FR3087091A1 - Procede de fractionnement enzymatique de graines de chanvre - Google Patents

Procede de fractionnement enzymatique de graines de chanvre Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un procédé de fractionnement enzymatique de graines de chanvre, caractérisé en ce qu'il comprend a) une étape d'hydrolyse enzymatique par mise en contact, en milieu aqueux, des graines de chanvre avec une protéase ; b) une étape de récupération de la phase aqueuse, riche en peptides, du mélange obtenu à l'issue de l'étape a) d'hydrolyse enzymatique.

Description

PROCEDE DE FRACTIONNEMENT ENZYMATIQUE DE GRAINES DE CHANVRE
La présente invention a trait à un procédé de fractionnement enzymatique des graines de chanvre (chènevis), permettant une hydrolyse en condition douce et la récupération d’une fraction riche en peptides. Le procédé selon l’invention permet également d’obtenir une fraction huileuse de haute qualité.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les graines de chanvre (chènevis), issues du chanvre industriel (Cannabis sativa) ont une composition nutritionnelle particulièrement intéressante. Elles contiennent en moyenne 25 à 35% de lipides, 20 à 25% de protéines et 10 à 15% de fibres majoritairement non-assimilables. Les protéines issues de ses graines sont principalement du type légumine, l’édestine représentant environ 60 % du total mesuré. L’albumine est la seconde classe de protéine (environ 30 % du total). D’un point de vue nutritionnel, la composition moyenne en acides aminés des graines est complète. Celle-ci inclut 19 acides aminés dont les 9 acides aminés essentiels en proportions équilibrées. La fraction protéique issue des graines de chanvre est en outre exempte de gluten. La fraction lipidique des graines de chanvre est également particulièrement intéressante d’un point de vu nutritionnel. En effet, la fraction lipidique renferme principalement des acides linoléiques, α-linolénique et oléique soit 80 % des lipides extractibles dans l’huile, avec un rapport d’environ 55/20/10. Les 20 % restant comprennent de l’acide palmitique, stéarique et γ-linolénique, et quelques acide gras mineurs tels que l’acide eicosénoique, vaccénique et arachidique, représentant chacun moins de 0,7 % du total de la fraction lipidique. Le rapport de 3/1 qui existe entre l’acide linoléique et linolénique est une caractéristique des graines de chanvre et des huiles qui en sont extraites leur conférant d’excellentes qualités nutritionnelles.
Actuellement, la fraction protéique des graines de chanvre est issue des tourteaux de chènevis déshuilés par extraction par pression à froid puis lavage à l’éthanol, lyophilisation et broyage. Une telle fraction protéique peut donc contenir des traces de solvant organique comme l’éthanol. Récemment, un procédé enzymatique a été développé, faisant intervenir un cocktail d’enzymes destinées à hydrolyser les fibres des graines de chanvre et permettant de récupérer une fraction solide (drèche) riches en peptides et protéines. Cependant, cette fraction riche en peptides et protéines est très peu soluble et comprend un pourcentage élevé d’huile, ce qui la rend peu stable dans le temps.
RESUME DE L’INVENTION
Dans ce contexte, les inventeurs ont développé un procédé de fractionnement enzymatique des graines de chanvre permettant d’en extraire une fraction protéique dépourvue de toute trace de solvant et directement utilisable pour l’alimentation humaine ou animale. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert qu’il est possible d’extraire la fraction protéique des graines de chanvre par extraction douce, en les mettant en contact avec une protéase apte à hydrolyser les protéines contenues dans les graines de chanvre. Selon l’invention, les graines de chanvre sont mises en contact avec une protéase, de préférence alcaline, en milieu aqueux. A Tissue de cette étape de dégradation enzymatique, on obtient une phase aqueuse riche en peptides et protéines sous forme solubilisée, et dépourvue d’huile. En outre, le procédé selon l’invention permet de récupérer une fraction lipidique avec un rendement similaire au rendement par pression à froid et présentant une qualité nutritionnelle identique. La fraction lipidique peut être récupérée indépendamment de la phase aqueuse, afin de fournir une huile de chanvre de haute qualité.
