FR3077824A1 - Procede de preparation d'un lysat plaquettaire irradie - Google Patents
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Abstract
Procédé de préparation d'un lysat plaquettaire irradié comprenant les étapes suivantes : - la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d'obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d'une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d'autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation, - l'irradiation dudit lysat plaquettaire de départ, par un rayonnement UVC de longueur d'onde comprise entre 200 et 280 nm afin d'obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, ladite irradiation étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d'au moins 20% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.
Description
L’invention concerne un procédé de préparation d’un lysat plaquettaire irradié ainsi qu'un lysat plaquettaire irradié obtenu par un tel procédé et un procédé de culture de cellules utilisant un tel lysat plaquettaire irradié.
L’invention s’applique au domaine des produits dérivés des plaquettes sanguines, et notamment au domaine de la culture cellulaire pour cultiver les cellules à usage thérapeutique, plus particulièrement les cellules souches mésenchymateuses.
Pour cultiver des cellules animales in vitro, on utilise classiquement des milieux de base de type RPMI (Roswell Park Memorial Institute), MEM (Modified Eagle Medium) ou DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) comprenant essentiellement des sels minéraux, du glucose, des acides aminés, des vitamines et des bases azotées. Ces milieux de base sont généralement complémentés extemporanément avec des antibiotiques pour prévenir la contamination bactérienne, de la L-glutamine - un acide aminé instable -, et entre 1,5 et 10% de sérum de veau foetal comme complément nutritif.
Pour utiliser des produits plus performants et pour éviter l’utilisation de produits xénogènes dans les cultures de cellules à usage thérapeutique, il a été proposé de remplacer le sérum de veau foetal par du lysat plaquettaire humain. Ce dernier présente notamment l'avantage de comprendre une quantité importante de facteurs de croissance tels que par exemple le facteur de croissance transformant bêtal (TGF-beta1, Transforming Growth Factor-betal), le facteur de croissance épidermique (EGF, Epidermal Growth Factor), le facteur de croissance dérivé des plaquettes AB (PDGF-AB, Platelet-Derived Growth FactorAB), le facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (PDGF-AB, PlateletDerived Growth Factor-BB), le facteur de croissance 1 ressemblant à l'insuline (IGF-1, Insulin-like Growth Factor-1), le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF, Vascular Endothélial Growth Factor) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2, Fibroblast Growth Factor 2), aussi appelé facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, Basic Fibroblast Growth Factor).
Le lysat plaquettaire est typiquement préparé à partir d’une suspension de plaquettes dans du plasma ou dans un mélange plasma et solution additive pour plaquettes, à laquelle on fait subir un ou plusieurs cycles de congélation/décongélation afin de libérer les facteurs de croissance contenues dans les plaquettes par lyse cellulaire.
Un inconvénient d’un tel lysat plaquettaire est qu’il contient du fibrinogène, provenant du plasma, dans une quantité variant d’environ 0,5 à 3 mg/ml, de sorte que l’addition d’un anticoagulant au milieu de base est nécessaire pour éviter une coagulation du milieu de base (Burnouf T, Strunk D, Koh MB, et al.: Human platelet lysate: replacing fêtai bovine sérum as a gold standard for human cell propagation? Biomaterials 2016; 76:371-387).
L’anticoagulant le plus utilisé est l’héparine. Mais les héparines disponibles dans le commerce sont généralement d’origine porcine, de sorte que le milieu de culture, bien que dépourvu de sérum de veau foetal, comprend encore un produit xénogène.
En outre, à certaines concentrations, l’héparine a un effet négatif sur la prolifération cellulaire (Viau, Sabrina, et al. Pathogen réduction through additivefree short-wave UV light irradiation retains the optimal efficacy of human platelet lysate for the expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells. PloS one 12.8 (2017): e0181406).
Plusieurs stratégies ont été proposées pour éliminer le pouvoir de coagulation d’un lysat plaquettaire :
Une première méthode est décrite dans le document WO 2013/003356, qui consiste à ajouter au lysat plaquettaire du chlorure de calcium, induisant la conversion du fibrinogène en fibrine et la formation d’un caillot. Le caillot est ensuite éliminé par centrifugation pour obtenir un lysat comprenant moins de
0,05 mg/ml de fibrinogène. Cette méthode entraîne cependant une perte en facteurs de croissance qui seraient piégés dans le caillot.
