FR3086668A1

FR3086668A1 - Production cellulaire de pures nanoparticules d'oxyde de fer

Info

Publication number: FR3086668A1
Application number: FR1801034A
Authority: FR
Inventors: Edouard Alphandery
Original assignee: Nanobacterie
Current assignee: Nanobacterie
Priority date: 2018-10-02
Filing date: 2018-10-02
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2038-10-02
Also published as: FR3086668B1

Abstract

L'invention concerne une méthode de production de nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté à l'aide de cellules productrices des nanoparticules, comprenant: i) Une étape de pré-croissance consistant à amplifier la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules dans un milieu de pré-croissance de telle sorte que la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules ne produisent pratiquement pas de nanoparticules, et ii) Une étape de croissance consistant à amplifier la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules provenant de l'étape de pré-croissance dans un milieu de croissance tel que la ou les cellule(s) productrice(s) des nanoparticules produisent des nanoparticules.

Description

PRODUCTION CELLULAIRE DE PURES NANOPARTICULES D’OXYDE DE FER

Domaine de P invention

Le domaine de l’invention est celui d’une production biologique de nanoparticules comprenant une faible quantité d’impuretés.

Arrière-plan technique

Les bactéries produisant des nanoparticules, telles que les bactéries magnétotactiques, sont connues pour accumuler des impuretés dans leur structure cristallisée. Par exemple, lorsque des bactéries magnétotactiques sont cultivées en présence de cobalt, elles produisent des magnétosomes comprenant de l'oxyde de fer et du cobalt (S. Staniland et al., Nature nanotechnology, V. 3, P. 158 (2008)). Pour les applications médicales, il est souhaitable que les nanoparticules contiennent un faible niveau d'impuretés toxiques telles que le cobalt.

Description de Pinvention

L'invention concerne une méthode de production de nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté à l'aide de cellules produisant des nanoparticules, comprenant:

i) une étape de pré-croissance consistant à amplifier la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules dans un milieu de pré-croissance de telle sorte que la ou les cellules produisant des nanoparticules ne produit ou produisent pratiquement pas de nanoparticules, et ii) une étape de croissance consistant à amplifier la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules provenant de l'étape de pré-croissance dans un milieu de croissance tel que la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules produit ou produisent des nanoparticules. Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les nanoparticule(s) selon l'invention est ou sontun/des ensembles de plus de 1, 2, 5, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ nanoparticules, nanoparticules par litre de milieu de croissance ou nanoparticules par cellule productrice de nanoparticules. Dans certains cas, l’oxyde de fer représente ou est un assemblage de plus de 1, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ atomes de fer et/ou plus de 1, 10, 10³, 105, ΙΟ¹⁰, 1O²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ atome (s) d'oxygène. Dans certains autres cas, le/les éléments chimiques et/ou la/les impureté(s) compris dans les nanoparticules est/ sont ou représente(nt) plus de 1, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ élément(s) chimique(s) et/ou impureté (s) compris dans la/les nanoparticule(s).

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la ou les nanoparticules selon l'invention sont des ensembles de moins de 1O¹⁰⁰, 10⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 100, 50, 10, 5 ou 2 nanoparticule(s), nanoparticule(s) par litre de milieu de croissance ou nanoparticules par cellule productrice de nanoparticules. Dans certains cas, l’oxyde de fer est ou représente un ensemble de moins de 1, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 1O⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ atomes de fer et/ou moins de 1, 10, ΙΟ³, ΙΟ⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 1O⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ atome (s) d'oxygène. Dans encore d’autres cas, le ou les éléments chimiques et/ou la/les impuretés compris dans les nanoparticules est/sont ou représente(nt) moins de ΙΟ¹⁰⁰, ΙΟ⁵⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, ΙΟ⁵, 10³, 100, 50, 10, 5 ou 2 éléments chimiques et/ou impuretés compris dans les nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins une impureté est comprise dans la nanoparticule.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté comprennent une faible quantité d'impureté(s), par exemple lorsque la méthode permet d'obtenir des nanoparticules avec une faible quantité d'impureté. Dans certains cas, la ou les nanoparticules ne comprend pas ou ne comprennent pas au moins une impureté ou comprennent au moins ΙΟ⁵⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, ΙΟ⁵, 10², 10, 5, 2, 5, 1, ΙΟ'², ΙΟ'¹⁰, 1O'²⁰ ou 1O'⁵⁰impureté(s) ou impureté(s) par gramme de nanoparticules ou gramme d’impureté(s) par gramme de nanoparticules. Dans d'autres cas, le pourcentage, préférentiellement en masse, d'impureté (s) compris (s) à l'intérieur ou à la surface de la ou des nanoparticules est inférieur à 100, 90, 80, 70, 60, 50, 30, 20, 10, 5, 1, 0,1 ou 0,001%. Selon l'invention, ce pourcentage d'impureté (s) peut dans certains cas être défini comme le rapport entre le nombre d'atomes, la quantité, la masse ou le volume d'impureté(s) compris dans la ou les nanoparticules divisé par le nombre total d'atomes, de quantité, de masse ou de volume de tous les éléments chimiques contenus dans les nanoparticules. Dans certains cas, tous les éléments chimiques contenus dans la ou les nanoparticules peuvent être la somme de l’oxyde de fer, du matériau dopant et de l’impureté ou des impuretés comprises dans la ou les nanoparticules. Dans d’autres cas encore, la concentration de la ou des impuretés à l’intérieur ou à la surface de la ou des nanoparticules est inférieure à 10⁵⁰, 10³⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 500, 100, 50, 10, 1, 10’¹, 10'³, 10'⁵, 10'¹⁰ ou 10'⁵⁰ pg d’impureté(s) par gramme de nanoparticule(s).

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté comprennent une grande quantité d'impureté(s), par exemple lorsque la ou les impuretés sont ajoutées ou incorporées aux nanoparticules après la production des nanoparticules par la méthode. Dans certains cas, les nanoparticules comprennent plus de 10' ⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'², 1, 2, 5, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, 1O²⁰ ou 10⁵⁰ impuretés ou impuretés par gramme de nanoparticules ou gramme d'impuretés par gramme de nanoparticules. Dans certains cas, les nanoparticules comprennent une grande quantité d'impureté (s). Dans certains cas, le pourcentage, préférentiellement en masse, de la ou des impuretés comprises à l'intérieur ou à la surface de la ou des nanoparticules est supérieur à ΙΟ'⁴⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, 10'⁵, 10' ², 10'¹, 1,5, 10, 25, 50, 75, 80 ou 90%. Dans d’autres cas encore, la concentration d’impuretés dans ou à la surface des nanoparticules est supérieure à ΙΟ'¹⁰⁰, ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, 10'³, 10' , 10' , 1, 10, 50, 100, 10 , 10 ou 10 pg d’impureté (s) par gramme de nanoparticule(s).

Dans certains cas, les impuretés peuvent être les mêmes impuretés, c'est-à-dire préférentiellement des impuretés comprenant les mêmes éléments chimiques.

Dans certains autres cas, les impuretés peuvent être différentes impuretés, c'est-à-dire préférentiellement des impuretés comprenant au moins un élément chimique différent.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le ou les élément(s) chimique(s) est ou sont choisis dans le groupe comprenant: actinide, actinium, aluminium, américium, antimoine, argon, arsenic, astatine, baryum, béryllium, bismuth, bismuth, bohrium, bore, brome , césium, calcium, californium, carbone, cérium, chlore, chrome, cobalt, copernicum, cadmium, cuivre, curium, darmstadtium, dubnium, dysprosium, einsteinium, erbium, europium, fermium, fleovium, fluor, francium, gadolinium, gallium, germanium , or, hafnium, hélium, hessium, holmium, hydrogène, indium, iodure, iridium, fer, krypton, lanthanide, lanthane, lawrencium, plomb, lithium, livermorium, lutétium, magnésium, manganèse, meganium, meitherium, mendelevium, mercure, molybdène , néon, néptunium, nickel, niobium, azote, nobelium, osmium, oxygène, palladium, phosphore, platine, plutonium, polonium, potassium, praséodyme, proctactinium, prométhium, radium, radon, rhénium, rhodium, rhodium, roentgenium, rubidium, ruthénium , samarium, sélénium, silicium, argent, sodium, strontium, soufre, scandium, seaborgium, tellure, terbium, thorium, thulium, étain, tantale, technétium, thallium, titane, tungstène, ununoctium, ununpentium, ununseptium, ununseptium, ununtrium, uranium, vanadium, xénon, ytterbium, yttrium, zinc, zirconium, et une combinaison de plusieurs de ces éléments chimiques.

L'invention concerne également le procédé selon l'invention, dans lequel la ou les impureté(s) est ou sont au moins un élément chimique différent du fer, de l'oxygène et/ou de l'oxyde de fer.

L'invention concerne également le procédé selon l'invention, dans lequel l'impureté est préférentiellement du carbone ou un matériau carboné.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le matériau carboné comprend au moins un atome de carbone, préférentiellement mais non nécessairement mélangé ou assemblé avec un autre élément chimique que le carbone.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, le carbone ou le matériau carboné provient de ou est produit par des cellules productrices de nanoparticules.

L'invention concerne également le procédé selon l'invention, dans lequel la ou les nanoparticules obtenues par la méthode comprend ou comprennent un ou plusieurs oxydes de fer, l'oxyde de fer ayant au moins l'une des propriétés suivantes: i), il comprend au moins un atome de fer et un atome d'oxygène, ii), il forme une structure cristallisée ou minérale, iii), il peut avoir la formule chimique FeO, FeO₂, Fe₃O₄, Fe₄O₅, Fe₅O₆, Fe₅O₇, Fe₂₅O₃₂, Fei₃0i₉, aFe₂O₃, P-Fe₂O₃, y-Fe₂O₃, £-Fe₂O₃, iv), il peut être composé de wüstite, de dioxyde de fer, de magnétite, d'hématite, de maghémite, v), il peut être dans la phase epsilon, la phase alpha, la phase bêta, la phase gamma, vi), il peut être à divers niveaux d'oxydation,, vii), il a la formule Fe_aOpD_y, où α, β et/ou γ est/sont des coefficients, préférentiellement stoechiométriques. Dans certains cas, α, β, et/ou γ est/sont égal/égaux à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19 ou 20. Dans d’autres cas, α, β, et/ou γ est/sont plus grand(s) que 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19 ou 20. Dans encore d’autres cas, α, β, et/ou γ est/sont plus faible(s) que 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19 ou 20. Dans d’autres cas, D est le matériau dopant des nanoparticules. Dans certains cas, In some cases, le matériau dopant peut être sélectionné parmi: Aluminium, antimonite, baryum, chrome, cuivre, or, manganèse, argent, étain, titane, et zinc.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'oxyde de fer contenu dans les nanoparticules est l'élément chimique prédominant de la nanoparticule. Dans certains cas, les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté peuvent comprendre une grande quantité d'oxyde de fer. Dans certains cas, le pourcentage, préférentiellement en masse, d'oxyde de fer compris dans la ou les nanoparticules est supérieur à 1O'⁴⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, ΙΟ'², 10'¹, 1. 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 99 ou 99,9%. Selon l'invention, ce pourcentage d'oxyde de fer peut dans certains cas être défini comme le rapport entre le nombre d'atomes, la quantité, la masse ou le volume d'oxyde de fer dans la ou les nanoparticules divisé par le nombre total d'atomes, la quantité, masse ou volume de tous les éléments chimiques contenus dans les nanoparticules. Dans d’autres cas encore, la concentration en oxyde de fer, comprise dans la ou les nanoparticules, est supérieure à 1O'¹⁰⁰, 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, ΙΟ'², 10’¹, 1,10, 50, 100, 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ pg d'oxyde de fer, par gramme de nanoparticule(s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté comprennent une faible quantité d'oxyde de fer, par exemple lorsque les nanoparticules sont traitées et/ou partiellement ou totalement détruites et/ou administrées à un organisme, ou lorsque la méthode ne permet pas d'incorporer une grande quantité d'oxyde de fer dans les nanoparticules. Dans certains cas, le pourcentage, préférentiellement en masse, d'oxyde de fer compris à l'intérieur ou à la surface de la ou des nanoparticules est inférieur à 100, 90, 80, 70, 50, 30, 10, 5, 1, 0,1 ou 0,001%. Dans certains autres cas, la concentration en oxyde de fer, comprise dans la ou les nanoparticules, peut être inférieure à 10⁵⁰, 10³⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 5 00, 100, 50, 10, 1, 10'¹, 10'³, 10'⁵, 10'¹⁰ ou 10'⁵⁰ pg d'oxyde de fer par gramme de nanoparticule(s).

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le pourcentage, la concentration, le nombre d'atomes, la quantité, la masse ou le volume d'oxyde de fer compris dans la ou les nanoparticules est plus grand, préférentiellement d'un facteur 1,00001, 1,001, 1,1, 2, 5, 10, 50, 10,10,10,10 ,10 ou 10 , que le pourcentage, la concentration, le nombre d'atomes, la quantité, la masse ou le volume d'impureté (s) compris dans la ou les nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'oxyde de fer et/ou les impuretés est/sont compris: i), à l'intérieur de la ou des nanoparticule(s), ii), à la surface de la ou des nanoparticule(s), iii), à l'extérieur de la ou des nanoparticule(s), iv), insérées dans la structure cristalline ou amorphe de la ou des nanoparticule(s), iii), dans un défaut de la ou des nanoparticule(s), et/ou iv), dans une vacance de la ou des nanoparticule(s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'oxyde de fer et/ou les impuretés sont en interactions, par exemple des interactions avec la(les) nanoparticules électrostatiques, fortes, faibles, nucléaires, métalliques, de Van der Waals, de Debye, de London ou hydrogène(s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'oxyde de fer et/ou les impuretés est/sont situé(s) à une distance inférieure de la/des nanoparticule(s), préférentiellement du centre ou de la surface de la ou des nanoparticule(s), qui est inférieure à 10⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 100, 10, 5 ou 1 nm. Dans certains cas, le centre des nanoparticules est la région ou le volume ou l'emplacement ou l'assemblage d'éléments chimiques situé au centre de la dimension la plus grande, la plus basse et/ou moyenne de la nanoparticule, telle que la moitié du diamètre d'une nanoparticule sphérique ou la moitié de la plus grande, la plus petite et/ou moyenne longueur d’une nanoparticule. Dans d'autres cas, la surface des nanoparticules est la région ou l'emplacement ou l'assemblage des éléments chimiques qui se trouve à la plus grande distance du centre de la nanoparticule tout en restant dans la nanoparticule.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, l'oxyde de fer et/ou les impuretés est/sont situé(s) à une distance des nanoparticules, préférentiellement du centre ou de la surface de la ou des nanoparticules, supérieure à 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 10³, 10⁵, 10¹⁰, 1O²⁰ ou 10⁵⁰ nm.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la ou les nanoparticules selon l'invention comprend ou comprennent un noyau et/ou un revêtement qui entoure(nt) préférentiellement le noyau de la ou des nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le noyau et/ou le revêtement de la ou des nanoparticules possède(nt) au moins une propriété commune avec les nanoparticules telle que la concentration en oxyde de fer et/ou en impureté(s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les nanoparticules, le cœur et/ou le revêtement de la ou des nanoparticules, présente(nt) au moins l'une des propriétés suivantes:

(a) Un/des comportement(s) ou propriété(s) magnétique(s), diamagnétique(s), superparamagnétique(s), ferromagnétique(s), ferrimagnétique(s) et/ou paramagnétique(s), observé(s) de préférence sous l’application d’un champ magnétique d’intensité supérieure à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'⁴⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, 10'² ou 10'¹ T, de préférence observés à des températures inférieures à 1O¹⁰, 10⁵, 10³, 10², 10 ou 1 K. Dans certains cas, le noyau peut avoir différentes propriétés magnétiques que celles du revêtement. Par exemple, le noyau peut être ferromagnétique ou superparamagnétique tandis que le revêtement peut être diamagnétique ou paramagnétique.

(b) une partie ou structure cristalline comprenant au moins 1,2, 5, 10, 50, 100, 10³, 10⁵, 10⁷, ΙΟ⁹, 1O²⁰ ou 10⁵⁰ plan(s) cristallin(s) ou structure(s) cristalline(s) ordonnée(s), que l'on peut de préférence observer ou mesurer en microscopie électronique. Dans certains cas, le noyau peut avoir une structure cristalline différente de celle du revêtement. Par exemple, le noyau peut comprendre plus de 1, 5, 10, 10³ ou 10⁵ plan(s) cristallin(s) ou structure(s) ordonnée(s) cristalline(s) tandis que le revêtement peut avoir moins de 10⁵, 10³, 10, 5 ou 2 plans cristallins ou structures ordonnées.

(c) , une composition constituée de métal/métaux ou d'oxyde(s) métallique(s), préférentiellement de l'oxyde de fer, plus préférentiellement de la maghémite et/ou de la magnétite. Dans certains cas, le noyau comprend une composition différente de celle du revêtement. Par exemple, le noyau comprend plus de 1, 5, 10, 25, 50, 75, 90, 95 ou 99 pourcent ou pourcent en masse d’oxyde de fer alors que le revêtement comprend moins de 99, 95, 90, 75, 50, 10, 5 ou 1 pourcent ou pourcent en masse d’oxyde de fer. Ce pourcentage peut être le rapport entre la quantité, le volume, le nombre d'atomes, la masse d'oxyde de fer compris dans le noyau et/ou le revêtement divisé par la quantité totale, le volume total, le nombre total d'atomes, la masse totale de tous les éléments chimiques compris dans le noyau et/ou le revêtement.

(d) , un mono-domaine ou mono-domaine magnétique, (e) , une microstructure magnétique, qui peut être caractérisée par la présence de lignes de champ magnétique, qui peuvent être orientées dans une direction préférentielle telle qu'un axe de facile aimantation ou une direction cristallographique du noyau de la ou des nanoparticules, [111], où une telle microstructure magnétique peut dans certaines conditions être observable, notamment par holographie électronique, (f) , une taille comprise entre 1 nm et 10⁵ pm, 1 nm et 10³ pm, 1 nm et 100 pm, 1 nm et 10 pm, 1 nm et 1 pm, 5 nm et 1 pm, 5 et 500 nm, 5 et 250 nm, 5 et 100 nm, 5 et 80 nm, 5 et 60 nm, 10 nm et 1 pm, 10 et 500 nm, 10 et 250 nm, 10 et 100 nm, 10 et 80 nm 10 et 60 nm, 15 nm et 1 pm, 15 et 500 nm, 15 et 250 nm, 15 et 100 nm, 15 et 80 nm, 15 et 60 nm, 20 nm et 1 pm, 20 et 500 nm, 20 et 250 nm, 20 et 100 nm, 20 et 80 nm, ou entre 20 et 60 nm, (g) , une taille dans certains cas supérieure à 0,1, 1,2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nm, (h) , une taille dans certains autres cas inférieure à 10¹⁰, 10⁵, 10⁴, 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 100, 95, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 nm, (i) un potentiel zêta, une charge ou charge de surface comprise entre -10¹⁰ mV et 10¹⁰ mV, 10⁵ mV et 10⁵ mV, -10⁴ mV et 10⁴ mV, -10³ mV, -10² mV et 10² mV, -10 et 10 mV, préférentiellement à pH compris entre 0 et 14, 1 et 13, 2 et 12, 3 et 11, 4 et 10, 5 et 9, ou entre 6 et 8.

(j) un potentiel zêta, une charge ou une charge de surface, qui est dans certains cas supérieure à -10⁵⁰, -10²⁰, -10¹⁰, -10⁵, -10³, -10, -5, -1, 0, 5, 10,20, 50 ou 100 mV, de préférence à un pH supérieur à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13.

(k) un potentiel zêta, une charge ou une charge de surface, qui est dans certains cas supérieure à -10⁵⁰, -10²⁰, -10¹⁰, -10⁵, -10³, -10, -5, -1, 0, 5, 10, 20, 50 ou 100 mV, de préférence à un pH inférieur à 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0.

(l) un potentiel zêta, une charge ou une charge de surface, qui est dans certains cas inférieure à 10⁵⁰, 10²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 10, 5, 1, 0, -5, -10, -20, - 50 ou -100 mV, de préférence à un pH supérieur à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13.

(m) un potentiel zêta, une charge ou une charge de surface, qui est dans certains cas inférieure à ΙΟ⁵⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, 10⁵, 103, 10, 5, 1, 0, -5, -10, -20, - 50 ou -100 mV, de préférence à un pH inférieur à 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0.

(n) , un point isoélectrique compris entre 0 et 14, 1 et 13, 2 et 12, 3 et 11, 4 et 10, 5 et 9, ou entre 6 et 8, (o) , dans certains cas, un point isoélectrique supérieur à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, et/ou (p), dans certains autres cas, un point isoélectrique dans certains autres cas inférieur à 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le noyau et/ou le revêtement est/sont synthétisés par la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le noyau et/ou le revêtement n'est ou ne sont pas synthétisé(s) par la ou les cellule(s) productrice de nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules, également appelée(s) cellule(s) produisant des nanoparticules ou la(les) cellule(s), est/sont une/des cellule(s) eucaryote(s) ou procaryote(s). Dans certains cas, il s'agit de la ou des cellules produite(s) par, comprise(s) ou amplifiée(s) dans le ou les milieux de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, moins de 100, 80, 70, 50, 10, 20, 10, 5, 2, 1, 0,1 ou 10'¹⁰% des cellules productrices de nanoparticules comprennent ou produisent au moins une nanoparticule. Dans certains cas, ce pourcentage peut être le rapport entre le nombre de cellules comprises dans le/les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance et comprenant ou produisant au moins une nanoparticule divisé par le nombre total de cellules dans le/les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, plus de 100, 80, 70, 50, 10, 20, 10, 5, 2, 1, 0,1 ou 10'¹⁰% de cellules productrices de nanoparticules comprennent ou produisent au moins une nanoparticule.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules est/sont une/des cellule(s) entière(s).

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules est/sont des parties de la ou des cellule(s) telles que membrane cellulaire, vésicule, enzyme, protéine, lipide, ADN, ARN, organite, compartiment, cytoplasme, virus, compris dans, provenant de, se répliquant dans, ou produits par la ou les cellules synthétisantes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les nanoparticules synthétisée(s) par la ou les cellule(s) est/sont appelée(s) nanoparticule(s) synthétisée(s) par la/les cellule(s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules synthétisent la ou les nanoparticules à l'intérieur de la ou des cellule(s). Préférentiellement, une ou plusieurs nanoparticule(s) est/sont synthétisée(s) à l'intérieur d'une ou de plusieurs cellule(s) lorsqu'elle(s) est/sont synthétisée(s), assemblée(s), cristallisée(s), en tout ou en partie: i), par ou dans ou près ou à l'intérieur d'une partie de la cellule telle qu'un organite, une vésicule ou un appareil de Golgi , endosome, exosome, ribosome, réticulum endoplasmique, filament d'actine, noyau, peroxysome, microtubule, lysosome, mitochondrie, filament, centrosome, flagelle ou membrane cellulaire, ii) dans une région située à l'intérieur de la ou des cellule(s), ou iii) dans une région située à une distance d'une partie de la ou des cellules inférieure à 10⁵, 10³, 100, 10 ou 1 nm.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules synthétise(nt) la ou les nanoparticules à l'extérieur de la ou des cellules. Préférentiellement, la ou les nanoparticule(s) est/sont synthétisée(s) en dehors de la ou des cellule(s) lorsqu'elle(s) est/sont synthétisée(s), assemblée(s), cristallisée(s), partiellement ou totalement: i) dans une région située à l'extérieur de la ou des cellule(s), ou ii) dans une région située à une distance d'une partie de la ou des cellule(s) plus grande que 1, 10, 100, 10³ ou 10⁵ nm.

Dans certains cas, la ou les cellule(s) est/sont des assemblages de plus de 1, 10, 10³, 10⁵, 10¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ cellules, de préférence par litre de milieu de culture. Dans certains autres cas, la/les cellule(s) est/sont des assemblages de moins de 1O¹⁰⁰, 10⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 100, 50, 10, 5 ou 2 cellules, préférentiellement par litre de milieu de culture.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les cellules produisant des nanoparticules est/sont une ou des cellules eucaryote(s), appartenant préférentiellement à l'homme, aux animaux, aux plantes, aux arbres, aux farines, aux branches, aux champignons, aux archées, aux oiseaux, aux poissons, aux pigeons, la truite, les mammifères, les fourmis, les abeilles ou les insectes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les cellule(s) produisant des nanoparticules est/sont une ou des cellule(s) procaryote(s) ou une bactérie.

Dans certains cas, les cellules productrices de nanoparticules peuvent être Mycobacterium, préférentiellement Mycobacterium paratuberculosis, Shewanella, préférentiellement Shewanella oneidensi, Geothrix, préférentiellement Geothrix fermentans. Ces bactéries synthétisent préférentiellement des nanoparticules en dehors des cellules.

Dans certains autres cas, les cellules productrices de nanoparticules peuvent être des bactéries magnétotactiques, telles que la souche AMB-1 Magnetospirillum magnelicum, la souche MC1 coccus magnétotactique, trois souches de vibrions anaérobies facultatives MV-1, MV-2 et MV-4, la Magnetospirillum magnetotacticum MS-1, la souche MSR-1 Magnetospirillum gryphisw aide use, un spirillum magnétotactique anaérobie facultatif, la souche MGT-1 Magnetospirillum magnelicum, et une anaérobe obligatoire, Desulfovibrio magneticus RS-1.