DESCRIPTION DETAILLE DE L’INVENTION
L’invention a donc pour objet un procédé de fractionnement enzymatique de graines de chanvre, caractérisé en ce qu’il comprend
a) une étape d’hydrolyse enzymatique par mise en contact, en milieu aqueux, des graines de chanvre avec une protéase ;
b) une étape de récupération de la phase aqueuse, riche en peptides, du mélange obtenu à Tissue de l’étape a) d’hydrolyse enzymatique.
Selon l’invention, les graines de chanvre sont mélangées avec la protéase et de l’eau de manière à favoriser la réaction enzymatique. Avantageusement, les graines de chanvres sont mélangées avec de l’eau dans un ratio graines de chanvre/eau compris entre 50 et 70% p/p, préférentiellement 60% +/- 10% p/p. Le ratio enzyme/graines de chanvre est avantageusement compris entre 2 et 5% p/p, préférentiellement égal à 3% +/-10% p/p.
Dans un mode de réalisation, la température lors de l’étape a) d’hydrolyse enzymatique est maintenue entre 50°C et 60°C, préférentiellement autour de 55°C. De même, le pH est avantageusement maintenu pendant l’étape a) d’hydrolyse enzymatique entre 7 et 8. Au besoin, il est possible de rajouter une base dans le milieu d’hydrolyse au cours de l’étape a), afin de maintenir le pH dans cette gamme. Par milieu d’hydrolyse, on entend le milieu contenant les graines de chanvre, le liquide et l’enzyme.
L’étape a) d’hydrolyse enzymatique peut être conduite pendant un temps compris entre 2h et 15h, plus préférentiellement un temps compris entre 4h et lOh.
Dans un mode de réalisation, les graines de chanvre sont broyées avant l’étape a) d’hydrolyse enzymatique. Un tel broyage n’est pas indispensable, mais permet de diminuer le temps de réaction et ainsi l’étape a) d’hydrolyse enzymatique, puisque les protéines sont plus directement accessibles après broyage des graines. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention comprend une telle étape de broyage avant l’étape a) d’hydrolyse enzymatique, et ladite étape a) est conduite pendant environ 4h. Dans un autre mode de réalisation, le procédé ne comprend pas une telle étape de broyage préalable des graines de chanvre, et l’étape a) d’hydrolyse enzymatique est conduite pendant environ lOh.
Le procédé selon l’invention se caractérise notamment par l’utilisation d’une protéase, apte à dégrader les protéines contenues dans les graines de chanvre. Avantageusement, l’enzyme utilisée est une protéase alcaline. La température et le pH du milieu de réaction sont avantageusement adaptés en fonction de la protéase utilisée. De telles adaptations sont parfaitement à la portée de l’homme du métier. Dans un mode de réalisation, l’enzyme utilisée est la protéase Alcalase® commercialisée par Novozyme. Le milieu de réaction est alors avantageusement maintenu à une température de 55°C, +/-5°C, et à pH 7,8, +/- 0,5, pendant toute l’étape a) d’hydrolyse enzymatique.
Selon l’invention, il est possible de prévoir une étape a’) d’inactivation de l’enzyme après l’étape a) d’hydrolyse enzymatique. Cette étape d’inactivation de l’enzyme permet de stopper la réaction d’hydrolyse des protéines et peptides contenus dans le milieu de réaction. Dans un mode de réalisation particulier, cette étape a’) d’inactivation de l’enzyme est réalisée par chauffage du milieu de réaction à une température comprise entre 80°C et 100°C, pendant un temps compris entre 5 et 20 minutes, préférentiellement 10 et 15 minutes. Par exemple, le milieu de réaction est chauffé à environ 90°C, +/-5°C, pendant 10 minutes environ à l’issue de l’étape
a) d’hydrolyse enzymatique.
A l’issue de l’étape a’) d’inactivation de l’enzyme, le milieu de réaction est avantageusement refroidi de manière à abaisser la température à environ 55°C, +/-5°C.