Une méthode indirecte consiste à éliminer le plasma qui contient le fibrinogène de la suspension de plaquettes de départ, par exemple en effectuant plusieurs cycles de lavage des plaquettes avant de préparer le lysat plaquettaire. Cette stratégie est par exemple décrite dans le document WO 2008/034803 et dans le document US 2012/0156306. L’élimination du plasma entraîne cependant de fait l’élimination d’autres protéines plasmatiques telles que l’albumine, nécessaires à la prolifération cellulaire.
Dans le document WO 2017/162830, il est proposé d’éliminer le plasma des suspensions de plaquettes de départ puis de chauffer le lysat plaquettaire entre 55 et 65°C pendant 20 à 40 minutes, de sorte à obtenir une quantité de fibrinogène inférieure à 0,3 mg/ml. Cependant, ce procédé réduit également la quantité des autres protéines présentes dans le lysat plaquettaire d’au moins 70%, ce qui n’est pas souhaitable pour une utilisation en culture cellulaire.
Laner-Plamberger et al. proposent une méthode originale consistant à ajouter le lysat plaquettaire non défibrinogéné au milieu de base afin de former un gel de fibrine, puis de détruire et éliminer ce gel par agitation vigoureuse et centrifugation. Le milieu de base complémenté en lysat plaquettaire ainsi obtenu est dépourvu de fibrinogène, mais contient encore les autres protéines plasmatiques (J Transi Med (2015) 13:354). Cette méthode est cependant complexe à mettre en place dans le cadre d’une production industrielle standardisée et de qualité contrôlée de lysats plaquettaires.
Dans le document WO 2016/193591, le lysat plaquettaire subit une irradiation par un rayonnement ionisant afin d’être stérilisé. Suivant la dose d’irradiation utilisée, le lysat plaquettaire irradié peut comprendre moins de 0,4 mg/ml de fibrinogène. Selon l’exemple décrit, un lysat plaquettaire a été préparé à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% de plasma et 70% d’une solution de conservation, puis irradié à une dose de 35 ou kGy. Lorsque le lysat plaquettaire irradié est ajouté dans une quantité de 8% dans le milieu de base, le milieu de base ne coagule pas.
En outre, le document WO 2013/042095 et l’article de S. Castiglia (Castiglia, Sara, et al. Inactivated human platelet lysate with psoralen: a new perspective for mesenchymal stromal cell production in Good Manufacturing Practice conditions. Cytotherapy 16.6 (2014): 750-763) divulguent un lysat plaquettaire obtenu à partir de concentrés de plaquettes issus de buffy coat qui ont subi une inactivation virale par un rayonnement ultraviolet en présence de psoralène, un agent chimique intercalant de l’ADN. Cette technique d'inactivation virale présente cependant l’inconvénient de devoir utiliser un agent chimique qui doit ensuite être éliminé du produit traité.
Une autre méthode d’obtention d’un lysat plaquettaire dépourvu de pathogènes est décrite dans l’article de S. Viau (Viau, Sabrina, et al. Pathogen réduction through additive-free short-wave UV light irradiation retains the optimal efficacy of human platelet lysate for the expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells. PloS one 12.8 (2017): e0181406). Dans cet article, un lysat plaquettaire est obtenu à partir de concentrés plaquettaires qui ont subi une inactivation virale par rayonnement UVC, en l’absence d’agent chimique.
Dans ces derniers documents, le lysat plaquettaire préparé à partir de concentrés plaquettaires ayant subi une inactivation virale reste coagulable.
L’invention propose un nouveau procédé de préparation d’un lysat plaquettaire avec un pouvoir réduit de coagulation en présence de calcium, tout en conservant les protéines plasmatiques nécessaires, notamment à la prolifération cellulaire.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention propose un procédé de préparation d’un lysat plaquettaire irradié comprenant les étapes suivantes :
- la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d’obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d’une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation, et
- l’irradiation dudit lysat plaquettaire de départ, par un rayonnement UVC de longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm afin d’obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, ladite irradiation étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d’au moins 20% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.
Selon un deuxième aspect, l’invention concerne le lysat plaquettaire irradié obtenu par le procédé selon le premier aspect de l’invention.