Ces bactéries synthétisent préférentiellement des nanoparticules à l'intérieur de la ou des cellules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules est/sont cultivée(s) dans ou en utilisant un milieu de pré-croissance pour/pendant l'étape de pré-croissance, et/ou dans ou en utilisant un milieu de croissance pour/pendant l’étape de croissance, et/ou dans ou en utilisant un milieu fed-batch pendant l’étape de croissance. Dans certains cas, le milieu de pré-croissance et/ou de croissance est/sont le(les) milieu(x) dans lequel/lesquels la/les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules est/sont amplifiée(s). Dans certains cas, le milieu fed-batch est le milieu ajouté au milieu de croissance, préférentiellement pendant l’étape de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le milieu total de pré-croissance et/ou de croissance peut comprendre au moins une source d'éléments chimiques, de l’eau et des cellules productrices des nanoparticules. Dans certains autres cas, le milieu partiel de précroissance et/ou de croissance comprend au moins une source d'éléments chimiques, de l'eau, et pas de cellules productrices de nanoparticules. Dans encore d'autres cas, le milieu de précroissance et/ou de croissance ne comprend que des cellules productrices de nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance et/ou fed-batch comprend ou comprennent au moins une source, de préférence une source d'un élément chimique, ou comprend/comprennent au moins un élément chimique, de préférence dans état liquide, gaze et/ou solide. Dans certains cas, le(les) milieu(x) de précroissance et/ou de croissance et/ou fed-batch est/sont à l'état liquide, gazeux et/ou solide.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la concentration d'un élément chimique tel que le fer dans le milieu de pré-croissance et/ou de croissance est la concentration de cet élément chimique dans: i) le milieu total de pré-croissance et/ou de croissance, ii), le milieu partiel de pré-croissance et/ou de croissance, ou iii), les cellules productrices de nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, une certaine quantité ou volume de cellule(s) peut être une certaine quantité ou volume de milieu de croissance comprenant ces cellules. Dans certains autres cas, une certaine quantité ou volume de cellule(s) peut être une certaine quantité ou volume de cellule(s) sans eau ou sans l'environnement aqueux de la ou des cellules ou après que l'eau ou l'environnement aqueux de la cellule(s) a été éliminé, par exemple par lyophilisation.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les conditions d'amplification de cellules pendant les étapes de pré-croissance et/ou de croissance permettent d'empêcher les modifications génétiques des cellules productrices de nanoparticules. Dans certains cas, les modifications génétiques des cellules productrices de nanoparticules sont des modifications d'au moins 10' ⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 5, 10, 50, 75, 90 ou 95% de gène(s), partie(s) de gène(s), portion(s) d'ADN ou nucléotide(s) Ce pourcentage peut être le rapport entre le nombre ou la quantité de gène(s), partie(s) de gènes, portions d’ADN ou de nucléotides modifiés dans la ou les cellules productrices de nanoparticules et le nombre total ou la quantité totale de tous les gènes, parties de gènes, de portions d’ADN ou nucléotide(s) appartenant à la ou aux cellules productrices de nanoparticules.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, les milieux de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent une majorité d'eau, de préférence d'eau purifiée, désionisée ou ultrapure, préférentiellement plus de 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, 1, 10, 50, 75, 80, 90, 99, 99,99 ou 99,99999 pour cent ou pour cent en masse d'eau. Ce pourcentage peut être le rapport entre la quantité, la masse, le volume ou le nombre d’atomes d’eau compris dans le/les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance divisés par la quantité totale, la masse, le volume ou le nombre d’atomes de tous les éléments chimiques compris (s) dans le ou les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins un élément chimique ou une source d'élément chimique. Dans certains cas, la concentration d'un élément chimique, tel que le fer, dans le ou les milieux de pré-croissance et/ou de croissance est la concentration de cet élément chimique à tout moment de l'étape de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains cas, cette concentration peut être mesurée en estimant le nombre de moles, la masse ou le volume de ou occupé par cet élément chimique divisé par le nombre total de moles, la masse totale ou le volume total de ou occupé par tous les éléments chimiques dans le/les milieu(x) de précroissance et/ou de croissance

Dans un mode de réalisation de l'invention, le/les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de carbone. Dans certains cas, la source de carbone comprend l’élément chimique du tableau périodique C. Dans certains cas, la source de carbone peut être sélectionnée dans la liste suivante: acétate, glycolate, glucose, lactate, pyruvate, succinate, dioxyde de carbone, glycérol, et un dérivé ou une combinaison de ces composés.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de croissance et/ou de précroissance comprend ou comprennent au moins une source d'azote. Dans certains cas, la source d’azote comprend l’élément chimique du tableau périodique N. Dans certains cas, la source d’azote peut être choisie dans le groupe comprenant: sels d’ammonium, sels de nitrate, urée, acides aminés, sels d’ammonium, ammoniac, azote gazeux, et un dérivé ou une combinaison de ces composés.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de soufre ou de sulfate. Dans certains cas, la source de soufre ou de sulfate comprend l'élément chimique du tableau périodique S. Dans certains cas, la source de soufre ou de sulfate peut être un sel de sulfate ou du sulfure d'hydrogène.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de phosphore ou de phosphate. Dans certains cas, la source de phosphore ou de phosphate comprend l'élément chimique du tableau périodique P. Dans certains cas, la source de phosphore ou de phosphate peut être un sel de phosphate.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de calcium. Dans certains cas, la source de calcium comprend l'élément chimique du tableau périodique Ca. Dans certains cas, la source de calcium peut être un sel de calcium.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de Potassium. Dans certains cas, la source de potassium comprend l'élément chimique du tableau périodique K. Dans certains cas, la source de potassium est un sel de potassium.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de magnésium. Dans certains cas, la source de magnésium comprend l'élément chimique du tableau périodique Mg. Dans certains cas, la source de magnésium est un sel de magnésium.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source d'oxygène. Dans certains cas, la source d'oxygène comprend l'élément chimique du tableau périodique O. Dans certains cas, la source d'oxygène est un composé organique, le dioxyde de carbone ou le di-oxygène.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source d'hydrogène. Dans certains cas, la source d'hydrogène comprend l'élément chimique du tableau périodique H. Dans certains cas, la source d'hydrogène est un composé organique, ou di-hydrogène.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de fer. Dans certains cas, la source de fer comprend l'élément chimique du tableau périodique Fe. Dans certains cas, la source de fer est ou consiste en ou comprend du fer. Dans certains cas, le fer provient du citrate de fer, du quinate de fer, du chlorure de fer ou du sulfate de fer.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une source de soufre. Dans certains cas, la source de soufre comprend l'élément chimique du tableau périodique S. Dans certains cas, la source de soufre est constituée d'au moins une vitamine.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les sources de carbone, d'azote, de soufre, de sulfate, de phosphore, de phosphate, de calcium, de potassium, de magnésium, d'oxygène, d'hydrogène, defer, comprennent plus de 1O'¹⁰⁰, 1O'⁵⁰, 1O'²⁰, 1O'¹⁰, 10'⁵, 10'³, 10'¹, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90 ou 95% en masse de carbone, azote, soufre, sulfate, phosphore, phosphate, calcium, potassium, magnésium, oxygène, hydrogène, fer, respectivement. Dans certains cas, ils sont à l'état gazeux, liquide ou solide. Dans d'autres cas, ils peuvent être utilisés pour préparer le ou les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains cas, le ou les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent plus de 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 10³, 10⁵, 10¹⁰ ou 10⁵⁰ sources différentes de carbone, d’azote, de soufre , sulfate, phosphore, phosphate, calcium, potassium, magnésium, oxygène, hydrogène et/ou fer. Dans d'autres cas, le ou les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprennent moins de 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 10³, 10⁵, 10¹⁰ ou 10⁵⁰ sources différentes de carbone, d'azote, de soufre, sulfate, phosphore, phosphate, calcium, potassium, magnésium, oxygène, hydrogène et/ou fer. Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins une source de carbone, d'azote, de soufre, de sulfate, de phosphore, de phosphate, de calcium, de potassium, de magnésium, d'oxygène, d'hydrogène et/ou de fer du même milieu de pré-croissance est la même que celle du milieu de croissance.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, au moins une source de carbone, d'azote, de soufre, de sulfate, de phosphore, de phosphate, de calcium, de potassium, de magnésium, d'oxygène, d'hydrogène et/ou de fer du milieu de pré-croissance est différente de celle du milieu de croissance.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le milieu de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent la ou les sources de carbone, d'azote, de soufre, de sulfate, de phosphore, de phosphate, de calcium, de potassium, de magnésium, d'oxygène, d'hydrogène, et/ou du fer à une concentration supérieure à 1O'¹⁰⁰, 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, 10’¹, 1, 10, 10², 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ mM.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent la ou les sources de carbone, d'azote, de soufre, de sulfate, de phosphore, de phosphate, de calcium, de potassium, de magnésium, d'oxygène, d'hydrogène, et/ou de fer, à une concentration inférieure à 1O¹⁰⁰, 10⁵⁰, 10²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 10, 1, ΙΟ’¹, ΙΟ'³, ΙΟ'⁶, ΙΟ'⁹, ΙΟ'²⁰, 1O'⁵⁰ ou 1O'¹⁰⁰ mM.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le ou les milieux de pré-croissance et/ou de croissance est/sont préparés en utilisant des produits ou éléments chimiques de qualité pharmaceutique ou ultra-pures.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, le ou les impuretés du milieu sont le ou les impuretés compris dans le ou les milieux de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent une faible quantité d'impureté(s) du milieu. Dans certains cas, le pourcentage d'impuretés du milieu est inférieur àlOO, 10 ,10 ,10,10,10, 5, 1, 0,1 ou 0,001%. Préférentiellement, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent une quantité ou concentration en impureté(s) du milieu inférieure, de préférence d'un facteur d'au moins 1,00001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 10³, 10¹⁰ ou 1O²⁰, à la quantité ou la concentration d'au moins une source de carbone, d'azote, de soufre, de sulfate, de phosphore, de phosphate, de calcium, de potassium, de magnésium, d'oxygène, d'hydrogène et/ou de fer. Selon l'invention, le pourcentage en impureté(s) du milieu peut dans certains cas être défini comme le rapport entre le nombre d'atomes, la quantité, la masse ou le volume d’ impuretés du milieu comprises dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou croissance divisé par le nombre total d'atomes, quantité, masse ou volume de tous les éléments chimiques compris dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains autres cas, la concentration en impureté(s) du milieu comprise(s) dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance est inférieure à 10⁵⁰, 10³⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 500, 100, 50, 10, 1, 10'¹, 10'³, 10' ⁵, 10'¹⁰ ou 10'⁵⁰ pg d’impureté(s) de milieu par mL de milieu de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance ne comprend pas ou ne comprennent pas au moins une impureté du milieu.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent une quantité significative d'impureté(s) du milieu. Dans certains cas, le pourcentage, préférentiellement en masse, d’impureté(s) du milieu est supérieur à 1O'⁴⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, ΙΟ'², 10'¹, 1, 5, 10 25, 50, 75, 80 ou 90%. Dans certains autres cas, la concentration en impureté(s) du milieu comprise(s) dans le(les) milieu(x) de précroissance et/ou de croissance est supérieure à ΙΟ'¹⁰⁰, ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'³, ΙΟ'², 10’¹, 1, 10, 50, 100, ΙΟ³, 10⁵ ou 1O¹⁰ pg d'impureté du milieu par ml de milieu de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans certains cas, les nanoparticules produites ou obtenues ou résultant du(des) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance peuvent être des magnétosomes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode selon l'invention comprend une étape de pré-croissance, consistant à amplifier la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules dans un milieu de pré-croissance, de manière à ce que la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules ne produise(nt) essentiellement pas de nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules utilisée(s) pour démarrer l'étape de pré-croissance sont des cellules ayant au moins l'une des propriétés suivantes: i), ce sont les cellules avant l'étape de pré-croissance, préférentiellement plus de 0.001, 0.1, 1, 5, 10, 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ heure(s) avant le début de l’étape de précroissance, ii) elles sont comprises dans une banque cellulaire telle qu'une banque de cellules mères, banque de cellules de travail, ou une banque de cellules de recherche, iii), elles comprennent plus de 1, 5, 10, 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ nanoparticules par cellule, iv), elles sont comprises dans un liquide ou un milieu, préférentiellement identique ou de composition similaire au(x) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance, comprenant de préférence une majorité d'eau, v), ils sont compris dans un milieu ayant une concentration en impureté(s) inférieure à 100, 10, 1, 10’¹, 10'², 10'³, 10'⁵ ou ΙΟ'¹⁰ μΜ, vi), elles sont comprises dans un milieu ou maintenus dans des conditions permettant de maintenir ou d'avoir moins de 100, 10, 1, 0,1 ou 0,01 gramme d’ impureté(s) par gramme de nanoparticule(s), v), elles sont comprises dans un volume compris entre 1O'¹⁰⁰ et ΙΟ¹⁰⁰, 10'⁵⁰ et ΙΟ⁵⁰, 10'³⁰ et ΙΟ³⁰, 1O'²⁰ et ΙΟ²⁰, 10'¹⁰ et ΙΟ¹⁰, 10'⁶ et 10⁵, 10'⁶ et ΙΟ⁴, 10'⁶ et 10², ou entre 10'⁶ et 1 litre, vi), elles sont comprises dans un volume au moins 10 fois inférieur au volume de la première étape de précroissance, vii), elles sont ou représentent un nombre de cellules, de préférence par litre de milieu de pré-croissance et/ou de croissance, compris entre 1 et 1O¹⁰⁰, 2 et 10⁵⁰, 3 et 1O²⁰, ou entre 10 et 10¹⁰ cellules, vii), elles ont une densité optique comprise entre 10'⁵⁰ et ΙΟ⁵⁰, 1O'²⁰ et ΙΟ²⁰, 10'¹⁰ et 10, 10'⁵ et 10⁵, 10'⁵ et 10³, 10'⁵ et ΙΟ², 10'⁵ et 1, 10'⁵ et 10’¹, 10'⁵ et 10'², ou entre 10'⁵ et 10'³, viii), elles ont un nombre de divisions cellulaires, préférentiellement par heure ou par heure et par litre de milieu de pré-croissance et/ou de croissance inférieur à 1, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 1O⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰, ix), elles sont stockées ou maintenues à une température inférieure à 100, 50, 25 ou 0 ° C, préférentiellement à 77 K ou -20 ° C.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les cellules productrices de nanoparticules utilisées pour débuter l'étape de pré-croissance ont au moins l'une des propriétés suivantes: i), elles sont comprises dans un milieu ayant une concentration en impureté supérieure à 1O'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'², 10’¹, 1 ou 10 μΜ, ii), elles sont comprises dans un milieu ou maintenus dans des conditions permettant de maintenir ou d’avoir plus de ΙΟ'⁴⁰, 1O'²⁰ ou 1O'¹⁰ grammes d'impureté(s) par gramme de nanoparticule, vii), elles présentent un nombre de divisions cellulaires, préférentiellement par heure ou par heure par litre de milieu de pré-croissance et/ou de croissance, qui est supérieur à 1, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰, viii), elles comprennent moins de 1, 5, 10, 10³, 10⁵ ou 1O¹⁰ nanoparticules par cellule. Cela peut être le cas lorsqu’elles ou si elles sont maintenues ou proviennent d'un milieu comprenant une concentration en fer suffisamment faible pour empêcher la production de nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins une des propriétés des cellules productrices de nanoparticules utilisées pour démarrer l'étape de pré-croissance permet d'empêcher la mort ou la destruction ou la disparition ou la dénaturation ou l'inactivation de la ou des cellules productrice(s) des nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la densité optique de la ou des cellules est mesurée lorsque les cellules sont comprises dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance, dans une solution ou dans de l'eau, de préférence après que le milieu de croissance ait été retiré et les cellules ont été remises en suspension dans de l'eau. Dans certains cas, la densité optique de la ou des cellules est mesurée à une longueur d'onde supérieure à 1, 2, 5, 10, 50, 100, 200, 3 00, 400, 450, 500, 550, 600, 900, 10³, 10⁵ ou 10⁷ nm. Dans d'autres cas, la densité optique de la ou des cellules est mesurée à une longueur d'onde inférieure à ΙΟ⁷, 10⁵, 10³, 900, 600, 550, 500, 450, 400, 3 00, 200, 100, 50, 10, 5 , 2 ou 1 nm. Dans certains autres cas, la densité optique des cellules est mesurée à une longueur d'onde comprise entre 1 et 10⁷nm, 50 et 10⁵ nm, 100 et 10³ nm, 200 et 900 nm ou entre 400 et 800 nm.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le nombre d'amplification cellulaire, entre deux instants t₀ et ti de la ou des étape(s) de pré-croissance et/ou de croissance, est égal ou proportionnel à: i), le rapport entre la densité optique mesurée à ti et la densité optique mesurée à t₀ et/ou ii), le rapport entre le nombre de cellules à 11, n(ti), et le nombre de cellules à t₀, n(t₀).

Dans un mode de réalisation de l'invention, la vitesse ou le rythme de division cellulaire est n(ti)-n (to)/(ti-to).

Dans un autre mode de réalisation, la vitesse ou le rythme de division cellulaire est: n(ti)n(t₀)/[(ti-t₀).V], où V est le volume du milieu de pré-croissance et/ou de croissance dans lequel les cellules sont cultivées ou amplifiées.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de pré-croissance commence par la décongélation ou le chauffage, de préférence d'une température inférieure à 100, 50, 25, 10 ou 0 °C à une température supérieure à 0, 10, 25, 50 ou 100 °C de la ou des cellule(s) productrice(s) de nanoparticules utilisées pour commencer l'étape de pré-croissance. Après cela, les cellules produisant des nanoparticules sont de préférence insérées ou ajoutées au milieu de pré-croissance. Dans certains cas, cette phase initiale de la phase de pré-croissance a lieu pendant un laps de temps compris entre 10'⁵⁰ et ΙΟ⁵⁰, 10'⁵⁰ et ΙΟ¹⁰, 10'³⁰ et 10⁵, 1O'²⁰ et 10³, 10'¹⁰ et 10² ou entre 10'⁵ et 10 heures.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'étape de pré-croissance est divisée en sousétapes 0, 1, ..., i, ..., j, correspondant aux amplifications dans les différents volumes V_o, V_b ..., Vi, Vj, préférentiellement croissants, où i est un entier désignant le nombre i d’amplifications dans différents volumes (0 <i <j), j étant un entier désignant le nombre total d’amplifications dans différents volumes, V_o, Vi et Vj sont le volume initial, ième volume, et dernier volume d’amplification, respectivement. Dans certains cas, l'amplification cellulaire ou le nombre d'amplifications cellulaires dans différents volumes peut être important pendant l'étape de pré-croissance, par exemple lorsque l'étape de pré-croissance commence à partir d'une faible quantité de cellules, préférentiellement inférieure à ΙΟ¹⁰⁰, ΙΟ⁵⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, 10⁵, 10³, 10², 10, 5, 3 ou 2 cellules, de préférence comprises dans un litre ou un millilitre ou un microlitre de milieu de pré-croissance ou de solution aqueuse. Dans ces cas, i et/ou j peut ou peuvent être supérieurs à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 10, 10³, 10⁵ ou 10¹⁰. Dans certains autres cas, l'amplification cellulaire ou le nombre d'amplification cellulaire dans différents volumes peut être faible, par exemple lorsque l'étape de pré-croissance commence à partir d'une grande quantité de cellules, préférentiellement supérieure à 2, 3, 5, 10, 10², 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ cellules, comprises préférentiellement dans un litre ou un millilitre ou un microlitre de milieu de pré-croissance ou de solution aqueuse. Dans ces cas, i et/ou j est/sont inférieur(s) à 10¹⁰, 10⁵, 10³, 10², 10, 5, 4, 3, 2 ou 1.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le rapport Vî/Vm est grand, préférentiellement supérieur à 10'⁵⁰, 10'³⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, ΙΟ'², 10’¹, 1, 1.00001, 1.0001, 1.001, 1.01, 1.01, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 10², 10³, 10⁵ ou 10¹⁰. Dans certains cas, Vî/Vm est grand lorsque entre la sous-étape i-1 et la sous-étape i de l'étape de pré-croissance: le nombre de divisions cellulaires, préférentiellement par heure ou par heure par litre de milieu de pré-croissance, est supérieur à 1, 5, 10, 103, 1O¹⁰ ou 1O²⁰, ou lorsque la densité optique des cellules augmente d’un facteur supérieur à 1,00001, 1,1, 2, 5, 10, ΙΟ³, 10⁵ ou 10⁷ par heure.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le rapport Vî/Vm est faible, préférentiellement inférieur à ΙΟ¹⁰⁰, ΙΟ⁵⁰, ΙΟ¹⁰, ΙΟ⁵, ΙΟ³, 10², 10, 5, 3, 2, 1,01, 1,001, 1,000001, 1, ΙΟ'⁵, 1O'¹⁰ ou 1O'⁵⁰. Dans certains cas, Vî/Vm est faible lorsque le nombre de divisions cellulaires, préférentiellement par heure ou par heure par litre de milieu de précroissance, est inférieur à 10 ,10 , 10 , 10 , 10, 5 ou 1, ou lorsque la densité optique des cellules augmente d’un facteur inférieur à 1,00001, 1,1, 2, 5, 10, ΙΟ³, 10⁵ ou 10⁷ par heure.

Dans certains cas, le nombre d’étapes de pré-croissance dans différents volumes peut être augmenté en diminuant Vî/Vm. Dans certains autres cas, le nombre d'étapes de pré-croissance dans différents volumes peut être réduit en augmentant Vî/Vm·

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de pré-croissance et/ou au moins une de ses sous-étape(s) dure(nt) et/ou se produit(produisent) jusqu'à ce que la densité optique de la suspension bactérienne dans le volume Vi (1 <i <j) atteigne une valeur: i) supérieure à 10'⁵⁰, ΙΟ'³⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 5, 10, 15, 50, ΙΟ², 10³ ou 10⁵, et/ou ii), plus élevée, de préférence d'un facteur supérieur à 1,000001, 1,0001, 1,01, 1,1, 1,5, 2, 5, 10, ΙΟ², ΙΟ³, 10⁵, 1O¹⁰ ou 1O²⁰, à la fin qu'au début de l'étape de pré-croissance et/ou à la fin qu'au début d'au moins une sous-étape de l'étape de pré-croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de pré-croissance et/ou au moins une de ses sous-étape(s) dure(nt) et/ou se produit(produisent) jusqu'à ce que la densité optique de la suspension bactérienne dans le volume Vi (l<i <j) atteigne une valeur: i) inférieure à 1O'⁵⁰, 10' ³⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 5, 10 , 15, 50, ΙΟ², 10³ ou 10⁵, et/ou ii), plus faible, préférentiellement d'un facteur supérieur à 1,000001, 1,0001, 1,01, 1,1, 1,5, 2, 5, 10, ΙΟ², 10³, ΙΟ⁵, 1O¹⁰ ou 1O²⁰, à la fin qu'au début de l'étape de pré-croissance et/ou à la fin qu'au début d'au moins une sous-étape de l'étape de pré-croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le début de l'amplification en volume Vo a lieu à l'instant tob, la fin de l'amplification en volume V_o a lieu à l'instant t_PGoe, le début de l'amplification en volume Vi a lieu à l'instant t_PGîb, la fin de l'amplification en volume Vi a lieu à l'instant t_PGie, le début de l'amplification en volume Vj a lieu à l'instant tjb et/ou la fin de l'amplification en volume Vj a lieu à l'instant t_PGj_e·

Dans un mode de réalisation de l'invention, le temps qui sépare: i), le début de l'étape de précroissance, à l'instant t_PGob, et la fin de l'étape de pré-croissance, à l'instant t_PGj_e, qui est égal à tpGje- tpcob et/ou ii), le début de la sous-étape i, t_PGib et la fin de la sous-étape i, t_PGie, qui est égal à tpGie-tpGib, est/sont supérieur(s) ou égaux(égal) à ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, ΙΟ'², 10’¹, 1, 2, 5,

10, 24, 100, 10³, ΙΟ⁵ ou ΙΟ⁷ heure (s). Dans certains cas, tpGje-tpGob et/ou tpGie-tpGib est(sont) grand(s) lorsque les cellules se divisent avec difficulté ou lentement, de préférence à une vitesse ou à un rythme inférieur à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵. ΙΟ'³, 10'¹, 1, 10, 10³ ou 10⁵ divisions cellulaires par heure ou divisions cellulaires par heure par litre de milieu de pré-croissance. Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, tpGje-tpGob et/ou tPGie-tpGib est/sont inférieur(s) ou égal(égaux) à ΙΟ⁴⁰, ΙΟ³⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, ΙΟ⁵, 10², 10, 5, 2, 1, ΙΟ’¹, ΙΟ'³, 10'⁵ ou 1O'¹⁰heure(s). Dans certains cas, tpGje-tpGob et/ou tPGie-tpGib est(sont) faible(s) lorsque les cellules se divisent facilement ou rapidement, de préférence à une vitesse supérieure à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, 1O'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 10, 10³ ou 10⁵ division(s) cellulaire(s) par heure ou divisions cellulaires par heure par litre de milieu de pré-croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les cellules productrices de nanoparticules sont amplifiées pendant l'étape de pré-croissance en introduisant à tpGib ou tpcob ou en maintenant au cours de l'étape de pré-croissance ou d'au moins une de ses sous-étapes une concentration en fer dans le milieu de pré-croissance inférieure à ΙΟ¹⁰⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ⁵, 10³, 10, 5, 1, ΙΟ'¹, 10'³ ou ΙΟ'⁵ μΜ, préférentiellement pour éviter la synthèse de nanoparticules qui pourrait empêcher l'amplification cellulaire.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules produisant des nanoparticules sont amplifiées pendant l'étape de pré-croissance en introduisant à t_PGib ou t_PGob ou en maintenant au cours de l'étape de pré-croissance ou d'au moins une de ses sous-étapes une concentration en fer dans le milieu de pré-croissance supérieure à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, 10'³, 10'² ou ΙΟ'¹ pM, préférentiellement pour permettre un métabolisme cellulaire efficace.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules productrices de nanoparticules sont amplifiées pendant l'étape de pré-croissance en introduisant à t_PGib ou t_PGob ou en maintenant au cours de l'étape de pré-croissance ou d'au moins une de ses sous-étapes une concentration en fer comprise entre 1O'¹⁰ et ΙΟ¹⁰, 10'⁵ et ΙΟ⁵, 10'³ et ΙΟ³, 10'¹ et 1 pM, 10'¹ et 10 pM, ou entre 10'² et 100 pM.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules productrices de nanoparticules sont amplifiées pendant l'étape de pré-croissance ou au moins une de ses sous-étapes en consommant de l'oxygène. Dans certains cas, le pourcentage d'oxygène dans le milieu de précroissance diminue de: i), une valeur supérieure à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, 10'³, 1, 5, 10, 20, 50, 75, 90, 95, 99 ou 99,9%, préférentiellement de 21% ou une valeur comprise entre 10 et 30%, à tpGib ou tpcob, jusqu'à une valeur inférieure à 99,9, 95, 90, 80, 75, 50, 20, 5,2, 1, 10'³, 10'⁵, 10' ¹⁰ ou 10'⁵⁰%, préférentiellement 0% ou une valeur comprise entre 0 et 10%, à t_PGie ou t_PGje, et/ou ii), le pourcentage de l'oxygène dans le milieu de pré-croissance diminue d'un facteur supérieur à 1.0001, 1.001, 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10, 50, ΙΟ², ΙΟ³, 10⁵ ou 1O¹⁰, préférentiellement entre t_PGob et t_PGj_e et/ou entre t_PGib et t_PGie· Dans certains cas, de l'oxygène n'est pas ajouté au milieu de pré-croissance pendant l'étape de pré-croissance ou au moins une de ses sousétapes, entraînant une diminution du pourcentage d'oxygène dans le milieu de pré-croissance en raison de la consommation de oxygène par les bactéries. Dans certains autres cas, de l'oxygène est ajouté au milieu de pré-croissance pendant l'étape de pré-croissance ou au moins une de ses sous-étapes, ce qui entraîne une variation du pourcentage d'oxygène dans le milieu de pré-croissance due à la consommation d'oxygène par les bactéries et à l'ajout d'oxygène au milieu de pré-croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le pourcentage d'oxygène, préférentiellement d'O₂, dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance est le pourcentage d'oxygène dissous, préférentiellement de O₂, dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains cas, un pourcentage de 100% peut correspondre à la quantité maximale d'O₂solubilisé dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance, comprise entre 10'⁵ et 1O²⁰ mg, préférentiellement entre 1 et 10 mg d'O₂ dissous par litre de milieu de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de pré-croissance consiste à amplifier les cellules, où une telle amplification est associée à, correspond à ou est: i) une vitesse ou un rythme ou un nombre de divisions cellulaires, préférentiellement par unité de volume tel que un litre de milieu de pré-croissance, qui est plus grand, préférentiellement d'un facteur supérieur à 1,000001, 1,0001, 1,01, 1,1, 1,2, 1,5 , 2, 5, 10, 10², 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, 1O²⁰ ou 10⁵⁰, au début qu’à la fin de l'étape de pré-croissance ou de l'une de ses sous-étapes, ou à tPGie ou tPGje qu'à tpGib ou tpGob, ü), une vitesse ou un rythme ou un nombre de divisions cellulaires, préférentiellement par unité de volume tel qu'un litre de milieu de pré-croissance, qui augmente d'un nombre de cellules ou de cellules par heure inférieur ou égal à ΙΟ¹⁰⁰, ΙΟ⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 10², 10, 5 ou 2, au début de l’étape de pré-croissance ou d’une de ses sousétapes ou à tpGib ou tpGob, jusqu'à un nombre de cellules ou cellules par heure supérieur ou égal à 2, 5, 10, 10², 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰, à la fin de l'étape de pré-croissance ou de l'une de ses sous-étapes ou à tPGie ou à t_PGje, iii), ^une densité optique, mesurée préférentiellement pour des cellules comprises dans un volume de pré-croissance fixe, tel qu'un litre, qui est plus important, préférentiellement par un facteur supérieur à 1,00001, 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, 1O²⁰ ou 10⁵⁰, à la fin de l'étape de pré-croissance ou de l'une de ses sous-étapes ou à t_PGie ou à t_PGj_e qu'au début de l'étape de pré-croissance ou de l'une de ses sous-étapes ou à t_PGib ou t_PGob, ou qui augmente à partir d'une densité optique inférieure ou égale à 10, 1, ΙΟ’¹, 10'² ou 10'³ au début de l'étape de pré-croissance ou de l'une de ses sousétapes ou à tpGib ou tpGob à une densité optique supérieure ou égale à ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'², ΙΟ’¹, 1 ou 10 à la fin de la l’étape de pré-croissance ou l’une de ses sous-étapes ou à tpGie ou à tpGje·

Dans un mode de réalisation de l’invention, préférentiellement pendant, au début, ou à la fin de l’étape de pré-croissance ou d’au moins l’une de ses sous-étapes, les cellules qui ne produisent essentiellement pas de nanoparticules sont caractérisées par au-moins l’une des propriétés suivantes: i), un nombre de nanoparticules contenues dans les cellules qui est plus faible que 10³, 10², 50, 20, 10, 5, 2 ou 1, préférentiellement plus faible que 10 ou 5, ou entre 0 et 10³, préférentiellement entre 0 et 10 ou entre 0 et 5, ii), un pourcentage de cellules avec au moins une nanoparticules qui est plus faible que 100, 99, 90, 80, 50, 20, 10, 1, 0.1 %, préférentiellement plus faible que 10 ou 1% ou compris entre 0 et 99%, 0 et 50, 0 et 10, préférentiellement entre 0 and 5%, où ce pourcentage est préférentiellement le rapport entre le nombre de cellules avec au moins une nanoparticule et le nombre total de cellules, préférentiellement compris dans le milieu de pré-croissance, iii), une densité optique plus grande que 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, 10'², 0.1, 0.2, 0.5, 1, 5, 10 ou 100, iv), un nombre de cellules plus grand que 1, 5, 10, 10², 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 1O⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰, v), elles sont contenues dans un volume plus grand que 0,0001, 0,001, 0,1, 1, 10, 50, ΙΟ², ΙΟ³, 10⁵ ou 1O¹⁰ litre(s), vi), un nombre de génération cellulaire compris entre 1 et ΙΟ¹⁰, 1 et 10³, préférentiellement entre 50 and 300, vii), un rapport entre la densité optique mesurée à la fin de l’étape de précroissance, ODpge, et le début de l’étape de pré-croissance, ODPGb, ODPge/ODPgb, plus grand que 1, 2, 5, 10, 15, 25, 50, 100, ΙΟ³, 10⁵, IO¹⁰, IO⁵⁰ or 1O¹⁰⁰, et/ou viii) le rapport entre la densité optique lesurée à la fin de la sous-étape i de l’étape de pré-croissance, ODPGîe, et le début de la sous-étape i de l’étape de pré-croissance i, OD_PGîb, ODpgîe/ODpgîb, plus grand ou égal à 1, 2, 5, 10, 15, 25, 50, 100, ΙΟ³, ΙΟ⁵, ΙΟ¹⁰, 1O⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰.

