FR3090010A1 - Méthode d’identification de cellules infectées - Google Patents

Abstract

L’invention concerne une méthode d'identification in vitro de cellules réservoirs d'un rétrovirus responsable d'une immunodéficience chez les mammifères, à partir d'un échantillon biologique desdits mammifères ayant été traités avec au moins un agent anti rétroviral, ladite méthode comprenant : - une étape de détermination de la présence ou la quantité d’ASP ou de son transcrit, - une étape de comparaison avec une référence, et - une étape d’identification des cellules réservoirs. Figure pour l’abrégé : pas de figure

Description

Description

Titre de l'invention : Méthode d’identification de cellules infectées

[0001] L’invention concerne une méthode d’identification de cellules infectées, notamment par des rétro virus.

[0002] Grâce aux antirétroviraux, les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH ou HIV en anglais) maintiennent leur charge virale (quantité de virus dans le sang) au-dessous du seuil de détection par les méthodes actuelles. Cependant, malgré leur efficacité, même les antirétroviraux les plus puissants ne peuvent éliminer complètement le virus, car il reste à l’état latent dans certaines cellules et échappe ainsi aux effets des antirétroviraux qui ciblent le virus en réplication ou lors de son entrée dans les cellules cibles. Ces cellules persistantes sont appelées réservoir viral.

[0003] Cibler les cellules réservoirs du VIH chez les patients sous traitement antirétroviral est la stratégie privilégiée depuis la fin du siècle dernier par la communauté scientifique. En effet, l’éradication de ces cellules permettrait d’éliminer complètement le virus des cellules des patients, et ainsi enfin proposer un traitement efficace et définitif de l’infection.

[0004] Il existe donc un réel besoin de caractériser l’ensemble du réservoir viral pour proposer une thérapie appropriée.

[0005] On connaît de l’état de la technique plusieurs marqueurs suspectés être des marqueurs des cellules réservoirs du VIH. Notamment on connaît des demandes de brevet FR 3056990 et WO 2018060979 les marqueurs CD32a et CD89. Les inventeurs cités dans ces demandes de brevet ont identifié ces marqueurs cellulaires comme étant exprimés spécifiquement par les cellules de patient séropositifs sous traitement et capables de produire des virus actifs lors que le traitement antirétroviral est arrêté.

[0006] Toutefois de tels marqueurs ne sont probablement pas les seuls qui permettent de différencier les cellules saines des cellules réservoirs.

[0007] Aussi, existe-t-il toujours un réel besoin de fournir des moyens de caractériser les cellules réservoirs, et d’identifier de nouveaux marqueurs.

[0008] L'invention a notamment pour but de pallier ce manque.

[0009] Un des buts de l’invention est donc de proposer une méthode d’identification des cellules réservoirs du VIH.

[0010] Un autre but de l’invention est de proposer une méthode permettant de s’assurer qu’un patient est en complète rémission de l’infection et qu’il n’existe donc plus de virus, c’est à dire qu’il n’existe plus de réservoir.

[0011] Encore un autre but de l’invention est de fournir un moyen simple pour le clinicien ou le médecin d’identifier si un patient séropositif présente un réservoir viral.

[0012] A cet effet, l’invention concerne une méthode d’identification, notamment in vitro, de cellules réservoirs d’un rétro virus responsable d’une immunodéficience chez les mammifères, à partir d’un échantillon biologique desdits mammifères ayant été traités avec au moins un agent anti rétroviral, ladite méthode comprenant

- une étape de détermination de la présence ou de l’absence, ou encore de mesure de la quantité d’un composé choisi parmi :

* le transcrit anti-sens codant la protéine anti-sens ou asp, * la protéine ASP, et * des anticorps spécifiques de la protéine ASP, dans ledit échantillon biologique desdits mammifères ayant été traités avec au moins un agent anti rétroviral,

- une étape de comparaison de ladite présence ou absence dudit composé, ou encore de comparaison de la quantité dudit composé mesurée à l’étape précédente, avec des échantillons de référence, notamment avec des échantillons de référence issus de patients non infectés pour la référence de négativité et issus de patients non infectés complémentés par l’étalon synthétique de référence correspondant à la méthode utilisée pour la référence de positivité, et

- une étape de détermination de la présence de cellules réservoirs dans ledit échantillon biologique si i) ledit composé est présent alors qu’il est absent dans l’échantillon de référence, ou ii) la quantité dudit composé est au moins égal au seuil défini par l’analyse statistique des échantillons négatifs pour chacune des méthodes fois la quantité observée, notamment au moins égale à 1,2 fois la quantité mesurée dans lesdits échantillons de référence.

[0013] L’invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que la quantité de transcrits anti-sens ASP, ou de la protéine ASP ou encore d’anticorps dirigés contre la protéine ASP, est un excellent marqueur du réservoir viral de l’infection par le VIH, et plus généralement des rétro virus provoquant une immunodéficience chez les mammifères.

[0014] ASP (ou protéine anti-sens, en anglais AntiSense protein), est une protéine codée par le brin anti-sens du génome du virus du VIH, et des virus apparentés. Ce cadre ouvert de lecture est entièrement chevauchant du cadre ouvert de lecture du brin sens codant le gène env. Le gène asp codant ladite protéine ASP est notamment retrouvé dans le génome de HIV 1 du groupe M.

[0015] Aussi, la méthode selon l’invention consiste, à partir d’un échantillon d’un patient infecté par le VIH, et préalablement traité avec au moins un agent antirétroviral, notamment une multi-thérapie, à détecter la présence ou l’absence i) du transcrit antisens asp, ii) la présence de la protéine ASP elle-même, ou iii) la présence d’anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine ASP.

[0016] Dans la cadre de la détection du transcrit asp, les techniques de biologie moléculaire classique peuvent être utilisée, telles que la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), quantitative ou non, les méthodes d’hybridation avec des sondes marquées avec de la radioactivité ou encore des marqueurs fluorescents, le séquençage direct (RNAseq) ou encore toute autre technique connue de l’homme du métier habitué à rechercher la présence ou l’absence de transcrits.

[0017] Dans le cadre de la détection de la présence ou de l’absence de la protéine ASP, les techniques immunologiques bien connues de l’homme du métier sont utilisables. Par exemple un test ELISA utilisant commande anticorps de capture un anticorps anti ASP peut être utilisé. Un second anticorps dirigé contre ASP, marqué ou non, sera utilisé pour détecter une immobilisation de la protéine ASP. L’utilisation d’un troisième anticorps reconnaissant la partie constante du second anticorps, et couplé à une molécule permettant une détection de type lumineuse, chimique ou fluorescente pourra également être mise en œuvre.