Selon un troisième aspect, l’invention propose un procédé pour la culture de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses, comprenant la mise en contact desdites cellules avec une composition nutritive comprenant un milieu de base et un lysat plaquettaire irradié selon le deuxième aspect de l’invention.
D'autres objets et avantages apparaîtront au cours de la description qui suit.
Les figures 1 à 6 représentent, respectivement, les concentrations en facteurs de croissance IGF-1, TGF-bêta1, bFGF, PDGF-AB, EGF et VEGF dans trois lots de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, en fonction de la dose d’irradiation.
Les figure 7 à 11 représentent, respectivement, les concentrations en facteurs de coagulation facteur II, facteur VII, facteur IX, facteur X et facteur XI, exprimées en pourcentage par rapport à un plasma humain normal étalon, dans trois lots de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, en fonction de la dose d’irradiation.
La figure 12 représente les facteurs d'amplification au 7ème jour de culture de cellules souches mésenchymateuses cultivées en présence de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC en fonction de la dose d’irradiation.
Les figures 13 à 16 montrent, respectivement, les concentrations en facteur de croissance bFGF, PDGF-AB, PDGF-BB et TGF-bêta1, d’un lysat plaquettaire non irradié (LP) et d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 (LP-UVC).
Les figures 17 et 18 montrent, respectivement, les concentrations en protéines totales et les concentrations en vitamine B12, d’un lysat plaquettaire non irradié (LP) et d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 (LP-UVC).
La figure 19 représente les facteurs d'amplification au 7ème jour de culture de cellules souches mésenchymateuses cultivées en présence d’un lysat plaquettaire non irradié (LP) et d’un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 (LP-UVC).
L’invention concerne un procédé de préparation d’un lysat plaquettaire irradié en vue notamment d’obtenir un lysat plaquettaire ayant un pouvoir de coagulation réduit.
Par lysat plaquettaire, on désigne le produit de la lyse de plaquettes, c'est-à-dire le produit obtenu après désintégration de la membrane cellulaire des plaquettes qui conduit à la libération des molécules (facteurs de croissance, cytokines) normalement contenues à l'intérieur des plaquettes.
La lyse des plaquettes est par exemple réalisée par un ou plusieurs cycles de congélation/décongélation, par l’utilisation d'ultra-sons ou par un traitement au solvant/détergent.
Le procédé selon l’invention comprend d’abord l’étape consistant en la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d’obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d’une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation.
Le lysat plaquettaire est produit à partir de plaquettes en suspension dans un liquide comprenant du plasma. Une telle suspension de plaquettes est par exemple un concentré de plaquettes ou un mélange de concentrés de plaquettes, une couche leucoplaquettaire, aussi appelée buffy coat, ou un mélange de couches leucoplaquettaires, un plasma riche en plaquettes ou un mélange de plasmas riche en plaquettes.
Plus particulièrement, la suspension de plaquettes est un concentré plaquettaire issu d'aphérèse ou préparé à partir d'un don de sang ou un mélange de concentrés plaquettaires issus d'aphérèse ou préparés à partir de dons de sang.
Par exemple, le mélange comprend entre 4 et 50 concentrés plaquettaires, en particulier entre 5 et 30 concentrés plaquettaires.
La préparation d’un lysat plaquettaire à partir d’un mélange de plusieurs concentrés plaquettaires, notamment plus de quatre concentrés plaquettaires, est avantageuse car elle permet de standardiser le lysat plaquettaire, c’est-à-dire d’homogénéiser la concentration de ses différents composants, notamment la concentration en facteurs de croissance (Viau S, Eap S, et al. A standardized and characterized clinical grade human platelet lysate for efficient expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotherapy. May 2017, Volume 19, Issue 5, Supplément, Page S195).
En effet, les concentrations en facteurs de croissance d’un lysat plaquettaire sont dépendantes du donneur de plaquettes initiales.
Les concentrés plaquettaires sont soit frais, c'est-à-dire qualifiés pour être transfusés à un patient, soit périmés, c'est-à-dire stockés pendant 5 jours ou plus après sa préparation et ne pouvant plus être transfusés à un patient.
De tels concentrés plaquettaires comprennent des plaquettes en suspension dans un milieu liquide contenant du plasma.