Dans un mode de réalisation de l’invention, les cellules qui ne produisent essentiellement pas de nanoparticules sont des cellules non-magnétiques.

Dans un mode de réalisation de l’invention, préférentiellement pendant, au début ou à la fin de l’étape de pré-croissance ou d’au-moins l’une de ses sous-étapes, un pourcentage de cellules non-magnétiques plus grand que ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 5, 10, 50 ou 75%, est obtenu. Dans certains cas, le pourcentage de cellules non-magnétiques est égal à nNMc/(nMc+nNMc), où n_MC et n_NMC sont les nombres de cellules magnétiques et nonmagnétiques, respectivement.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules non magnétiques n’ont pas de réponse magnétique, la réponse magnétique pouvant être l'orientation d'au moins une cellule parallèle à un champ magnétique ou un mouvement de la cellule à une vitesse proportionnelle à la force du champ magnétique, l’intensité du champ magnétique pouvant être supérieure à ΙΟ'⁹, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 10³ ou 10⁶ mT et/ou le champ magnétique est appliqué préférentiellement sur la ou les cellules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode comprend une étape de croissance consistant à amplifier la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules provenant de l'étape de pré-croissance dans un milieu de croissance de manière à ce que la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules productrices de nanoparticules. Dans certains cas, l'étape de croissance est réalisé dans un fermenteur ou un appareil qui permet de contrôler la température, le pH, la concentration en fer et/ou la concentration en oxygène du milieu de croissance.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'étape de croissance commence par l'insertion des cellules obtenues à partir de l'étape de pré-croissance dans le milieu de croissance. Dans certains cas, l’étape de croissance ou au moins l’une de ses sous-étapes a lieu pendant un laps de temps compris entre 1O'⁵⁰ et ΙΟ⁵⁰, 1O'⁵⁰ et ΙΟ¹⁰, 1O'³⁰ et 10⁵, 1O'²⁰ et 10³, 1O'¹⁰ et 10², ou entre 10'⁵ et 24 heure(s). Dans certains autres cas, l’étape de croissance ou au moins l’une de ses sous-étapes a lieu pendant un laps de temps inférieur à ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, 10⁵, ΙΟ³, 10², 10, 5, 2, 1, ΙΟ’¹, ΙΟ'², ΙΟ'³, ΙΟ'⁵, 1O'¹⁰ ou 1O'²⁰ heure(s). Dans d’autres cas encore, l’étape de croissance ou au moins une de ses sous-étapes a lieu pendant un laps de temps supérieur à ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, ΙΟ'², 10’¹, 1, 2, 5, 10, ΙΟ², ΙΟ³, ΙΟ⁵, 1O¹⁰ ou 1O²⁰ heure(s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de croissance consiste à amplifier les cellules au cours des sous-étapes successives GSO... GSi... GSj, où tosob, tosib, tosjb sont le début des étapes 0, i et j, et tosoe, tosie, tosje, sont les fins des étapes 0, i, et j, où 0 < i <j. Dans certains cas, i et/ou j est/sont supérieur(s) à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 10, 10³, 10⁵ ou 1O¹⁰. Dans certains autres cas, i et/ou j est/sont inférieur(s) à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 10, 10³, 10⁵ ou 1O¹⁰.

Dans un mode de réalisation de l'invention, chaque sous-étape i consiste à faire huiler ou à apporter une quantité différente d'oxygène au/dans le milieu de croissance et/ou à apporter une quantité différente de fer au/dans le milieu de croissance, de préférence à l'aide d'un milieu fed-batch.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de croissance comprend au moins l'une des sous-étapes suivantes au cours de laquelle un gaz, tel que de l'air comprimé ou un gaz contenant plus de 1% d'O₂, est introduit dans le milieu de croissance, préférentiellement sous des conditions d’agitation de 1 à 1O¹⁰, de 5 à 10⁵, de 10 à 10⁴, de 100 à 10³ et de 100 à 300 rotations par minute, et durant lesquelles:

-Au cours de la première sous-étape qui dure de 10' à 10 heures ou préférentiellement de 2 à 16 heures, le débit du gaz est compris entre 0 et 10¹⁰, préférentiellement entre 40 mL/min par litre de milieu de croissance, entraînant une augmentation de la densité optique des cellules, d'une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10³, préférentiellement entre 0,08 et 0,12 au début de la première sous-étape, à une valeur à la fin de la première sous-étape plus grande d'un facteur supérieur à 1,0000, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ à la valeur au début de la première sous-étape ou à une valeur comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement entre 0,2 et 1.

-Au cours de la deuxième sous étape qui dure de 10'³ à 10³ heures ou préférentiellement de 2 à 120 heures, le débit du gaz est augmenté d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ comparé avec la première sous-étape ou est compris entre 0 et 10¹⁰, préférentiellement entre 1 et 50 mL/min par litre de milieu de croissance, conduisant à une augmentation de la densité optique des cellules à partir d'une valeur au début du deuxième sous- étape égale à celle obtenue à la fin de la première étape ou comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement entre 0,2 et 1, à une valeur supérieure à la fin de la deuxième sous étape par un facteur de plus de 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ que la valeur au début de la deuxième sous-étape ou à une valeur comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement comprise entre 0,5 et 4.

-Au cours de la troisième sous-étape qui dure de 10'³ à 10³ heures ou préférentiellement de 2 à 120 heures, le débit du gaz est augmenté d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ comparé avec la deuxième sous-étape ou est compris entre 0 et 10¹⁰, préférentiellement entre 50 et 120 mL/min par litre de milieu de croissance, entraînant une augmentation de la densité optique des cellules à partir d'une valeur au début de la troisième sous-étape égale à celle obtenue à la fin de la deuxième sous-étape ou comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement entre 0,5 et 4 jusqu'à une valeur à la fin de la troisième sous-étape plus grande d'un facteur de plus de 1,0000, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ que la valeur au début de la troisième sous-étape ou à une valeur comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement comprise entre 1 et 8 à la fin de la troisième sous-étape.

-Au cours de la quatrième sous-étape qui dure de 10'³ à 10³ heures, préférentiellement de 2 à 120 heures, le débit du gaz est augmenté d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ comparé avec la troisième sous-étape ou est compris entre 0 et 10¹⁰, préférentiellement entre 200 et 300 mL/min par litre de milieu de croissance, entraînant une augmentation de la densité optique des cellules à partir d'une valeur au début de la quatrième sous-étape égale à celle obtenue à la fin de la troisième sous-étape ou comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement entre 1 et 8, une valeur préférentiellement à la fin de la quatrième sousétape supérieur d'un facteur de plus de 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 103 à la valeur au début de la quatrième sous-étape ou à une valeur comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement entre 2 et 16 à la fin de la quatrième sous-étape.

-Au cours de la cinquième sous-étape qui dure de 10'³ à 10³ heures, préférentiellement de 2 à 120 heures, le débit du gaz est augmenté d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ comparé avec la quatrième sous-étape ou est compris entre 0 et 10¹⁰, préférentiellement entre 300 et 500 ml/min par litre de milieu de croissance, entraînant une augmentation de la densité optique des cellules à partir d'une valeur au début du cinquième sous-étape égale à celle obtenue à la fin de la quatrième sous-étape ou comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement entre 2 et 16 jusqu'à une valeur à la fin de la cinquième sous-étape plus grande d'un facteur de plus de 1,0000, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ que la valeur au début de la cinquième sous-étape ou à une valeur comprise entre 10'⁹ et 10⁴, préférentiellement comprise entre 4 et 32 à la fin de la cinquième sous-étape.

Dans un mode de réalisation de l'invention, au cours de la sous-étape i, préférentiellement des sous-étapes 2 à 5: i), le pourcentage d'oxygène est maintenu au-dessus de 0,01% ou 0,1 mBar par le débit d'air et en dessous de 0,9% ou 9 mBar en raison de la consommation d'oxygène par les cellules, ii) le débit du gaz est compris entre 0 et 10¹⁰, 1 et 10⁵, 5 et 10⁴, 10 et 10³mL/min par litre de milieu de culture, iii), le milieu de culture est agité à une vitesse comprise entre 1 et 10⁵, 10 et 10⁴, 50 et 10³, ou entre 100 et 500 rotations par minute, iv), le débit du gaz peut être diminué en augmentant la vitesse d'agitation du milieu, v), le débit du gaz peut être augmenté en diminuant la vitesse d'agitation du milieu, et/ou, vi), la densité optique des cellules augmente d'une valeur comprise préférentiellement entre 10'⁵⁰ et 10³ au début de la sous-étape i à une valeur compris préférentiellement entre 1O'²⁰ et 10⁵ à la fin de la sous-étape

i.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de croissance comprend au moins une sous-étape au cours de laquelle: i), le pH du milieu de croissance est maintenu à un pH fixé ou déterminé ou choisi, compris entre 0 et 14, 2 et 13, 4 et 11, 5 et 10, préférentiellement compris entre 5 et 8, le plus préférentiellement égal à 6,9, préférentiellement par addition d'une source de fer acide comprise dans un milieu fed-batch, préférentiellement sous agitation de 1 à 10¹⁰, préférentiellement de 100 à 300 rotations par minute. Dans certains cas, le milieu de croissance comprend une concentration en fer au début de l’étape de croissance ou une de ses sous-étapes qui est: i) inférieure à ΙΟ¹⁰, 10⁵ ou ΙΟ² μΜ, préférentiellement inférieure à 10 ou 2 μΜ, et/ou ii) comprise entre 1O'¹⁰ et ΙΟ¹⁰, 10'⁵ et ΙΟ⁵, 10'³ et ΙΟ³ μΜ, préférentiellement comprise entre 0,2 et 20 μΜ. Dans certains autres cas, au cours de l’étape de croissance ou de l’une de ses sous-étapes, la concentration en fer du milieu de croissance augmente, de préférence avec l’ajout du milieu fed-batch dans le milieu de croissance, pour atteindre une valeur à la fin de l’étape de croissance ou d’une de ses sous-étapes qui est: i) supérieure à 10' ¹⁰, 10'⁵, 10'¹ ou 1 μΜ, préférentiellement supérieure à 2 μΜ et/ou ii), comprise entre 10'¹⁰ et ΙΟ¹⁰ μΜ, préférentiellement entre 2 μΜ et 5 mM ou entre 2 μΜ et 0,5 mM.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de croissance comprend au moins l'une des sous-étapes suivantes, dans laquelle:

- Au cours de la première sous-étape, qui dure de 10'³ à 10³, préférentiellement de 2 à 16 heures, l'insertion du milieu fed-batch dans le milieu de croissance conduit à une concentration en fer dans le milieu de croissance comprise entre 10'¹⁰ et ΙΟ¹⁰ μΜ, préférentiellement entre 2 et 20 μΜ, dans certains cas sans tenir compte de la consommation de fer par les bactéries, dans d’autres cas en tenant compte de la consommation de fer par les bactéries. Cela se traduit préférentiellement par une production de nanoparticules qui augmente d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ du début à la fin de la première sous-étape, ou d'une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement entre 0,001 et 0,1 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance au début de la première sous-étape jusqu'à une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement entre 1 et 10 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance à la fin de la première sous-étape.

- Au cours de la deuxième sous-étape, qui dure de 10 à 10³ heures, préférentiellement de 2 à 120 heures, l'insertion du milieu fed-batch dans le milieu de croissance mène à une concentration en fer dans le milieu de croissance comprise entre 10 et 10 μΜ, préférentiellement entre 20 et 40 μΜ, dans certains cas sans tenir compte de la consommation de fer par les bactéries, dans d’autres cas en tenant compte de la consommation de fer par les bactéries. Cela se traduit préférentiellement par une production de nanoparticules qui augmente d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ du début à la fin de la deuxième sous-étape, ou d'une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement 1 à 10 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance au début de la deuxième sous-étape jusqu'à une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement entre 2 et 20 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance à la fin de la deuxième sous-étape.

- Au cours de la troisième sous-étape, qui dure de 10'³ à 10³, de préférence de 2 à 120 heures, l'insertion du milieu fed-batch dans le milieu de croissance mène à une concentration en fer dans le milieu de croissance comprise entre 10 et ΙΟ¹⁰ μΜ, préférentiellement entre 40 et 150 μΜ, dans certains cas sans tenir compte de la consommation de fer par les bactéries, dans d’autres cas en tenant compte de la consommation de fer par les bactéries. Cela se traduit préférentiellement par une production de nanoparticules qui augmente d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³ du début à la fin de la troisième sous-étape, ou d'une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 1O¹⁰, préférentiellement entre 2 et 20 mg de nanoparticules par litre de croissance.

- Au cours de la quatrième sous-étape de l’étape de croissance, qui dure de 10 à 10³ heures, de préférence de 2 à 120 heures, l’insertion du milieu fed-batch dans le milieu de croissance mène à une concentration en fer dans le milieu de croissance comprise entre 10'¹⁰ et ΙΟ¹⁰ μΜ, préférentiellement entre 150 et 500 μΜ, dans certains cas sans tenir compte de la consommation de fer par les bactéries, dans d'autres cas, en tenant compte de la consommation de fer par les bactéries. Cela se traduit préférentiellement par une production de nanoparticules qui augmente d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³du début à la fin de la quatrième sous-étape, ou d'une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement d'une valeur comprise entre 4 et 40 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance au début de la quatrième sous-étape à une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement entre 8 et 80 mg de nanoparticules par litre du milieu de croissance à la fin de la quatrième sous-étape.

- Au cours de la cinquième sous-étape de l’étape de croissance, qui dure de 10 à 10³ heures, de préférence de 2 à 120 heures, l’insertion du milieu fed-batch dans le milieu de croissance mène à une concentration en fer dans le milieu de croissance comprise entre 10'¹⁰ à ΙΟ¹⁰ μΜ, préférentiellement entre 500 et 1000 μΜ, dans certains cas sans tenir compte de la consommation de fer par les bactéries, dans d'autres cas, en tenant compte de la consommation de fer par les bactéries. Cela se traduit préférentiellement par une production de nanoparticules qui augmente d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10 ou 10³du début à la fin de la deuxième sous-étape, ou d'une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement entre 8 et 80 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance au début de la cinquième sous-étape jusqu'à une valeur comprise entre 10'¹⁰ et 10¹⁰, préférentiellement entre 16 et 160 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance à la fin de la cinquième sous-étape.

Dans un mode de réalisation de l'invention, au cours de l'étape de croissance ou de la sousétape i de l'étape de croissance, préférentiellement des sous-étapes 1 à 5: i), la concentration en fer du milieu de croissance est augmentée au-dessus de ΙΟ'¹⁰ μΜ, préférentiellement de 2 μΜ, préférentiellement en ajoutant un milieu fed-batch contenant du fer au milieu de croissance et en dessous de 1O¹⁰ mM, préférentiellement 5 mM, en raison de la consommation de fer par les cellules, ii), la quantité totale de fer par litre de milieu de croissance amené au milieu de croissance est compris entre 10'⁶ et 15, préférentiellement entre 2.10'⁴ et 1,5 g de fer par litre de milieu de croissance, et/ou iii) la quantité de nanoparticules augmente à partir d'une valeur comprise entre 0 et 500 mg, préférentiellement entre 0 et 80 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance au début de l’étape de croissance ou l’une de ses sous-étapes à une valeur comprise entre 1 et 10⁵ mg, préférentiellement entre 10 et 200 mg de nanoparticules par litre de milieu de croissance à la fin de l'étape de croissance ou l'une de ses sous-étapes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape de croissance consiste à amplifier les cellules, où une telle amplification est associée ou correspond à: une vitesse ou un rythme ou un nombre de divisions cellulaires ou une densité optique plus grande, préférentiellement d'un facteur de plus de 1,000001, 1,0001, 1,01, 1,1, 1,2, 1,5 , 2, 5, 10, 10², 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, 1O²⁰ ou 10⁵⁰ pendant l’étape de croissance ou au moins l’une de ses sous-étapes par rapport à l’étape de pré-croissance ou au moins l’une de ses sous-étapes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, préférentiellement au début ou à la fin de l'étape de croissance ou d'au moins une de ses sous-étapes, les cellules productrices de nanoparticules ont ou sont caractérisées par au moins l'une des propriétés suivantes: i) un nombre de nanoparticules compris dans les cellules supérieur à 1, 2, 5, 10, 50, 10² ou 10³, préférentiellement supérieur à 0, 1 ou 2, ou compris entre 0 et 10³, préférentiellement compris entre 0 et 100 ou entre 0 et 10, ii), un pourcentage de cellules avec au moins une nanoparticule supérieure à ΙΟ'⁴, ΙΟ'², 10’¹, 1, 5, 10, 50, 75 ou 95, préférentiellement supérieure à 10 ou 50% ou compris entre 0 et 99%, 10 et 75, 5 et 90, préférentiellement entre 20 et 100%, iii), une densité optique supérieure à 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, 10'², 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10 ou 100, iv), un nombre de cellules supérieur à 1, 5, 10, 10², 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, ΙΟ²⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰, v), des cellules comprises dans un volume supérieur à 0,0001, 0,001, 0,1, 1, 10, 50, 10², 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ litre(s), vi), un nombre de générations de cellules compris entre 1 et 10¹⁰, 1 et 10³, préférentiellement entre 50 et 300, vii), un rapport entre la densité optique mesurée à la fin de l'étape de croissance, ODGE, et le début de l’étape de croissance, ODGB, ODGE/ODGB, qui est supérieure à 1, 2, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰, ou viii) un rapport entre la densité optique mesurée à la fin de la sous-étape i de l'étape de croissance, ODGiE et au début de la sous-étape i de l'étape de croissance, OD_GiB, OD_GiE/OD_GiB, qui est supérieure à 1, 2, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, 10⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les cellules qui ne produisent pratiquement pas de nanoparticules sont des cellules non magnétiques.

Dans un mode de réalisation de l'invention, au début, préférentiellement pendant, au début ou à la fin de l'étape de croissance ou au moins l’une de ses sous-étapes, un pourcentage de cellules magnétiques supérieur à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 5, 10, 50 ou 75% est obtenu. Dans certains cas, le pourcentage de cellules magnétiques est égal à n_MC7(n_Mc+n_NMcj, où n_MC et n_NMC sont respectivement les nombres de cellules magnétiques et non magnétiques.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules magnétiques sont des cellules qui ont une réponse magnétique.

Dans certains cas, l’étape de pré-croissance, l’étape de croissance, ou au moins l’une de leurs sous-étapes, est réalisée à une température supérieure à -250, -200, -150, -100, -50, -20, -10, 5, -2, -1, 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 10³, 10⁵ ou 10⁷ °C ou avec une variation de température supérieure à 10'⁵, 10'³, 10'², 0,1, 1, 5, 10, 50, 100 ou 150 °C. Dans d'autres cas, l'étape de pré-croissance, l'étape de croissance ou au moins l'une de leurs sous-étapes est réalisée à une température inférieure à 10⁷, 10⁵, 10³, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0, -1, -

2, -5, -10, -20, -50, -100, -150, -200 ou -250 ° C ou avec une variation de température inférieure à 10⁵, 10³, 10², 50, 20, 10, 5, 2, 1 ou 0,1 ° C.

Dans certains cas, l'étape de pré-croissance, l'étape de croissance ou au moins l'une de leurs sous-étapes est réalisée à un pH supérieur à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11, 12, 13 ou 14 unité(s) de pH ou avec une variation de pH supérieure à 10'¹⁰, 10'⁷, 10'⁵, 10'⁴, 10'³, 10’¹, 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 unité(s) de pH. Dans certains autres cas, l'étape de précroissance, l'étape de croissance ou au moins l'une de leurs sous-étapes est réalisée à un pH inférieur à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 ou avec une variation de pH inférieure à 10'¹⁰, 10'⁷, 10'⁵, ΙΟ'⁴, ΙΟ'³, 10’¹, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 unités de pH.

Dans certains cas, la température, la variation de température, le pH ou la variation de pH sont suffisamment importants pour permettre au moins 1, 5, 10, 10³, 10⁵, 1O¹⁰ ou 1O⁵⁰ divisions ou divisions cellulaires par heure.

Dans d’autres cas, la température, la variation de température, le pH ou la variation de pH sont suffisamment bas pour empêcher la destruction, la disparition ou la dénaturation de plus de 1, 5, 10, 10³, 10⁵, 10¹⁰ ou 10⁵⁰ cellules ou cellule (s) par heure.

L'invention concerne également la méthode selon l'invention, dans laquelle le milieu de précroissance ne comprend pas de fer ou au moins une source de fer.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle le milieu de pré-croissance comprend du fer ou au moins une source de fer, dans laquelle la nature et/ou la quantité de fer ou de la source de fer, ne permet pas, de préférence essentiellement, la production des nanoparticules par les cellules tout en permettant la croissance cellulaire.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la nature de la source de fer est la composition, la formule chimique, le type de la source de fer, ou est la source de fer elle-même. Dans certains cas, la source de fer est une source de fer ferrique ou ferreux. Dans certains cas, il peut s'agir ou comprendre ou être composé de ou avoir la formule chimique : Cl₃Fe, Ci₀H₁₂FeN₂NaO₈, Fe₂O₁₂S₃, C₆H₈FeNO₇, C₆H₅FeO₇, FeH₁₈N₃O₁₈, C₃oH₂₁FeN₃0₁₅'³, FeO4P, C6H7FeO8, Fe2H20i3S3, Fe2Hi20i8S3, CioHi2FeN2Na08, CioHi3FeN208, FeH28N02oS2, CioHisFeN2Na08, C10H14FeN2NaO8⁺⁴, C14H₂₁FeN₃O₁₀, C₁₈Fe₇N₁₈, Fe₄H₂O₂₂S₅, Fe₄O₂₁P₆, F₃Fe, C₆H_nFeNO₇ ⁺³, CeHnFeNO7, Ci8HisFeO9, Ci2H29Fe5Na2O23, Ci2H22Fe20i4, CisFFiFeOô, CisH24FeO6, C6H5FeO7, C10H16FeN3O8, C4H10FeO5, C54H105FeO6, AsFeH13O9⁺, AsFeO4, Fe⁺³, C6H12FeN30i2, C6H18As3FeO6, FeH2O5P, C2iH21FeO9S3, C6HnFeNaO7⁺³, Ci4H₂₂FeN₃NaOi₀, FeNaO₇P₂, C₃H₉As₃Fe₃O₉, C₄₈H₂₄Fe₄O₄₂P6, CgHnFeOio, C₉Hx₈FeN₃Sg, Cl₃FeO₄₂, C₆H₉FeNO₇ ⁺, Cr3Fe2O12, C6H10FeNO8, FeH3O3, C15H30FeN3S6, C30H27FeN3O15, C3FeN3S3, C6H12FeKO6⁺⁴, FeH3O₃, FeN₃O₉, C₃H₃FeO₆, C₆H₈FeO₇, C₂₄H₄₅FeO₆, FeO₆P₃, Fe₂H₁₄0i₉S₃, C₁₈H₃₃FeO₂₁, C₆H₉FeO₉, C₁₈H₂₇FeO₂₄, C₆FeN₆'³, C10H12FeN2O8-, C22H36N4O13, C3FeN3, C6H12FeN3O12, C6H9FeO6, C15H27FeO6, FeH4O6P, C21H15FeO9, FeH8O8P, C6H6FeNO6, C4FeKO8, C12H12Fe2O18, C33H35FeN4O4, Cl3FeH4O2, C24H45FeO6, C10H15FeN2O7, FeH4NO8S2, C32H31FeN4O5, Fe2H6O3, AlF6Fe, C4H4FeNO8, C81H84FeN3O33, Fe2S3, Cl3FeH14O7, C18H6FeN9O21, Cl3FeO9, Fel3, C6H14FeO10, C6H10FeO8, C55H80FeN17O21S3, C10H16FeN5O13P3, C18H34FeO16⁺³, C12H₁₂Fe₂O₁₅, C₆FeNa₃O₁₂, C₁₀H₁₂FeKN₂O₈,

C₂iH₂₄FeN₃O₉, C₉Hf,Fe₂O|₂, CgFe₂0i₂, AsFe, C₃5H₃₃FeNsOn ³, Cl3FeH2O, Ci8H3oFe2N60i2, FeI3O9, CioH18FeN2NaOu, Cl3FeH48O9, Cr2FeH4NO8, C9H24Fe2Oi8P3, C48H34FeO2, C3oH27Fe06, C3oH24FeN3Oi5, C54Hio2FeOg, Fe4H4803oP6, Fe2Se3, C54H99FeOg, CisELiFeOg, CioHi8FeN207 ², CioHi8FeN₂0₇ ², CioHi9FeN308, C22Hi4FeO4, C39H63FeNgOi5 ³, CioHi9FeN₃0₈, C₄FeNaO₈, FeO₄V, CLHuFeN-.Oi?, C6Fe₂0i₂, Ci₈H₂₄Fe₂O₂₄ ⁶, Ci8H19FeN2NaO6, Ci8Hi9FeN2NaO6, Ci2Hi8Fe20i2, CgFeK^Ng, C24H47FeO2j, Ci8H38FeOi9, C15H21FeO6, C18H39FeO24, C6HnFeNO7, C6H12FeO6, C12H28FeO14, FeHO2, C45H36FeN3O6, Fe3H2O4, Fe2O3, C3gH72FeO6, Ci2Hi8Fe20i5, C9Hi8FeO9, FeHgO3, C54Hio2FeOg, C42H84FeOg, Ci6H3iFeO2², C36H₆₉FeO₆, Fe₃H₈O₄, C₈Hi5Fe₂O₂ ⁴, Ci₂H₄₈Fe₂Ni₂Oi₂S₃, C₄₈H₉gFeO6, C₉H₁₅FeO₉, C₃₅H₃₉N₅O_n, C₄₂H₈iFeO6, C₄₈H₉₃FeOg, CioH₂₄0₂, Fe₂Hi₈O₂iS₃, FeHi₂N₃0is, C₂₄H₂₃FeNio06S₂, Ci₈Hi₄Cl₃FeNioS₂, CLiHuFeCf,, Fe₂HioOi₇S₃, CioHi₉FeN₃0₈, C₁₈H₂₀FeN₂NaO₆, C₃F₉FeO₉S₃, C₅H₁₄FeO₄, C₆H₁₉FeNO_lb C₁₈H₁₆FeN₂NaO₆, C₃₂H₃₆N₄O₉, C₁₅H₃₀FeO₆, C₁₅H₂₄FeO₆, C₁₅H₁₅F₉FeO₆, C₂₁H₂₁Cl₃FeIS, C₆H₁₂Fe₂O₁₈, C₆H₁₈FeO₁₂,

C₆H₁₅FeO₁₂, C₆H₁₈Fe₂O₁₈, C₆H₈FeO₇, C₆H₁₃FeO_n, C₆H₄Fe₂N₇, FeH₂O₄S, C₄₂H₆₀N₁₂O₁₆, C₆Fe₂N₆, C₃Fe₂O₉, C₁₆₂H₂₉₇FeO₂₇’⁶, C21H27Cl4FeN2O, C6H4FeNaO7, C27H50FeN6O10, C25H48FeN6O8, C27H48FeN6O9, C6H7FeO6⁺², Fe2H₂O₄, C₁₄H₂₆FeN₅O₁₀, Cl₄FeH₄N, Cl₃FeH₁₂O₁₈, C₆H₁₇FeN₂NaO₇ ⁺³, C10HnFeNO6, C15H15F9FeO6, C6Fe2N6Na, C9H21Fe2O18P3, C21H27C1N2O, C2H3FeO, C10H12Fe2N2O8, FeH3O3P, C7H5FeO2, C7H5FeO2, FeI3O12, C3H4FeNO2S, C2H2FeNO2, C12H12Fe2O12, C8H7FeNO3, C2HFe, C6H7FeO2S4, C6HnFeO6, C14H19FeO12, BFeH3O3, C21H18FeO15, C35H56FeN6O13, C12H30FeO3, CHFe, C47H48FeNO14, Fe2H6O3, Fe2O9Sn3, Ci8H48FeO3, Fe2O9Se3, Fe2O9Si3, Fe2O9S3, Br3FeO9, FeN3Og, C24H54FeO3, C66H129FeO6, FeP, C6H18FeO24P6⁺³, C33H₇₂FeO₃, C₄₀H₇₅FeO₄, C₂H₃FeS, C₃FeN₃, C₂iH₃₉FeC>6, FeSi, C₃oH₂₉FeN₃Oi6, C₂₂H₃gFeN₄0i₃, C₃oHs₇Fe06, CôoHi i-FeOr,, Ci₈Hi₂FeN₃0e, C₁₈H₃₁FeO₂ ⁺², FeS2, C6HnFeN4O2, C6H5FeO7, C6H5FeS, C10H13FeN2O10·, C8H13FeOS2, C27H51FeO6, C24H44FeO25',C6H15FeN3O6, C6H12FeO9, Cl3FeO9S3, CFeNS, Fe4H120i2Si3, C3H6FeO12, C4H3FeO4S2, C4H4FeO6, C6H3FeN3O6, C5H5FeO2, C10H24FeN4O9, Ci4H19FeN3NaOio, CioH44FeN2Na208, C3gH44FeN4, CgFeNa30i2, Fe2H3OS3, CigH27FeO4, C6H8Fe20i3, C6H7FeO3, C4H4FeO6S2, C2H5FeN2, C5H7FeOS2, Ci8H18FeNa6O2b C3H9FeO9S3, C24H54FeO12P3, C36H55FeN6On, Fe2H2O10Si3, C2H4FeNO2, C4HnFeN2O4, AsFeH2O5, Ci2H43FeOi3, C36H67FeO6, Ci2H43FeOi3, C3HgFeN3O6, Ci8HisFeO9S3, C3gH75FeOi2S3, Fe2H4O5, C28H24FeN4⁺³, F3Fe, C₃₀H₃₀FeO₆, BFe, C₂H₈N₂O₄, C₈H₅FeN₂O₅, Fe₂H₄O_nSe₃, C₆H₇FeO₆S₄, C₄H₁₀FeN₃, C₆H₁₂Fe₂O₁₅, C₁₅H₂₃FeO₅, C₈H₁₂FeNO₁₂, C₄₉H₅₆ClFeN₄O₆, FeH₄NO₈S₂, C₃₆H₇₅FeO₉S₃, B₃F₁₂Fe, FeP, Fe₂H₂₀O₂₂S₃, Cl₃FeH₁₂O₁₅, C₁₈H₉FeN₆, Fe₂H₁₂O₁₅Se₃, C₅₆H₅₁FeN₄, Fe₂H₈O₁₃Se₃, C₄₄H₂₇FeN₄, C₃₃H₃₀FeN₄O₆·², CrFeO₃,