[0018] Dans le cadre de la détection des anticorps anti ASP, les techniques immunologiques connues de l’homme du métier seront également utilisées. Ici, la protéine ASP servira d’appât aux anticorps à détecter, et un second anticorps reconnaissant la partie constante des anticorps, et couplé à une molécule permettant une détection de type lumineuse, chimique, radioactive ou fluorescente, sera utilisé pour la détection.

[0019] Egalement, la méthode selon l’invention consiste, à partir d’un échantillon d’un patient infecté par le VIH, et préalablement traité avec au moins un agent antirétroviral, notamment une multi-thérapie, à détecter la quantité ou i) du transcrit antisens asp, ii) la présence de la protéine ASP elle-même, ou iii) la présence d’anticorps dirigés spécifiquement contre la protéine ASP. Cela signifie qu’il est important de connaître « le nombre relatif » de molécules (transcrits, protéines ou anticorps).

[0020] Les méthodes susmentionnées pour la détection de la présence ou de l’absence sont utilisables, mais dans leur version « quantitative » c’est à dire permettant de donner une valeur quantifiée de chacune des molécules. Par exemple pour les transcrits, la technique de PCR quantitative sera privilégiée.

[0021] La seconde étape de la méthode susmentionnée consiste en une étape de comparaison avec un ou plusieurs échantillons contrôles permettant de définir la présence ou l’absence, ou la quantité de chacune des molécules (transcrits, protéines ou anticorps).

[0022] Les échantillons contrôles sont multiples, et peuvent correspondre i) à un ou des échantillons issus d’individus sains qui n’ont jamais été infectés par un virus de l’immunodéficience (contrôles négatifs), ii) à un ou des échantillons de l’individu testé, ledit échantillon ayant été prélevé avant son infection par ledit virus, iii) à un ou des échantillons d’individus infectés par ledit virus et qui n’ont pas été traités par un agent antirétroviral, iv) à un ou des échantillons de l’individu testé, ledit échantillon ayant été prélevé près son infection par ledit virus, mais avant son traitement par un agent antirétroviral, ou v) des étalons, c’est à dire des compositions dont la quantité de molécule (transcrits asp, protéines ASP ou anticorps anti ASP) sont connues précisément. Bien évidemment dans le cadre de la méthode il est possible d’utiliser un ou plusieurs des échantillons de référence susmentionnés, ou tout autre échantillon de référence que l’homme du métier jurera utile.

[0023] Les étapes de comparaison sont des méthodes classiquement utilisées par l’homme du métier consistant à réaliser des différences, des ratios, ou toute autre opération mathématique permettant de définir s’il existe une différence qualitative ou quantitative en molécule (transcrits asp, protéines ASP ou anticorps anti ASP) entre l’échantillon testé et le ou les échantillons contrôle ou témoin.

[0024] Dans le cadre de la troisième étape, il est déterminé si oui ou non l’échantillon testé provient d’un individu présentant un réservoir viral, ou même de quantifier ledit réservoir si celui-ci existe.

[0025] Dans le cadre de la présence ou de l’absence des molécules ((transcrits asp, protéines ASP ou anticorps anti ASP), si une détection desdites molécules est possible, le patient dont est issu l’échantillon testé sera considéré comme ayant un réservoir viral, et donc susceptible après l’arrêt du traitement antirétroviral, de subir un rebond viral et donc de produire à nouveau du virus actif. A l’inverse, si aucune molécule n’est détectée ou détectable, l’individu dont est issu l’échantillon testé sera considéré comme ne présentant pas de réservoir viral, dans la limite de la détection permise par les techniques utilisées.

[0026] Il peut être particulièrement avantageux plutôt que de détecter la présence ou l’absence des molécules (transcrits asp, protéines ASP ou anticorps anti ASP), ou en complément de cette détection de présence ou d’absence, d’en détecter leur quantité. En effet, afin de limiter les faux négatifs (absence de détection car la méthode utilisée n’est pas assez sensible), une méthode quantitative peut être utilisée. Cela permet notamment de quantifier le réservoir viral et de déterminer si celui-ci est faible (peu de cellules le constituent) et donc que le patient serait susceptible d’avoir un faible rebond viral (peu de production de virus actif à l’arrêt du traitement), soit si le réservoir est important, et dans ce cas que le rebond viral risque d’être très important (grande production de virus à l’arrête du traitement).

[0027] Le seuil de positivité d’un échantillon est défini comme étant au moins égal au seuil correspondant à la quantité de molécules (transcrits asp, protéines ASP ou anticorps anti ASP) défini par l’analyse statistique des échantillons négatifs pour chacune des méthodes fois la quantité observée. Notamment, si la quantité mesurée dans l’échantillon est au moins égale à 1,2 fois la quantité mesurée dans l’échantillon contrôle dit négatif, l’individu sera considéré comme ayant un réservoir viral.

[0028] Afin de déterminer le seuil de détection, la précision et la spécificité de chacune des méthodes considérées, une mesure est effectuée sur un panel d’échantillons de sujets non-infectés (négatifs) et de sujets infectés (positifs). Les résultats sont soumis à une analyse statistique permettant de déterminer les taux des spécificités et sensibilité tel que par exemple une analyse ROC (Delacour, H., et al. La Courbe ROC (receiver operating characteristic) : principes et principales applications en biologie clinique, Annales de biologie clinique, 2005 ; 63 (2) : 145-54) ou tout autres méthodes statistiques équivalentes .

[0029] De manière avantageuse, ladite protéine ASP est la protéine ASP du virus de l’immunodéficience humaine, notamment du virus de l’immunodéficience humaine -1 du groupe M.

[0030] Il existe deux types de virus de l'immunodéficience humaine (VIH) : le VIH-1 et le VIH-2. Le VIH-1 se compose de quatre groupes (M, N, O et P), chacun ayant une origine propre qui a résulté d'une transmission du singe à l'homme à au moins quatre occasions. Alors que l'origine simienne des groupe M et N, en fait des chimpanzés du Cameroun (en particulier la sous-espèce Pan troglodytes troglodytes), avait été identifiée il y a plusieurs années, l’origine des groupes O et P semble plutôt être le gorille.

[0031] Le groupe M du VIH-1, la souche la plus répandue, est responsable de la pandémie de SIDA (99 % des infections sur un total de 75 millions). Alors que le groupe P n'a été détecté que chez deux individus jusqu’à présent, le groupe O a pu se propager chez les humains dans plusieurs pays en Afrique centrale et occidentale. On estime qu’il a infecté près de 100.000 personnes.