Par exemple, le milieu liquide ne comprend que du plasma. Selon un autre exemple, le milieu liquide comprend en outre une solution de conservation des plaquettes, telle que la solution SSP+ (Maco Pharma) ou l'Intersol® (Fresenius Kabi).
Dans un exemple particulier, le milieu liquide comprend de 20% à 100%, notamment 30% de plasma et de 0% à 80%, notamment 70% de solution de conservation des plaquettes.
La lyse d’une suspension de plaquettes comprenant des plaquettes dans du plasma fournit un lysat plaquettaire de départ comprenant d’une part des facteurs plaquettaires normalement contenus à l’intérieur des plaquettes et d’autre part des constituants du plasma.
Le plasma est constitué d'eau à 90%, de sels tels que le sodium, le chlore et le calcium, de lipides tels que les triglycérides et le cholestérol, d’hormones, de vitamines telles que la vitamine B12 et la vitamine D et de protéines telles que l'albumine, les immunoglobulines, les facteurs de coagulation dont le fibrinogène, l’antithrombine III impliquée dans la chaîne de coagulation, les globulines, les interleukines et les interférons.
Ainsi, le lysat plaquettaire de départ auquel est appliqué le procédé de l’invention comprend notamment d’une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation.
Ces facteurs de croissance sont notamment le TGF-bêta1, EGF, PDGF-AB, IGF-1, VEGF et bFGF. D'autres facteurs de croissance se trouvant dans le lysat plaquettaire sont notamment le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF, Connective Tissue Growth Factor) et le facteur dérivé des cellules stromales de type 1-alpha (SDF-1 alpha, Stromal Cell-Derived Factor-1 alpha). Ces facteurs de croissance sont dits endogènes.
Par substance endogène, on désigne toute substance produite par les plaquettes ou comprise dans la suspension de plaquettes initiales utilisées pour préparer le lysat plaquettaire, par opposition à une substance exogène introduite dans le lysat plaquettaire ou dans la suspension de plaquettes initiales.
Par exemple, un lysat plaquettaire produit par lyse par congélation/décongélation d’une suspension de plaquettes comprend les concentrations en facteurs de croissance suivantes :
Tableau 1 :
| bFGF | 110-180 pg/ml |
| PDGF-AB | 20 000 - 45 000 pg/ml |
| PDGF-BB | 12 000- 15 000 pg/ml |
| IGF-1 | 25 - 150 pg/ml |
| VEGF | 500 - 1 000 pg/ml |
| EGF | 1 600 - 3 000 pg/ml |
| TGFbêtal | 30 000 - 80 000 pg/ml |
Le lysat plaquettaire de départ comprend d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation.
Les facteurs de coagulation sont notamment le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI. D’autres facteurs de coagulation sont le facteur V et le facteur VIII.
Les autres protéines du plasma autre que les facteurs de coagulation sont notamment l’albumine et l’antithrombine III, protéine impliquée dans la chaîne de coagulation.
La quantité de protéines totales du lysat plaquettaire de départ dépend donc du pourcentage de plasma dans la suspension de plaquettes initiale, avant lyse des plaquettes.
Par exemple, un lysat plaquettaire de départ produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma comprend notamment les composants suivants :
Tableau 2 :
| Protéines totales (mg/ml) | 60-80 mg/ml |
| Fibrinogène (mg/ml) | 0,5 -1,5 mg/ml |
| Vitamine B12 | 250-300 pg/ml |
Dans un autre exemple, un lysat plaquettaire de départ produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma et 70% d’une solution de conservation des plaquettes comprend notamment les composants suivants :
Tableau 3 :
| Protéines totales (mg/ml) | 20-30 mg/ml |
| Fibrinogène (mg/ml) | 0,45 -0,5 mg/ml |
| Vitamine B12 | 150-170 pg/ml |
L’étape de fourniture d’un lysat plaquettaire s’entend comme la mise à disposition d’un lysat plaquettaire. C’est-à-dire que le procédé de l’invention est mis en œuvre sur un lysat plaquettaire préalablement produit par lyse des plaquettes d’une suspension de plaquettes.