Le mélange obtenu à l’issue de l’étape a), et éventuellement de l’étape a’), comprend trois phases : une phase aqueuse, comprenant les protéines et peptides solubilisés, une phase huileuse et une phase solide.
La phase aqueuse peut être récupérée par tout moyen. Notamment, il est possible de laisser décanter le mélange obtenu à l’issue de l’étape a), pendant un temps suffisant pour que la phase solide précipite au fond de la cuve du réacteur, ou tout autre contenant dans lequel l’hydrolyse a été réalisée, pour former un culot, la phase huileuse remonte à la surface et la phase aqueuse se retrouve entre le culot et la phase huileuse. Il est également possible d’accélérer la phase de décantation en procédant à une centrifugation.
A ce stade, la phase aqueuse comprend les protéines et peptides hydrolysés ainsi que des sucres. La phase aqueuse comprend environ 11% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la phase aqueuse. Il est possible de valoriser directement cette fraction, en procédant à une étape c) de séchage de la phase aqueuse, de manière à récupérer une matière sèche composée de peptides, protéines et sucres sous forme de polysaccharides (notamment cellulose et hémicellulose).
L’étape de séchage c) peut être réalisée par tout moyen permettant l’évaporation du liquide, et notamment par chauffage, atomisation, etc.
La matière sèche récupérée comprend environ 70% en poids de peptides et protéines par rapport au poids total de la matière sèche et environ 22% en poids de sucre.
Cependant, cette matière sèche présente un aspect collant, qui peut pour certaines utilisations ultérieures se révéler problématique. Il est donc possible de procéder à une étape de purification additionnelle, de manière à éliminer les sucres et augmenter la concentration en peptides et protéines. Cette étape consiste en une étape d’enrichissement c’), selon laquelle la phase aqueuse est filtrée avant l’étape c) de séchage, ladite étape c) étant mise en œuvre sur le filtrat, de manière à récupérer une matière sèche enrichie en peptides.
L’étape d’enrichissement c’) consiste avantageusement en une microfiltration ou nanofiltration tangentielle en utilisant un filtre dont le seuil de coupure permet de retenir les protéines et d’éliminer les sucres. Par exemple, on utilise un filtre présentant un seuil de coupure compris entre 8.000 et 15.000 Da. Dans un mode de réalisation, le filtre présente un seuil de coupure à 10.000 Da.
Le rendement de filtration est d’environ 70-80% pour les peptides et de 5-10% pour les sucres, en fonction du filtre utilisé. La matière sèche récupérée à partir d’un tel filtrat, ou fraction peptidique enrichie, comprend environ 80% en poids de peptides et protéines par rapport au poids total de la matière sèche et seulement 3% en poids de sucre. En outre, la matière sèche récupérée ne présente plus l’aspect collant que l’on peut constater lorsque les sucres non pas été éliminés. Elle est donc plus facile à travailler et à conserver. Cette fraction peptidique enrichie se présente sous la forme d’une poudre de particules très fines et solubles dans l’eau.
Il est également possible de récupérer la fraction huileuse, afin de la valoriser en huile de chanvre.
Pour cela, selon le procédé de l’invention, on procède à une étape d) de récupération de la phase huileuse du mélange obtenu à Tissue de l’étape a) d’hydrolyse enzymatique. La phase huileuse, qui se trouve au-dessus de la phase aqueuse peut être récupérée par tout moyen et notamment par aspiration.
Avantageusement, une fois la phase huileuse récupérée, on procède à une étape e) de purification, selon laquelle on soumet la phase huileuse à un traitement à chaud à pH compris entre 4 et 5, puis à une centrifugation, à Tissue de laquelle la fraction huileuse est récupérée.
La fraction huileuse récupérée est limpide et brillante et présente les mêmes aspects que ceux d’une huile obtenue par pressage à froid.
Enfin, il est également possible de valoriser le culot, comprenant la matière sèche résiduelle des graines de chanvre. Par exemple, il est possible de récupérer cette matière sèche pour l’alimentation animale, la culture végétale (comme support d’engrais par exemple, la fabrication de biomatériaux, etc.).