C₁₈H₁₂FeN₃O₁₅S₃, Cl₃FeH₁₈O₂₁, C₆H₅FeNa₃O₁₃, C₁₈H₁₄FeN₁₃O₉S₂, C₁₅H₂₄FeO₆,

C₂₄H₂₇FeO₉S₃, C₂₇H₅₄FeN₃S₆, Cl₃FeH₁₂O₆, C₁₆H₃₆Pb, C₈H₁₈Fe₂O₁₂P₂, Cl₃FeH₂₄O₁₂, C₂₄H₃₀FeO₉S₃, C₂iH₂₄FeO₉S₃, Ci₈HisFeOi₂S₃, Cl₃FeH₂oOio,

C₂₈H₂₄FeN₆O₆ ,C₆6H₁₂₁Fe₂NaO₆5, Cr₃FeH₃O₄₂, Ci₂H₂₈Fe₂0i₄, C₃H₈FeNS₂Zn ,F₃FeHgO₃, (NoHsiFeOe, C₃oH4₈Fe₄N60₂₄, C₃oHi₈FeN₃Oe, C₂oH₃gFe0₄, CeHeFeK^Ois, CisHgFisFeOe, C₁₀H₁₃FeN₂O₈, C₆FeN₆, C₁₅H₃F₁₈FeO₆, C₁₅H₁₂FeN₃O₃S₃, C₂₁H₂₃FeO₁₀S₃, FeH₂O⁺³, C24H44FeNaO28, Cr3FeO6, Fe2H2O⁺⁶, C6H₁₂FeN₉, FeH₅NO₄S, C₂K₂O₄, C₁₈H₁₃FeN₆, C₃₀H₂₇FeO₆, C₃₄H₃₈N₄O₄, Cl₃FeH₁₅O₁₈, C₆H₁₈FeO₆P₃S₆, C₆H_uClFeNO₁₀S₂, C₅H₄F₃FeO₂ ⁺², C6H6Cr2O12, C4H3CrKO8, C2MgO4, C12H25FeO14, C2H2MgO4⁺², C2CrO₄ ⁺,C2HNaO4, C2HKO4, CgCr20i2, C2H2FeO4, C2H4MgOg, CgAlOn ³, CgAl20i₂, C₂Li₂O₄, C₂MgO₄, C₄₄H₃oN₄0₄₂S₄, C₁₀H₁₉FeN₂NaO₁₀, C₅H₄CuFeN₆O₃, C₁₀H₁₄FeN₂NaO₉, C₃₀H₁₅FeN₃Na₃O₁₅S₃, C₂₇H₁₅FeN₁₂O₆, C₉H₁₈FeN₃S₆, C₃₀H₃₀FeN₃O₁₅ ⁺³, C9H18FeN3S6, C6FeN6, C18Fe7N18, C18H18FeN2NaO6, C30H21FeN12O6, C44H30FeN4⁺³, C14H₁₈FeK₂N₃O₁₀, C₁₀H₁₆FeN₂NaO₈, C₃₃H₂₉FeNO_u ⁺,

C₂₅H₁₈FeN4O₆S⁺,C35H24FeN6O2S⁺,C32H32ClFeN4O₆, C3₀H₁₂F₉FeN₁₂O₆, C3oH₁₈Cl₃FeN₁₂0₉, C6oH₇₂FeN₉0₉ ³, CgoHggFeNgOg ³, CisH^FeOg, C22H25Cl2FeN3O9 ,Ci8H23C13FeN3Oi2, CiiH24FeNOn, C49H54FeN4O9⁺,C42H₅₄Cl₈Fe₂N₄O₂, C₄₄H₂₆Cl₄FeN₄ ⁺³,

C3₄H3₂FeN₄O₄ ⁺,C44H38FeN8⁺⁷, C9H_uCl₂FeN₄O₂S, Ci₈H₃₂FeN₄O₈ ⁺³, C34H32ClFeN4O6, or Ci9H25FeN4O6. Dans certains autres cas, la source de fer peut être ou comprendre ou être composée de ou avoir la formule chimique suivante: Fe⁺², FeH14OnS, FeH₈N₂O₈S₂, FeO₄S, Cl₂Fe, FeS, C₄H₂FeO₄, C₁₂H₂₆FeO₁₆, C₄H₅FeNO₄, C₁₂H₁₀Fe₃O₁₄, C₁₆H3₀FeO₄, FeH₂O₅S, CioHi₂FeN₂Na₂0₈, As₂Fe3O₈, CFeCh, C₉H|₂FeO₉, FeHi₂N₂0i₂, Ci₂HioFe30i₄, C^FTFeNaO-, C3₄H₃₂FeN₄O₄, Ci₂H₂₂FeOi₄, Ci₂Hi₄FeOi₂, CgHioFeOg, C₄H₈FeN₂O₄, Ci₂H₂₈FeOi6, Fel₂, FeH₄N₂O₆S₂, C3₄H₃₂FeN₄O₄·², C34H32FeN4O4, F2Fe, C6H18FeO9, C6H5FeO7·, C2FeO4, C4H4FeO4, Cl2FeO8, Fe3O8P2, FeO, B2F8Fe, FeH8O8S, C4H6FeO4, C4H4FeO4, Ci2HioFeNa4Oi4, C22Hi4FeO4, C2H4FeOô, Ci2H24FeOi4, Ci4H2oFeN30io, Cl2FeH8O4, C12H8FeN2O4, C4H8FeO4, C5H7FeNO4, C8H12FeN2O8, C12H10Fe3O14, C6H16FeO9, C19H19FeN7O10S, C10H16FeN2O8, C12H10Ca2FeO14, C^FeOe, C36H70FeO4, C^FeCH, C4H2FeO4, C36H21Cl2FeN9Oi4, C32H62FeO4, FeH2O2, C4H6FeO6, C6H8CaFeO7⁺⁴, C4H₁₀Cl₂FeN₂O₄, C3₆H₂₄Cl₂FeN₆O₈, C₆H₁₄FeO₇, C₁₂H₁₆FeO₁₂, BFe, C₃₂H₁₆FeN₈, C₁₂H₂₆FeO₁₅, C₁₂H₁₀Fe3O₁₄, FeH₈I₂O₄, C₄H₁₀FeN₂O₈S, C3₀H₂₄Cl₂FeN₆O₈, C3₉H3₀Cl₂FeN₆O₈, C₁₂H₁₄FeO₁₂, C3₀H₂₄FeN₆ ⁺², C4H2FeO4'², C4H₄FeO₄, C₁₀H₁₆FeO₄, C3₆H₂₄FeN₆O₄S, C₂H₄FeO₆, C₂H₂FeO₆, C₈H₁₅Fe₂O₂ ⁺⁴, C32H16FeN8, C12H16Fe3O14, C12H24FeO14, C2FeN2S2, C12H16FeN6O4, C14H20FeN3O10, C12H7FeN3O6S, C20H12FeN4, C12H16Ca2FeO14, C46H54FeO9, C6H5FeO7, FeH4O6S, C10H15FeN2NaO7, C10H6FeN4O8, Fe2P, C4H4FeO6, C14H26FeO16, Cl2FeH12O14, C4H8Cl2FeN2O4, C6Fe3N6, C4H12As2FeO8, C10H16FeO4, FeH20N2O14S2, C16H3oFe04, C4oH40FeN804 , Fe2Na8O24P6, C44H8FeOio, C44H8FeO4, Ci2H2oFe04, C8H8FeS, CsH4FeO, C2H3FeNO2, C10H14FeN2O8, C6H2FeN3O7⁺, C2H₂Fe, C₁₀H₆FeN₂, C₆H₁₅FeN₃O₇, C₇₂H₁₂₄FeO₈’², FeH22N2O15S2, C40H78FeO4, FeH2N2O6⁺², C44H₈₆FeO₄, C₁₀H₂₀FeN₂O₈S₂, C₂oH₃₈Fe0₄, C3eH₆6FeO₄, C₂₄H₄₆FeO₄, C₂₉H₂gFeP⁺, C36Hg4FeO6, Ci4H2gFeO4, C26H28FeNP, C28H54FeO4, C36H32FeN4O4, C36H36FeN4O8, C6H9FeNO7⁺, C5H₆FeO₂, C₄H_nBFeO₄, C₈H₁₉BFeO₄, C₄H₄FeO₄S₂, C₆H6FeO₇, C₁₈H₃₄FeO₄, C₁₂H₂oFe0₁₃, C₄H₄FeO₆, C₅H₇FeNO₃, Fe₃H₈O₄, C₂FeN₂S₂, FeH₂O₂, Fe₃H₂O₄, C₄₄H₂₈FeN₄, C₂H₆FeO₅, Fe₂H₆O_uS₂, C₃H₄FeN₂O3, Fe₃H₂O₉P₂, C₆H₁₄Fe3N3O₇'³, C₄H₁₀FeN₂O₆, Cl₂FeH₂O, FeO₄W, C₆H₅FeO₃P, C₆H₈FeO₇, FeTe, C₄H₂FeO₄, C₂₀H₂₀Cl₂FeN₈, C₁₄H₁₂FeO₆, C3H₃FeO₇P, C₄H₇FeNO₄, FeO₃Si, Cl₂FeH₁₂O₆, Cl₂FeH₂O₉, FeH₁₀O₉S, FeH₁₂O₁₀S, C₈H₁₇FeO₃P, C₄H₁₄FeO₈, Fe₃H₁₆O₁₆P₂, F₆FeSi, C₇₂H₄₂FeN₆Na₆O₂₂S₇, FeH₄O₅S, C₃₉H3oFeN₆0₄S, C₄₀H₅₀O₄, C₄H₁₀FeN₂O₄, C₂H₄FeN₂O₄S, Br₂FeH₂O, C₉₈H₂₀₀FeN₁₀, C3₆H₂₁FeN₉O₁₀S, C₁₀H₁₀Fe, C₂H₆FeN₂, F₆FeH₁₂O₆Si, C₄₈H₄₈FeN₆O₄S, FeO₄S,

C₂H₁₀FeN2O₈S2, C₄₄H₂₇FeN₅O, C₃₀H₂₄FeN₆O₄S, C₆H₈O₆, C₆H₇NaO₆, FeH₄O₂ ⁺², FeH2O⁺², C3H₇FeNO₇S, C₃₀H₁₈FeN₃NaO₆, C₂H₁₈FeN2O₁₂S2, C₄H₄FeO₄, C₇H₇FeN₄O⁺, Br₂Fe, C₁₈H₂2Cl₂FeN2, C^IWeNeOeS^ C₁₂H₁₄MgO₁₂, C₂H₅FeNO₆S, C₄₅H₆₀FeN₂O₈, C₃₀H22Cl₂FeN2, C₃₈H₂6FeN₈O₂S₂, C₃₀H₂₈FeN₂O₆, C₁₄H₁₂Cl₆FeO₄, C₁₂H₁₄Fe,

C₃₆H₃₆Cl₂FeN₆O₈, C₁₇H₁₄FeN₄O₄S, C₂₄H₃₀FeN₄O₄, C₃₄H₃₂ClFeN₄O₆, C₁₂H₁₂Fe, Fe₃H₁₄O₁₂P₂ ⁺⁶, C32H16FeN8, FeS2, C16H15FeNO2⁺², C29H₂₀FeO₆, C₂₃H₂₈FeO₂, CnH₁₀FeO₂, Ci₃H₁₄FeO₂, Ci2Hi2FeC>2, C₄6H₄₈FeN₄O6⁺², C47H59FeNi3O8², C46Hs9FeNi₃O₈ ⁺², C48Hg2FeNi2O8S⁺², CsoHesFeNnO^², C48Hg₃FeNi₃O₈ ⁺², C48Hg2FeNi2O8S⁺², C55H76FeNi₄C>9⁺², C25H19FeN3, C15H17FeN3OS⁺², C22H₂₃FeN₃OS⁺², C26H28ClFeN3, C28H33ClFeN4, C27H31ClFeN4, C29H35ClFeN4, C30H37ClFeN4, C28H33ClFeN4, C27H30ClFeN3, C26H28ClFeN3, C29H35ClFeN4, C27H30ClFeN5O⁺², C41H₃₈ClFeN₅O₃ ⁺², C42H4iFeN5O3⁺², C41H₃₈FFeN₅O₃ ⁺², C42H47FeN5O3⁺², C43H₄₉FeN₅O₃ ⁺², C42H4iFeN5O3⁺², C42H₄₀ClFeN₅O₃ ⁺², C42H40ClFeN5O3⁺², C42H₄₀FFeN₅O₃ ⁺², C41H45FeN5O3⁺², C42H₄₇FeN₅O₃ ⁺², C41H39FeN5O3⁺², C22H₂₅FeN₅O₅ ⁺², C24H23ClFeN4O2⁺², C24H₂₃FFeN₄O₂ ⁺², C24H24FeN4O2⁺², C15H₂₁FeN₃S⁺², C29H34FeN4O2⁺², C28H₃₁ClFeN₄O₂ ⁺², C28H31FFeN4O2⁺², C30H₃₅ClFeN₄O₃ ⁺², C30H35FFeN4O3⁺², C28H₃₂FeN₄O₂ ⁺², C27H3oFeN402⁺², C26H27ClFeN₄O₂ ⁺², C30H36FeN4O3⁺², C28H₃₁ClFeN₄O₃ ⁺², C28H31FFeN4O3⁺², C28H₃₂FeN₄O₃ ⁺², C27H29ClFeN4O3⁺², C26H27FFeN₄O₂ ⁺², C26H28FeN4O2⁺², C26H₂₈FeN₄O₂ ⁺², C27H29FFeN4O3⁺², C27H₃₀FeN₄O₃ ⁺², C26H27ClFeN4O3⁺², C26H₂₇FFeN₄O₃ ⁺², C26H28FeN4O3⁺², C25H₂₅ClFeN₄O₃ ⁺², C25H25FFeN4O3⁺², C25H₂6FeN₄O₃ ⁺², C24H23ClFeN4O3⁺², C24H₂₃FFeN₄O₃ ⁺², C24H24FeN4O3⁺², C25H₂₅ClFeN₄O2⁺², C25H25FFeN4O2⁺², C25H₂₆FeN₄O2⁺², C25H26FeN4O2⁺², C29H₃₂ClFeN₇ ⁺², C33H32ClFeN7⁺², C22H₂₇ClFeN₃RuS⁺, C18H19ClFeN3RuS⁺, C19H₁₉BFeO₃ ⁺², C28H25ClFeN4O⁺², C31H₃₈FeN₄O₃, C₂₉H₃₄FeN₄O₃, C₃₁H₄₁FeN₃O, C₂₈H₃₂FeN₄O₃,

C26H₂9FeN₃O₂, C2ôH₃oFeN20, C₃iH₃6FeN₄O₃, C₃oH₃5FeNs0₄, C29H₃5FeNsO₃, C₃2H₄iFeN5O₃, C₃₅H₃₈FeN₄O₃, C₃2H₄oFeN₄0₃, Ci9H₄₃BBr2F2FeO2, Ci9Hi₄BClF2FeO2, Ci9Hi₄BBrF2FeO2, Ci9Hi5BF2FeC>2, C2iH2oFe0₄, C2oH₄₈Fe0₃, C2oH₄₈Fe0₃, C2oH₄₈Fe0₃, CigHp^FeC^,

Ci9Hi₄Br2FeO2, CigHisBrFeC^, Ci₄Hi2FeO₃, C2iHi9BF2FeO₄, C2oHi₇BF2Fe0₃, C₂₀H₁₇BF₂FeO₃, C₂₀H₁₇BF₂FeO₃, C₁₉H₁₃BF₄FeO₂, C₁₉H₁₃BC12F₂FeO2, C2iH₂9AuCl₂FeN₄S⁺, C3oH24C12FeNg ², C22H2iC12FeN3 ², C23H22FeNg ², C2iH49FeN₇ ², C23H24FeNgO ², C47H6₄FeNi₄O9, C^HeoFeN^Oio, C₄iH5₃FeNnO₇, C₄₇H65FeNi5O₈, C₄5Hs9FeNi₃O9, C₄2H5₄FeNi2O₇, C₄₃H6₇FeNisO₈, C₄₈H6sFeNi₃O₈, C₄₇H6₄FeNi2O₈, C5₄H₇₇FeNi₇C>9, C₅₁H₇₁FeN₁₅O₁₀, C₁₉H₁₆FeO₂, C₄₄H₄₈FeN₉O₁₇P₃, C₁₃H₉Cl₂FeN₃O₆S, C₁₉H₁₅FeNO₃,

C₂₀H₁₈FeO₂, C₂₀H₁₈FeO₃, C₂₁H₂₀FeO₃, C₁₇H₂oFeN₂02, C₁₈H₁₅FeNO, C₁₇H₁₄FeOS,

C₁₇H₁₄FeOS, C₁₇H₁₄FeO₂, C22H₂₂FeO₄, C₂₀H₁₈FeO₂, C₂₀H₁₈FeO₂, C₁₉H₁₄Cl₂FeO, C₂iH₂₀FeO₃,

C₄₈H₂₈FeN₄O₈, C₁₇H₁₅FeNS, C₃₄H₃₀FeN₄O₄·², C₃₀H₂₆Br₂FeN₄O₄, C₁₀H₁₈FeN₂O₇ ⁺²,

C₁₄H₁₂FeO₄, C₄₄H₂₀Cl₈FeN₄, C₆₄H₆₄FeN₈O₁₂S₄, C₅₆H₅₆FeN₈O₈S₄, C₅₆H₄₄Br₈FeN₄,

C₅₆H₅₂FeN₄, C₅₂H₄₀FeN₈Oi₂S₄, C₄₄H₃₂FeN₈O₈S₄, or C₄₄H₂₈FeN₄. Dans d'autres cas, la source de fer a comme formule chimique CaHbFe_cOdNeSfBrgClhPiNajAskKiAl_mCmV_oIpBqF_rTe_sWt, où a, b, c, d, e, f, g, h, I, j, k 1, m, n, o, p, q, r, s, t sont des coefficients qui peuvent être égaux à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou tout autre nombre entier compris entre 21 et 1000000000000, où les atomes C, H, Fe, O, N, S, Br, Cl, P, Na, As, K, Al, Cr, V, I, B, F, Te et W occupent préférentiellement les première, deuxième, troisième, quatrième, cinquième, sixième, septième, huitième, neuvième, dixième, onzième, douze, treize ans, quatorzième, quinzième, seize ans, dix-septième, dix-huitième, dix-neuvième, vingtième positions, respectivement. Dans certains cas, au moins un atome de la formule chimique peut occuper l’une quelconque des vingt positions de la formule. Dans certains autres cas, la source de fer peut comprendre les groupes fonctionnels chimiques choisis dans le groupe comprenant: hydrocarbures, alcane (R(CH₂)nH), alcène (R₂C=CR₂), alcyne (RC=CR'), dérivé de benzène (RC₆H₅), groupes contenant des atomes d'halogène, haloalcane (RX), Groupes contenant de l'oxygène, Alcool (ROH), Carbonyle (RCOR'), Aldéhyde (RCHO), Halogénures d'acyle (RCOX), Carbonate (ROCOOR'), Carboxylate (RCOO-), Acide carboxylique (RCOOH), ester (RCOOR'), méthoxy (ROCH3), hydroperoxyde (ROOH), peroxyde (ROOR'), éther (ROR'), hémiacétal (RCH(OR')(OH)), hémiketal (RC(OR)(OH)R'), acétal (RCH(OR')(OR)), kétal (RC(OR)(OR)R'), orthoester (RC(OR') (OR)(OR')), hétérocycle (PhOCOPh), ester orthocarbonate (C(OR)(OR'(OR)(OR)), groupes contenant de l'azote, amide (RCONR2), amines (RNH2, R2NH, R3N, R4N+), imine (RC(=NH)R', RC(=NR)R', RC(=NH)H, RC(=NR')H, Imide ((RCO)2NR'), Azide (RN3), Composé azoïque (RN2R'), Cyanates (ROCN, RNCO), nitrates (RONO2), nitriles (RCN, RNC), nitrites (RONO), composés nitro (RNO2), composés nitroso (RNO), oximes (RCH=NOH), dérivés de la pyridine (RC5H4N), Groupes contenant du soufre, du thiol (RSH), du sulfure (RSR'), du disulfure (RSSR'), du sulfoxyde (RSOR'), du sulfone (RSO2R), de l’acide sulfinique (RSO2H), Acide sulfonique (RSO3H), thiocyanate (RSCN, RNCS), thiocétone (RCSR'), thial (RCSH), groupes contenant du phosphore, phosphine (R3P), acide phosphonique (RP(=O)(OH)2), phosphate (ROP)(=O)(OH)2), phosphodiester (HOPO(OR)2), groupes contenant du bore, acide boronique (RB(OH)2), ester boronique (RB(OR)2), acide borinique (R2BOH), ester borinique (R2BOR), et une combinaison de plusieurs de ces groupes. Dans d'autres cas, la source de fer peut être un agent chélateur du fer.

Dans certains cas, la quantité de source de fer est la quantité ou la concentration de la source de fer ou de fer, provenant préférentiellement de la source de fer, préférentiellement dans le ou les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

L'invention concerne également la méthode selon l'invention, dans laquelle le fer ou la source de fer dans le milieu de pré-croissance consiste en ou comprend du Fe²⁺ et/ou Fe³⁺.

Dans certains cas, une source de fer comprend du Fe²⁺ lorsqu'elle comprend Fe₂ dans sa formule chimique. Dans d'autres cas, une source de fer comprend Fe³⁺ lorsqu'elle comprend Fe3 dans sa formule chimique.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle la concentration de fer ou de la source de fer dans le milieu de pré-croissance est inférieure à 20 μΜ. Dans certains cas, la concentration de fer ou de la source de fer dans le milieu de pré-croissance est inférieure à 1O¹⁰⁰, 1O⁵⁰, 1O²⁰, 1O¹⁰, 10⁵, 10³, 10² ou 20 μΜ. Dans certains autres cas, la concentration de fer ou de la source de fer dans le milieu de pré-croissance est supérieure à 0, ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, 10'⁵, 10' \ 1, 5, 10 ou 20 pM. Dans d’autres cas encore, la concentration de fer ou de la source de fer dans le milieu de pré-croissance est comprise entre 10'⁵⁰ et ΙΟ⁵⁰, 10'¹⁰ et ΙΟ¹⁰, 10'¹⁰ et 10⁵, 10' ¹⁰ et 10³, ou entre 10'¹⁰ et 1 μΜ.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle le milieu de croissance comprend du fer ou au moins une source de fer, la nature et/ou la quantité de fer ou d'une source de fer permettant la production des nanoparticules par les cellules productrices de nanoparticules et la croissance cellulaire.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle la source de fer du milieu de croissance est la même que la source de fer du milieu de pré-croissance.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle la concentration de fer ou d'une source de fer dans le milieu de croissance est supérieure ou égale à la concentration de fer ou d'une source de fer dans le milieu de pré-croissance.

Dans certains cas, la concentration de fer ou de la source de fer dans le milieu de croissance est inférieure à 1O¹⁰⁰, 10⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 10² ou 20 pM. Dans certains autres cas, la concentration de fer ou de la source de fer dans le milieu de croissance est supérieure à 0, 10' ⁵⁰, 1O'²⁰, 10'⁵, 10’¹, 1, 5, 10 ou 20 pM. Dans d’autres cas encore, la concentration de fer ou de la source de fer dans le milieu de croissance est comprise entre 10'⁵⁰ et ΙΟ⁵⁰, 10'¹⁰ et 10¹⁰, 10' ¹⁰ et 10³, ou entre 10'¹⁰ et 1 pM.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle le milieu de croissance est alimenté par un milieu fed-batch.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le milieu fed-batch comprend au moins une source commune avec le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains cas, la concentration de cette source est égale ou supérieure d’au moins 1,00001, 1,1, 2, 5, 10, 10³ ou 10⁵ dans le milieu fed-batch que dans le milieu de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains autres cas, la concentration de cette source est au moins inférieure de 10⁵, 10³, 10, 1, 1,1 ou 1,00000001 dans le milieu fed-batch que dans le milieu de pré-croissance et/ou de croissance.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle le milieu fed-batch comprend du fer ou une source de fer ayant une concentration supérieure à 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10’¹, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 10³ ou 10⁵ μΜ. Dans certains autres cas, le milieu fed-batch comprend du fer ou une source de fer à une concentration inférieure à 10 ,10 ,10 ,10,10, 10' , 10' ¹⁰ ou ΙΟ'²⁰ μΜ. Dans encore d’autres cas, le milieu fed-batch comprend du fer ou une source de fer à une concentration comprise entre 10'⁵⁰ et ΙΟ⁵⁰, 10'¹⁵ et 10¹⁵, 10'¹⁰ et 10⁵, 10'⁵ et 10⁵, entre 10'³ et 10³ μΜ, ou entre 0,5 nM et 50 M, préférentiellement avant l'ajout du milieu fedbatch au milieu de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le milieu fed-batch est acide ou a un pH inférieur à 7, 6, 5, 4 ou 3, préférentiellement inférieur à 2. Dans certains cas, le milieu fed-batch a un pH supérieur à 0 ou 1.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle le milieu fed-batch est introduit dans le milieu de croissance à une vitesse comprise entre 10'¹⁵ litres par heure et 10¹⁵litres par heure ou entre 10'¹⁵ μΜ de fer par heure et 10¹⁵ μΜ de fer par heure. Dans certains cas, le fed-batch est ajouté au milieu de croissance à faible vitesse, préférentiellement à une vitesse inférieure à 1O¹⁰⁰, 10⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10², 10, 5, 1, 10'², 10'³, 10'⁵ ou 10'¹⁰ litre(s) de fed-batch ou μΜ de fer par minute, préférentiellement lorsque le nombre de divisions cellulaires dans le milieu de croissance est faible, préférentiellement inférieur à ΙΟ²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 10, 1 division(s) cellulaire(s) par seconde ou heure ou jour ou mois. Dans certains autres cas, le milieu fed-batch est ajouté au milieu de croissance à un débit élevé, préférentiellement supérieur à ΙΟ'¹⁰⁰, ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, 10'², 1, 5, 10, ΙΟ², ΙΟ³, 10⁵ ou 1O¹⁰ litre(s) de milieu fed-batch par minute ou μΜ de fer par minute, préférentiellement lorsque le nombre de division(s) cellulaire(s) dans le milieu de croissance est grand, préférentiellement supérieur àl, 2, 5, 10, 10, 10, 10 ou 10 division(s) cellulaire(s) par seconde ou heure ou jour ou mois Dans certains cas, entre deux sous-étapes de l’étape de croissance, le débit du milieu fed-batch diminue, préférentiellement par un facteur supérieur à 1,0000001, 1,00001, 1,0001, 1,01, 1,1, 1,2, 1,5 , 2, 5, 10, 10³, 10⁵, 10⁷ ou 10⁹. Dans certains autres cas, entre deux sous-étapes de l'étape de croissance, le débit du fed-batch augmente, de préférence d'un facteur supérieur à 1,0000001, 1,00001, 1,0001, 1,01, 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10, 10³, 10⁵, 10⁷ ou 10⁹.

Dans un mode de réalisation de l'invention, avant d'être ajouté au milieu de croissance, le milieu fed-batch a une concentration en fer supérieure d'au moins 1,000001, 1,001, 1, 1,5, 2, 5, 10, ΙΟ², 10³ ou 10⁵ à la concentration en fer du milieu de croissance.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, de préférence après avoir été ajouté au milieu de croissance, le milieu fed-batch fait partie du milieu de croissance.

L'invention concerne la méthode selon l'invention, dans laquelle le(les) milieu(x) de précroissance et/ou de croissance selon l'invention ne comprend ou ne comprennent qu'une seule vitamine choisie dans le groupe constitué de : la biotine, le pantothénate de calcium, l'acide folique, l'inositol, l’acide nicotinique, l’acide p-aminobenzoïque, pyridoxine HCl, la riboflavine, la thiamine HCL et tout dérivé de ces vitamines.

Dans certains cas, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance peut ou peuvent comprendre moins de 10⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 100, 75, 50, 25, 10, 5, 3, 2 ou 1 vitamines ou différentes vitamines. Dans certains cas, différentes vitamines peuvent être des vitamines comprenant au moins 1, 2, 5, 10, 10², 10³, 10⁵, ΙΟ¹⁰, 1O²⁰ ou 10⁵⁰ élément(s) chimique(s) différent(s). Dans certains autres cas, le ou les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent plus de 1, 2, 5, 10, 10², 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ vitamine(s) ou différente(s) vitamine(s).

