement des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson
La maladie de Parkinson, avec sa morbidité élevée, a été étudiée récemment dans des modèles cellulaires traités par exposition aux lysats plaquettaires humains regroupés/poolés (hLP). Les résultats confirment que de telles thérapies pourraient être utilisées pour prévenir la perte neuronale in vivo car le lysat plaquettaire présente des propriétés protectrices contre les voies de mort cellulaire et certains inducteurs du stress oxydatif (Gouel F, Do Van B, Chou M-L, Jonneaux A, Moreau C, Bordet R, et al. The protective effect of human platelet lysate in models of neurodegenerative disease: involvement of the Akt and MEK pathways.J Tissue Eng Regen Med2017;11(11):3236–3240 ).
Également, un spray nasal contenant un lysat plaquettaire a été testé avec des résultats encourageants chez les souris atteintes de la maladie de Parkinson (Chou M-L, Wu J-W, Gouel F, Jonneaux A, Timmerman K, Renn T-Y, et al. Tailor-made purified human platelet lysate concentrated in neurotrophins for treatment of Parkinson’s disease.Biomaterials2017;142:77–89).
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation pour le traitement de troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour le traitement de troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson.
La présente invention concerne également une méthode de traitement de troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson, comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement de troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson.
Le terme « traitement » n’est pas un terme absolu, et, lorsqu’il est appliqué au traitement de troubles neurodégénératifs et plus particulièrement de la maladie de Parkinson, il désigne une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité faible de succès, mais devant induire un effet bénéfique global tel que le retard d’apparition de la pathologie ou la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes ou la stabilisation.
Typiquement, le traitement de la maladie de Parkinson s’entend de la capacité de la mousse de lysat plaquettaire à prévenir et/ou diminuer la perte neuronale in vivo pour réduire la progression de la Maladie de Parkinson et ses séquelles.
Utilisation dans le traitement des suites d’un AVC
La prise en charge des séquelles de maladies graves telles que les accidents vasculaires cérébraux peut également être envisagée en présence de lysats plaquettaires humains regroupés/poolés (hLP) ou pools de lysats plaquettaires. Les modèles d'AVC ischémiques sont courants chez les rats pour évaluer les déficits neurologiques ou les fonctions motrices après l'occlusion des vaisseaux sanguins. Qu'il soit utilisé pour cultiver des cellules stromales mésenchymateuses avant injection ou directement injecté dans des sites ischémiques, le lysat plaquettaire montre des résultats favorables sur les fonctions neuro-motrices post-attaque (Yamauchi T, Saito H, Ito M, Shichinohe H, Houkin K, Kuroda S. Platelet lysate and granulocyte-colony stimulating factor serve safe and accelerated expansion of human bone marrow stromal cells for stroke therapy.Transl Stroke Res2014;5(6):701–710).
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation pour favoriser les fonctions neuro-motrices suite à un accident vasculaire cérébral (AVC).
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour favoriser les fonctions neuro-motrices suite à un accident vasculaire cérébral (AVC).
La présente invention concerne également une méthode de traitement pour favoriser les fonctions neuro-motrices suite à un accident vasculaire cérébral (AVC), comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné à favoriser les fonctions neuro-motrices suite à un accident vasculaire cérébral (AVC).
Utilisation dans la régénération des tissus parodontaux
Les données récentes concernant la régénération des tissus parodontaux ont été obtenues par Babo et al. qui ont étudié l'intérêt de la stabilisation au contact de la racine dentaire des protéines contenues dans le lysat plaquettaire, et ont démontré que cela favorisait la régénération des tissus parodontaux du rat, en particulier l’os alvéolaire et le cément, les deux tissus minéralisés du parodonte (Babo PS, Cai X, Plachokova AS, Reis RL, Jansen J, Gomes ME, et al. Evaluation of a platelet lysate bilayered system for periodontal regeneration in a rat intrabony three-wall periodontal defect.J Tissue Eng Regen Med2017. doi:10.1002/term.2535 ; Babo PS, Cai X, Plachokova AS, Reis RL, Jansen JA, Gomes ME, et al. The Role of a Platelet Lysate-Based Compartmentalized System as a Carrier of Cells and Platelet-Origin Cytokines for Periodontal Tissue Regeneration.Tissue Eng Part A2016;22(19–20):1164–1175)
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation dans une méthode pour favoriser la régénération des tissus parodontaux.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour favoriser la régénération des tissus parodontaux.