Après l’étape de fourniture d’un lysat plaquettaire de départ, le procédé selon l’invention comprend l’étape consistant en l’irradiation dudit lysat plaquettaire de départ, par un rayonnement UVC de longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm afin d’obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, ladite irradiation étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d’au moins 20% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.
Le rayonnement UVC désigne un rayonnement électromagnétique non ionisant, c’est-à-dire un rayonnement incapable de provoquer l'ionisation d'atomes ou de molécules. Le rayonnement UVC possède une longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm, en particulier 254 nm.
En conservant plus de 75% des protéines totales du lysat plaquettaire de départ, le lysat plaquettaire ainsi irradié par rayonnement UVC peut être utilisé comme complément pour milieu de base pour culture cellulaire. Notamment, l’albumine qui représente plus de 50% des protéines dans le plasma et qui est un nutriment particulièrement important dans la culture cellulaire, est conservée à au moins 80% par rapport au lysat plaquettaire de départ.
En particulier, au moins 80%, et plus particulièrement au moins 90% de la concentration en protéines totales dans le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est conservé par rapport au lysat plaquettaire de départ.
Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant de 20 à 80 mg/ml, selon la concentration en plasma de la suspension de plaquettes initiales.
Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 55 mg/ml à environ 80 mg/ml.
Selon un autre exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 18 mg/ml à environ 30 mg/ml.
De plus, en réduisant d’au moins 20% la concentration de l’un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI, le pouvoir de coagulation du lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est réduit.
C’est-à-dire qu’un milieu de base comprenant du calcium, par exemple environ 0,2 g/l de chlorure de calcium ne coagulera pas en présence de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC ou coagulera à partir d’une concentration de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC dans le milieu de base plus élevée que celle d’un lysat plaquettaire de départ à partir de laquelle le milieu de base coagule.
Par exemple, le milieu de base alphaMEM coagule en présence de 5% ou plus de lysat plaquettaire de départ, alors que ce milieu coagule à partir de 10% de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC.
Notamment, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est ajouté dans une plage allant de 2 à 25 %, en particulier dans la plage allant de 5 à 15%, et encore plus particulièrement dans la plage allant de 8 à 10% dans un milieu de base.
Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC ayant un pouvoir de coagulation réduit, son utilisation en tant que complément de milieu de base pour culture cellulaire est possible, dans certaines concentrations, sans utiliser d’anticoagulant tel que l’héparine.
En particulier, l’irradiation par rayonnement UVC est agencée pour réduire d’au moins 20% la concentration de chacun des facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.
Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend les constituants plasmatiques suivants.
Tableau 4 :
| Protéines totales (mg/ml) | 14-30 mg/ml |
| Fibrinogène (mg/ml) | <0,4 mg/ml |
| Vitamine B12 | 125-140 pg/ml |
De plus, le lysat plaquettaire de départ comprend notamment les facteurs de croissance endogènes TGF-bêta1, EGF, PDGF-AB, IGF-1, VEGF et bFGF.
L’irradiation par rayonnement UVC est en particulier agencée pour conserver au moins 80% la concentration de l’un des facteurs de croissance incluant IGF-1, PDGF-AB, EGF et VEGF du lysat plaquettaire de départ, afin notamment de pourvoir utiliser le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comme complément de milieu de base.
En particulier, l’irradiation par rayonnement UVC est agencée pour conserver au moins 80% de la concentration de chacun des facteurs de croissance incluant IGF-1, PDGF-AB, EGF et VEGF, afin notamment de pourvoir utiliser le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comme complément de milieu de base.
Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend les facteurs de croissance suivants.
Tableau 5 :
| bFGF | 88- 140 pg/ml |
| PDGF-AB | 16 000-45 000 pg/ml |
| PDGF-BB | 6 400-12 000 pg/ml |
| IGF-1 | 20 - 120 pg/ml |
| VEGF | 400 - 900 pg/ml |
| EGF | 1 300 - 2 800 pg/ml |
| TGF-bêta1 | 24 000 - 70 000 pg/ml |
Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC conserve ainsi son intérêt pour une utilisation en culture cellulaire ou autre application pour laquelle les facteurs de croissance ont un intérêt.
L’irradiation par rayonnement UVC est en particulier agencée pour conserver au moins 75%, particulièrement au moins 80%, du facteur d’amplification des cellules souches mésenchymateuses cultivées pendant 7 jours dans un milieu de base complémenté avec du lysat plaquettaire de départ.