Dans certains cas, la ou les vitamines peut ou peuvent être une ou des vitamine(s) soluble(s) dans l’eau. Dans certains autres cas, la ou les vitamines peut ou peuvent être une ou des vitamine(s) liposoluble(s). Dans d'autres cas encore, la ou les vitamines peut ou peuvent appartenir à la ou aux vitamines A, Bl, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12 ou C. Dans d'autres cas encore, la vitamine n'est pas produite par les cellules productrices de nanoparticules. Dans d'autres cas encore, la vitamine est une vitamine utilisée pour traiter une maladie telle qu'une maladie causée ou associée à une carence en vitamines.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, la ou les vitamines est ou sont choisie(s) dans le groupe constitué de: l'adénosylcobalamine, l'acide aminobenzoïque, l'acide ascorbique, la biotine, le calcium D-(+)-pantothénate, la carotène thiamine, les caroténoïdes bêta, le cholécalciférol (D3), Cyanocobalamine, Cyanacobalamine, Ergocalciférol (D2), Folates, Acide folique, Acide folinique, Hydroxocobalamine, Inositol, Menaquinones (K2), Méthylcobalamine, Niacinalide, Niacinamide, Nicotinamide, Acide Nicotinique, Acide dihydrogène, Pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine, acide p-thioctique, pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine, chlorhydrate de pyridoxine, rétine, acide rétinoïque, rétinol, riboflavine, thiamine, timaïne, tocophérol, ou tocotriénols, et un dérivé ou une combinaison de ces vitamines.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, au moins une vitamine comprise dans le milieu de croissance est la biotine, l'acide folique, la riboflavine, l'acide nicotinique ou la thiamine HCl.

Dans certains cas, la ou les vitamine(s) comprise(s) dans le milieu de pré-croissance est ou sont identique(s) à la ou aux vitamine(s) comprise(s) dans le milieu de croissance. Dans certains autres cas, la ou les vitamine(s) comprise(s) dans le milieu de pré-croissance est ou sont différente(s) de la ou les vitamine(s) comprise(s) dans le milieu de croissance.

L'invention concerne également la méthode selon l'invention, dans laquelle la concentration d'au moins une vitamine comprise dans le/les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance est inférieure à 1O¹⁰⁰, 1O⁵⁰, 1O²⁰, 1O¹⁰, 10⁵, 10³, 10, 1, ΙΟ’¹, ΙΟ'³, ΙΟ'⁴, ΙΟ'⁶, ΙΟ'⁹, ΙΟ'²⁰, 1O'⁵⁰ ou ΙΟ'¹⁰⁰ M, ou de préférence inférieure à 0,002 mol/L.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une vitamine ou un élément chimique compris dans au moins une vitamine à une concentration supérieure à ΙΟ'¹⁰⁰, ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, ΙΟ'⁴, 10'³ ou 10’¹, 1, 10, 10², 10³, 10⁵ ou 10¹⁰M.

L'invention concerne également la méthode selon l'invention dans laquelle le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent au moins une vitamine à une concentration inférieure, préférentiellement d'un facteur supérieur à 1.0001, 1.2, 1.5. 2, 5, 10, 10³ ou 10⁵, à la concentration de la source de carbone, d’azote, de soufre, de sulfate, de phosphore, de phosphate, de calcium, de potassium, de magnésium, d’oxygène, d’hydrogène et/ou de fer. Dans certains cas, les cellules ne nécessitent pas une grande concentration de vitamines pour croître, se diviser et/ou synthétiser des nanoparticules.

L'invention concerne également la méthode selon l'invention, dans laquelle le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent, par gramme ou ml de milieu de croissance, moins de: i) 1 mg d'extrait de levure, ii ), 1 mg d'au moins un composant d'extrait de levure, iii), 1 mg de peptone, iv), 1 mg d'au moins un composant de peptone, v), 1 mg d'agent CMR, vi), 1 mg d'au moins au moins un agent chélatant, vii), 1 mg d'au moins un acide aminé, viii), 1 mg d'un composé toxique ou cytotoxique et/ou ix), 1 mg d'au moins un métal lourd.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent une concentration en extrait de levure, peptone, agent

CMR, agent chélatant, acide aminé, composé toxique ou cytotoxique et/ou métal lourd, qui est inférieure à ΙΟ¹⁰⁰, ΙΟ⁵⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, ΙΟ⁵, 10², 10, 1, ΙΟ’¹, ΙΟ'³, 10'³ ou 10'⁵ pg d'extrait de levure, peptone, agent CMR, agent chélatant, acide aminé, et/ou métal lourd par litre ou millilitre de milieu de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains cas, cette situation peut se produire lorsque l'extrait de levure, la peptone, l'agent CMR, l'agent chélatant, les acides aminés, les composés toxiques ou cytotoxiques et/ou les métaux lourds, ont été enlevés ou ne sont pas compris dans le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le premier et/ou second milieu(x) comprend ou comprennent une concentration en extrait de levure, peptone, acide(s) aminé(s) et/ou métal/métaux lourd(s) supérieure(s) à ΙΟ'¹⁰⁰, ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'², 10’¹, 1, 10, 10³ ou 10⁵ pg d'extrait de levure, de peptone, d'acide(s) aminé(s) et/ou métal/métaux lourd(s) par litre ou millilitre de milieu de pré-croissance et/ou de croissance. Dans certains cas, cette situation peut survenir lorsqu'un extrait de levure, une peptone, un agent CMR, un agent chélatant, un acide aminé et/ou un métal lourd a ou ont été ajouté(s), préférentiellement involontairement, au(x) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de levure est ou comprend des peptides, des acides aminés, des bases de purine, des bases de pyrimidine et/ou des vitamines hydrosolubles du groupe B.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le ou les acides aminés sont l'alanine, l'arginine, l'asparagine, l'acide aspartique, la cystéine, la glutamine, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la leucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la phénylalanine, la proline, la sérine thréonine, le tryptophane, la tyrosine et/ou la valine.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le ou les métal/métaux lourd(s) est ou sont l'arsenic (As), le cadmium (Cd), le chrome (Cr), le cuivre (Cu), le mercure (Hg), le nickel (Ni), le plomb (Pb), le sélénium (Se) et/ou le zinc (Zn).

Dans un mode de réalisation de l'invention, le ou les agents cancérigènes, mutagènes ou toxiques pour la reproduction, également dénommé(s) agent(s) CMR, est ou sont préférentiellement l'acide nitriloacétique, le sel trisodique et/ou l'acide borique.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le composé toxique ou cytotoxique est un composé qui provoque la mort d'une cellule ou d'un organisme, préférentiellement des cellules productrices de nanoparticules, préférentiellement lorsqu'il est introduit dans le milieu de pré-croissance et/ou de croissance, préférentiellement à une concentration supérieure à 10' ¹⁰, 10'⁵, 10'², 1, 5, 10, 10³, 10 μΜ, préférentiellement à une concentration comprise entre 10'¹⁰et ΙΟ¹⁰ μΜ.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le milieu de pré-croissance et/ou de croissance ne comprend pas ou ne comprennent pas les minéraux sélectionnés dans le groupe constitué de: CôHôNOeNas, sel trisodique d'acide nitriloacétique, MnO₄S H2O, Manganèse(II) sulfate monohydraté, NaCl, chlorure de sodium, CON2O6 6H2O, nitrate de cobalt (II) hexahydraté, O₄SZn 7H₂O, sulfate de zinc heptahydraté, CuO₄S 5H₂O, sulfate de cuivre (II) pentahydraté, A1KO₈S₂ 12H₂O, sulfate de sodium d'aluminium, H₃BO₃, acide borique, Na₂MoO₄ 2H₂O, molybdate de sodium dihydraté, Cl₂Ni 6H₂O, chlorure de nickel (II) hexahydraté, Na₂SeO₃, sélénite de sodium, et un dérivé ou une combinaison d'un ou plusieurs de ces composés.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent une concentration en minéral/minéraux inférieure à 1O¹⁰⁰, 1O⁵⁰, 1O²⁰, O¹⁰, 10⁵, 10², 10, 1, ΙΟ’¹, 10'³ ou 10'⁵ pg de minéraux par litre ou millilitre de milieu de culture. Dans certains cas, cette situation peut se produire lorsque les minéraux ont été retirés du/des milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

Dans un mode de réalisation de l’invention, le premier et/ou le deuxième milieu de croissance comprend ou comprennent une concentration en minéraux, supérieure à IO'¹⁰⁰, IO'⁵⁰, 1O'²⁰, 10' , 10' , 10' , 10' , 1, 10, 10 ou 10 pg de minéraux par litre ou millilitre de milieu de culture.

Dans certains cas, cette situation peut se produire lorsque les minéraux ont été retirés, préférentiellement involontairement, du/des milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance. L'invention concerne également la méthode selon l'invention, qui comprend une étape supplémentaire de purification de nanoparticule(s) d'oxyde de fer de haute pureté en éliminant au moins une ou plusieurs impureté(s) de la ou des nanoparticule(s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape supplémentaire de purification des nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté consiste à éliminer les impuretés des nanoparticules et/ou à dénaturer et/ou à détruire les impuretés contenues dans les nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape supplémentaire de purification des nanoparticules est précédée d'une étape antérieure d'isolement ou d'extraction des nanoparticules des cellules. Dans certains cas, l'étape antérieure est une étape de récupération des nanoparticules. Dans certains cas, l'étape antérieure est réalisée: i) en mélangeant les cellules, obtenues préférentiellement à l'étape de croissance, avec un détergent tel que KOH ou NaOH, ii), en chauffant les cellules à une température supérieure à -270, - 250, -200, -150, -100, -50, -30, -10, -5, 0, 5, 10, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ °C ou compris entre -270 et 10¹⁰, -100 et 10⁵, ou entre 0 et 100 °C, iii), induisant un gradient de température supérieur à 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, 10'¹, 1, 2, 5, 10, 10³, 10⁵ ou 10¹⁰ °C par heure, minute ou seconde, ou compris entre 1O'⁵⁰ et 1O¹⁰ °C par heure, minute ou seconde, iii), en appliquant un pression sur les cellules, préférentiellement supérieure à 1, 10, 100, 500, 10³, ΙΟ⁴, ΙΟ⁵, ΙΟ⁶, ΙΟ⁷, ΙΟ⁸, 10⁹ ou 10⁹ atmosphère (s) ou comprise entre 1 et 10⁹ atmosphère (s), en utilisant par exemple une presse de French, et/ou iv), sonication des cellules, préférentiellement à une puissance supérieure à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'⁵, 10’¹, 1, 10, ΙΟ², ΙΟ³, 10⁵ ou 10¹⁰W.

Dans un autre mode de réalisation de l’invention, l’étape supplémentaire de purification des nanoparticules permet d’éliminer: i) un pourcentage en masse d’impureté(s) supérieur à 1O'²⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'², 10’¹, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 80 ou 90%, ou ii) plus de ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, 10'⁵, 10' \ 1,5, 10 , ΙΟ³, 10⁵ ou 1O¹⁰ pg d’impureté(s) par gramme de nanoparticule (s).

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les impureté(s), préférentiellement éliminée(s) par l'étape supplémentaire de purification des nanoparticules, est/sont du carbone ou du matériau carboné et/ou n’est pas ou ne sont pas de l'oxyde de fer. Préférentiellement, cette/ces impureté(s) est ou sont située(s) dans le revêtement des nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la ou les impureté(s) est ou sont éliminée(s) du noyau et/ou du revêtement des nanoparticules, préférentiellement du revêtement des nanoparticules. Préférentiellement, l’(les) impureté(s) qui est/sont éliminées est/sont une/des impureté(s) peu profonde(s). Dans d'autres cas, l’(les) impureté(s) qui est/sont éliminée(s) est/sont une/des impureté(s) profonde(s).

L'invention concerne également l'étape supplémentaire de la méthode de purification des nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté en éliminant au moins une ou plusieurs impuretés de la ou des nanoparticules, comprenant au moins deux étapes de chauffage dans lesquelles:

- Au cours de l'étape 1, la température des nanoparticules est augmentée à une température T_bpuis maintenue à T! pendant une durée de chauffage comprise entre 1 seconde et 20 ans, où Ti est comprise entre 150 °C et 250 °C.

- Au cours de l'étape 2, la température des nanoparticules est augmentée jusqu'à une température T₂, puis maintenue à T₂ pendant une durée de chauffage comprise entre 1 seconde et 20 ans, où T₂ est comprise entre 350 et 450 °C.

Dans certains cas, l’étape supplémentaire de la méthode de purification des nanoparticules d’oxyde de fer de haute pureté ou l’étape de chauffage peut être qualifiée de méthode de purification.

L'invention concerne une méthode d'élimination d'au moins une impureté de nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté, comprenant une étape supplémentaire entre les étapes 1 et 2, dans laquelle la température des nanoparticules est augmentée à une température T₃ et est ensuite maintenue à T₃ pendant un temps de chauffage compris entre 1 seconde et 20 ans, où T₃ est comprise entre 250 ° C et 350 ° C.

Dans certains cas, la température des nanoparticules est maintenue à la température Ti, T₂et/ou T₃ pendant une durée de chauffage inférieure à 100 ans, 50 ans, 20 ans, 10 ans, 5 ans, 2 ans, 1 année, 11 mois, 6 mois, 3 mois, 2 mois, 1 mois, 3 semaines, 2 semaines, 1 semaine, 6 jours, 5 jours, 3 jours, 1 jour, 23 heures, 12 heures, 6 heures, 1 heure, 50 minutes, 30 minutes, 20 minutes, 10 minutes, 5 minutes, 2 minutes, 1 minute, 50 secondes, 30 secondes, 10 secondes, 1 seconde, 1 milliseconde ou 1 microseconde. Dans d'autres cas, la température des nanoparticules est maintenue à la température Ti, T₂ et/ou T₃ pendant une durée de chauffage supérieure à 1 microseconde, 1 milliseconde, 1 seconde, 10 secondes, 30 secondes, 50 secondes. 1 minute, 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 1 heure, 6 heures, 12 heures, 23 heures, 1 jour, 3 jours, 5 jours, 6 jours, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 6 mois, 11 mois, 1 an, 2 ans, 5 ans, 10 ans, 20 ans, 50 ans ou 100 ans. Dans d'autres cas encore, la température des nanoparticules est maintenue aux températures Ti, T₂ et/ou T₃ pendant une durée de chauffage comprise entre 1 microseconde et 100 ans, 1 seconde et 20 ans, 1 seconde et 1 an, 1 seconde et 1 mois, 1 seconde et 1 jour, 1 minute et 1 jour, 5 minutes et 1 jour, 10 minutes et 12 heures, 30 minutes et 6 heures ou entre 30 minutes et 3 heures.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la durée de chauffage est supérieure à la durée pendant laquelle la température est augmentée jusqu'à T_b T₂ et/ou T₃, de préférence d'un facteur supérieur à 1,001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10. 10³, 10⁵ ou 10¹⁰.

Dans certains cas, T₃ est comprise entre -273 °C et 250 °C, -200 °C et 250 °C, -100 et 250 °C, 0 et 250 °C, 50 et 250 °C, 150 et 250 °C ou entre 180 et 220 °C. Dans d'autres cas, T₂ est comprise entre 200 et 10⁵, 250 et 10⁵, 300 et 10⁵, 350 et 10⁵, 350 et 10³, 350 et 500, 350 et 450, ou entre 360 et 400 °C. Dans certains cas, T₃ est comprise entre -273 et 10⁵, -200 et 10³, -100 et 500, -50 et 200, 0 et 500, 100 et 500, 200 et 500, 200 et 400, ou entre 250 et 350 °C.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, T₃ est compris entre T₃ et T₂. Dans certains cas, T₃ est inférieure à T₂, préférentiellement d’un facteur supérieur à 1 0001, 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10, 10³ ou 10⁵. Dans d’autres cas, T₃ est supérieure à T_b préférentiellement d’un facteur de plus de 1.0001, 1.1, 1.2, 1.5,2, 5, 10, 10³ ou 10⁵.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la température des nanoparticules est la température de l'appareil ou du four de chauffage utilisé pour chauffer les nanoparticules et/ou comprenant les nanoparticules, préférentiellement avant, pendant ou après le traitement des nanoparticules par la méthode de purification.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'intervalle de températures séparant T₃ et T₂, désigné par [T_b T₂], est tel que: i), les nanoparticules présentent la plus grande variation ou perte de poids ou de masse en fonction de la température et/ou ii), la dérivée de la variation de la perte de poids ou de masse des nanoparticules en fonction de la température est la plus grande.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le rapport %W(T₂)-%W(T₁)/(T₂-T₁), où %W(T₂) et %W(Ti) sont les pourcentages en poids ou en masse de la nanoparticules à T₂ et T_brespectivement, est supérieur à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'³⁰, ΙΟ'²⁰, ΙΟ'¹⁰, 10'⁵, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 1, 10 ou 105 %/°C. Dans certains cas, ce rapport est important lorsque le pourcentage en masse de carbone dans les nanoparticules, préférentiellement avant le traitement des nanoparticules par ou avec la méthode de purification, est important, préférentiellement supérieur à 10'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, ΙΟ'², 10’¹, 1, 5, 10, 20, 50, 75, 85, 95 ou 100%.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le rapport %W(T₂)-%W(T₁)/(T₂-T₁) est inférieur à ΙΟ⁵⁰, ΙΟ³⁰, ΙΟ²⁰, ΙΟ¹⁰, 10⁵, 10, 5, 2, 1, 0,5 0,05, 10'³, 10'⁵, 10'¹⁰ ou 1O'²⁰ %/°C. Dans certains cas, ce rapport est faible lorsque le pourcentage en masse de carbone dans les nanoparticules, préférentiellement avant le traitement des nanoparticules par ou avec la méthode de purification, est faible, préférentiellement inférieur à 100, 95, 80, 70, 50, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 10’¹, 10'³, 10'⁵, 10'¹⁰ ou 10'²⁰%.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la température des nanoparticules est maintenue à Ti, T₂ et/ou T₃, lorsque T_b T₂ et/ou T₃ varie ou varient de moins de 10⁵, 10³, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3, 2, 1, 10'⁵, 10'¹⁰ ou 10'²⁰%. Dans certains cas, pour chaque température T_b T₂ et/ou T₃, ce pourcentage est égal à T_maxi-T_mini/T_avi, où T_maxi, T_mini et T_avi (i = 1, 2, 3) sont les températures maximales, minimales et moyennes atteintes pendant la durée de chauffage ou pendant l'étape de chauffage, préférentiellement après ou lorsque la température est maintenue à une température T_b T₂ et/ou T₃. Dans certains cas, ce pourcentage est faible lorsque le four ou l'appareil de chauffage permet de maintenir la température stable sans grandes fluctuations et/ou lorsque les nanoparticules ne sont pas sujettes à des réactions endothermiques et/ou exothermiques. Dans certains cas, la réaction endothermique est une réaction dans laquelle de la chaleur ou de l’énergie est transférée du milieu entourant les nanoparticules aux nanoparticules. Dans d'autres cas, la réaction exothermique est une réaction dans laquelle de la chaleur ou de l'énergie est transférée des nanoparticules au milieu entourant les nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la température des nanoparticules n'est pas maintenue à T_b T₂ et/ou T₃, lorsque la température des nanoparticules varie de plus de 10⁵,

10³, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 , 3 , 2, 1, ΙΟ'⁵, ΙΟ'¹⁰ ou 10'²⁰%. Dans certains cas, ce pourcentage est grand lorsque le four ou l'appareil de chauffage ne permet pas de maintenir la température stable sans grandes fluctuations et/ou lorsque les nanoparticules sont sujettes à des réactions endothermiques et/ou exothermiques.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les températures ?! et/ou T₂ sont déterminées en:

i) mesurant la variation du pourcentage en poids ou en masse des nanoparticules en fonction de la température lorsque les nanoparticules sont chauffées entre deux températures T_t<t1 et T_t>t2, où T_t<ti est inférieure à Ti et T_t>t2 est supérieure à T₂.

ii) mesurant, représentant, considérant, examinant ou utilisant au moins un pic de la dérivée de la variation de ce pourcentage en fonction de la température, iii) estimant ou déduisant de la variation du pourcentage en poids ou en masse des nanoparticules en fonction de la température, l'intervalle de température dans lequel cette variation est maximale, où les températures minimale et maximale de cet intervalle sont T ! et T₂, respectivement, iv) estimant ou déduisant de la position d'au moins un pic dans le tracé de la dérivée de la variation du pourcentage en poids ou en masse des nanoparticules les deux températures T ! et T₂, conduisant aux valeurs minimales de la dérivée au début et à la fin du pic, respectivement, et T₃ menant à la valeur maximale de la dérivée au milieu du pic,

v) estimant ou déduisant de la position d'au moins un pic dans le graphique de le tracé du flux thermique des nanoparticules en fonction des températures, les températures T_b T₂, T₃, situées préférentiellement au début d’au moins un pic.

Dans certains cas, la température à laquelle ou pour laquelle le pic commence à présenter une augmentation de la dérivée de la variation du pourcentage en poids ou en masse des nanoparticules en fonction de la température est au début du pic. Dans certains autres cas, la température à laquelle ou pour laquelle le pic cesse de présenter une augmentation de la dérivée de la variation du pourcentage en poids ou en masse des nanoparticules en fonction de la température est la fin du pic.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le flux de chaleur des nanoparticules est le flux de chaleur produit par les nanoparticules ou libéré par les nanoparticules ou provenant des nanoparticules, préférentiellement lorsque les nanoparticules sont chauffées avec un appareil de chauffage tel qu'un four. Préférentiellement, le flux thermique peut être mesuré avec un appareil ou en utilisant une méthode thermo-analytique, ou en utilisant la thermoanalyse différentielle (DTA) ou en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage (DSC).

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape i de chauffage de la méthode de purification selon l'invention comprend au moins l'une des phases suivantes, dans laquelle:

- Au cours de la première phase, la température des nanoparticules augmente d'une température Ti à une température Ti_av, pendant un laps de temps tup,

- Au cours de la deuxième phase, la température des nanoparticules est maintenue à la température T_iav, pendant un laps de temps ti₂p,

- Au cours de la troisième phase, la température des nanoparticules est diminuée de T_iav à Tf, pendant un laps de temps fop.

Dans certains cas, Ti et/ou tiip est/sont au moins 1.0001, 1.1, 1.5, 2, 5, 10 ou 100 fois inférieur à Ti_av et/ou ti₂p. Dans certains cas, Ti_av est égale à Ti, T₂ ou T₃ et/ou tup est égal au temps de chauffage. Dans d'autres cas encore, T_f et/ou ti_3P ne diffère pas ou ne diffèrent pas d'un facteur supérieur à 1 0001, 1,1, 1,5, 2, 5, 10, 10² ou 10⁵ de Ti et/ou tup.

L'invention concerne également la méthode, préférentiellement de purification, selon l'invention, dans laquelle plus de 10% en masse de carbone ou de matière carbonée sont éliminés des nanoparticules, ce pourcentage étant égal à (%Cat/%Cbt)/%Cbt, où %Cat et %C_Bt sont les pourcentages de carbone ou de matière carbonée après et avant le traitement des nanoparticules avec la méthode, respectivement.

Dans certains cas, (%Cat-%Cbt)/%Cbt est supérieur à 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'⁵, ΙΟ'², 10’¹, 1, 5, 10, 50, 75, 90, 95 ou 99%. Cela peut être le cas lorsque la méthode de purification est efficace ou lorsque la quantité de carbone ou de matière carbonée comprise dans la nanoparticule avant traitement des nanoparticules par la méthode de purification est inférieure à un certain seuil, préférentiellement inférieure à 99, 90, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou 1%

Dans certains autres cas, (%Cat-%Cbt)/%Cbt est inférieur à 99, 90, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ou 1%. Cela peut être le cas lorsque la méthode de purification n’est pas efficace ou lorsque la quantité de carbone ou de matériau carboné comprise dans la nanoparticule avant traitement des nanoparticules avec la méthode de purification est supérieure à un certain seuil, préférentiellement supérieure à 99, 90, 70, 60. 50, 40, 30, 20, 10 ou 1%.

Dans quelques autres cas encore, (%Cat-%Cbt)/%Cbt est compris entre 0,1 et 100, 1 et 99, 10 et 99, 50 et 99, ou entre 80 et 99%.

L'invention concerne des nanoparticules à base d'oxyde de fer de haute pureté obtenues par la méthode selon l'invention.

L'invention concerne également des nanoparticules de haute pureté ou des nanoparticules de haute pureté qui ne sont pas obtenues par le procédé.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules de haute pureté, préférentiellement le revêtement de ces nanoparticules, comprennent: i) entre 0,8 et 0,999999999 g d'oxyde de fer par gramme de nanoparticule, et ii) entre 1O'⁴⁰ et 10⁵ pg d'impureté(s) par gramme de nanoparticule.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules de haute pureté comprennent un pourcentage en masse de carbone ou de matériau carboné inférieur à 90, 10, 5, 2, préférentiellement 1, 0,5, 0,4 ou 0,3%. Dans certains cas, un si faible pourcentage en masse de carbone permet de revêtir les nanoparticules d'un revêtement qui ne provient pas des cellules produisant des nanoparticules.

Dans un mode de réalisation de l'invention, la SAR des nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté est supérieure à 1O'¹⁰⁰, 10'⁵⁰, 1O'²⁰, 10'¹⁰, 10'⁵, 10'³, 10’¹, 1, 10, 10³ ou 10⁵ Watt par gramme de nanoparticules. Dans certains cas, la SAR des nanoparticules est la plus élevée lorsque la quantité d'impuretés dans les nanoparticules est la plus faible. Dans certains cas, la SAR des nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté est comprise entre 1O'¹⁰⁰ et ΙΟ¹⁰⁰, 10'¹et 10⁵, ou entre 0,1 et 10³ Watt par gramme de nanoparticules. Dans certains cas, la SAR des nanoparticules est proportionnelle à la pente, préférentiellement initiale, de la variation de température dans le temps des nanoparticules, (ΔΤ/ôt), préférentiellement entourée d'un milieu tel que l'eau, du matériel biologique, une partie du corps, ou tissu, où (ΔΤ/ôt) est estimé de préférence en °C/s., où SAR = a (ΔΤ/ôt). Dans certains cas, a = C_v/C_rai₁₀, où C_v est la capacité thermique spécifique, préférentiellement de l'eau, du matériel biologique, de la partie du corps ou du tissu, comprenant les nanoparticules, et Cnano est la concentration en nanoparticules ou la quantité ou le nombre de nanoparticules, comprises de préférence dans de l'eau, du matériel biologique, une partie du corps ou des tissus. Dans certains cas, la SAR est mesurée en exposant les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté à un rayonnement, de préférence un rayonnement qui produit de la chaleur, de préférence un laser, un champ magnétique, un champ magnétique alternatif, une onde acoustique, des ultrasons, une radiofréquence.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté ont une distribution de taille inférieure à 10⁵⁰, 1O²⁰, 10¹⁰, 10⁵, 10³, 10², 10, 1, 10'¹, 10'² ou 10'⁵nm. Dans certains cas, la distribution en taille des nanoparticules est faible lorsque la méthode selon l'invention permet la fabrication de nanoparticules présentant une faible distribution en taille.

Dans un autre mode de réalisation de l’invention, les nanoparticules d’oxyde de fer de haute pureté, préférentiellement à une concentration supérieure à ΙΟ'⁶, ΙΟ'³, ΙΟ’¹, 1 ou 10 mg de nanoparticules par ml, par mm³ ou par cellule, détruisent plus de 1, 10, 10³, 10⁶ ou 10⁹cellule(s).

L'invention concerne également des nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté produites à un rendement supérieur à ΙΟ'⁵⁰, ΙΟ'³⁰, ΙΟ'¹⁰, ΙΟ'⁵, ΙΟ'², 10’¹, 1, 5, 10, 50, ΙΟ², 10³ ou 10⁵ mg de nanoparticule(s) ou mg de fer compris dans une ou plusieurs nanoparticule(s), préférentiellement par cellule, préférentiellement par litre de milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

L'invention concerne également la ou les nanoparticule (s) obtenue(s) par la méthode selon l'invention, dans laquelle le rendement de production de nanoparticules est inférieur à 10⁵⁰, ΙΟ³⁰, ΙΟ¹⁰, ΙΟ⁵, 10², 10, 5, 1, ΙΟ’¹, ΙΟ'², 10'³ ou 10'⁵ mg de nanoparticule(s) ou mg de fer compris dans la(les) nanoparticule(s), préférentiellement par cellule, préférentiellement par litre de milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance.

L'invention concerne également une ou plusieurs nanoparticule(s) à base d'oxyde de fer de haute pureté selon l'invention, où la(les) nanoparticule(s) d'oxyde de fer de haute pureté est/sont un/des magnétosomes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les magnétosomes sont des nanoparticules produites par des bactéries magnétotactiques qui sont traitées préférentiellement de la manière suivante: i) les nanoparticules sont extraites et/ou isolées des bactéries, de manière à obtenir préférentiellement des magnétosomes comprenant des minéraux cristallisés entourés d'une membrane biologique, ii), la membrane biologique est retirée, préférentiellement en utilisant la méthode de purification, iii), les magnétosomes sont recouverts d'un revêtement ne provenant pas de la cellule produisant les nanoparticules pour la stabilisation, de manière à éviter que les magnétosomes s'agrègent et/ou sédimentent.