EXEMPLES
1- Procédé de fractionnement
Le schéma de procédé ci-après résume les différentes étapes réalisées permettant d’aboutir à une fraction huileuse et une fraction peptidique purifiée :
Matériel & méthode
800 kg de chènevis à 93 % de matière sèche (mesure prise après deux heures à 105°C), 30% de lipides (mesurée par la méthode Soihlets norme NF EN ISO 659) et 23% de protéines (mesurée par la méthode de Kjeldhal).
Protéase alcaline Alcalase® de chez Novozyme.
Le taux d’incorporation des graines de chanvre dans l’eau a été optimisé à 60 % (p/p), la quantité d’enzyme à 3 % (p/p) par rapport à la masse des graines.
Broyage des graines et préparation du mélange - 9 heures
L’étape de broyage permet de réduire le temps de l’étape ultérieure d’extraction enzymatique, en rendant les protéines plus directement accessibles aux enzymes.
L’étape de broyage est réalisée au moyen d’un broyeur à marteaux. Bien entendu, tout autre moyen permettant de broyer les graines de chanvre peut être utilisé. Il est également possible de décortiquer les graines et de ne broyer que les amandes.
Une fois les graines broyées, elles sont introduites dans un réacteur et de l’eau est ajoutée dans les proportions eau/graines de chanvre de 60/40 en poids par rapport au poids total du mélange. La température est stabilisée à 55°C et le pH à 7,8 par ajout de NaOH IN.
Extraction enzymatique - 4 heures
L’objectif de cette étape est de dégrader les graines de chanvre broyées pour en libérer les fractions lipidiques, protéiques et aqueuse afin de préparer leur séparation. L’enzyme utilisée est la protéase Alcalase® de Novozyme dont l’activité est maximale à 55°C et pH de 7,8. Elle permet de solubiliser les protéines dans l’eau en les coupants.
La quantité d’enzyme ajoutée est égale à 3% (p/p) du poids de graines de chanvre. La réaction enzymatique entraîne une acidification du milieu de réaction et augmente la température du milieu. Pour surveiller les fluctuations d’acidité, une sonde pH est installée. L’ajustement du pH à 7,8 +/-0,1 s’effectue par ajout de soude concentrée à 10%. La température est également surveillée et ajustée pour être maintenue à 55°C.
Le contenu de la cuve est maintenu sous agitation pendant 4 heures.
Inactivation de l’enzyme - 2 heures
Une fois l’étape d’hydrolyse enzymatique effectuée, la protéase est désactivée en chauffant le milieu de réaction pendant 10 minutes à 90°C. Le mélange est ensuite laissé à refroidir jusqu’à retrouver une température constante de 50°C environ.
Séparation des phases - 2 heures
Cette étape permet de séparer le produit obtenu précédemment par l’action des enzymes sur le chènevis en trois phases : drèche ou culot, phase huileuse et phase aqueuse.
Le mélange est introduit dans un décanteur à 3 phases, Andritz®, et soumis à une centrifugation à 8000 rpm pendant 20 minutes, à l’issue de laquelle on obtient les trois phases.
La phase huileuse est retirée à l’aide de pipettes tubulaires. Dans ces conditions, la phase huileuse récupérée s’apparente à une émulsion qu’il est nécessaire de rompre de manière à obtenir une huile parfaitement homogène. Pour cela, un traitement à chaud de l’émulsion à pH légèrement acide, suivi d’une centrifugation, est effectué. Le pH de la phase huileuse est ajusté à pH 4,5 par ajout de HCl IN, et maintenue sous agitation à 50°C pendant 15 minutes. La phase huileuse est ensuite soumise à une centrifugation à 8000 rpm pendant 20 minutes, à l’issue de laquelle la fraction huileuse est récupérée.
Seconde séparation - 30 minutes
Une fois la phase huileuse retirée, la phase aqueuse et le culot passent dans un décanteur 2 phases (Flottweg® Z23-3) pendant 2 heures, afin de séparer le liquide des drèches résiduelles non éliminées précédemment.