La présente invention concerne également une méthode de traitement pour favoriser la régénération des tissus parodontaux, comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné à favoriser la régénération des tissus parodontaux.
Le terme « favoriser » n’est pas un terme absolu, et, lorsqu’il est appliqué à la régénération des tissus parodontaux, il désigne une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité faible de succès, mais devant induire un effet bénéfique global tel que la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes ou la stabilisation.
Typiquement, « régénération des tissus parodontaux» s’entend de la capacité de la mousse de lysat plaquettaire à stabiliser au contact de la racine dentaire des protéines contenues dans le lysat plaquettaire et ainsi augmenter la quantité et la densité des tissus parodontaux et plus particulièrement de redonner au parodonte une structure originelle basée sur la présence de cément à la surface de la dent, d’os alvéolaire et de ligament desmodontal entre les deux.
Utilisation pour le traitement de l’ alopécie
Il a été montré que le lysat était capable d'activer des voies anagènes favorisant la croissance des cheveux (Dastan M, Najafzadeh N, Abedelahi A, Sarvi M, Niapour A. Human platelet lysate versus minoxidil stimulates hair growth by activating anagen promoting signaling pathways.Biomed Pharmacother Biomedecine Pharmacother2016;84:979–986).
Ainsi, la présente invention concerne également une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour son utilisation pour le traitement de l’alopécie.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour le traitement de l’alopécie.
La présente invention concerne également une méthode de traitement de l’alopécie, comprenant l’administration, à un patient en ayant besoin, d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement de l’alopécie.
D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
montre la résistance à la compression des mousses de lysat plaquettaire selon l’invention (« Mousses »), en comparaison avec les hydrogels initiaux («Hydrogels ») (n = 12) ;
Fig. 2
montre la cinétique de dégradation en milieu aqueux de la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention ;
Fig. 3
montre la libération du facteur de croissance le VEGF (en pg/ml) au cours du temps (en jours) en fonction des différentes formes (mousse de lysat plaquettaire selon l’invention, hydrogel de lysat plaquettaire et liquide contrôle);
Exemples
Exemple 1 : obtention d’hydrogel à partir de lysat plaquettaire
Des hydrogels de lysat plaquettaire ont été obtenus à partir de lysat plaquettaire combiné avec les différents éléments sous forme liquide selon les proportions telles que résumées dans le tableau 1 ci-après :
Constituants Proportion (%)
Lysat plaquettaire entre 60 et 80%
CaCl2 entre 2 et 3%
NaCl entre 20 et 30%
Acide Tranexamique Entre 0,1 et 0,5%
Les hydrogels ainsi obtenus possèdent des structures fibreuses et poreuses optimales, notamment pour promouvoir la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire.
Avantageusement, ces hydrogels de lysat plaquettaires sont utilisés pour obtenir des mousses de lysat plaquettaire capables de fournir les mêmes propriétés que les lysats plaquettaires tout en démontrant des qualités supérieures en vue d’une commercialisation. L’utilisation des mousses de lysat plaquettaire est facilitée et peut convenir à toutes les pathologies traitées par ingénierie tissulaire ou cellulaire.
Exemple 2 : Procédé d’obtention d’une mousse de lysat plaquettaire
L’hydrogel de lysat plaquettaire obtenu est ensuite séché dans le réacteur d’un sécheur en CO2supercritique. Ce type de réacteur permet avantageusement un maintien de la structure tridimensionnelle de l’hydrogel au cours de l’opération de séchage.