L'invention concerne également une composition, un médicament, un dispositif médical, une composition de diagnostic, une composition thérapeutique ou une composition cosmétique, comprenant la ou les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté selon l'invention.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté mènent à: i) une activité médicale ou thérapeutique, par exemple en permettant la destruction de cellules pathogènes, de virus, de bactéries, de cellules cancéreuses ou en étant moins toxiques pour les tissus sains que les organismes pathogènes, cellules, virus, bactéries, cellules cancéreuses, ii), une activité de diagnostic, par exemple en permettant la détection de cellules pathogènes, virus, bactéries, cellules cancéreuses, ou en étant moins toxique pour les tissus sains, et/ou, iii), une activité cosmétique, par exemple en améliorant l’apparence d’un être humain.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté sont non immunogènes ou non pyrogènes. Dans ce cas, de préférence, elles: i), attirent ou conduisent à l’apparition d’un faible nombre de cellules immunitaires, préférentiellement inférieures à 1, 5, 10, 10³, ΙΟ¹⁰, 1O⁵⁰ ou 1O¹⁰⁰ cellules immunitaires et/ou ii) produisent une augmentation de température d'un organisme vivant inférieure à 10⁵, 10³, 10², 50, 20, 10, 5, 2, 1 ou 0,1 °C.

Dans encore un autre mode de réalisation de l’invention, la ou les propriété(s) ou caractéristique(s), préférentiellement de la/des nanoparticule(s) ou de la méthode, décrite(s) dans chaque mode de réalisation individuel ou section ou phrase de cette demande de brevet peuvent être combinées pour aboutir à une combinaison de propriété(s) ou de caractéristique(s), préférentiellement de la/des nanoparticule(s) ou de la méthode

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, lorsqu'un composé tel que la nanoparticule ou l'élément chimique a une propriété dans une condition 1 (PI) qui est supérieure, plus longue ou plus grande d'un facteur a qu'une propriété dans une condition 2 (P2), cela signifie que Pl = α P2.

Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, lorsqu'un composé tel que la nanoparticule ou l'élément chimique a une propriété dans une condition 1 (PI) plus petite ou plus faible d'un facteur a qu'une propriété dans une condition 2 (P2), cela signifie que Pl = P2 / a.

L'invention sera en outre décrite par les exemples non limitatifs suivants.

Description des figures

Figure 1: Analyse TGA-DSC de bactéries magnétotactiques entières et de magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques selon la condition 2 de lyse, a), La variation du pourcentage en poids en fonction de la température ainsi que la dérivé de cette variation en fonction de la température pour un échantillon comprenant 3 mg de bactéries magnétotactiques lyophilisées lorsqu'il est chauffé entre 20 °C et 600 °C à une vitesse de 6 °C/min. (b), Flux de chaleur en mW en fonction de la température produit par un échantillon comprenant 3 mg de bactéries magnétotactiques lyophilisées lorsqu'il est chauffé entre 20 °C et 600 °C à une vitesse de 6 °C/min. (c), La variation du pourcentage en poids en fonction de la température ainsi que la dérivé de cette variation en fonction de la température pour un échantillon comprenant 3 mg de magnétosomes lyophilisés extraits de bactéries entières selon la condition 2 de lyse lorsque le l'échantillon est chauffé entre 20 °C et 600 °C à une vitesse de 6 °C/min. (d), flux de chaleur en mW en fonction de la température produit par un échantillon comprenant 3 mg de magnétosomes lyophilisés extraits de bactéries entières selon la condition 2 de lyse lorsque l'échantillon est chauffé entre 20 °C et 600 °C à une vitesse de 6 °C/min. En ce qui concerne les figures 1(a) et 1(c), l'axe des y peut être remplacé par le pourcentage en masse conduisant aux mêmes tracés.

Figure 2: Analyse TGA-DSC de magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques selon la condition 3 et de nanoparticules SIGMA synthétisées chimiquement, (a), Variation du pourcentage en poids en fonction de la température ainsi que la dérivé de cette variation en fonction de la température pour un échantillon comprenant 3 mg de magnétosomes lyophilisés extraits de bactéries magnétotactiques selon la condition 3. (b), Flux thermique en mW en fonction de la température produit par un échantillon comprenant 3 mg de magnétosomes lyophilisés extraits de bactéries magnétotactiques selon la condition 3. (c), Variation du pourcentage en poids en fonction de la température ainsi que la dérivée de la variation en fonction de la température d’un échantillon comprenant 3 mg de nanoparticules SIGMA lyophilisées, (d), Flux de chaleur en mW en fonction de la température produit par un échantillon comprenant 3 mg de nanoparticules SIGMA lyophilisées. En ce qui concerne les figures 2 (a) et 2 (c), l'axe des y peut être remplacé par le pourcentage en masse conduisant aux mêmes tracés.

EXEMPLES: MATÉRIEL ET MÉTHODES:

Mesures de la densité optique de suspensions de bactéries magnétotactiques entières pour évaluer la croissance bactérienne: La densité optique des différentes suspensions de bactéries magnétotactiques a été mesurée à 565 nm, appelée DO₅₆5nm, à l'aide d'un spectrophotomètre Secomam UviLine9400. La valeur d’DO₅₆5nm est proportionnelle aux concentrations de bactéries dans les suspensions.

Mesure de la réponse magnétique de bactéries magnétotactiques vivantes à l'aide d'observations au microscope optique de ces bactéries sous application d'un champ magnétique: 1 mL d'une suspension de bactéries magnétotactiques MSR-1 a été centrifugé à 14500 tours par minute pendant 10 minutes. Le milieu de croissance a été retiré et remplacé par un volume de PBS 0,lX pour atteindre une DOsesnm de 0,5. 1 pL de cette suspension de bactéries magnétotactiques MSR-1 a été déposé sur une lame de microscope parallélépipédique (Menzel-Glàser, 24 mm x 60 mm, 0,13-16 mm d'épaisseur) pour l'observation microscopique à l'aide d'un microscope optique Zeiss Primo Vert avec un grossissement X40. Quatre petits aimants cubiques en Neodinium de force 1,3 T (supermagnet, N42 W-10-N 10x10x10 mm) ont été placés sur la plate-forme du microscope à une distance d'environ 2 cm de la suspension bactérienne de manière à générer un champ magnétique parallèle à la position de l'observateur ou à la ligne séparant les deux jumelles (position 1) ou perpendiculaire à cette position (position 2). 20 secondes après le positionnement de l'aimant en position 1 ou 2, le pourcentage de bactéries alignées dans la direction du champ magnétique a été estimé, en considérant 200 bactéries magnétotactiques. Les bactéries qui n'étaient pas alignées dans la même direction que le champ magnétique généré par l'aimant ont été considérées comme non magnétiques. Leur nombre est désigné par πβνμ- Les bactéries qui étaient alignées dans la direction du champ magnétique généré par l'aimant étaient considérées comme magnétiques. Leur nombre a été désigné comme n_BM- Le pourcentage de bactéries magnétiques a ensuite été donné par πεμ/^βμ+πεκμ)· Une réponse magnétique positive des bactéries magnétotatiques correspondait à Πεμ^Πεμ+πεμμ) > 0,5. Une réponse magnétique négative des bactéries magnétotatiques correspond à Πβμ/(πβμ+πβνμ) < θ,5.

Mesure de la concentration en fer intracellulaire: La concentration en fer dans les bactéries magnétotactiques a été déterminée par un dosage destructif du fer. Pour cela, 2 ml de bactéries magnétotactiques MSR-1 ont été centrifugés à 14500 g pendant 10 minutes. Le culot bactérien a ensuite été lavé deux fois avec du PBS IX et de l'eau MilliQ. Après le deuxième lavage, le culot bactérien a été recueilli et 1 ml d'acide chlorhydrique 12N (HCl) a été ajouté au culot sous la hotte chimique. L'échantillon a été chauffé à 75 °C pendant 2 heures sous agitation à 300 tours par minute pour transformer le fer intracellulaire en ions Fe et Fe . Les ions Fe²⁺ ont ensuite été oxydés en Fe³⁺ avec du peroxyde d’hydrogène (H2O2) à 20%. La présence d'ions Fe³⁺ a été révélée par l'ajout de thiocyanate de potassium (KCN, 2 mol/L) dans un milieu acide, ce qui a conduit à la formation d'une solution rouge-orange dont la couleur dépend de la concentration de Fe³⁺ dans l'échantillon. Dès que le KCN a été ajouté, l'absorbance de la solution a été mesurée à 476 nm. La concentration en fer dans l'échantillon a ensuite été estimée à l'aide d'une relation déterminée entre la valeur de l'absorbance mesurée à 476 nm et la concentration en chlorure de fer (III). Cette méthode permet d’estimer la concentration totale en fer intracellulaire.

Analyse de la composition chimique élémentaire des magnétosomes par ICP-AES: Après la fermentation, les bactéries magnétotactiques MSR-1 ont été concentrées par filtration tangentielle dans un volume de 5 L pour atteindre une densité optique comprise entre 25 et 30. Les bactéries ont ensuite été lysées pendant 1 heure dans une solution de KOH 1 M sous agitation à 150 tours/minute à une température de 80 °C. Le lysat bactérien contenant les magnétosomes a été placé contre un aimant de Néodynium pendant 12 heures. Les magnétosomes ont ensuite été séparés du lysat bactérien et remis en suspension dans du PBS 10X. Cette procédure de lavage a été répétée deux fois avec du PBS 10X et trois fois dans de l'eau MilliQ. Les magnétosomes ont ensuite été lyophilisés et chauffés dans un four à moufle dans les conditions décrites ci-dessous pour obtenir une poudre de magnétosome comprenant des cristaux d'oxyde de fer de haute pureté avec une faible teneur en carbone. Pour l’analyse de la composition chimique élémentaire, une solution de 500 pg de cette poudre a été mélangée à 200 μΐ de HCl 12 N et à 10 ml de HN0₃ filtré à 2%. La mesure ICP-AES de la poudre indique la quantité d'éléments chimiques contenus dans les magnétosomes, en pg de ces éléments chimiques (Ag, Al, As, Ba, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb, Sb , Se, Si, Sn, Ti, Tl, W et Zn) par gramme de fer compris dans les magnétosomes.

Produits chimiques utilizes pour la preparation des milieu de croissance: Sulfate d'aluminium et de potassium dodécahydraté (A1K(SO₄)212H₂O, ref. NFG A6435, Merck); Hydroxyde d'ammoniac (NH₄0H, ref. NFG 1336-21-6, Acros Organics; ref. FG 105422, Merck); Chlorure d'ammonium (NH₄C1, ref. NFG A9434, Merck; ref. FG 1011420001, Merck); Sulfate d'ammonium ((NH₄)₂SO₄, ref. NFG A4418); Biotine (CioH₁₆N₂0₃S, ref. NFG B4639, Merck; ref. FG B301, Merck); Acide borique (H₃BO₃, ref. NFG B6768, Merck); Chlorure de calcium (CaCl₂, ref. NFG 223506, Merck; ref. FG 1.42002, Merck); Pantothénate de calcium (HOCH₂C(CH3)₂CH(OH)CONHCH₂CH₂CO₂ l/2Ca, reference FG C0400000, Merck); nitrate de cobalt(II) hexahydraté (nitrate de cobalt(II) hexahydraté, ref. FG 239267, Merck); Sulfate de cuivre (II) pentahydraté (CuChS 5H2O) (ref. NFG C8027, Merck), DLméthionine (CH3SCH₂CH₂CH(NH₂)COOH, ref. NFG M2768, Merck); DL-tryptophane (C_nH₁₂N₂O₂, ref. NFG T3300, Merck); EDTA ((HO₂CCH₂)₂NCH₂CH₂N(CH₂CO₂H)₂, ref. NFG E6758, Merck); Citrate ferrique (C₆H₅FeO₇, ref. NFG F3388, Merck; ref. FG B301, Merck); Acide folique (C₁₉H₁₉N₇O₆, ref. NFG F7876, Merck; ref. FG F0300000, Merck); Inositol (CeHnOe, ref. FGPHR1351, Merck); Sulfate de fer (II) heptahydraté (FeO4S.7H2O, ref. NFG F8633, Merck; ref. FG 1.03963, Merck); Oxalate de fer (III) hexahydraté (Fe₂(C₂O₄)3.6H₂O, ref. NFG 381446, Merck); L-histidine (C₆H₉N3O₂, ref. FG PHR1108, Merck); Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO₄.7H₂O, ref. NFG 63138, Merck; ref. FG 105882, Merck); Sulfate de manganèse (II) monohydraté (MnO₄S.H2O, ref. NFG M7899, Merck); chlorure de nickel(II) Hexahydraté (CLNi.ôHiO, ref. NFG N6136, Merck); L'acide nicotinique (C₆H₅NO₂, ref. NFG N4126, Merck); Sel trisodique de l'acide nitrilotriacétique (CeH₆NO6Na3, ref. NFGN0253, Merck); acide p-aminobenzoïque (H₂NC6H₄CO₂H, ref. NFG A9878, Merck); acide p-aminobenzoïque (K₂HPO₄, ref. NFGP8281, Merck; ref. FG 105101, Merck); Phosphate de potassium monobasique (KH₂PO₄, ref. NFG P9791, Merck); Protoporphyrine IX (C3₄H₃₄N₄O₄, ref. NFG P8293, Merck); Pyridoxine HCl (C₁₂H₁₇C1N₄OS.HC1, ref. NFG P9755, Merck); Riboflavine (C₁₇H₂₀N₄O₆, ref. NFG R9504, Merck; ref. FG PHR1054, Merck); Chlorure de sodium (NaCl, ref. NFG S7653, Merck); lactate de sodium (C₃H₅NaO3, ref. NFG L1375, Merck; ref. FG 106522, Merck); Molybdate de sodium dihydraté (Na₂Mo₄.2H2O, ref. NFG M1003, Merck); Sélénite pentahydraté de sodium (Na₂SeO₃.5H₂O, ref. FG 89771, Merck); Thiamine HCL (C₁₂H₁₇C1N₄OS.HC1, ref. NFG 47858, Merck, ref. FG PHR1037, Merck); extrait de levure (ref. NFG Y1625, Merck); Sulfate de zinc heptahydraté (O4SZn.7HzO, ref. NFG Z0251, Merck). NFG désigne les produits chimiques de qualité non pharmaceutique utilisés pour préparer le milieu de croissance; FG désigne les produits chimiques de qualité pharmaceutique utilisés pour la préparation du milieu de croissance. Nous avons également utilisé de l'eau déminéralisée (H₂0) avec une résistivité de 15 ΜΩ.

Composition des différents élixirs de minéraux: La composition des différents élixirs de minéraux (V0, CB1, V2, CB2, CB3, CB4, CB5, CB7, CB9, CB9, CB10, CB11, CB 12, CB 13) est donnée dans le tableau 6, où la quantité (en grammes) des différents produits chimiques utilisés pour préparer 1 litre de ces élixirs est indiquée.

Composition des différents extraits de levure: La composition des différents extraits de levure (YE, YNBWAA, YNBWoAA, YNBWoAA.AS) est donnée dans le tableau 7, où la quantité (en grammes) des différents produits chimiques utilisés pour préparer 1 litre de ces extraits de levures est indiqué. YNBWAA, YNBWoAA, YNBWoAA.AS désignent les extraits de levure réduits tandis que YE désigne les extraits de levure non réduite (référence: Y0875, Sigma). Le YE comprend les composés azotés, le carbone, le soufre, les oligoéléments, le complexe de vitamines B et d'autres facteurs de croissance importants.

Composition des différents cocktails de vitamines: La composition des différents cocktails de vitamines (VitlX, Vit5X, VitlOX, Vit0.5X, VitO.lX) est indiquée dans le tableau 8, où la quantité (en grammes) des différents produits chimiques utilisés pour préparer 1 litre de ces cocktails de vitamines est indiquée.

Composition du milieu de pré-croissance pour la condition 1 (tableau 1): Un litre de milieu de pré-croissance comprend dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 g d’extrait de levure YE (tableau 7) et 0,5 ml de l’un des élixirs de minéraux V0, CB1, V2, CB2, CB3, CB4, CB5, CB7, CB9, CB 10, CB11, CB 12, CB 13 (tableau 6).

Composition du milieu de croissance pour la condition 1 (tableau 1): Un litre de milieu de croissance comprend dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 g d'extrait de levure YE (tableau 7), 0,5 ml de l'un des élixirs de minéraux V0, CB1, V2, CB2, CB3, CB4, CB5, CB7, CB9, CB10, CB11, CB12 ou CB13 (tableau 6) et 10 mL de citrate ferrique (concentration initiale 20 mM).

Composition du milieu de pré-croissance pour la condition 2 (tableau 2): Un litre de milieu de pré-croissance comprend dans un litre d'eau déionisée: 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 g de l'un des extraits de levure YE, YNBWAA, YNBWoAA, YNBWoAA.AS (tableau 7) et 0,5 ml d'élixir de minéral CB3 (tableau 6).

Composition du milieu de croissance pour la condition 2 (tableau 2): Un litre de milieu de croissance comprend dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 g de l'un des extraits de levure YE, YNBWAA, YNBWoAA ou YNBWoAA.AS (tableau 7), 0,5 ml de minéral élixir CB3 (tableau 6) et 10 ml de citrate ferrique (concentration initiale 20 mM).

Composition du milieu de pré-croissance pour la condition 3 (tableau 3): Un litre de milieu de pré-croissance comprend dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 mL de l'une des vitamines VitlX, Vit5X, VitlOX, Vit5X, Vit0.5X ou VitO.lX (tableau 8) et 0,5 mL de minéral élixir CB3 (tableau 6).

Composition du milieu de croissance pour la condition 3 (tableau 3): Un litre de milieu de croissance comprend dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 ml d'un des cocktails vitaminés VitlX, Vit5X, VitlOX, Vit5X, Vit0.5X ou VitO.lX (tableau 8), 0,5 ml de minéral élixir CB3 (tableau 6) et 10 ml de citrate ferrique (concentration initiale de 20 mM).

Composition du support de pré-croissance pour la condition 4 (tableau 4): Un litre de milieu de pré-croissance comprend dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium,

O, 4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 mL de chacune des vitamines Bt, CP, FA, I, NA, AA,

P, R ou T (tableau 9), 0,5 ml de minéral élixir CB3 (tableau 6).

Composition du milieu de croissance pour la condition 4 (tableau 4): Un litre de milieu de croissance comprend dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 ml de chacune des vitamines Bt, CP, FA, I, NA, AA, P, R ou T (tableau 9), 0,5 ml de minéral élixir CB3 (tableau 6) et 10 ml de citrate ferrique (concentration initiale de 20 mM).

Composition du milieu de pré-croissance pour la condition 5 (tableau 5): La composition des différents milieux de pré-croissance avec diverses concentrations des composants principaux du milieu de pré-croissance, à savoir lactate de sodium, chlorure d'ammonium, sulfate de magnésium heptahydraté, phosphate de potassium dibasiques (N, SLO, SL0.5X, SL0.2X, SL0.1X, AC0, AC0.5X, AC0.2X, AC0.1X, MG0, MG0.5X, MG0.5X, MG0.2X, MG0. IX, P, P0.5X, P0.2X, PO.IX) est donné dans le tableau 5, où la quantité (en grammes) des différents produits chimiques utilisés pour préparer un litre de ces milieux de précroissance est indiquée.

Composition du milieu de pré-croissance, du milieu de croissance et du milieu fed-batch pour la condition 6, préparée à l'aide de produits chimiques de qualité non pharmaceutique (tableau 14 a)): Les milieux de pré-croissance Bl et B4 contiennent dans un litre d'eau déionisée 2,6 g de lactate de sodium, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 mL de cocktail de vitamines Vit 0.1X (tableau 8) et 0,5 mL de minéral élixir CB3 (tableau 6). Les milieux de croissance B1 et B4 comprennent dans un litre d’eau déminéralisée 104 g de lactate de sodium, 16 g de chlorure d’ammonium, 1,2 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 2,8 g de phosphate de potassium dibasique, 3,2 ml de cocktail de vitamines VitO.lX (Tableau 8). ), 2,8 mL de minéral élixir CB3 (tableau 6). Les milieux fed-batch B1 et B4 contiennent dans un litre d'eau 100 g d'acide lactique, 4,8 g d'ammoniac, 6 g de phosphate de potassium dibasique, 2,4 de sulfate de magnésium heptahydraté, 1 ml de cocktail de vitamines VitO.lX (tableau 8), 7 mL de minéral élixir CB3 (tableau 6) et soit 1,8 g de citrate ferrique (B 1) ou 2 g de chlorure de fer III (B4).

Composition du milieu de pré-croissance, du milieu de croissance et du milieu fed-batch pour la condition 6, préparée à l'aide de produits chimiques de qualité pharmaceutique (tableau 14 b)): Les milieux de croissance B2 et B3 contiennent dans un litre d’eau déionisée 2,6 g de sodium lactate, 0,4 g de chlorure d'ammonium, 0,1 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 0,5 g de phosphate de potassium dibasique, 0,1 mL de cocktail de vitamines Vit 0.1X (tableau 8) et 0,5 mL de minéral élixir CB3 (tableau 6). Les milieux de croissance B1 et B4 comprennent dans un litre d’eau déminéralisée 104 g de lactate de sodium, 16 g de chlorure d’ammonium, 1,2 g de sulfate de magnésium heptahydraté, 2,8 g de phosphate de potassium dibasique, 3,2 ml de cocktail de vitamines VitO.lX (Tableau 8). ), 2,8 mL de minéral élixir CB3 (tableau 6). Les milieux alimentés B1 et B4 contiennent dans un litre d'eau 100 g d'acide lactique, 4,8 g d'ammoniac, 6 g de phosphate de potassium dibasique, 2,4 de sulfate de magnésium heptahydraté, 1 ml de cocktail de vitamines VitO.lX (tableau 8). 7 ml d’élixir minéral CB3 (tableau 6) et soit 1,8 g de citrate ferrique (B2) soit 2 g de chlorure de fer III (B3).

Stock de bactéries magnétotactiques MSR-1 utilisées pour les différentes cultures: Les bactéries magnétotactiques MSR-1 sont commercialisées par la société DSMZ sous la référence DSM 6361. Après réception, les suspensions bactériennes MSR-1 ont été stockées à une densité DOsesnm (densité optique mesurée à 565 nm) de 0,01, ce qui correspond approximativement à une concentration bactérienne de 5.10 bactéries par ml de milieu de culture (Milieu DSMZ 380 utilisé pour cultiver la MSR-1 Magnetospirillum milieu de la souche DSMZ 6361) dans un congélateur à -80 °C dans des tubes de 15 ml (5 ml de suspension par tube) ou dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml (600 pL de suspension bactérienne par tube). Les suspensions de bactéries MSR-1 stockées dans le congélateur à -80 ⁰ C constituent le stock cellulaire.

Notation: le nombre X après D dans DX désigne le nombre de jours suivant le début de l'étape de pré-croissance, préférentiellement le jour où les bactéries magnétotactiques sont insérées dans le milieu de pré-croissance pour la première fois ou pendant la première sous-étape de l'étape de pré-croissance.

Exemple 1: Détermination du minéral élixir minéral minimum permettant la croissance bactérienne et la synthèse de magnétosomes : Cet exemple décrit le protocole expérimental utilisé pour réduire autant que possible la composition en minéral élixir tout en permettant la croissance des bactéries magnétotactiques MSR-1 et la synthèse de magnétosomes par ces dernières. Dans cet exemple, des produits chimiques de qualité non pharmaceutique ont été utilisés pour la préparation du milieu de croissance. La composition de 1 litre de milieux de pré-croissance et de croissance utilisés dans cet exemple (condition 1) est indiquée dans le tableau 1. Au cours du premier jour de l'expérience (Dl), une première étape consistait à recueillir les tubes de 15 ml contenant 5 ml de cellules MSR-1 provenant du congélateur à 80°C, à décongeler les tubes en les laissant à température ambiante pendant 10 minutes. Sous une hotte, nous avons recueilli dans ces tubes 100 μΐ de 5.10⁶ bactéries magnétotactiques MSR-1 que nous avons insérées dans un tube de 50 mL contenant 8 mL de milieu de précroissance filtré. Au total, 13 conditions de culture différentes ont été testées correspondant aux 13 différents élixirs de minéraux testés. Les tubes de 50 ml ont été incubés pendant 6 jours entre les jours Dl et D6 dans un incubateur à 29,5 °C dans des conditions d'agitation par secousses à 150 tours par minute. Une deuxième étape a consisté à ajouter une source de fer au milieu de croissance afin de permettre la synthèse de magnétosomes par la bactérie MSR-

1. Après 6 jours de pré-croissance, à D6, les tubes de 50 ml ont été placés sous une hotte. 30 ml de milieu de culture filtré ont ensuite été ajoutés aux tubes de 50 ml et les bactéries se sont développées entre D6 et D13. Une réponse magnétique positive à D13 et un rapport entre la densité optique à D13 et la densité optique à D6 supérieure à 1 ont été observés avec V0, V2, CB2, CB3, CB4, CB5, CB7, CB10, CB11, CB12, CB13 (condition 1). En revanche, aucune réponse magnétique n’a été observée pour les conditions CB1 et CB9, où les concentrations d'éléments chimiques qui composent les élixirs de minéraux sont inférieures à 10'⁵ g/1. En conclusion, le minéral élixir minéral minimal permettant la croissance de bactéries MSR-1 avec une augmentation importante de la densité optique OD565nmDi3/OD565nmD6 supérieur à 4,8 et la synthèse de magnétosomes (réponse magnétique positive) est CB 13, composé uniquement de sulfate de fer heptahydraté à une concentration de 1 g/1 et de chlorure de calcium à une concentration de 20 g/1.

Exemple 2: Détermination d'un milieu de croissance sans extrait de levure, permettant la croissance de bactéries magnétotactiques et la synthèse de magnétosomes: Cet exemple décrit le protocole expérimental utilisé pour déterminer le milieu réduit remplaçant l'extrait de levure permettant la croissance de bactéries magnétotactiques MSR-1 et la synthèse de magnétosomes par ces bactéries. Dans cet exemple, nous avons utilisé des produits chimiques de qualité non pharmaceutique pour la préparation du milieu de croissance. Les compositions des milieux de pré-croissance et de croissance, dans un litre d'eau déionisée, sont indiquées dans les tableaux 2 (condition 2), 3 (condition 3) et 4 (condition 4). Au cours du premier jour de l'expérience (Dl), une première étape consiste à collecter les tubes de 15 ml contenant 5 ml de cellules MSR-1 du congélateur à -80 ° C, à les décongeler en les laissant à température ambiante pendant 10 minutes. Sous une hotte, nous avons prélevé dans ces tubes 100 pl contenant 5.10⁶ bactéries magnétotactiques MSR-1 que nous avons insérées dans un tube de 50 ml contenant 8 ml de milieu de pré-croissance fdtré de l'une des conditions 2 (tableau 2), 3 (tableau 3), ou 4 (tableau 4). Les tubes de 50 ml ont été incubés pendant 6 jours entre les jours Dl et D6 dans un incubateur à 29,5 °C dans des conditions d'agitation par secousses à 150 tours par minute. Une deuxième étape a consisté à ajouter une source de fer au milieu de croissance afin de permettre la synthèse de magnétosomes par la bactérie MSR-1. Après 6 jours de pré-croissance, à D6, les tubes de 50 ml ont été placés sous une hotte. 30 ml de milieu de croissance filtré ont ensuite été ajoutés aux tubes de 50 ml (condition 2, tableau 2, condition 3, tableau 3, condition 4, tableau 4) à D6 et les bactéries se sont développées entre D6 et D13. Les tableaux 11 et 12 indiquent qu’une réponse magnétique supérieure à 90% à D13 et à un rapport entre la densité optique mesurée à D13 et la densité optique mesurée à D6 supérieure à 1 ont été observées pour les extraits de levure YE, YNBWAA, YNBWAA, YNBWoAA, YNBWoAA, YNBWoAA.AS (condition 2), pour VitlX, Vit0.5X, VitO.lX, (condition 3), biotine (Bt), acide folique (FA), acide nicotinique (NA), riboflavine (R), thiamine HCl (T ) (condition 4). En revanche, la réponse magnétique est 0 pour les conditions Vit5X, VitlOX (condition 3) et très faible pour les conditions CP, I, AA, P (condition 4). En conclusion, l'extrait de levure peut être remplacé par une seule vitamine, à savoir la biotine, l'acide folique, la riboflavine, l'acide nicotinique ou la thiamine HCl. Ces vitamines mènent à des valeurs de ODsftsnmni ₃/ODs6Snmr>6 de 9,8 (biotine), 2,9 (acide folique), 4,8 (riboflavine), 2,4 (acide nicotinique), 5,8 (thiamine HCl) et 90% de réponse magnétique (tableau 11).