On obtient ainsi une phase aqueuse dépourvue de drèches résiduels.
Filtration tangentielle (Microfiltration) - 3 heures
Cette étape permet d’assainir le produit et de réduire la biocharge. La filtration tangentielle est réalisée par un module de microfiltration Orelis-Kerasep®. Et une membrane filtrante présentant un diamètre de pores de 0,2pm. Grâce à un gradient de pression, le liquide est filtré par les pores de la membrane de manière perpendiculaire. Les éléments ayant un diamètre supérieur à 0,2 pm ne passent pas les pores et sont retenus au sein de la membrane. Des prélèvements sont faits au sein de la cuve d’entrée et de la cuve de sortie, pour ensuite être analysés au niveau microbiologique.
Concentration en peptides - 3 heures
La fraction aqueuse peut faire l’objet d’une étape de concentration par ultrafiltration tangentielle, de façon à pouvoir enrichir sa teneur en peptides. Une membrane de seuil de coupure de 10 000 Da permet de retenir les peptides présents dans l’extrait et d’éliminer les sucres. Les peptides sont ainsi concentrés dans le rétentat et les sucres sont éliminés avec le perméat.
Séchage : concentration par évaporation - 9 heures
L’étape de séchage est réalisée par évaporation à basse pression au moyen d’un évaporateur à triple effets. Afin de préserver l’intégrité de protéines issues de la graine de chanvre, l’évaporateur fonctionne sous vide. Ainsi, la pression exercée au sein de la machine est diminuée et les températures de chauffage nécessaires pour l’évaporation sont plus faibles. Pour sécher le produit et obtenir une poudre fluide, on procède à une atomisation, permettant une déshydratation du liquide sous forme de poudre par passage dans un flux d’air chaud.
2- Caractérisation de la fraction huileuse et de la fraction peptidique
Fraction huileuse
Le rendement d’extraction de la fraction huileuse est de 65 % (p/p) environ, résultat similaire à l’extraction par pressage. L’huile obtenue est très limpide et brillante. Elle possède la même coloration verte naturelle que l’huile obtenue par pressage.
Les résultats analytiques réalisés selon la méthode officielle de l’AOCS (American Oil Chemists’Society) montrent que la qualité de l’huile de chanvre obtenue par voie enzymatique est très bonne, dans la mesure où les indices de peroxyde et d’acide sont faibles. Il n’y a donc ni oxydation des acides gras insaturés, ni hydrolyse des triglycérides lors du procédé d’obtention de l’huile par cette méthode. D’autre part, la composition en acides gras est conforme au profil habituellement obtenu pour l’huile de chanvre.
Fraction peptidique
De façon à pouvoir caractériser les peptides de la fraction peptidique (obtenue après concentration par ultrafiltration et séchage de la phase aqueuse), un aminogramme de cet extrait enrichi a été réalisé.
Les résultats, reproduits dans le tableau 1 ci-dessous, sont conformes à ce qui est habituellement observé avec un aminogramme de protéines de graines de chanvre. Le procédé d’hydrolyse enzymatique selon l’invention ne modifie donc pas la composition en acides aminés des protéines de chanvre.
Tableau 1 : Composition en acides aminées
Acide aminé Poudre de chanvre Moyenne bibliographique sur 10 variétés en % Fraction peptidique selon l’invention en %
ASP Asparagine 10,7 11
THR Thréonine 3,92 3,5
SER Sérine 5,06 5,5
GLU Glutamate/glutamine 17,7 19,9
PRO Proline 4,65 4
GLY Glycine 4,85 4,3
ALA Alanine 4,71 4,9
CYS Cystéine 2,02 1,2
VAL Valine 5,56 5,5
MET Méthionine 2,58 2,6
ILE Isoleucine 4,22 4,2
LEU Leucine 6,84 6,8
TYR Tyrosine 3,36 3,9
PHE Phénylalanine 4,74 4,2
HIS Histidine 2,72 2,8
LYS Lysine 3,83 3,5
ARG Arginine H,4 11,1
TRP Tryptophane 1,14 1,1
3- Evaluation de l’hydrosolubilité de la fraction peptidique
La solubilité dans l’eau de la fraction peptidique des poudres (obtenue après concentration par 5 ultrafiltration et séchage de la phase aqueuse) a été évaluée et comparée à celle d’une poudre de protéines de chanvre du marché et d’une fraction peptidique obtenue à partir de graines de chanvre par une méthode d’extraction CO2 supercritique.