En vue de retirer l’eau contenue dans l’hydrogel de lysat plaquettaire, celui-ci est trempé 48h dans un bain d’acétone puis séparé de son support avant d’être placé dans le réacteur fermé du sécheur. Préférentiellement, l’hydrogel est mis à tremper dans un récipient en verre ou un récipient métallique.
La température de la chambre du réacteur est abaissée à une température inférieure à 10°C pour permettre l’entrée du CO2à l’état liquide. Le réacteur avec le CO2liquide est rempli jusqu’à immerger les échantillons puis l’ensemble est laissé à tremper pendant 45 minutes afin de permettre au CO2liquide de pénétrer le réseau poreux du gel. Un rinçage est ensuite effectué par vidange du CO2présent dans la chambre et entrée d’une même nouvelle quantité de liquide. Cette opération de trempage/rinçage est reproduite trois fois. A l’issue des cycles, le réservoir est de nouveau rempli jusqu’à mi-hauteur, le réacteur fermé puis on élève progressivement sa température jusqu’à 40°C et la pression jusqu’à 90 bar. Le réacteur étant clos, lorsque la température augmente, la pression à l’intérieur du réacteur augmente. L’état supercritique, qui correspond au 4ème état de la matière, est atteint lorsque la température est supérieure à 31°C et la pression supérieure à 74 bars. Le réacteur est maintenu à cette température et à cette pression durant 4 heures puis dégazé et dépressurisé rapidement en 90 secondes.
L’ensemble de l’acétone présent dans l’hydrogel a été substitué par du CO2liquide au cours des phases de trempage/rinçage, puis lors de la montée en température et en pression, toute trace de solvant est éliminée, le réseau de fibre est désormais sec et le gel sec se présente sous forme d’une mousse fibreuse poreuse.
Comme démontré dans les exemples suivants, la mousse de lysat plaquettaire obtenu conserve avantageusement son agencement fibreux tridimensionnel (exemple 3) et les éléments majeurs tels que le sodium, le chlore, le phosphore, le soufre et le calcium (exemple 4).
La mousse de lysat plaquettaire possède par ailleurs des propriétés mécaniques supérieures à celles de l’hydrogel initial (exemple 5). La mousse ainsi obtenue est un matériau sec capable de se conserver et se réhydrate facilement (exemple 6), ce qui favorise la pénétration rapide des fluides biologiques et des cellules mais également l’activité cellulaire par le relargage de facteurs de croissance et autres protéines (exemple 7).
Exemple 3 : caractérisation de la microstructure
Le réseau de fibres de la mousse de lysat plaquettaire a été observé en microscopie électronique à balayage environnemental avec métallisation avant et après séchage au CO2supercritique.
Le procédé permet d’obtenir un réseau fibreux telle une matrice 3D. Avantageusement, le réseau de fibrine conserve son agencement fibreux tridimensionnel.
Le maillage du réseau fibreux est plus large après séchage, ce qui permet de contrôler la porosité. Il est ainsi possible en modifiant la porosité moyenne et le diamètre moyen des pores majoritairement présents dans le réseau tridimensionnel de modifier les phénomènes de diffusion à l’intérieur du matériau poreux.
Ainsi, il est ainsi possible de modifier la pénétration des fluides et des cellules (ainsi que la cinétique de libération des facteurs de croissance).
Ces deux paramètres modifient la cinétique de libération des facteurs de croissance et de tout ce qui aura été intégré dans la mousse. Cela ne modifie pas la quantité libérée mais la vitesse à laquelle les facteurs de croissance vont être libérés et par la même, la durée d’action de la mousse.
D’une manière générale, la vitesse de libération croît lorsque la porosité moyenne augmente et lorsque la taille moyenne des pores augmente.
La porosité de la mousse de lysat plaquettaire a été quantifiée et le réseau poreux a été caractérisé.
La méthode utilisée est la porosimétrie mercure (appareil : Autopore III, Micromeritics). La méthode consiste à faire pénétrer le mercure dans les pores de la mousse de lysat plaquettaire sous pression croissante. Un échantillon de mousse de lysat plaquettaire va être pesé dans une cellule de conductance avant et après remplissage de mercure. Une analyse du différentiel de pression mercurielle va être réalisée afin de quantifier la porosité et caractériser le réseau poreux.