Exemple 3: Détermination des concentrations minimales des composants principaux du milieu de croissance (lactate de sodium, chlorure d'ammonium, sulfate de magnésium, phosphate de potassium) permettant la croissance de bactéries magnétotactiques et la synthèse de magnétosomes par ces bactéries. Cet exemple décrit le protocole expérimental utilisé pour déterminer le milieu de croissance réduit, permettant la croissance des bactéries magnétotactiques MSR-1 et la synthèse de magnétosomes par ces bactéries. Dans cet exemple, nous avons utilisé des produits chimiques de qualité non pharmaceutique pour la préparation du milieu de croissance. Nous avons varié la concentration en lactate de sodium (conditions SLO, SL0.5X, SL0.2X, SLO.IX), chlorure de ammonium (ACO, AC0.5X, AC0.2X, ACO. IX), sulfate de magnésium heptahydraté (MGO, MGO. 5X, MG0.2X, MG0.1X), phosphate de potassium dibasique (PO, P0.5X, P0.2X, PO.IX). Les compositions chimiques et les concentrations des milieux de pré-croissance et de croissance N, SLO, SL0.5X, SL0.2X, SLO.IX, ACO, AC0.5X, AC0.2X, ACO.IX, MGO, MG0.5X, MGO ,2X, MGO.IX, PO, P0.5X, P0.2X, PO.IX, sont résumés dans le tableau 5 pour 1 litre de milieu de croissance. Au cours du premier jour de l'expérience (Dl), une première étape consiste à collecter les tubes de 15 ml contenant 5 ml de cellules MSR-1 du congélateur à -80 °C, à les décongeler en les laissant à température ambiante pendant 10 minutes. Sous une hotte, nous avons recueilli de ces tubes 100 μΐ contenant 5.10⁶ bactéries magnétotactiques MSR-1 que nous avons insérées dans un tube de 50 mL rempli de 8 mL de milieu de pré-croissance (condition 5, tableau 5). Les tubes de 50 ml ont été incubés pendant 6 jours entre les jours Dl et D6 dans un incubateur à 29,5 °C dans des conditions d'agitation par secousses à 150 tours par minute. Une deuxième étape a consisté à ajouter une source de fer au milieu de croissance afin de permettre la synthèse de magnétosomes par la bactérie MSR-1. Après 6 jours de précroissance, à D6, les tubes de 50 ml ont été placés sous une hotte. 30 ml de milieu de croissance filtré ont ensuite été ajoutés aux tubes de 50 ml à D6 et les bactéries se sont développées entre D6 et D13. Pour les conditions N, P0,5X, P0,2X, le rythme de croissance, ou rapport entre la densité optique mesurée à D13 et la densité optique mesurée à D6, était supérieur à 1 et une réponse magnétique positive (réponse magnétique > 90%) a été observé à D13. Cela indique que ces conditions ont permis aux bactéries de se développer et de produire des magnétosomes. En revanche, pour les conditions SLO, SL0.5X, SL0.2X, SLO. IX, ACO, AC0.5X, AC0.2X, ACO.IX, MGO, MG0.5X, MG0.2X, MGO.IX, PO.IX, PO, la synthèse des magnétosomes était très faible (réponse magnétique < 50%). En conclusion, la concentration en phosphate de potassium peut être réduite d'un facteur 2 ou 5 dans le milieu de croissance sans affecter la croissance et la production de magnétosomes. En effet, ces conditions mènent à des valeurs de ODs6Snmr>i 3/ODs6Snmr>6 valant 1,5 (condition P0,5X), 2,1 (condition P0,2X) et un pourcentage de réponse magnétique positive parmi les bactéries supérieure à 90% (tableau 13). En revanche, les concentrations des autres produits chimiques du milieu (chlorure d'ammonium, lactate de sodium, phosphate de magnésium) ne pourraient être réduites sans affecter de manière significative la croissance et/ou la réponse magnétique des bactéries magnétotactiques MSR-1.

Exemple 4: Détermination de la source de fer dans des fermenteurs de 1 litre permettant la croissance de bactéries magnétotactiques et la synthèse de magnétosomes par ces bactéries ainsi que la réduction des impuretés obtenues en utilisant des produits chimiques de haute qualité pharmaceutique pour la préparation du/des milieu(x) de précroissance et/ou de croissance. Cet exemple décrit le protocole expérimental utilisé pour déterminer la source de fer, qui permet la croissance de bactéries magnétotactiques MSR-1 et la synthèse de magnétosomes par ces bactéries, ainsi que la réduction des impuretés comprises dans les magnétosomes obtenus en utilisant des produits chimiques de grade pharmaceutique (condition 6). Dans cet exemple, nous avons utilisé des produits chimiques de qualité pharmaceutique pour préparer les milieux de croissance B2 et B3 (tableau 14 (b)) et des produits chimiques de qualité non pharmaceutique pour préparer les milieux de croissance B1 et B4 (tableau 14 (a)). Les compositions du milieu de pré-croissance, du milieu de croissance et du milieu fed-batch sont indiquées pour 1 litre de milieu dans les tableaux 14(a) et 14(b). Au cours de la première journée (Dl), une première étape de pré-croissance consiste à collecter 1 tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 600 pL de cellules MSR-1 du congélateur à 80 °C, à décongeler le tube en le laissant à température ambiante pendant 10 minutes. Sous une hotte, nous avons recueilli dans ces tubes 300 μΐ, comprenant 1.5.10⁷ bactéries magnétotactiques MSR-1, que nous avons insérées dans un flacon stérile de 500 mL rempli de 250 mL de milieu de croissance préalablement filtré. La bouteille de 500 ml a été incubée pendant 7 jours entre les jours Dl et D7 dans un incubateur à 29,5 °C. Une deuxième étape de pré-croissance a ensuite été réalisée dans une bouteille plus grande de 2 litres. Après 7 jours de pré-croissance, à D8, la bouteille de 500 ml a été placée sous une hotte. Le milieu de précroissance contenant les bactéries MSR-1 a été transféré manuellement dans un flacon stérile de 2 L rempli de 1,5 L de milieu de pré-croissance filtré pour la deuxième étape de précroissance. La bouteille de 2 L a été incubée pendant 1 jour entre D8 et D9 dans un incubateur à 29,5 °C dans des conditions d'agitation par secousses de 150 tours par minute. Au neuvième jour (D9), l’étape de croissance a commencé. Pour cela, 4 fermenteurs (conditions Bl, B2, B3, B4) de 1,5 L ont été remplis avec 780 mL d’eau déminéralisée et autoclavés. Les fermenteurs ont ensuite été remplis avec 20 ml de milieu de croissance filtré. Chacun des 4 fermenteurs (conditions Bl, B2, B3, B4) a ensuite été rempli avec 200 ml de milieu de précroissance contenant les bactéries MSR-1 provenant de la deuxième étape de pré-croissance.

Entre les jours D9 et DI 1, un milieu fed-batch acide comprenant une source de fer a été ajouté au milieu de croissance pour permettre la synthèse des magnétosomes par les bactéries MSR1, tout en maintenant le pH du milieu de croissance à 6,9. Au cours de l'étape de croissance, la température a été maintenue à 29,5 °C, le débit d'air à 0,05 mL/min et l'agitation à 200 tours par min. Les densités optiques mesurées à 565 nm des suspensions bactériennes à différents jours de l'étape de pré-croissance (D0 et D8) et de l'étape de croissance (D9, D10, DU) sont indiquées dans le tableau 15 pour les conditions Bl, B2, B3, et B4. Après la fermentation à D13, les cellules MSR-1 des fermenteurs Bl, B2, B3 et B4 (conditions Bl à B4) ont été concentrées par centrifugation à 4000 tours par minute pendant 45 min. Pour lyser les bactéries, les cellules MSR-1 des fermenteurs Bl, B2, B3, B4 ont été remises en suspension dans 15 ml d'une solution de KOH 1 M et chauffées à 80 °C pendant 2 heures dans un bain de sonication à 25 kHz dans des bouteilles en verre de 20 ml. Après la lyse bactérienne, les magnétosomes des cellules MSR-1 ont été séparés du matériau organique en utilisant un aimant au néodyme toute la nuit. A D14, les magnétosomes des conditions Bl, B2, B3 et B4 ont été lavés deux fois en utilisant 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate 10X et deux fois en utilisant 15 ml d'eau déionisée à l'aide d'un aimant au néodyme. Au cours de chaque lavage, les suspensions de magnétosomes ont été positionnées contre un aimant au néodyme pendant 2 heures pour attirer les magnétosomes. Les débris organiques contenant le surnageant ont été jetés et remplacés par 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate 10X ou 15 ml d'eau déionisée. A D16, après le dernier lavage, le surnageant a été jeté et les magnétosomes des conditions Bl, B2, B3, B4 ont été transférés dans des coupelles en céramique et séchés en les plaçant contre un aimant en néodyme toute la journée. A DI7, le liquide restant a été jeté et les magnétosomes ont été insérés dans des coupelles en céramique et placés dans un four à moufle et chauffés à 200 °C pendant 30 min, à 300 °C pendant 1 heure et à 380 °C pendant 1 heure. A DI7, environ 1 mg de magnétosomes purifiés des conditions Bl, B2, B3, B4 ont été insérés dans des tubes de 15 mL remplis avec 200 pL de HCL 12N. Les tubes de 15 ml contenant les magnétosomes ont été vortexés et incubés à la température ambiante pendant 2 heures, puis remplis de 9,8 ml de HN03 à 2%. Ensuite, la concentration en pg d’impuretés élémentaires par gramme de nanoparticules a été mesurée par ICP-AES. Les résultats de ces mesures sont indiqués dans le tableau 16 pour les conditions Bl, B2, B3, B4, où les impuretés élémentaires sont Ag (argent), Al (aluminium), As (arsenic), Ba (baryum), Cd (cadmium), Co (cobalt), Cr (chrome), Cu (cuivre), Mn (manganèse), Mo (molybdène), Ni (nickel), Pb (plomb), Sb (antimoine), Se (sélénium), Si (silice), Sn (étain), Ti (titane), Tl (tallium), W (tungstate), Zn (zinc). En conclusion, la condition B3 donne la plus grande valeur de ODsftsnmni i/ODs6Snmr>9 de 26,8 et un pourcentage de réponse magnétique positive chez les bactéries (> 90%) (tableau 15), indiquant que le chlorure de fer (III) est la meilleure source de fer. En outre, à l'exception du Pb, les concentrations d'impuretés élémentaires sont réduites dans la condition B3 dans laquelle des produits chimiques de qualité pharmaceutique ont été utilisés, par rapport à la condition B4 dans laquelle des produits chimiques de qualité non pharmaceutique ont été utilisés (tableau 16).

EXAMPLES 5 (méthode de purification):

MATÉRIEL ET MÉTHODES:

Remarque: dans cet exemple, le poids pourrait être remplacé par la masse, conduisant préférentiellement au même sens.Equipment used to analyze and heat the various samples: TGA-DSC: «Analyse thermogravimétrique» (TGA) couplée à la «Calorimétrie différentielle à balayage» (DSC) est utilisée pour mesurer le flux thermique (en mW) ou le pourcentage de perte de masse de poudres contenant des magnétosomes lyophilisés (traités ou non), bactéries entières lyophilisées, ou nanoparticules SIGMA lyophilisées en fonction de la température de chauffage de ces poudres. Pour les mesures, les poudres sont chauffées à une vitesse de 6 °C par minute entre 20 °C et 600 °C. La dérivée du pourcentage de la variation de masse de ces poudres est également représentée en fonction de la température. Les profds en TGA-DSC permettent de définir les températures pour lesquelles le matériau, de préférence un matériau organique, situé dans ou à la surface des magnétosomes ou des nanoparticules sera dégradé, enlevé des nanoparticules, ou transformé. Les analyses TGA et DSC ont été effectuées avec le SDT Q600 (instrument TA), qui consiste en une enceinte fermée, un four avec contrôle de la température, une micro-balance et un thermocouple pour mesurer la température.

CHNS: Analyseur de carbone élémentaire, d'hydrogène, azote, et de soufre. Les mesures CHNS sont effectuées à l'aide d'un analyseur CHNS (Flash Elemental Analyzer EA 1112 de Thermo Fischer Scientific) à l'aide d'une masse de 3 mg par mesure de magnétosomes lyophilisés (conditions de traitement n° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), bactéries entières lyophilisées, nanoparticules SIGMA lyophilisées (non traitées). Les mesures CHNS permettent de déterminer les pourcentages en masse de carbone et d’azote dans les différentes poudres.

Four: Un four à moufle (Nabertherm L9/11/B410) est utilisé pour chauffer 30 ou 500 mg de magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques à la suite des conditions n °1 ou 2 sans traitement thermique supérieur à 200 °C ou avec traitement thermique supérieur à 200 °C. (suivant les conditions n°3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11). Pour cela, la poudre de 30 ou 500 mg de chaque échantillon est déposée dans un récipient en porcelaine non recouvert et placée au centre du four. Un programme est utilisé pour effectuer les différentes conditions de chauffage. Le four permet de maintenir la température des nanoparticules ou la température à l'intérieur du four à une température donnée de plus ou moins 2 °C, ou le four permet d'obtenir une température stable entre 20 °C et 380 °C avec une fluctuation de 2 °C maximum.

Echantillon comprenant des bactéries magnétotactiques entières (échantillon 0): Des bactéries magnétotactiques obtenues à partir de la condition 1 (minéral élixir V2, tableau 1) ont été recueillies et concentrées à l'aide d'un système de filtration tangentielle à une densité optique mesurée à 565 nm (OD₅₆5nm), entre 100 et 200. L'échantillon 0 comprend des bactéries magnétotactiques entières concentrées.

Echantillons comprenant des magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques sans traitement thermique supérieur à 200 °C (échantillons 1 et 2):

Condition 1 de lyse (échantillon 1): 100 ml de l'échantillon 0, concentré à une DO₅₆5nm de 120, ont été mélangés à 400 ml de NaOH 5 M, soumis à une sonication, et chauffés à 60 °C pendant 1 heure à l'aide d'un bain à ultrasons pour lyser les bactéries. Les magnétosomes traités ont ensuite été isolés des débris bactériens en plaçant un aimant Neodinium une nuit contre la paroi du récipient contenant la suspension de bactéries lysées et en remplaçant le surnageant contenant le milieu et les débris bactériens par du PBS IX. La suspension résultante a ensuite été soniquée pendant 20 secondes à 10W en présence de PB S IX, placée contre un aimant de Neodinium pendant 15 minutes, le surnageant a été retiré et les magnétosomes traités ont été remis en suspension dans du PBS IX. Cette séquence de sonication et de séparation magnétique a été répétée quatre fois. Pour un fermenteur entier, ce traitement a été répété 10 fois dans 10 volumes différents. On a ainsi obtenu des chaînes de magnétosome pyrogènes extraites de bactéries magnétotactiques MSR-1, c'est-à-dire environ 500 mg de fer dans des magnétosomes compris dans 1,7 ml d'eau. L'échantillon 1 comprend des magnétosomes obtenus à partir de la condition 1 de lyse.

Condition 2 de lyse (échantillon 2): les bactéries magnétotactiques concentrées ont été congelées à -80 ° C pendant 48 heures. Après décongélation et dilution du concentré avec de l'eau MilliQ pour obtenir une DO₅₆5nm de 30, une quantité de KOH a été ajoutée pour obtenir les bactéries concentrées afin d'obtenir une concentration finale en KOH de IM. Cette solution a été transférée dans une bouteille de polypropylène (PP) et placée dans le bain-marie à 80 °C sous agitation à 150 tours par minute avec un tampon d'agitation mécanique (Fisher Scientific) pendant 30 minutes. Ensuite, le contenu de la bouteille a été transféré dans 4 autres bouteilles en verre de 2 L. Chaque bouteille a été placée contre un aimant NdFeB pendant 12 heures pour séparer magnétiquement les magnétosomes extraits des débris bactériens. Les magnétosomes ont ensuite été lavés 6 fois dans des bouteilles de 500 ml par sélection magnétique, jusqu'à obtention d'un surnageant clair. Les deux premiers lavages ont été effectués avec du PB S 10X, ce qui permet de revenir à un pH neutre. Ensuite, les quatre autres lavages ont été effectués avec de l'eau. Après la lyse, le pH basique du lysat, causé par le KOH, a été ramené à un pH neutre afin de ne pas endommager les magnétosomes. On a ainsi obtenu des chaînes de magnétosomes pyrogènes extraites de la souche MSR-1, à savoir environ 500 mg de magnétosomes en fer dans 1,7 ml. L'échantillon 2 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 2 de lyse.

Echantillons comprenant du magnétosome extrait de bactéries magnétotactiques et traités au phénol-chloroforme (condition 3):

Condition 3 de traitement (échantillon 3): 100 μΐ de la suspension contenant 30 mg de fer de magnétosomes obtenus à la suite de la condition 1 de lyse ont été mélangés à 200 ml d'une solution contenant 1% de Triton X-100 et 1% de SDS. Le mélange a été chauffé pendant une nuit à 50 °C, a été placé contre un aimant de Neodinium, le surnageant a été retiré et remplacé par 80 ml de phénol à pH 8. La suspension obtenue a été chauffée pendant 2 heures sous sonication à 60 ° C, pendant une nuit à 60 ° C sans sonication, placé contre un aimant, le surnageant de la suspension a été retiré et remplacé par 80 ml de chloroforme. La suspension contenant le chloroforme a été placée contre un aimant de Neodinium, le surnageant a été éliminé et le chloroforme résiduel adsorbé à la surface des magnétosomes traités a été éliminé par chauffage de ces magnétosomes pendant 2 heures sous une hotte. Enfin, les noyaux des magnétosomes ainsi obtenus ont été désorbés de la paroi de verre des tubes les contenant en ajoutant 80 ml de NaOH 1 M chauffés pendant 1 heure à 60 ° C dans un bain à ultrasons. La suspension contenant les noyaux des magnétosomes a été placée contre un aimant Neodinium. Le surnageant a été retiré et remplacé par de l'eau MilliQ stérile. La suspension a été traitée par ultrasons pendant 20 secondes à 10 W. Cette séquence de lavage a été répétée quatre fois. Des magnétosomes purifiés non-pyrogènes ont été obtenus dans un petit volume d’eau apyrogène. L'échantillon 3 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 3 du traitement.

Echantillons comprenant du magnétosome extrait de bactéries magnétotactiques et chauffés à des températures supérieures à 200 ° C (échantillons 4 à 11):

Condition 4 de traitement thermique (échantillon 4): 100 μΐ de la suspension contenant environ 30 mg en fer de magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques MSR-1 après la condition 2 de lyse ont été lyophilisés, introduits dans un creuset en porcelaine et cuits au four Nabertherm L9/11/B410. Le protocole de chauffage était le suivant. La température du four a été augmentée de 20 °C à 200 °C à une vitesse de 6 °C/min jusqu'à ce que la température du four atteigne 200 °C et la température dans le four a été maintenue à 200 °C pendant une heure. Ensuite, la température du four a été réduite de 200 °C à 25 °C en 12 heures. L’échantillon 4 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 4 du traitement.

Condition 5 de traitement thermique (échantillon 5): 100 μΐ de la suspension contenant environ 30 mg de fer de magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques MSR-1 après la condition 2 de lyse ont été lyophilisés, introduits dans un creuset en porcelaine et cuits au four Nabertherm L9/11/B410. Le protocole de chauffage était le suivant. La température du four a été augmentée de 20 °C à 400 °C à une vitesse de 6 ° C/min jusqu'à ce que la température du four atteigne 400 °C. La température dans le four a été maintenue à 400 °C pendant une heure. Ensuite, la température du four a été réduite de 400 °C à 25 °C en 20 heures. L'échantillon 5 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 5 du traitement.

Condition 6 de traitement thermique (échantillon 6): 100 μΐ d'une suspension comprenant 30 mg en fer de magnétosomes préparés selon la condition 2 de lyse ont été lyophilisés, puis introduits dans un creuset en porcelaine et chauffés au four Nabertherm L9/11/B410. Le traitement thermique était comme suit. La température du four a été augmentée de 20 °C à 200 °C en 20 minutes à une vitesse de 9 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 200 °C pendant 30 minutes. La température du four a ensuite été augmentée de 200 °C à 300 °C en 10 minutes à une vitesse de 10 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 300 °C pendant 1 heure. Ensuite, la température du four a été réduite de 300 °C à 25 °C en 12 heures. L'échantillon 6 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 6 du traitement.

Condition 7 de traitement thermique (échantillon 7): 100 μΐ d'une suspension comprenant 30 mg en fer de magnétosomes préparés selon la condition 2 de lyse ont été lyophilisés, puis introduits dans un creuset en porcelaine et chauffés au four Nabertherm L9/11/B410. Le traitement thermique était comme suit. La température du four a été augmentée de 20 °C à 200 °C en 20 minutes à une vitesse de 9 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 200 °C pendant 30 minutes. La température du four a ensuite été augmentée de 200 °C à 300 °C en 10 minutes à une vitesse de 10 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 300 °C pendant 1 heure. La température du four a ensuite été augmentée de 300 à 380 °C en 10 minutes à une vitesse de 8 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 380 °C pendant 1 heure. La température du four a ensuite été augmentée de 380 °C à 550 °C en 20 minutes à une vitesse de 8,5 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 550 °C pendant 1 heure. Ensuite, la température du four a été réduite de 550 °C à 25 °C en 20 heures. L'échantillon 7 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 7 du traitement

Condition 8 de traitement thermique (échantillon 8): 100 pl de la suspension contenant 30 mg en fer de magnétosomes préparés selon la condition 2 de lyse ont été lyophilisés, puis introduits dans un creuset en porcelaine et cuits au four Nabertherm L9/11/B410. Le traitement thermique était comme suit. La température du four a été augmentée de 20 °C à 200 °C en 20 minutes à une vitesse de 9 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 200 °C pendant 30 minutes. La température du four a ensuite été augmentée de 200 °C à 300 °C en 10 minutes à une vitesse de 10 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 300 °C pendant 1 heure. La température du four a été augmentée de 300 °C à 380 °C en 10 minutes à une vitesse de 8 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 380 °C pendant 1 heure. Ensuite, la température du four a été réduite de 380 °C à 25 °C en 12 heures. L'échantillon 8 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 8 du traitement.

Condition 9 de traitement thermique (échantillon 9): 100 μΐ de la suspension contenant 30 mg en fer de magnétosomes préparés selon la condition 1 de lyse ont été lyophilisés, puis introduits dans un creuset en porcelaine et chauffés au four Nabertherm L9/11/B410. Le traitement thermique était comme suit. La température du four a été augmentée de 20 °C à 200 °C en 20 minutes à une vitesse de 9 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 200 °C pendant 30 minutes. La température du four a ensuite été augmentée de 200 °C à 300 °C en 10 minutes à une vitesse de 10 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 300 °C pendant 1 heure. La température du four a été augmentée de 300 °C à 380 °C en 10 minutes à une vitesse de 8 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 380 °C pendant 1 heure. Ensuite, la température du four a été réduite de 380 °C à 25 °C en 12 heures. L'échantillon 9 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 9 du traitement.

Condition 10 de traitement thermique (échantillon 10): 1.7 ml d'une suspension contenant 500 mg en fer de magnétosomes préparés selon la condition n ° 2 de lyse ont été lyophilisés, puis introduits dans un creuset en porcelaine et chauffés au four Nabertherm L9/11/B410. Le protocole de traitement thermique était comme suit. La température du four a été augmentée de 20 °C à 200 °C en 2 heures 30 minutes à une vitesse de 1,2 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 200 °C pendant 1 heure. La température du four a ensuite été augmentée de 200 °C à 300 °C en lh20 à une vitesse de 1,25 °C/min. La température du four a ensuite été maintenue à 300 °C pendant 2 heures. La température du four a ensuite été augmentée de 300 °C à 380 °C en 1 heure 20 minutes à une vitesse de 1 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 380 °C pendant 2h. Ensuite, la température du four a été réduite de 380 °C à 25 °C en 12 heures. L'échantillon 10 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 10 de traitement.

Condition 11 de traitement thermique (échantillon 11): 1,7 ml d'une suspension contenant 500 mg en fer de magnétosomes préparés selon la condition η ° 1 de lyse, ont été lyophilisés puis introduits dans un creuset en porcelaine et chauffés au four Nabertherm L9/11/B410. Le traitement thermique était comme suit. La température du four a été augmentée de 20 °C à 200 °C en 2 heures et 30 minutes à une vitesse de 1,2 °C/min. La température du four a ensuite été maintenue à 200 °C pendant 1 heure. La température du four a ensuite été augmentée de 200 °C à 300 °C en lh20 à une vitesse de 1,25 °C/min. La température du four a ensuite été maintenue à 300 °C pendant 2 heures. La température du four a ensuite été augmentée de 300 °C à 380 °C en 1 heure 20 minutes à une vitesse de 1 °C/minute. La température du four a ensuite été maintenue à 380 °C pendant 2h. Ensuite, la température du four a été réduite de 380 °C à 25 °C en 12 heures. L'échantillon 11 comprend des magnétosomes obtenus après la condition 11 du traitement.

Nanoparticules de synthèse chimique (SIGMA, référence: 637106, n ° de lot: MKBK2270V): Une poudre de nanoparticules synthétisées chimiquement a été achetée chez SIGMA. Ils ont une taille de 35 ± 13 nm et comprennent, outre de l’oxyde de fer, 198 ppm d’aluminium (Al), 600 ppm de calcium (Ca), 74 ppm de chrome (Cr), 72 ppm de magnésium (Mg), 642,5 ppm de manganèse (Mn), 30 ppm de nickel (Ni), 128 ppm de sodium (Na), 34 ppm de titane (Ti), 8,3 ppm de vanadium (V), 56,5 ppm de zinc (Zn).

Résultats:

La figure 1 (a) montre le pourcentage de perte de poids d'un échantillon comprenant 3 mg de bactéries magnétotactiques MSR-1 entières lyophilisées (échantillon 0) en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 °C à 600 °C à une vitesse de 6 °C par minute, ainsi que la dérivée première de ce pourcentage. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil combiné TGA-DTA/DSC, mesurant à la fois le flux thermique en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage et les variations de masse en utilisant la thermogravimétrie en fonction de la température. Les mesures CHNS de 3 mg de bactéries magnétotactiques MSR-1 entières lyophilisées (échantillon 0) ont montré qu'elles contenaient un pourcentage élevé de carbone de 44%, avant d'être chauffées (Figure 3 (a)). Le pourcentage en poids de cet échantillon diminue de 100% à 20 °C à 5,5% à 600 °C, ce qui indique que l’échantillon perd la plus grande partie de sa masse entre 20 et 600 °C. Plus précisément, il apparaît sur la figure 1(a) que la pente de la variation du pourcentage de poids en fonction de la température est la plus grande dans deux plages de température: entre 200 et 400 °C (intervalle 1) et entre 400 et 540 °C (intervalle 2). Entre 200 et 400 ° C, la variation en fonction de la température de la pente du pourcentage de poids en fonction de la température affiche un double pic dont les maxima sont à 260 °C et 315 °C. Ce double pic pourrait être dû à la perte par l'ensemble des bactéries magnétotactiques de matière organique, préférentiellement de type 1, pour le pic centré à 260 °C et de matière organique, préférentiellement d'un type différent du type 1 tel que le type 2, pour le pic centré à 315 °C. Entre 400 et 540 °C, la variation en fonction de la température de la pente du pourcentage de variation de poids en fonction de la température affiche un pic. Ce pic pourrait être dû à la perte par les nanoparticules de matériau organique, préférentiellement d'un type différent du type 1 ou du type 2 tel que le type 3.

La Figure 1 (b) montre le flux thermique en milliwatt d'un échantillon comprenant 3 mg de bactéries magnétotactiques entières lyophilisées en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 ° C à 600 ° C à une vitesse de 6 ° C par minute. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil TGA-DSC. La figure 1 (b) montre deux pics avec le flux de chaleur maximum observé à des températures de 330 ° C et 500 ° C. Le pic centré à 330 ° C pourrait être attribué à la combustion de la masse de nanoparticules perdues ou éliminées des nanoparticules ou transformées entre 200 et 400 ° C. Le pic à 500 ° C pourrait être attribué à la combustion de la masse de nanoparticules perdue entre 500 et 540 ° C.

La Figure 1(c) montre le pourcentage de variation du poids d'un échantillon comprenant 3 mg de chaînes de magnétosomes lyophilisées préparées selon la condition 2 de lyse en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 °C à 600 °C à la vitesse de 6 °C par minute, ainsi que la dérivée première de ce pourcentage. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil TGA-DSC. Les mesures CEINS des chaînes de magnétosomes lyophilisées (condition n°2) ont montré qu'elles contiennent un pourcentage de carbone de 7% avant d'être chauffées, ce qui est bien inférieur au pourcentage de carbone de bactéries magnétotactiques entières (Figure 3(a)). Le pourcentage en poids de l'échantillon comprenant des chaînes de magnétosomes diminue de 100% à 20 °C à 91,4% à 600 °C, ce qui indique que l'échantillon comprenant des chaînes de magnétosomes perd beaucoup moins en masse, soit 8,6%, que l'échantillon comprenant les bactéries magnétotactiques entre 20 °C et

600 °C. Plus précisément, il apparaît sur la figure 1(c) que la pente de la variation du pourcentage en poids des chaînes de magnétosomes en fonction de la température est la plus grande dans la plage de températures de 200 à 400 °C. Entre 200 et 400 ° C, la variation en fonction de la température de la pente du pourcentage en poids des chaînes de magnétosomes en fonction de la température affiche un double pic dont les maximums sont à 260 °C et 315 °C, des positions similaires que ceux du double pic observé avec des bactéries entières. Ce double pic pourrait être dû à la perte par les chaînes de magnétosomes de matériau organique, préférentiellement du matériau organique de type 1, pour le pic centré à 260 °C, et de matériau organique, préférentiellement matériau organique de type 2 pour le pic centré à 315 °C, où cette matière organique provient probablement de la membrane organique entourant le noyau d'oxyde de fer minéral des magnétosomes. La figure 1 (d) montre le flux thermique en milliwatt d'un échantillon comprenant 3 mg de chaînes de magnétosomes lyophilisées en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 °C à 600 °C à une vitesse de 6 °C par minute. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil TGA-DSC. La figure 1(d) montre trois pics avec le flux thermique maximal observé à des températures de 250 °C, 360 °C et 525 °C. Les pics centrés à 250 °C et à 360 °C pourraient être attribués à la combustion de la masse de nanoparticules perdue entre 200 et 400 °C. Le pic à 525 °C pourrait être attribué à la combustion de la masse de nanoparticules perdues au-dessus de 500 °C et/ou à l'oxydation des magnétosomes à partir d'une composition d'oxyde de fer composée de magnétite, de maghémite ou d'une composition intermédiaire entre la magnétite. et de la maghémite en hématite, ce qui pourrait entraîner un dégagement de chaleur éventuellement causé par une réaction exothermique.