Selon une réalisation particulière, l’irradiation par rayonnement UVC est réalisée à une dose comprise entre 0,01 à 2 J/cm2, particulièrement entre 0,5 J/cm2 et 1,5 J/cm2, et plus particulièrement à 1 J/cm2.
Une dose de rayonnement UVC inférieure à 0,01 J/cm2 n’est pas suffisante pour dégrader les facteurs de coagulation présents dans le lysat plaquettaire de départ. Une dose de rayonnement UVC supérieure à 2 J/cm2 endommage les facteurs de croissance entraînant une perte importante en prolifération cellulaire.
En particulier, le lysat plaquettaire de départ est irradié par rayonnement UVC à l’état liquide.
Par exemple, le lysat plaquettaire de départ à l’état liquide est conditionné dans un récipient perméable aux UVC, telle qu’une poche d’irradiation perméable aux UVC. Une poche d’irradiation perméable aux UVC est notamment réalisée dans un matériau n’ayant pas un maximum d’adsorption dans la plage allant de 200 à 280 nm. La poche d’irradiation est en particulier réalisée en acétate de vinyle ou en polytétrafluoroéthylène.
La poche d’irradiation contenant le lysat plaquettaire de départ est ensuite disposée dans un appareil d’illumination aux UVC. La poche est agitée de façon orbitale pendant l’irradiation par rayonnement UVC, de sorte à irradier de façon homogène la totalité du lysat plaquettaire.
En alternative, l’irradiation par rayonnement UVC du lysat plaquettaire de départ est réalisée sous condition de flux.
Selon une réalisation particulière, le procédé comprend, préalablement à l’irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration dudit lysat plaquettaire de départ au travers d'un filtre de porosité 0,65 pm ou moins, particulièrement 0,45 pm ou moins.
Cette étape de filtration permet d’éliminer les éventuels débris cellulaires provenant de l’étape de lyse des plaquettes et qui pourraient entraver l’irradiation du lysat plaquettaire.
Selon une autre réalisation particulière, le procédé comprend, postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration stérilisante dudit lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC au travers d'un filtre de porosité 0,45 pm ou moins, particulièrement 0,22 pm ou moins.
Cette étape de filtration au travers un filtre stérilisant permet de retenir les bactéries ayant une taille supérieure à 0,22 pm et, avantageusement combinée à l’irradiation par rayonnement UVC, permet d’obtenir un lysat plaquettaire ayant un risque réduit en contamination bactérienne et virale.
Afin de réduire encore plus le pouvoir de coagulation lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, le procédé selon l’invention comprend avantageusement une étape d'irradiation du lysat plaquettaire par un rayonnement ionisant ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 100 nm, particulièrement inférieure à 10 nm.
Un rayonnement ionisant ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 100 nm comprend les rayons X-UV ayant une longueur d’onde allant de 10 nm à 100 nm, les rayons X ayant une longueur d’onde allant de 10 pm à 10 nm et les rayons gamma ayant une longueur d’onde inférieur à 10 pm.
Un procédé d’irradiation d’un lysat plaquettaire par rayonnement ionisant est notamment décrit dans la demande de brevet WO 2016/193591. En particulier, l’irradiation est réalisée à une dose absorbée comprise dans la plage allant de 20 kGy à 75kGy, notamment de 35 kGy à 55 kGy.
Dans un tel procédé, préalablement à l’étape d’irradiation par rayonnement ionisant, le procédé comprend une étape de congélation dudit lysat plaquettaire afin d’irradier par rayonnement ionisant le lysat plaquettaire à l’état congelé. En particulier, la congélation du lysat plaquettaire est réalisée à une température comprise entre -10°C et -196°C, notamment d'environ -20°C ou d’environ -80°C.
En alternative, le lysat plaquettaire est irradié par rayonnement ionisant dans un état lyophilisé.
Pour l’irradiation par rayonnement ionisant dans un état congelé, le lysat plaquettaire est conditionné dans un récipient résistant à la congélation et notamment dans une poche résistante à la congélation. Le matériau résistant à la congélation est notamment de l'éthylène acétate de vinyle, le polyéthylène ou un fluoropolymère tel que l’éthylène-propylène fluoré.