Avantageusement, les mousses de lysat plaquettaire selon l’invention ont une porosité moyenne d’environ 80%. Avantageusement, une porosité moyenne d’environ 80% permet aux fluides, aux molécules, ions et aux cellules de s’insinuer entre les fibres du réseau et ainsi favoriser leur pénétration.
Le diamètre des pores majoritairement présents de la mousse de lysat plaquettaire est de 3,5 µm. Avantageusement, ce diamètre des pores majoritairement présents permet aux fluides, ions, molécules et cellules environnantes de pénétrer jusqu’au cœur du réseau.
On observera de manière minoritaire des pores ayant un diamètre moyen compris entre 10 et 11µm, des pores ayant un diamètre moyen compris entre 6.5 et 8µm, des pores ayant un diamètre moyen compris entre 0.4 et 2µm.
Exemple 4 : caractérisation des propriétés mécaniques
Des tests de compression TAX T2 ont été réalisés afin de caractériser les propriétés mécaniques des mousses de lysat plaquettaire séchées au CO2supercritique. Ces propriétés mécaniques ont été comparées à celles des hydrogels initiaux (« hydrogels » sur la figure 1).
Les conditions étaient les suivantes :
- Vitesse de mise en charge : 2mm/min ;
- Analyse du comportement jusqu’à 60% de compression ;
-Appareil : TA.XT Plus Texture Analyzer.
Les réseaux séchés présentent une nette augmentation de leur résistance à la compression par rapport aux hydrogels initiaux (n=4 ; p<0.01).
Les mousses de lysat plaquettaire selon l’invention présentent donc des propriétés mécaniques supérieures à celles de l’hydrogel initial. Ces mousses peuvent ainsi facilement se manipuler à la pince ou à la main sans se déliter comme le fait l’hydrogel.
Exemple 5 : détermination du taux de réhydratation après séchage
Le taux de réhydratation après séchage des mousses de lysat plaquettaire selon l’invention a été déterminé. La méthode utilisée est la méthode des pesées.
Les conditions sont les suivantes :
- Les échantillons ont été trempés dans 1200µL d’eau à 25°C pendant 48h ;
- Le taux de réhydratation est calculé grâce à la formule :
Le taux de réhydratation moyen calculé est de 804.9%.
La mousse de lysat plaquettaire possède ainsi un taux de réhydratation important. Avantageusement également, et en l’absence d’eau, la mousse de lysat plaquettaire présente une conservation favorable à sa commercialisation. En effet, et en l’absence d’eau, le matériau sec ne se dégrade pas au cours du temps.
Exemple 6 : Cinétique de dégradation et l ibération prolongée
La cinétique de dégradation en milieux aqueux et le relargage d’un facteur de croissance compris dans la mousse de lysat plaquettaire ont été évalués.
Cinétique de dégradation en milieu aqueux
La méthode utilisée est celle des pesées.
Les conditions sont les suivantes :
- Echantillons trempés dans 20mL d’eau à 25°C ;
- Suivi de la dégradation par pesée du matériau.
Comme illustré sur la figure 2, la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention est délitée au bout de 5 jours. Les facteurs de croissance sont donc libérés de manière prolongée et non pas immédiate comme c’est le cas avec le liquide de lysat plaquettaire.
Relargage d’un facteur de croissance, le VEGF
Le VEGF a été dosé afin d’évaluer son relargage. La méthode utilisée est celle du Test ELISA Human VEGF Pre-Coated ELISA Kit, Biogems. La libération du VEGF par la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention a été comparée avec la cinétique de libération par l’hydrogel de lysat plaquettaire. Un liquide a été utilisé en contrôle, et ce tel qu’illustré à la Figure 3.
L’hydrogel de lysat plaquettaire a été préparé par le procédé décrit à l’exemple 1 et la mousse de lysat plaquettaire a été préparée par le procédé décrit à l’exemple 2.