La figure 2(a) montre la variation du pourcentage en poids d'un échantillon comprenant 3 mg de magnétosomes lyophilisés (échantillon 3), préparé selon la condition 3 en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 °C à 600 °C à raison de 6 °C par minute, ainsi que la dérivée première de ce pourcentage. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil TGA-DSC. Les mesures CHNS de magnétosomes lyophilisés préparés selon la condition 3 ont montré qu’ils contenaient un pourcentage de carbone de 4% avant chauffage, ce qui est inférieur au pourcentage de carbone dans les magnétosomes préparés selon la condition 2. Le pourcentage en poids de l’échantillon comprenant des magnétosomes (échantillon 3) diminue de 100% à 20 °C à 95,1% à 600 °C, ce qui indique que l’échantillon 3 comprenant des magnétosomes préparés selon la condition 3 perd moins de poids, c’est-à-dire 4,9%, que l’échantillon 2 contenant des magnétosomes préparé selon la condition 2. Plus précisément, il apparaît sur la figure 2 (a) que la pente de la variation du pourcentage de poids en fonction de la température est la plus grande dans la plage de températures de 200 à 400 °C. Entre 200 et 400 °C, la variation en fonction de la température de la pente du pourcentage en poids en fonction de la température affiche un pic quadruple dont les maxima sont à 264 °C, 286 °C, 325 et 331 °C. Les deux pics à 264 °C et 325 °C peuvent être associés à des épaulements de pics. Ce quadruple pic pourrait être dû à la perte par les nanoparticules de matériau organique, préférentiellement de type 1, pour le pic centré à 264 °C, de matériau organique, préférentiellement de type 3, pour le pic centré à 286 °C, de matériau, préférentiellement de type 2 pour le pic centré à 325 °C, et de matériau organique, préférentiellement de type 4, pour le pic centré à 331 °C, lorsque ce matériau organique provient probablement d'une matière organique entourant ou se trouvant à la surface du noyau d'oxyde de fer minéral des magnétosomes. La figure 2(b) montre le flux thermique en milliwatt d'un échantillon comprenant 3 mg de magnétosomes lyophilisés, préparé conformément à la condition 3 (Sample3), en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 °C à 600 °C à raison de 6 °C par minute. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil TGA-DSC. La figure 2(b) montre quatre pics avec le flux thermique maximal observé à des températures de 277 °C, 335 °C, 455 °C et 522 °C. Les pics centrés à 277 °C et à 335 °C pourraient être attribués à la combustion de la masse de nanoparticules perdue entre 200 et 400 °C. Les pics à 455 et 522 °C pourraient être attribués à la combustion de la masse de nanoparticules perdue au-dessus de 500 °C et/ou à l'oxydation des magnétosomes d'une composition d'oxyde de fer composée de magnétite, de maghémite ou d'une composition intermédiaire entre la magnétite et la maghémite en hématite, ce qui pourrait entraîner un écoulement de chaleur éventuellement causé par une réaction exothermique.

La figure 2 (c) montre la variation du pourcentage en poids d'un échantillon comprenant 3 mg de poudre de nanoparticules SIGMA, achetée chez Merck Sigma, en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 °C à 600 °C à la vitesse de 6 °C par minute, ainsi que la dérivée première de ce pourcentage. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil TGA-DSC. Les mesures CEINS de nanoparticules SIGMA lyophilisées ont montré qu’elles contenaient un pourcentage de carbone de 0,3% avant chauffage, ce qui est inférieur au pourcentage de carbone dans les magnétosomes préparés selon la condition 3 (échantillon 3). Le pourcentage en poids de l'échantillon comprenant les nanoparticules SIGMA diminue de 100% à 20 °C à 98,7% à 600 °C, ce qui indique que l'échantillon contenant des nanoparticules SIGMA perd moins de masse, soit 1,3%, que les magnétosomes préparés selon les conditions 2 et 3. Plus précisément, il apparaît sur la figure 2(c) que la pente de la variation du pourcentage en poids de nanoparticules SIGMA en fonction de la température est la plus grande dans la plage de températures de 200 à 400 °C. Entre 200 et 400 °C, la variation en fonction de la température de la pente du pourcentage en poids de nanoparticules SIGMA en fonction de la température affiche un pic dont le maximum est à 296 °C. Ce pic pourrait être dû à la perte par les nanoparticules de matériau organique, préférentiellement de type 5, ce matériau organique pouvant provenir d'un matériau organique adsorbé à la surface ou compris dans ou à la surface des nanoparticules SIGMA. La figure 2 (d) montre le flux thermique en milliwatt d'un échantillon comprenant 3 mg de poudre de nanoparticules SIGMA en fonction de la température de l'échantillon, lorsque la température de l'échantillon est augmentée de 20 °C à 600 °C à une vitesse de 6 °C par minute. Ces mesures ont été effectuées avec un appareil TGA-DSC. La figure 2(d) montre deux pics avec le flux de chaleur maximal observé à des températures de 200 °C et 515 °C. Le pic centré à 200 °C pourrait être attribué à la combustion de la masse de nanoparticules perdue entre 200 et 400 °C. Le pic centré à 515 °C pourrait être attribué à la combustion de la masse de nanoparticules perdue au-dessus de 500 °C et/ou à l'oxydation des magnétosomes d'une composition d'oxyde de fer composée de magnétite, de maghémite ou d'une composition intermédiaire magnétite et maghémite en hématite, pouvant entraîner un dégagement de chaleur éventuellement provoqué par une réaction exothermique résultant de l'oxydation.

Détermination des différents types d'impuretés, préférentiellement de matières organiques, pouvant être éliminées, libérées ou dissociées des nanoparticules: Chaque température correspondant ou conduisant à la valeur maximale de la dérivée de la variation du pourcentage en poids de magnétosomes ou de nanoparticules Sigma en fonction de la température pourrait être associé à un certain type de matériau organique qui est retiré des nanoparticules. Ainsi, en connaissant les valeurs de ces températures, il est possible de comparer entre différents échantillons, le type de matériau organique pouvant être éliminé des nanoparticules.

Détermination des températures auxquelles les magnétosomes ont été chauffés dans le four: Dans les différents échantillons étudiés (bactéries magnétotactiques entières, Fig. 1(a), chaînes de magnétosomes extraites de bactéries magnétotactiques, Fig. 1(c), magnétosomes extraits et chauffés Fig. 2(a)), la majeure partie de la matière organique est extraite ou libérée des magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques entre 200 et 400 °C, c’est-à-dire la variation de poids (%) et la dérivée de la variation du poids (%/°C) sont les plus élevés dans cette plage de température. Nous avons donc choisi de chauffer les magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques à différentes températures comprises entre 200 et 400 °C.

Détermination de la méthode de lyse conduisant à la plus faible quantité de carbone dans les magnétosomes: Les magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques avec KOH ont une quantité de carbone inférieure à celle du magnétosome extrait de bactéries magnétotactiques avec NaOH (7,1% avec KaOH, échantillon 2, par rapport à 14% avec NaOH, échantillon 1). Les magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques avec du KOH et chauffés à 200 °C pendant 30 minutes, à 300 °C pendant 1 heure et à 380 °C pendant 1 heure ont un pourcentage de carbone inférieur à celui des magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques avec NaOH et chauffés à 200 °C pendant 30 minutes, 300 °C pendant 1 heure et 380 °C pendant 1 heure (0,3% avec KOH, échantillon 8, comparé à 1% avec NaOH, échantillon 9). Les magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques avec KOH et chauffés à 200 °C pendant 1 heure, à 300 °C pendant 2 heures et à 380 °C pendant 2 heures ont un pourcentage de carbone inférieur à celui des magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques avec NaOH et chauffés à 200 °C pendant 1 heure, 300 °C pendant 2 heures et 380 °C pendant 2 heures (0,23% avec KOH, échantillon 10, comparé à 0,8% avec NaOH). Cela indique que KOH est la meilleure méthode de lyse pour obtenir un faible pourcentage de carbone dans les magnétosomes et donc pour obtenir un niveau élevé de purification. Les magnétosomes extraits de bactéries magnétotactiques à l'aide de NaOH puis purifiés par une méthode chimique au phénol et au chloroforme possèdent un pourcentage de carbone supérieur à celui des magnétosomes extraits de bactéries magnétoatctiques à l'aide de NaOH et chauffés à 200 °C pendant 30 minutes. 300 °C pendant 1 heure et 380 °C pendant 1 heure (1% de carbone avec l'échantillon 9 comparé à 5% de carbone avec l'échantillon 3).

Détermination de la température de chauffage conduisant à la plus faible quantité de carbone dans les magnétosomes: Considérant les magnétosomes lysés avec du KOH, les chauffer à 400 ° C pendant 1 heure entraîne une quantité de carbone inférieure à celle obtenue lorsqu’ils sont chauffés à 200 °C pendant 1 heure (3% de carbone à 400 °C, échantillon 5, comparé à 5% de carbone à 200 °C, échantillon 4), indiquant que l'augmentation de la température de chauffage permet d'éliminer plus de carbone.

Détermination du nombre d'étapes de chauffage conduisant à la plus faible quantité de carbone dans les magnétosomes: Considérant les magnétosomes lysés avec KOH, les chauffer à deux températures différentes de 200 et 300 °C (échantillon 6) ou trois températures différentes de 200 °C , 300 °C et 380 °C (échantillon 8), permet d’éliminer plus de carbone que les chauffer uniquement à une température (il reste 0,65% de carbone dans les magnétosomes lorsqu’ils sont chauffés à 200 °C et 300 °C, échantillon 6 et il reste 0,3% de carbone dans les magnétosomes lorsqu’ils sont chauffés à 200, 300 et 380 °C, échantillon 8). Ceci suggère que pour atteindre un niveau bas de carbone dans les magnétosomes, ceux-ci peuvent être chauffés à plus de deux températures différentes comprises entre 200 °C et 380 °C, telles que 200 °C, 300 °C et 380 °C.

Détermination du temps de chauffage conduisant à la plus faible quantité de carbone dans les magnétosomes: Considérant les magnétosomes lysés avec du KOH et chauffés à 200 °C, 300 °C et 380 °C, augmenter le temps de chauffage à 200 °C de 30 minutes à 1 heure et augmenter la durée de chauffage à 300 °C et à 380 °C de 1 heure à 2 heures, diminuent légèrement le pourcentage de carbone restant dans les magnétosomes après traitement thermique (0,23% pour l’échantillon 10 par rapport à 0,3% pour l’échantillon 8).

En conclusion, nous avons développé une méthode de chauffage de nanoparticules, appelées magnétosomes, produites par des cellules spécifiques appelées bactéries magnétotactiques, qui permet d’atteindre un très faible pourcentage de carbone, similaire à celui trouvé dans les nanoparticules synthétisées chimiquement, qui ne sont pas synthétisées par des cellules.

TABLES:

Table 1: Compositions dans un litre d'eau des milieux de pré-croissance et de croissance utilisés pour cultiver les bactéries magnétotactiques MSR-1 dans des tubes de 50 millilitres suivant la condition 1. Dans cette condition, 13 milieux de pré-croissance et 13 milieux de croissance différents ont été préparés en utilisant 13 élixirs de minéraux différents (VO, CB1, V2, CB2, CB3, CB4, CB5, CB7, CB9, CB10, CB11, CB12, CB13), dont la composition dans un litre d’eau déionisée est donnée dans le tableau 6.

Table 2: Compositions dans un litre d'eau des milieux de pré-croissance et de croissance utilisés pour cultiver les bactéries magnétotactiques MSR-1 dans des tubes de 50 millilitres suivant la condition 2. Dans cette condition, 4 milieux de pré-croissance et 4 milieux de croissance différents ont été préparés en utilisant 4 extraits de levure différents (YE, YNBWAA, YNBWoAA, YNBWoAA.AS), dont la composition dans un litre d’eau déionisée est donnée dans le tableau 7.

Table 3: Compositions dans un litre d'eau des milieux de pré-croissance et de croissance utilisés pour cultiver les bactéries magnétotactiques MSR-1 dans des tubes de 50 millilitres suivant la condition 3. Dans cette condition, 5 milieux de pré-croissance et 5 milieux de croissance différents ont été préparés en utilisant 5 cocktails de vitamines différentes (VitIX, Vit5X, VitlOX, Vit0.5X, VitO.lX), dont la composition dans un litre d’eau déionisée est donnée dans le tableau 8.

Table 4: Compositions dans un litre d'eau des milieux de pré-croissance et de croissance utilisés pour cultiver les bactéries magnétotactiques MSR-1 dans des tubes de 50 millilitres suivant la condition 4. Dans cette condition, 9 milieux de pré-croissance et 9 milieux de croissance différents ont été préparés en utilisant 9 vitamines différentes (Bt, CP, FA, I, NA, AA, P, R, T), dont la composition en un litre d’eau déionisée est donnée dans le tableau 9.

Table 5: Compositions dans un litre d'eau des milieux de pré-croissance et de croissance utilisés pour cultiver les bactéries magnétotactiques MSR-1 dans des tubes de 50 millilitres suivant la condition 5. Dans cette condition, 4 concentrations différentes de lactate de sodium (SLO, SL0.5X, SL0.2X, SLO.IX), chlorure d'ammonium (A0, A0.5X, A0.2X, A0.IX), sulfate de magnésium heptahydraté (MG0, MG0.5X, MG0.2X, MG0.1X), phosphate de potassium dibasique (PO, P0,5X, P0,2X, PO,IX) ont été testés.

Table 6: Compositions dans un litre d'eau des différents élixirs de minéraux (VO, CB1, V2, CB2, CB3, CB4, CB5, CB7, CB9, CB10, CB11, CB12, CB13).

Table 7: Composition dans un litre d'eau des différents extraits de levure (YE, YNBWAA, YNBWoAA, YNBWoAA.AS).

Table 8: Compositions dans un litre d’eau de différents cocktails de vitamines (VitlX, Vit5X, VitlOX, Vit0.5X, VitO.lX).

Table 9: Compositions dans un litre d'eau des différentes vitamines (Biotine Bt, Pantothénate de calcium CP, Acide folique FA, Inositol I, Acide nicotinique NA, Acide p-aminobenzoïque AA, Pyridoxine HCl P, Riboflavine R, Thiamine HCl T) .

Table 10: Pour la condition 1, densité optique mesurée à la fin de l'étape de pré-croissance, 6 jours après le début de la croissance, OD_D6, ou 13 jours après le début de la croissance, OD_d13, rapport OD_d13/OD_D6 et pourcentage de réponse magnétique.

Table 11: Pour les conditions 2 et 3, densité optique mesurée à la fin de l'étape de précroissance, 6 jours après le début de la croissance, OD_D6, ou 13 jours après le début de la croissance, OD_Di₃, rapport OD_Di₃/OD_D6 et pourcentage de réponse magnétique.

Table 12: Pour la condition 4, densité optique mesurée à la fin de l'étape de pré-croissance, 6 jours après le début de la croissance, OD_D6, ou 13 jours après le début de la croissance, OD_d13, rapport OD_d13/OD_D6 et pourcentage de réponse magnétiques.

Table 13: Pour la condition 5, densité optique mesurée à la fin de l'étape de pré-croissance, 6 jours après le début de la croissance, OD_D6, ou 13 jours après le début de la croissance, OD_d13, rapport OD_d13/OD_D6 et pourcentage de réponse magnétique.

Table 14 (a): Pour la condition 6 de croissance de bactéries magnétotactiques MSR-1 dans un fermenteur d'un litre, compositions du milieu de pré-croissance, de milieu de croissance et de milieu alimenté en fed-batch pour Bl et B4, préparées à l'aide de produits chimiques de qualité non pharmaceutique.

Table 14 (b): Pour la condition 6 de croissance de bactéries magnétotactiques MSR-1 dans un fermenteur d'un litre, compositions du milieu de pré-croissance, du milieu de croissance et du milieu alimenté fed-batch pour B2 et B3, préparés à l'aide de produits chimiques de qualité pharmaceutique.

Table 15: Pour la condition 6, densité optique et nombre de cellules par ml mesurés au début de l'étape de pré-croissance (DO) pour les bactéries insérées dans un volume de 250 ml de milieu de pré-croissance, à la fin de l'étape de pré-croissance (D9) pour les bactéries cultivées dans un milieu de pré-croissance de 1,5 litre, au début de l'étape de croissance (D9), lorsque les bactéries sont cultivées dans un milieu de croissance de 800 ml, à D9 de l'étape de croissance, à DU de l'étape de croissance. Rapport entre la densité optique des bactéries mesurée à DU et la densité optique des bactéries mesurée à D9. Pourcentage de réponse magnétique mesurée à D11.

Table 16: Pour les magnétosomes produits dans la condition 6, extraits de bactéries magnétotactiques et purifiés pour éliminer plus de 99% des matières carbonées, concentration d'impuretés (Ag, Al, As, Ba, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb, Sb, Se, Si, Sn, Ti, W, Zn) en pg d’impuretés par gramme de magnétosome, pour les milieux Bl, B2, B3 et B4.

Table 17: Pour les fermenteurs Bl, B2, B3, B4, les concentrations en fer compris dans: i), le milieu de pré-croissance à D0 (jour 0), D8, D9, ii), le milieu de croissance Oh après le début de l'étape de croissance à D9, 6h après le début de l'étape de croissance à D9, 12h après le début de l'étape de croissance à D9, 24h après le début de l'étape de croissance à D10, 48h après le début de l'étape de croissance à Dl 1, iii) volume de milieu fed-batch introduit dans le milieu de croissance Oh après le début de l'étape de croissance à D9, 6h après le début de l'étape de croissance à D9, 12h après le début de l'étape de croissance à D9, 24h après le début de la phase de croissance à D9, 48h après le début de la phase de croissance à Dl 1.

Table 18: Conditions de traitement pour les différents échantillons (échantillons 0 à 11), y compris l'état de lyse (avec NaOH, KOH ou NaOH + Phénol et chloroforme), la température initiale avant chauffage de l'échantillon (Ti), la température T_b la vitesse r^ auquel la température est augmentée de Ti à T_b la durée ti pendant laquelle la température est maintenue à T_b la température T₂, la vitesse r₁₂ à laquelle la température est augmentée de Ti à T₂, la vitesse r_i2 à laquelle la température est augmentée de Ti à T₂, la durée t₂ pendant laquelle la température est maintenue à T₂, la température T₃, la vitesse r₁₃ à laquelle la température est augmentée de Ti à T₃, la vitesse r₃₂ à laquelle la température est augmentée T₃ à T₂, la durée t₃ pendant laquelle la température est maintenue à T₃, la température T₄, la vitesse r₃₄ à laquelle la température est augmentée de T₃ à T₄, la durée t₄ pendant laquelle la température est maintenue à T₄, la température finale Tf, la vitesse rif à laquelle la température est diminuée de Ti à Tf, la vitesse r₂f à laquelle la température est diminuée de T₂ à Tf, la vitesse r_3f à laquelle la température est abaissée de T₃ à Tf, la vitesse r_4f à laquelle la température est diminuée de T₄ à T_f.

Table 19: Pour les différents échantillons (échantillons 3 à 11), les pourcentages en masse de carbone (%C) et d'azote (%N) après traitement des nanoparticules dans les conditions 3 à 11, les pourcentages en masse de carbone et (%Ci) et azote (%Ni) pour les magnétosomes extraits 10 de bactéries magnétotactiques après la condition 1 ou 2 avant le traitement thermique (échantillons 4 à 11) ou avant le traitement au phénol-chloroforme (échantillon 3). Valeurs de A%C = %Ci-%C, Δ%Ν = %Ni-%N, (100.A%C)/%Ci, (100.Δ%Ν)/%Νΐ.

Conditi on 1:13 différents élixirsde minéraux testés (Bactéries mag nétotaet iq use MSR-1 amplifiées dans des tu bas de 50 mL j

Table 2

Condition 3:7 différentscocktailsde vitamines testés (Bactéries magnétotactîquesMSR-1 amplifiées dans des tubes de 50 mtj

Table 3

Condition 4: S différentes vit aminés individueiies testées (Bactéries magnétotactiques MSR-1 amplifiées dans des tubes de 50 mL)

Condition 5: Tost de 4 différentes concentrations des pri ncipaux composants d u milieu dé culture

Lactate de sodium ($Lj_rt%t0nif«^:diAnwM4riiU<n'(A}₍ Sulfate de magnesium hepta hdrats {MG], Phosphate de potassium dibasique [P] (Bactériesmagnétotartiques MSR-1 amplifiées dares des tubes de SO ml)

: li tre, ml : m ill i litre Table 5

Composition des différents élixirs de minéraux testés:

reposition dès différents extraits de levure testas;

Tabfe?

Com gtositi ο n des diffère nts cocktails de vitamines testés :

Compoüition des dif férentes vitaminés i nd ividwelies testées:

Ômdîtîôn 6 dam das fermentedrsdél Stréavec dès produits, chimiaues. ég gradé non phétmaceutioug

_fc,. j . . ,_x t.· L· i m si | m 84

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Lactate de sodium

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ÎVifeetal elixir t.'B3 (Table&} ITorktai i de ^terrain® ÎAS.IX paisieSi^ lEaw dëiosïsée ·

Laciate de sodium

Chlorure tfÂmmorâô

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CsH>,t®Oj mua Sulfate dé rs^nesiam tefftaiiydrate ’ 7Mÿ3 iFSospfeate de potassium dibasKiiie

M'feera-i ejaôr CB3 (Table fij i----------------------------------------------------------------; CorLtaîî de vitamines VüBtlX .{Tahie $$ ! ».$g i lstCm

I 0.5ml i ÔM

IL

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	- -----_;--------γ·-------.............. ______ j... .„ „ .... \| Formule J 82- s 82	Bi \| B3f
8:	«U Λ.88Ϊ Làctate de sedâtim	____chimique.(g CjHsNb&j	eiantitél Og	riiorentratiisri 2.3J0^M	Ipaatiitite	(igocenugife 2.3. W^SM
e w '' JI 2 ϋ	f ....— ............. —J..................................... Chiorute d’Ammsidom \| U________________________________________________________________________t_____________________________________	é.dg	7.4.,W'^SM	0.4g	7.4.:10'^SM
—---------*——-------------------—------------—------------------- SiiSste de niagriédùm bepndi ydrete	MgSâtrîH?^	ô.ig	sO.lir' M	0.1g	ΑΛΛΟ* M
Έ a	Phosphate <fe potassium diirasiquei JfeHRla	0,5«	2,9,10'’ M	8.5g	a.o.io’ m
ϋ -53	Mmerai elixir CB3 (Tâbte 6)	/	Ü.Srcîl	/	o.5ml	/
55	C&îtait de æitswnmss VhtMX ITab-^e	/	OmL	·/	&IM	/
1	æet) rfét&nisée	H;0	IL	/	IL	/
ê	Lactate de sodium	CîHsNbQj	W4g	ο,ολο’μ	104g	8.9. W³M
B.	Cbfefnre d'Ammssmm	ÎÎHaCJ	Î6g	03.10’M	idg	0.3. W⁴ M
	Soliste de magrîèsKttti feeptahydrate	MgWW)	1.2«		12g	4,9,M^Î:M
	Phosphate dé poîàssium diteasiqua	VWPàt	2,8g	8.2.10* M	2.8g	8,2,10'* M
i	Minerai eli.dr œ {Table 6)	/	2.8ml	/	2,toL	./
î=	Wfc&ft ÎitsmmffiViiaj.X (Tablé	/	Wml	/	3,2ml	/
	lËaudéfenisée	w	H	/	IL	7
	Asdie lactique·	CHsCHtDWœoH	Wg		100g
	Ammoniaque	SHs		2.S.IO'M	4,8g	2.8.18^
t	Phosphate de potassium dtfeasique	Kd«_a	^::Gg	3,4.10^ M	®g	3,4,10* M
J	Suifate de magnésium heptah^drate	MgSQa yn₃O	3,4g	9.7.10⁵ W5	2.4g:	9.7.1ίΥ*Μ
4	Chrifte· Ϊ^ΒΊφί&ν _____________________________	Ci.H₅F8<h	l.«g	MaîUM	0 g \| OM
«i	Chlorure de fer iii Claie		«M	2g M.IîJ'M
i	Mîfiérai ébdr t&3 (Tablé SJ &rç.k&fî ife $it3»htnS'Vi&lX(la&$e£ji j	................z................. ^f _: :Z _:	Tbit 1ml	/ /	7mL “T™¹ 1ml	/
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Tabie 19

Claims

REVENDICATIONS

1. Méthode de production de nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté à l'aide de cellules productrices des nanoparticules, comprenant :

i) Une étape de pré-croissance consistant à amplifier la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules dans un milieu de pré-croissance de telle sorte que la ou les cellules productrice(s) de nanoparticules ne produisent pratiquement pas de nanoparticules, et ii) Une étape de croissance consistant à amplifier la ou les cellule(s) productrice(s) de nanoparticules provenant de l'étape de pré-croissance dans un milieu de croissance tel que la ou les cellule(s) productrice(s) des nanoparticules produisent des nanoparticules.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le milieu de pré-croissance ne comprend pas de fer, ni de source de fer.
3. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le milieu de pré-croissance comprend au moins une source de fer choisis dans le groupe comprenant le citrate de fer, le quinate de fer, le chlorure de fer ou le sulfate de fer.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, dans laquelle la concentration
5 3 2 en fer ou en source de fer dans le milieu de pré-croissance est inférieure à 10,10 , 10 ou 20 μΜ .

5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la concentration en fer ou en source de fer dans le milieu de croissance est supérieure ou égale à la concentration en fer ou en source de fer dans le milieu de pré-croissance ou est supérieure à 0, 1,5, 10 ou 20 μΜ. .
6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle le milieu de croissance est alimenté par un milieu fed-batch.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le ou les milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance ne comprend ou ne comprennent qu'une seule vitamine choisie dans le groupe constitué de la biotine, du pantothénate de calcium, de l'acide folique, de l'inositol, de l'acide nicotinique, de l’Acide amino-benzoïque, de la pyridoxine HCl, de la riboflavine et de la thiamine HCL, ainsi que de tout dérivé de ces vitamines.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle le(les) milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance comprend ou comprennent, par gramme ou ml de milieu(x) de pré-croissance et/ou de croissance, moins de: i) , 1 mg d'extrait de levure, ii), 1 mg d'au moins un composant d'extrait de levure, iii), 1 mg de peptone, iv), 1 mg d'au moins un composant de peptone, v), 1 mg d'agent CMR , vi), 1 mg d'au moins un agent chélateur, vii), 1 mg d'au moins un acide aminé, viii), 1 mg d'un composé toxique ou cytotoxique, et/ou viii), 1 mg d'au moins un métal lourd.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, qui comprend une étape supplémentaire de purification de nanoparticule(s) d'oxyde de fer de haute pureté en éliminant au moins une ou plusieurs impureté(s) de la ou des nanoparticule(s).
10. Méthode selon la revendication 9, comprenant au moins deux étapes de chauffage dans lesquelles:

- Au cours de l'étape 1, la température des nanoparticules est augmentée à une température Ti, puis est maintenue à Ti pendant une durée de chauffage comprise entre 1 seconde et 1 mois, où Ti est comprise entre 150 °C et 250 °C,

- Au cours de l'étape 2, la température des nanoparticules est augmentée à une température T₂, puis est maintenue à T₂ pendant une durée de chauffage comprise entre 1 seconde et 1 mois, où T₂ est comprise entre 350 ⁰ C et 450 ⁰ C.
11. Nanoparticule(s) à base d'oxyde de fer de haute pureté obtenue(s) par la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Nanoparticule(s) selon la revendication 11, comprenant un pourcentage en masse de carbone ou de matériau carboné inférieur à 90, 10, 5, 2, préférentiellement 1, 0,5, 0,4 ou 0,3%.
13. Nanoparticule(s) d'oxyde de fer de haute pureté suivant l’une quelconque des revendications 11 à 12, où la(les) nanoparticule(s) d'oxyde de fer de haute pureté est/sont un/des magnetosome(s).
14. Composition comprenant la ou les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté selon l’une quelconque des revendications 11 à 13.
15. Dispositif médical comprenant la ou les nanoparticules d'oxyde de fer de haute pureté selon l’une quelconque des revendications 11 à 13.