Selon une réalisation particulière avantageuse, l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC, c’est-à-dire que l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée sur le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC.
Encore plus avantageusement, l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC et postérieurement à la filtration stérilisante du lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, c’est-à-dire sur le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC puis filtré stérilement.
Dans ce cas, l'étape d'irradiation par rayonnement ionisant est réalisée sur le lysat plaquettaire dans son conditionnement final, notamment dans une poche de stockage. La poche de stockage est par exemple réalisée en un matériau résistant à la congélation et à l'irradiation par rayonnement ionisant tel que l'éthylène acétate de vinyle.
En alternative, l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée préalablement à l’irradiation par rayonnement UVC sur le lysat plaquettaire de départ.
Selon un mode de réalisation, le rayonnement ionisant est un rayonnement gamma ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 10 pm.
Le rayonnement gamma est un rayonnement électromagnétique composé de photons de haute énergie, de l'ordre de 1,6 MeV. Il est par exemple émis par une source de cobalt 60.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un lysat plaquettaire irradié obtenu par le procédé selon le premier aspect de l'invention.
Le lysat plaquettaire préparé selon le procédé de préparation de l'invention présente un profil de facteurs de croissance et de protéines particulier.
En particulier, l’irradiation par rayonnement UVC impacte certains facteurs de croissance non ou moins impactés par une irradiation par rayonnement ionisant, par exemple. Ces facteurs de croissance comprennent notamment les facteurs EGF, TGF-bêta1 et PDGF-BB.
Par exemple, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en facteur de croissance endogène EGF inférieure à 2 800 pg/ml, et/ou une concentration en facteur de croissance endogène TGF-bêta1 inférieure à 70 000 pg/ml, notamment inférieure 40 000 ng/ml, et/ou une concentration en facteur de croissance endogène PDGF-BB inférieure à 12 000 pg/ml.
Il en va de même de la vitamine B12 impactée par le rayonnement UVC mais pas par le rayonnement ionisant.
Par exemple, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en vitamine B12 réduite de 10 à 30% par rapport au lysat plaquettaire de départ. En particulier, la concentration en vitamine B12 est comprise dans la plage allant de 120 à 140 pg/ml.
Certains facteurs de croissance ou protéines ne sont pas ou sont peu impactés par l’irradiation par rayonnement UVC ou par l’irradiation par rayonnement ionisant.
Ainsi, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en facteur de croissance PDGF-AB comprise dans la plage allant de 16 000 à 45 000 pg/ml.
Certains facteurs de croissance ou protéines ne sont pas impactés par l’irradiation par rayonnement UVC, mais le sont par l’irradiation par rayonnement ionisant.
Par exemple, l’antithrombine III, protéine impliquée dans la chaîne de coagulation n’est que faiblement impactée par l’irradiation par rayonnement UVC.
Certains facteurs de croissance sont impactés par l’irradiation par rayonnement UVC comme par l’irradiation par rayonnement ionisant.
Ainsi, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en facteur de croissance bFGF endogène inférieure à 140 pg/ml.
Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend en outre une concentration en fibrinogène inférieure à 0,4 mg/ml.
L’irradiation par rayonnement UVC n’a pas d’impact notable sur la concentration en protéines totales du lysat plaquettaire.
Ainsi, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales comprise entre 14 et 80 mg/ml, selon la quantité initiale de plasma.
Plus particulièrement, la concentration en protéines totales dans un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma, irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 55 mg/ml à environ 80 mg/ml.
La concentration en protéines totales dans un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma, irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant d’environ 18 mg/ml à environ 30 mg/ml.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne un procédé pour la culture de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses, comprenant la mise en contact desdites cellules avec une composition nutritive comprenant un milieu de base et un lysat plaquettaire irradié selon le deuxième aspect de l’invention.
Les cellules souches mésenchymateuses sont par exemple des cellules souches mésenchymateuses humaines issues de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical.
Selon une réalisation particulière, la composition nutritive comprend de 2 % à 25%, en particulier de 5% à 15%, et encore plus particulièrement de 8 à 10% de lysat plaquettaire irradié selon l'invention.
Notamment, le lysat plaquettaire irradié est ajouté extemporanément de façon préliminaire audit milieu de base de sorte à former ladite composition nutritive.