[0032] De manière avantageuse, l’échantillon biologique est un échantillon de sang, de sérum ou de plasma, et dans laquelle ledit composé est un anticorps spécifique de la protéine ASP.

[0033] A partir d’un simple échantillon de sang, ou de plasma ou de sérum, il est possible de mesurer la quantité de protéine ASP, ou de son transcrit afin de mettre en œuvre la méthode selon l’invention.

[0034] Avantageusement, l’échantillon biologique est un échantillon de cellules, et dans laquelle ledit composé est le transcrit codant la protéine ASP ou la protéine ASP, [0035] Il est avantageux de mettre en œuvre la méthode de l’invention à partir d’un échantillon de cellules de patient, notamment prélevé à partir d’une simple prise de sang, et de rechercher, ou quantifier, la quantité de transcrits codant la protéine ASP.

[0036] Aussi, ce mode de de réalisation avantageux concerne une méthode d’identification, notamment in vitro, de cellules réservoirs d’un rétro virus responsable d’une immunodéficience chez les mammifères, à partir d’un échantillon de cellules, notamment hématopoïétiques desdits mammifères ayant été traités avec au moins un agent anti rétroviral, ladite méthode comprenant

[0037] une étape de détermination de la présence ou de l’absence, ou encore de mesure de la quantité du transcrit anti-sens codant la protéine anti-sens ou asp,

[0038] dans ledit échantillon biologique desdits mammifères ayant été traités avec au moins un agent anti rétroviral,

[0039] une étape de comparaison de ladite présence ou absence dudit composé, ou encore de comparaison de la quantité dudit composé mesurée à l’étape précédente, avec des échantillons de référence notamment issu de patients non infectés, et

[0040] une étape de détermination de la présence de cellules réservoirs dans ledit échantillon biologique si i) ledit composé est présent alors qu’il est absent dans l’échantillon de référence, ou ii) la quantité dudit composé est au moins égal au seuil défini par l’analyse statistique des échantillons négatifs pour chacune des méthodes fois la quantité observée, notamment au moins égale à 1,2 fois la quantité mesurée dans lesdits échantillons de référence.

[0041] De manière avantageuse, dans la méthode susmentionnée, le gène ASP correspond au gène dont l’identifiant est Gene ID: 19424028, notamment ayant la séquence nucléique de référence (NC_001802.1) SEQ ID NO : 22 suivante : ATGCCCCAGACTGTGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGCAAATT GTTCTGCTGCTGCACTATACCAGACAATAATTGTCTGGCCTGTACCGTCAG CGTCATTGAGGCTGCGCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCCCAAGAACCCAAG GAACAAAGCTCCTATTCCCACTGCTCTTTTTTCTCTCTGCACCACTCTTCTCT TTGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAATGGTTCAATTTTTACTACTTTATATTTA TATAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCATATCTCCTCCTCCAGGTCTGAAGA TCTCGGACTCATTGTTGCTATTACCACCATCTCTTGTTAATAGCAGCCCTGT AATATTTGATGAACATCTAATTTGTCCACTGATGGGAGGGGCATACATTGC TTTTCCTACTTTCTGCCACATGTTTATAATTTGTTTTATTCTGCATGGGAGGG TGATTGTGTCACTTCCTTCAGTGTTATTTGACCCTTCAGTACTCCAAGTACT ATTAAACCAAGTACTATTAAACAGTTGTGTTGAATTACAGTAG.

[0042] La protéine ASP correspond à la protéine comprenant ou constituée de la séquence SEQ ID NO : 1, ou une protéine présentant une identité d’au moins 75% au niveau protéique calculée hors des zones hypervariables sous-lignées dans la séquence protéique de référence, excluant aussi la délétion des 26 premiers résidus propres par exemple aux virus du sous-type A du groupe M du VIH-1 (en italique dans la séquence SEQ ID NO : 1).

[0043] La protéine ASP du virus de référence HXB2 présente la séquence suivante (SEQ ID No 1 :

[0044] MPQTVSCNRC CCASIALSKL FCCCTIPONN CLACTVSVIE AAPIVLPAAP KNPRNKAPIP TALFSLCTTL LFALVGATPN GSIFTTLYLY NSLLQLSLIS PPPGLKTSDS LLLLPPSLVN SSPVIFDEHL ICPLMGGAYI AFPTFCHMFI TCFTLHGRVI VSLPSVLFDP SVLOVLLNOV LLNSCVELQ.

[0045] Par « protéine présentant au moins 75% d’identité avec ladite protéine de séquence SEQ ID NO : 1 » on entend une protéine qui présente en acides aminés 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la protéine de séquence SEQ ID NO : 1.

[0046] De manière avantageuse, ces protéines comprenant au moins 75% d’identité avec la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 présentent toutes la séquence SEQ ID NO : 2 suivante : Nter- PDNNCLACTVSVIEAAPIVLPAAPKNPRNKAPIPTALFSLCTTLLFALVGATPNGSIFTTLYLYNSLLQLSLI-Cter. . EN particulier cela concerne les protéines ASP de séquence suivante :

[0047] SEQ ID NO : 3 : MPQTVSCNRC CCASIALSKL FCCCTIPDNN CLACTVSVID RAPIVLPAAP KNPRNKAPIP TALFSLCTTL LFALVGATPN GSIFTTLYLY NSLLQLSLIS PPPGLKISDP LLLLPPSLVN SSPVIFDEHL ICPLMGGAYI AFPTSCHMFI NCFILHGSVI VSLPSVLFDP SVLQVLLNQV LLNSCVELQ,

[0048] SEQ ID NO : 4 : MPQTVSCNRC CCASIALSKL FCCCTISDNN CLACTVSVID AAPIVLPAAP KNPRNKAPIP TALFSLCTTL LFALVGATPN GSIFTTLYLY NSLLQLSLIS PPPGLKISDP LLLLPPSLVN SSPVIFDEHLI CPLMGGAYI AFPTSCHMFI NCFILHGSVI VSLPSVLFDP SVLQVLLNQV LLNSCVELQ, et

[0049] SEQ ID NO : 5 : MPQAVSCNIC CCASIALSKL FCCCTIPDNN CLACTVSVID AAPIVLPAAP KNPRNITPIT PTXLFSLXTT LLXALVGATP NGSIFTTLYL YNXLLQLSLI SPPPGLKISV VSLLFPPSLV NSSPVIFDEH LICPSMGGAY IAFPTSCHMF IICFILHGSL IILSDQVLFP SVLFQVLLNS CVELQ.