Méthode
2g de fraction peptidique ou de farine de chanvre sont ajoutés dans un verre à 130g d’eau minérale naturelle des Alpes Thonon®. Le mélange a été laissé à reposer 1 minute, puis mélangé à l’aide d’une cuillère puis de nouveau laissé à reposer une minute.
L’aspect visuel des mélanges a été comparé.
Résultats
Fraction CO2 supercritique
La fraction a une couleur marron foncé. La matière se disperse très peu. La moitié de la fraction reste à la surface du liquide tandis que l’autre moitié tombe au fond du verre. L’eau reste claire.
La cuillère qui a servi à mélanger est couverte de quelques coques.
Poudre de la marque HEMP PRO 70
La fraction a une couleur uniforme, d’un beige clair. La poudre reste en suspension. Le liquide est très opaque. On observe une sédimentation de 1,3 cm au fond du verre.
Fraction peptidique selon l’invention
La fraction a une couleur uniforme, d’un beige moyen. La poudre est entièrement soluble. On observe aucune sédimentation au fond du verre. La cuillère qui a servi à mélanger est propre, sans aucune trace.

Claims (12)

  1. REVENDICATIONS
    1. Procédé de fractionnement enzymatique de graines de chanvre, caractérisé en ce qu’il comprend
    a) une étape d’hydrolyse enzymatique par mise en contact, en milieu aqueux, des graines de chanvre avec une protéase ;
    b) une étape de récupération de la phase aqueuse, riche en peptides, du mélange obtenu à Tissue de l’étape a) d’hydrolyse enzymatique.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de broyage des graines de chanvre avant l’étape a) d’hydrolyse enzymatique.
  3. 3. Procédé selon Tune quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape c) de séchage de la phase aqueuse, de manière à récupérer une matière sèche composée de peptides, protéines et sucres.
  4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu’il comprend une étape d’enrichissement c’) selon laquelle la phase aqueuse est filtrée avant l’étape c) de séchage, ladite étape c) étant mise en œuvre sur le rétentat, de manière à récupérer une matière sèche enrichie en peptides.
  5. 5. Procédé selon Tune des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape d) de récupération de la phase huileuse du mélange obtenu à Tissue de l’étape a) d’hydrolyse enzymatique.
  6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu’il comprend une étape e) de purification de la phase huileuse, selon laquelle on soumet la phase huileuse à un traitement à chaud à pH compris entre 4 et 5, puis à une centrifugation à Tissue de laquelle la fraction huileuse est récupérée.
  7. 7. Procédé selon Tune des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de centrifugation du mélange obtenu à Tissue de l’étape a) d’hydrolyse, de manière à séparer la phase aqueuse, la phase huileuse et la phase solide dudit mélange.
  8. 8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les graines de chanvres sont mélangées avec de l’eau dans un ratio graines de chanvre/eau compris entre 50 et 70% p/p, préférentiellement 60% +/-10% p/p pour la mise en œuvre de l’étape a) d’hydrolyse enzymatique.
    5
  9. 9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ratio enzyme/graines de chanvre pour la mise en œuvre de l’étape a) d’hydrolyse enzymatique est compris entre 2 et 5% p/p, préférentiellement égal à 3% +/-10% p/p.
  10. 10. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape a) d’hydrolyse enzymatique est mise en œuvre à une température comprise entre 50°C et 60°C, et
    10 un pH compris entre 7 et 8.
  11. 11. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape a’) d’inactivation de l’enzyme après l’étape a) d’hydrolyse enzymatique, préférentiellement par chauffage du mélange obtenu à l’étape a) à une température comprise entre 80°C et 100°C.
  12. 15 12. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéase est une protéase alcaline.
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