La mesure de l’absorbance a été mesurée à 450 nm.
Comme illustré à la figure 3, le VEGF est libéré progressivement sur 5 jours jusqu’à atteindre sa concentration maximale. Le relargage prolongé du VEGF se poursuit sur 25 jours.
Ainsi, et avantageusement, la mousse de lysat plaquettaire selon la présente invention initialement composée à base de lysat plaquettaire riche en facteurs de croissance, relargue du VEGF au cours du temps. Cela démontre que les facteurs de croissance sont enchâssés dans le réseau de fibrine et sont accessibles pour les cellules.
Cette libération est prolongée et en quantité similaire à celle de l’hydrogel de lysat plaquettaire, confirmant l’absence de perte de matériel protéique durant le procédé de séchage.
Avantageusement donc, les mousses de lysat plaquettaire selon l’invention peuvent être utilisées dans de nombreuses applications biologiques telles que la régénération et la réparation des tissus endommagés.
En effet, la présence naturelle de facteurs de croissance et de cytokines tels que le VEGF, le PDGF, l’EGF et le TGFβ qui seront libérés lors de l’implantation de la mousse de lysat plaquettaire selon l’invention dans le milieu, contribuant ainsi à la croissance des tissus et au développement des organes, constitue un argument important pour l’utilisation biomédicale des mousses de lysat plaquettaire selon l’invention.
Outre leur avantage de libération prolongée par rapport aux hydrogels de lysat plaquettaire, les mousses de lysat plaquettaire selon l’invention sont de plus, plus facilement manipulables et possèdent des propriétés de conservation et mécaniques améliorées.

Claims (11)

  1. Mousse de lysat plaquettaire caractérisée en ce qu’elle comprend du TGF-β, de l’EGF, du PDGF-AB, de l’IGF-1, du VEGF et du bFGF, au sein d’une matrice de fibrine polymérisée.
  2. Mousse de lysat plaquettaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre du calcium et/ou de l’acide tranexamique.
  3. Mousse de lysat plaquettaire selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite mousse possède une porosité comprise entre 70% et 95%, préférentiellement ladite mousse possède une porosité d’environ 80%.
  4. Procédé d’obtention d’une mousse de lysat plaquettaire comprenant les étapes:
    - d’obtention d’un hydrogel par polymérisation d’un lysat plaquettaire ;
    - substitution par lavage du solvant aqueux par un solvant polaire ;
    - puis séchage par un procédé de séchage en atmosphère CO2supercritique.
  5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que l’hydrogel est obtenu par polymérisation d’un lysat plaquettaire, ledit lysat plaquettaire étant combiné avec un initiateur de la polymérisation tel que le chlorure de calcium (CaCl2), la thrombine, la genepine, avec un agent permettant le maintien de l’isotonie et le gonflement du gel tel que le chlorure de sodium (NaCl), et avec un stabilisateur de la coagulation tel que l’acide tranexamique, l’acide amino-caproique et la fibronectine.
  6. Mousse de lysat plaquettaire susceptible d’être obtenue par le procédé selon les revendications 4 ou 5.
  7. Utilisation d’une mousse de lysat plaquettaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou selon la revendication 6 pour la culture cellulaire.
  8. Mousse de lysat plaquettaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou selon la revendication 6 pour son utilisation dans une méthode pour favoriser la régénération tissulaire ou dans une méthode de thérapie cellulaire.
  9. Mousse de lysat plaquettaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou selon la revendication 6, pour son utilisation dans une méthode pour favoriser la cicatrisation cutanée et la régénération du derme, ou pour favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse.
  10. Mousse de lysat plaquettaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou selon la revendication 6, pour son utilisation dans le traitement des troubles de la cornée.
  11. Mousse de lysat plaquettaire selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou selon la revendication 6, pour son utilisation dans une méthode pour favoriser l’ostéogenèse et la régénération osseuse ou pour favoriser la régénération des tissus parodontaux.
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