[0050] De manière avantageuse, dans la méthode susmentionnée, la protéine ASP correspond à la protéine comprenant ou constituée de la séquence SEQ ID NO : 1, ou une protéine présentant au moins 75% d’identité avec ladite protéine sous réserve qu’elle conserve la séquence SEQ ID NO : 2.

[0051] De manière avantageuse, dans la méthode susmentionnée, la protéine ASP correspond à la protéine comprenant ou constituée de la séquence SEQ ID NO : 1, ou une protéine présentant au moins 75% d’identité avec ladite protéine ladite protéine étant choisie parmi les protéines de séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.

[0052] L’invention concerne également une méthode de détermination, notamment in vitro, de l'efficacité dans un échantillon biologique, d'une thérapie anti rétrovirale sur le réservoir viral de mammifères infectés par un rétrovirus responsable de l'immunodéficience humaine, ladite méthode comprenant :

- une étape de détermination de la présence ou de l'absence, ou encore de mesure de la quantité, d'un composé choisi parmi :

o du transcrit antisens codant la protéine anti sens ou ASP, notamment représenté par la séquence SEQ ID NO : 22, o de protéine ASP, notamment représentée par la séquence SEQ ID NO : 1, ou l’un de ses variants, notamment représentés par l’une quelconque des séquences SEQ ID NO : 3 à 5, ou o d'anticorps spécifique de la protéine ASP, dans ledit échantillon biologique,

- une étape de comparaison de ladite présence ou absence dudit composé, ou encore de comparaison de la quantité mesurée dudit composé à l'étape précédente, avec des échantillons de référence issu de patients non infectés, pour la référence de négativité, et issus de patients non infectés complémentés par l'étalon synthétique de référence correspondant à la méthode utilisée pour la référence de positivité, et

- une étape de détermination de l'efficacité de ladite thérapie antirétrovirale si o ledit composé est absent après thérapie anti rétrovirale alors qu'il était présent dans l'échantillon de référence, ou o la quantité dudit composé varie d'au moins 1,2 fois la limite de précision statistiquement significative de la méthode considérée.

[0053] La méthode susmentionnée permet de déterminer si une thérapie dirigée contre les cellules réservoirs est efficace ou non, en mesurant la quantité du réservoir viral, c’est-à-dire en mesurant la quantité de marqueurs tels que décrits ci-dessus (transcrits anti sens, protéine ASP ou anticorps).

[0054] Si à l’issue de la méthode susmentionnée et après comparaison avec un ou plusieurs échantillons de référence, les marqueurs (transcrits anti sens, protéine ASP ou anticorps) ne sont plus détectables, alors qu’ils l’étaient avant l’administration du traitement ciblant les cellules réservoir, il sera considéré que le traitement a été efficace. De la même manière si la quantité de marqueurs (transcrits anti sens, protéine ASP ou anticorps) se trouve réduite significativement par rapport à la quantité de marqueurs chez le patient avant traitement, il sera aussi considéré que le traitement est efficace.

[0055] Bien évidemment, à l’inverse, si le niveau de marqueurs ne varie pas, voire augmente, il sera alors considéré que la thérapie anti-cellules réservoirs a été inefficace.

[0056] Une telle méthode est un atout majeur dans le cadre du développement de thérapie ciblant les cellules réservoirs, et permet de disposer d’un arsenal thérapeutique, en association avec les multi-thérapies, pour éradiquer le virus chez les individus atteints.

[0057] De manière avantageuse, ledit échantillon de référence est un échantillon dudit mammifère avant traitement avec ladite thérapie antirétrovirale.

[0058] En effet, la meilleure référence pour déterminer si le traitement est efficace est de de comparer le niveau des marqueurs (transcrits anti sens, protéine ASP ou anticorps) avant le traitement et après le traitement.

[0059] Encore plus avantageusement, il est fait référence à la méthode susmentionnée dans laquelle ladite protéine ASP est la protéine ASP du virus de l’immunodéficience humaine, notamment du virus de l’immunodéficience humaine -1 du groupe M.

[0060] Dans un autre aspect, l’invention concerne kit pour la détection des cellules réservoirs de rétrovirus de mammifères comprenant :

- des moyens de détection d’un composé choisi parmi o un transcrit anti sens codant la protéine anti sens ou ASP o la protéine ASP, notamment représentée par la séquence SEQ ID NO : 1, ou un de ses variants, notamment représentés par l’une quelconque des séquences SEQ ID NO : 3 à 5, ou o un ou plusieurs anticorps spécifique(s) de la protéine ASP, et - au moins un échantillon biologique de référence.

[0061] Le kit susmentionné comporte les éléments essentiels permettant de détecter la présence de l’un au moins des marqueurs (transcrits anti sens, protéine ASP ou anticorps) permettant de quantifier le réservoir viral. Associé à ces moyens de détection, le kit comprend également au moins échantillon biologique de référence.

[0062] Concernant les échantillons biologiques de référence, il peut s’agir soit d’une quantité déterminée de marqueurs purifiés, (ARN, protéines ou anticorps) qui notamment correspondent à une moyenne que l’on peut observer soit chez des individus sains, soit chez des patients infectés mais qui n’ont pas encore été traités avec une thérapie antirétrovirale. L’échantillon biologique peut également correspondre à des extraits de cellules, ou même des cellules, issues de patients infectés et non encore traités, ou des cellules ou extraits de celles-ci issus d’individus sains.

[0063] Les moyens de détections contenus dans le kit peuvent être notamment :

[0064] - pour détecter le transcrit anti sens, des oligonucléotides spécifiques permettant de réaliser une PCR quantitative, et en particulier le couple d’oligonucléotides tels que représentés par les séquences SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12,

[0065] - pour détecter la protéine, des anticorps spécifiques de la protéine ASP, notamment capable de reconnaître la séquence SEQ ID NO : 1, ou toute protéine comprenant cette séquence, et

[0066] - pour détecter les anticorps, des peptides, notamment de séquence SEQ ID NO : 2, d’ASP, ou la protéine ASP, notamment de séquence SEQ ID NO : 1 ou de séquence SEQ ID NO : 3 à 5.

[0067] Aussi, avantageusement, il est proposé un kit comprenant :

[0068] - des oligonucléotides permettant de détecter le transcrit anti sens ASP, notamment les oligonucléotides de séquence SEQ DI NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et/ou

[0069] - des anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine ASP, et notamment des anticorps spécifiques de la séquence SEQ ID NO : 2, et/ou

[0070] - des peptides de la protéine ASP, notamment le peptide de séquence SEQ ID NO : 2, ou la protéine ASP, notamment de séquence SEQ ID NO : 1 ou de séquence SEQ ID NO : 3 à 5, et

[0071] - au moins un échantillon biologique de référence, ledit échantillon biologique de référence étant soit un échantillon issu d’un individu sain, soit un échantillon issu d’un patient infecté par ledit virus mais n’ayant pas été traité avec une thérapie antirétrovirale, soit les eux types d’échantillons.

Brève description des figures

[0072] L'invention sera mieux comprise à la lecture des figures suivantes :

[0073] [fig-1] Mesure des anticorps anti-ASP par LIPS : Des plasmas de patients infectés (HIV+) ou non-infectés(HIV-) par le VIH-1 sont incubés avec la protéine de fusion renilla-ASP puis l’expérience est poursuivie en suivant le protocole de LIPSdécrit dans l’exemple 2. La figure présente les RLU (Relative Light Unit) pour les deux groupes de patients. La ligne horizontale indique le seuil de positivité pour lequel la spécificité (taux de vrai positif) est égale à 100 %.

[0074] [fig.2] Mesure de la transcription virale anti-sens dans des lymphocytes T CD4+ exvivo : Des lymphocytes T CD4+ d’un patient infecté par le VIH-1 et sous traitement anti-viral ont été stimulés pendant 5 jours par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 puis maintenus en IL-2. Aux différents temps indiqués sur le graphique une partie des cellules a été récupérée pour permettre l’analyse de la transcription virale antisens selon le protocole décrit dans l’exemple 1.

[0075] [fig.3] Infection de lymphocytes T par un mutant n’exprimant pas ASP : Des lymphocytes T CD4+ isolés d’un donneur sain ont été infecté avec un virus du VIH exprimant ASP (courbe grise) ou n’exprimant pas ASP (courbe noire). A différents temps post-infection (en jours), la production virale a été évaluée en déterminant le pourcentage de cellules exprimant la protéine virale GAG par cytométrie et marquage intracellulaire.

[0076] [fig.4] Infection de cellules dendritiquess par un mutant n’exprimant pas ASP : Des cellules dendritiques dérivées de monocytes isolés d’un donneur sain ont été infecté avec un virus du VIH exprimant ASP (courbe grise) ou n’exprimant pas ASP (courbe noire). A différents temps post-infection (en jours), la production virale a été évaluée en déterminant le pourcentage de cellules exprimant la protéine virale GAG par cytométrie et marquage intracellulaire.

Exemple

[0077] Exemple 1 : Protocole de RT-qPCR brin spécifique pour la détection du transcrit d’ASP dans les cellules de patients infectés

[0078] Matériel utilisé

[0079] 1) Amorces

[0080] Amorces de réverse transcription :

- ASP : 5’- ATC ATG A AG CAT CTA GAT TC A AAG TGC TGC GGA GCA GCA GG AAG CAC TAT- 3’ (SEQ ID NO : 6)

- Gag : 5’- TC A TCC ATC CTA TTT GTT CCT GAA G-3’ (SEQ ID NO : 7)

- Actine Beta : 5’- AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA-3’ (SEQ ID NO : 8)

- RPL19 : 5’- TGC GTG CTT CCT TGG TCT TA-3’ (SEQ ID NO : 9)

- HPRT : 5’- GGC GAT GTC AAT AGG ACT CC-3’ (SEQ ID NO : 10)

[0081] Amorces de qPCR :

- ASP : amorces sens 5’- ATG CCC CAG ACT GTG AGT TG-3’ (SEQ ID NO : 11) et anti-sens 5’- ATC ATG AAG CAT CTA GAT TCA AAG TGC TGC-3’ (SEQ ID NO : 12).

[0082] Les amorces de ré verse transcription et de qPCR spécifiques d’ASP ont été conçues de manière à détecter le transcrit d’ASP issu de différents sous-types du groupe M, et ciblent l’extrémité 5’ du transcrit d’ASP qui est très conservée entre les différents sous-types.

[0083] - Gag : amorces sens 5’- GTG GGG GGA CAT CAA GCA G-3’ (SEQ ID NO : 13) et antisens 5’- TGC TAT GTC ACT TCC CCT TGG -3’ (SEQ ID NO : 14).

[0084] - Actine beta : amorces sens 5’- CCA ACC GCG AGA AGA TGA -3’ (SEQ ID NO :

15) et antisens 5’- CCA GAG GCG TAC AGG GAT AG -3’ (SEQ ID NO : 16).

[0085] - RPL19 : amorces sens 5’- CTC TAG TGT CCT CCG CTG TG -3’ (SEQ ID NO :

17) et antisens 5’- CTT CCG CTT ACC TAT GCC CA-3’ (SEQ ID NO : 18).

[0086] - HPRT : amorces sens 5’- TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA -3’ (SEQ ID

NO : 19) et antisens 5’- GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT -3’ (SEQ ID NO : 20).

[0087] 2) Réactifs

[0088] RNeasy Mini Kit (Qiagen)

[0089] Superscript transcriptase III (Thermofisher)

[0090] PCR Clean-up Gel extraction Kit (Macherey-Nagel)

[0091] LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Life Science)

[0092] Protocole de RT-qPCR brin spécifique

[0093] 1) Isolation des cellules de patient

[0094] Les cellules sont isolées à partir de tubes de sang (4 à 7 mL) prélevés sur anticoagulant.

[0095] Les cellules peuvent être isolées par différentes approches dont :

[0096] Ensemble des globules blancs : lyse érythrocytaire et centrifugation

[0097] Eraction monocytaire : Isolement sur coussin de ficoll

[0098] Isolement des lymphocytes T CD4+ totaux par exemple par sélection négative, ce qui permet d’éviter leur activation. : kit RosetteSep (Stemcell)

[0099] Les cellules sont soit utilisées tout de suite soit congelées à -80°C sous forme de culot sec. Les ARN totaux sont alors ultérieurement extraits de ces cellules.

[0100] Les ARN totaux sont extraits selon le protocole du kit « RNeasy Mini Kit » (Qiagen). L’ARN total obtenu est dosé au nanodrop.

[0101] 2) Transcription réverse

[0102] Une quantité d’ARN comprise entre 600 ng et 2pg est utilisée comme matrice pour l’étape de réverse transcription. Des amorces spécifiques des transcrits d’ASP et de Gag, mais également des gènes de ménage codant pour les protéines Actine Beta, RPL19 et HPRT sont utilisées pour la réverse transcription. A l’extrémité 3’ de l’amorce d’ASP, une séquence non complémentaire nommée ancre a été ajoutée. Cette séquence permet d’amplifier spécifiquement les ADNc issus de la ré verse transcription de l’ARNm d’ASP, et non pas les ADN issus d’une éventuelle réaction d’auto-amorçage de TARN. La réverse transcription est réalisée à 55°C à l’aide de la réverse transcriptase Superscript III. Les ADNc obtenus sont purifiés sur colonne afin d’éliminer les amorces utilisés pour la réverse transcription, à l’aide du kit PCR Clean-up Gel extraction.

[0103] 3) qPCR brin spécifique

[0104] La réaction de qPCR est réalisée en plaque 384 puits. Pour chaque échantillon d’ADNc, l’expression de trois gènes de ménage (actine beta, rpll9 et hprt) et de deux gènes cibles (asp, gag) est analysée. Chaque mesure de l’expression d’un gène pour un échantillon donné est réalisée en triplicat (dans trois puits différents).

[0105] Dans un même puits sont ajoutés :

[0106] - 2.5 pL du mix lightcycler 480 SYBR green II master mix qui contient l’ADN polymérase, le SYBR green et les dNTPs.

[0107] - 0.5 pL des amorces spécifiques du gène cible à amplifier (IpM final).

[0108] - 2 pL d’ADNc. Les ADNc purifiés à Tissue de l’étape de réverse transcription sont directement utilisés dans la réaction de qPCR.

[0109] La plaque de qPCR est centrifugée 1 minute à 2000 g.

[0110] La fluorescence émise lors de la réaction de qPCR est mesurée par l’appareil LightCycler480 (Roche). Les paramètres de cycle utilisés pour la qPCR sont les suivants :

[OUI] 5minà95°C

[0112] 55 cycles : 10 sec de dénaturation à 95°C

[0113] 10 sec d’hybridation à 60°C

[0114] 10 sec d’élongation à 72°C

[0115] Mesure de la température à laquelle 50% de l’ADN est dénaturé à la fin de la qPCR (Température de fusion).

[0116] 4) Analyse de la g PCR

[0117] Pour un même échantillon, l’expression des gènes cible gag et asp est quantifiée de manière relative par la méthode des droites standards. Au préalable, des gammes de dilutions de concentrations connues ont été réalisée pour chaque gène (gènes cible et gènes de ménage). Ces gammes ont été réalisées à partir des amplicons de gag, asp, actine beta, rpll9 et hprt obtenus à partir d’une lignée stablement transduite par un clone moléculaire du VIH-1. Ces gammes de dilution de concentrations connues permettent de déterminer la concentration des gènes cibles et des gènes de ménage. L’expression des gènes cibles est ensuite normalisée par le logiciel LightCycler 480 par rapport à celle des gènes de ménage. Le résultat obtenu est exprimé sans unité, et correspond à l’expression relative de gag et d’asp.

[0118] Dans chaque plaque de qPCR, un point de rappel de la gamme de dilution de chaque gène est déposé.

[0119] La température de fusion (Tm) est analysée pour chaque gène dans les échantillons puis comparé à celui obtenu pour la gamme étalon. Cette étape permet de vérifier la spécificité de la séquence amplifiée.

[0120] La concentration de chaque gène est déterminée à l’aide des droites étalons pour chaque échantillon, et l’expression relative des gènes cibles est calculée.

[0121] La figure 2 montre la quantification de la transcription virale antisens obtenue avec la procédure présentée dans l’exemple 1 sur des cellules isolées d’un patient infecté par le VIH et recevant un traitement antiviral (et donc avirémique). On constate que dans les cellules de cet individu, on peut détecter, dès leur isolement, un certain niveau de transcription antisens (J0), spécifique de chaque individu. Au cours de la phase A, les cellules sont stimulées ce qui conduit à un réveil des virus latents. On constate alors une diminution de la transcription antisens (J5). Durant la phase B, l’arrêt de la stimulation cellulaire, et donc de la production virale, est associée à une augmentation de la transcription antisens (J9).

[0122] Exemple 2 : Protocole de la technique LIPS

[0123] Matériel utilisé

[0124] 1) Constructions plasmidiques

[0125] Les expériences de LIPS ont été réalisées avec une protéine ASP recombinante produite dans des HEK 293T. La séquence codante d’ASP utilisée est dérivée du clone moléculaire HXB2 et est donc de sous-type B. Cette séquence a été optimisée pour l’usage de codons en cellules eucaryotes, comme décrit précédemment par Torresilla et coll. (Torresilla et al., 2013). Pour les constructions codant pour les protéines de fusion luciférase-ASP (luei-ASP) et luciférase-p24 (luci-p24), une séquence Flag (DYKDDDDK - SEQ ID NO : 21) a été insérée en amont de T ORF de la luciférase. Pour plus de clarté, les séquences codantes Flag-luci-ASP et Flag-luci-p24 seront nommées luci-ASP et luci-p24 par la suite. Les ORF luci-ASP et luci-p24 ont été insérés dans le plasmide d’expression p-CAGGS, sous le contrôle du promoteur de la β-actine de poulet et de l’enhancer du Cytomegalovirus (CMV) (Niwa et al., 1991).

[0126] 2) Tampons

[0127] Tampon de lyse : 50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl, 1% Triton X100, 50% glycerol et 2 tablettes d’inhibiteurs de protéase pour 50 mL de tampon

[0128] Tampon A : 50 mM de Tris, pH 7.5, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgC12, et 1% de Triton X-100. Une solution mère de Tris à 500 mM pH 7.5 est réalisée. Le tampon A est réalisé extemporanément à partir de cette solution mère. Le tampon A est filtré (0.2 pm) avant utilisation et renouvelé tous les 15 jours. Le pH de la solution mère de Tris est vérifié avant chaque utilisation.

[0129] 3) Réactifs

[0130] - Billes de sépharose couplées à des protéines chimériques A/G (Protein A/G

Ultralink resin, Thermo Scientific).

[0131] - Substrat de la luciférase (Promega).

[0132] Protocole de LIPS.

[0133] 1) Transfection des constructions

[0134] La veille, des HEK 293 T sont ensemencées en plaque 6 puits à une concentration de 1.106 cellules/mL par puits.

[0135] Le lendemain, les HEK sont transfectées avec les constructions suivantes : pCAG-luci, p-CAG-luci-ASP ou p-CAG-luci-p24.

[0136] Une seule construction est transfectée par puits.

[0137] Trois puits sont transfectés pour chaque construction.

[0138] 3pg de chaque construction sont transfectés. Les 3 pg d’ADN sont additionnés de 400pL de NaCl et de 9 pg de Polyethylenimine, incubés 20 minutes à température ambiante puis ajoutés aux puits de HEK correspondants.

[0139] Le milieu de culture est renouvelé 5 à 6h après la transfection.

[0140] 2) Récolte des cellules et lyse

[0141] Le milieu de culture est retiré 48h post-transfection.

[0142] Les cellules sont lavées avec du PBS IX.

[0143] Pour 3 puits transfectés avec la même construction : 700pL de tampon de lyse froid (sorti du -20°C au dernier moment) sont ajoutés à un puits et les cellules sont décollées à l’aide d’un cell scraper. Les 700 pL de tampon et de cellules décollées sont ajoutés au 2e puits et les cellules du 2e puits sont décollées au cell scraper. Cette opération est renouvelée pour le 3e puits.

[0144] Les lysats cellulaires obtenus pour chaque condition (700 pL de lysat correspondent à 3 puits transfectés avec la même construction) sont soniqués dans la glace. 3 puises de 5 secondes espacés de 10 secondes à puissance moyenne (environ 30-40) sont réalisés.

[0145] Les lysats sont ensuite centrifugés 2 fois 4 minutes à 12500 rpm à 4°C.

[0146] A l’issue de cette étape, des lysats cellulaires totaux enrichis dans en protéine recombinante (luciférase, luciférase-ASP ou luciférase-p24) sont obtenus.

[0147] 3) Calcul du nombre de LU (light units) par uL de lysât (LU/uL)

[0148] Des dilutions en série au l/10e de chaque lysat total sont réalisées dans le tampon de lyse en plaque 96 puits (50 pL final par dilution).

[0149] Les dilutions en série réalisées sont placées dans une plaque à fond blanc et le substrat de la luciférase est ajouté. La lecture de la luminescence obtenue, exprimée en LU, est lue par un luminomètre.

[0150] Une droite d’étalonnage correspondant à la luminescence obtenue en fonction du volume de lysat cellulaire présent dans le puits (lysat pur = 1 pL ; lysat dilué au l/10e = 0.1 pL) est réalisée. L’équation de cette droite permet de calculer le nombre de LU obtenus après ajout du substrat de la luciférase pour 1 pL de chaque lysat total (luciférase, luci-ASP et luci-p24).

[0151] Les lysats totaux sont aliquotés puis placés à -80°C.

[0152] A l’issue de cette étape, le volume de lysat total nécessaire à l’obtention d’une luminescence de 10⁷ LU par puits peut être calculé.

[0153] 4) Préparation des plasmas de patients

[0154] Différents échantillons de plasma sont utilisés :

[0155] Des plasmas de patients infectés par le VIH-1.

[0156] Des plasmas de donneurs non infectés fournis par l’Etablissement français du sang.

[0157] Les plasmas de donneurs non infectés et de patients infectés sont dilués au l/10e dans du tampon A contenant. La manipulation des plasmas de patients infectés se fait en laboratoire de confinement de niveau 3 jusqu’à l’ajout du tampon A qui inactive le virus éventuellement présent dans le plasma de patients infectés.

[0158] Les plasmas dilués au l/10e peuvent être conservés un mois à 4°C.

[0159] 5) Réalisation du LIPS

[0160] Chaque échantillon de plasma est analysé en triplicat (dans 3 puits différents). La réaction est réalisée en plaque 96 puits. Trois plaques 96 puits sont successivement utilisées pour le LIPS :

[0161] Une plaque 96 puits transparente à fond plat (plaque 1).

[0162] Une plaque 96 puits transparente à fond conique (plaque 2 ; pour les lavages).

[0163] Une plaque 96 puits blanche à fond plat (plaque 3 ; pour la lecture de la luminescence).

[0164] Utilisation de la plaque 1. Dans chaque puits sont ajoutés :

[0165] 40 pL de tampon A

[0166] 10 pL de plasma de patient ou de donneurs non infectés sont ajoutés.

[0167] 50 pL de lysat total contenant la luciférase seule ou les protéines luci-ASP ou luci16 p24, dilué dans du tampon A de sorte à obtenir 1.10⁷ LU par puits.

[0168] Les échantillons de plasma au préalable dilués au l/10e dans du tampon A sont de nouveau dilués au l/10e dans le puits. Au final, l’équivalent de IpL de plasma non dilué est utilisé dans chaque puits pour une expérience.

[0169] Les plasmas de patients ou de donneurs non infectés sont incubés avec le lysat total contenant la luciférase ou la protéine de fusion luci-ASP/luci-p4 sous agitation pendant Ih, à température ambiante.

[0170] Des billes de sépharose couplées à des protéines chimériques A/G sont ajoutées dans chaque puits. Le volume de billes ajoutées (1.5 pL par puits) a été calculé de sorte à permettre l’immuno-précipitation de toutes les Immunoglobulines G présentes dans 1 pL de plasma humain. La résine de billes utilisée a une capacité de fixation supérieure à 20 mg d’immunoglobulines (Ig) G humaines / mL de billes (Protein A/G Ultralink resin, Thermo Scientific). Les billes et les éventuels complexes luci-ASP/anticorps formés sont incubés Ih à température ambiante.

[0171] Les billes et les éventuels complexes luci-ASP/anticorps formés sont transférés dans la plaque 2 pour réaliser les lavages. Les lavages permettent d’éliminer les protéines luciférase, luci-ASP ou luci-p24 qui n’auraient pas été complexées par des anticorps et immuno-précipitées par les billes. Quatre lavages au tampon A et deux lavages au PBS IX sont réalisés. Lors de chaque lavage, la plaque 2 est centrifugée 2 min à 2000 g. Après le dernier lavage, les complexes billes/anticorps sont repris dans 50 pL de PBS IX.

[0172] Les complexes billes/anticorps repris dans 50 pL de PBS IX sont transférés dans la plaque 3 pour la lecture de la luminescence. Le substrat de la luciférase est ajouté dans chaque puits. La luminescence est lue à 0.1 s au luminomètre.

[0173] Pour chaque expérience, plusieurs puits sont dévolus aux contrôles positifs et négatifs :

[0174] Contrôle négatif : Un point déposé en triplicat correspondant à un plasma de donneur sain.

[0175] Contrôles positifs :

[0176] Une gamme de dilution d’un anticorps reconnaissant l’antigène est ajouté à un plasma de donneur non infecté.

[0177] Un point déposé en triplicat correspondant au lysat total avant immuno-précipitation (INPUT).

[0178] La figure 1 illustre le type de résultats qui peuvent être obtenus avec la méthode LIPS. Elle représente la mesure d’anticorps anti-ASP au sein de plasma de sujets noninfectés (n=15) et de sujets infectés (n=20). En établissant un seuil de positivité permettant d’avoir la meilleure spécificité (le minimum de faux positifs), on constate qu’il y a bien chez le patient infecté le développement d’une réponse anticorps anti17

ASP et que celle-ci peut présenter un niveau variable selon l’individu.

[0179] En complément de la figure 2, les figures 3 et 4 présentent des résultats obtenus lors d’une infection expérimentale de lymphocytes T CD4+ stimulés et de cellules dendritiques isolées et différentiées à partir d’un même sujet sain puis infectées in vitro. Dans les lymphocytes T activés, les inventeurs ont montré que la transcription antisens est indétectable (Laverdure et al.) et donc que la protéine ASP n’est pas produite. L’infection de ces cellules avec un virus incapable de produire ASP, par introduction d’un codon STOP, 12 acides aminés après le codon initiateur, montre que dans ce contexte ASP ne joue logiquement pas de rôle. En effet, on voit que la production du virus mutant (courbe noire) est superposable avec celle du virus sauvage (courbe grise).

[0180] Dans les cellules dendritiques, Les inveteurs ont montré que la transcription antisens était particulièrement active. Lorsque ces cellules sont infectées par le virus mutant incapable de produire ASP, on constate de manière étonnante une production de virus accrue (figure 4, courbe noire) comparativement à celle observée avec le virus sauvage (courbe grise).

[0181] Ces résultats supportent un rôle de la protéine ASP dans le contrôle de la production virale par la cellule infectée. C’est à dire que lorsqu’elle est produite, il en résulte une diminution ou une absence de la production virale. Cette régulation pourrait avoir pour but soit l’évitement de la réponse immunitaire (pour éviter la production d’antigènes viraux qui seraient reconnus) soit l’évitement des effets cytopathiques associés à la production virale et qui conduisent à la mort de la cellule productrice (évitement pour maintenir en vie la cellule réservoir dans cette hypothèse).

[0182] L’ensemble de ces résultats sont donc en faveur de l’invention qui propose d’utiliser ASP, la réponse anti-ASP et la transcription antisens comme paramètres pour l’évaluation du réservoir viral.

[0183] L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.

Claims (1)

1. Revendications [Revendication 1] Méthode d'identification in vitro de cellules réservoirs d'un rétrovirus responsable d'une immunodéficience chez les mammifères, à partir d'un échantillon biologique desdits mammifères ayant été traités avec au moins un agent anti rétroviral, ladite méthode comprenant : - une étape de détermination de la présence ou de l’absence, ou encore de mesure de la quantité d’un composé choisi parmi : o le transcrit anti-sens codant la protéine anti sens ou asp, o la protéine ASP, et o un anticorps spécifique de la protéine ASP, dans ledit échantillon biologique desdits mammifères ayant été traités avec au moins un agent anti rétroviral, - une étape de comparaison de ladite présence ou absence dudit composé, ou encore de comparaison de la quantité mesurée dudit composé à l’étape précédente, avec des échantillons de référence issus de patients non infectés pour la référence de négativité et issu de patients non infectés complémentés par l’étalon synthétique de référence correspondant à la méthode utilisée pour la référence de positivité, et - une étape de détermination de la présence de cellules réservoirs dans ledit échantillon biologique si o ledit composé est présent alors qu’il est absent dans l’échantillon de référence, ou o la quantité dudit composé est au moins égale au seuil défini par l’analyse statistique des échantillons négatifs pour chacune des méthodes fois la quantité observée. [Revendication 2] Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ladite protéine ASP est la protéine ASP du virus de l’immunodéficience humaine, notamment du virus de l’immunodéficience humaine -1 du groupe M. [Revendication 3] Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle l’échantillon biologique est un échantillon de sang, de sérum ou de plasma, et dans laquelle ledit composé est un anticorps spécifique de la protéine ASP. [Revendication 4] Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle l’échantillon biologique est un échantillon de cellules, et dans laquelle ledit composé est le transcrit codant la protéine ASP ou la protéine ASP. [Revendication 5] Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la protéine ASP correspond à la protéine, codée par le gène dont

   l’identifiant est : Gene ID: 19424028. [Revendication 6] Méthode de détermination in vitro de l'efficacité dans un échantillon biologique, d'une thérapie anti rétrovirale sur le réservoir viral de mammifères infectés par un rétrovirus responsable de l'immunodéficience humaine, ladite méthode comprenant : - une étape de détermination de la présence ou de l’absence, ou encore de mesure de la quantité, d’un composé choisi parmi : o le transcrit antisens codant la protéine anti sens ou ASP, o la protéine ASP, ou o un anticorps spécifique de la protéine ASP, dans ledit échantillon biologique, - une étape de comparaison de ladite présence ou absence dudit composé, ou encore de comparaison de la quantité mesurée dudit composé à l'étape précédente, avec des échantillons de référence issus de patients non infectés, pour la référence de négativité, et issus de patients non infectés complémentés par l'étalon synthétique de référence correspondant à la méthode utilisée pour la référence de positivité, et - une étape de détermination de l’efficacité de ladite thérapie antirétrovirale si o ledit composé est absent après thérapie anti rétrovirale alors qu’il était présent dans l’échantillon de référence, ou o la quantité dudit composé varie d’au moins 1,2 fois la limite de précision statistiquement significative de la méthode considérée. [Revendication 7] Méthode selon la revendication 6, dans laquelle ledit échantillon de référence est un échantillon dudit mammifère avant traitement avec ladite thérapie antirétrovirale. [Revendication 8] Méthode selon la revendication 6 ou la revendication 7, dans laquelle ladite protéine ASP est la protéine ASP du virus de l’immunodéficience humaine, notamment du virus de l’immunodéficience humaine -1 du groupe M. [Revendication 9] Kit pour la détection des cellules réservoirs de rétrovirus comprenant : - des moyens de détection d’un composé choisi parmi o le transcrit anti sens codant la protéine anti sens ou ASP o la protéine ASP, ou o un anticorps spécifique de la protéine ASP, et - au moins un échantillon biologique de référence.

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