Comme le lysat plaquettaire irradié présente un pouvoir de coagulation réduit, il n'est pas nécessaire d'ajouter à la composition nutritive un anticoagulant de type héparine pour éviter sa coagulation et la maintenir dans un état liquide.
Ainsi, selon un mode de réalisation du procédé pour la culture de cellules, la composition nutritive est sous forme liquide et exempte d'anticoagulant.
Exemple 1: Production en laboratoire de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC
1.1 Préparation d'un lysat plaquettaire
Un lot de lysat plaquettaire est préparé comme décrit ci-dessous.
Des concentrés plaquettaires (20 concentrés plaquettaires) comprenant 70% de solution de conservation Intersol® et 30% de plasma ont été préparés à partir d'un mélange de cinq buffy coat et conservés dans des poches de stockage.
Les poches de stockage ont été congelées à -80°C pendant une durée d'environ 24 heures avant d'être décongelées à 4°C pendant environ 24 heures.
Les poches de stockage décongelées sont ensuite centrifugées à une vitesse de 5000 g pendant 10 minutes de sorte à séparer le surnageant comprenant le lysat plaquettaire du sédiment comprenant les débris cellulaires.
Le surnageant de chacune des poches de stockage est transféré dans une poche de mélange de sorte à obtenir un mélange de lysats plaquettaires (LP).
1.2. Irradiation aux UVC
Le mélange de lysats plaquettaires est transféré, par volume de 500 ml, dans des poches d’irradiation. L’air et toutes les bulles sont éliminés des poches d’irradiation.
Les poches d’irradiation sont ensuite irradiées à l’aide d’un appareil d’illumination aux UVC (Macotronic UV, Maco Pharma, France), à différentes doses (0-3,2 J/cm2). Les poches d’irradiation sont agitées à une vitesse de 110 trs/min.
Après irradiation par rayonnement UVC, les contenus des poches d’irradiation sont re-mélangés dans une poche de transfert.
1.3. Dosages de cytokines
Les tests suivants, réalisés sur 3 lots, ont été menés afin de caractériser les lysats plaquettaires irradiés aux différentes doses UVC :
- Dosages à l’aide de kits ELISA de l'IGF-1 (réf. DG100/lot 341313) et du TGFBêtal (réf. DB100B/lot 340010),
- Dosages à l’aide de kits ELISA du bFGF (réf. DFB50/lot P104841), du PDGFAB (réf. DHDOOC/lot P101565), de l’EGF (réf. DEG00/1ot 339998), et du VEGF (réf. DVEOO/lot P100719)
Les résultats, illustrés sur la figure 1, montrent que la concentration en IGF-1 dans le lysat plaquettaire n'est pas impactée par l’irradiation aux UVC.
La moyenne des 3 lots permet de conclure que la concentration en PDGF-AB est peu ou pas impactée par l'irradiation aux UVC (figure 4).
En revanche, les figures 2, 3, 5 et 6 montrent que la concentration en TGF-bêta1, bFGF, EGF et VEGF, et diminue à mesure que la dose d'UVC augmente et ce, à partir de 0,8 J/cm2.
Les pertes en EGF et VEGF sont moins importantes comparées aux pertes en TGF-bêta1 et bFGF. On observe 23% et 24% de perte respectivement pour le TGF-bêta1 et bFGF à 0,8 J/cm2 (figures 2 et 3), et jusqu'à 50% et 44% respectivement à 1,6 J/cm2 (figures 5 et 6).
1.4. Dosages de facteurs plasmatiques
Des dosages biochimiques, réalisés sur les 3 mêmes lots, ont été menés afin de caractériser les lysats plaquettaires irradiés aux différentes doses UVC.
Les résultats des dosages des facteurs plasmatiques dans le lysat plaquettaire après irradiation aux UVC, illustrés sur les figures 7 à 11, montrent que les UVC ont un effet sur les facteurs II, VII, IX, X, et XI. Comme pour le TGF-bêta1, la concentration de ces facteurs plasmatiques diminue en fonction de la dose UVC délivrée lors de l’irradiation.
1.5. Impact de l’irradiation par rayonnement UVC sur l'efficacité du LP (prolifération de CSMs)
Des tests de prolifération, réalisés sur 3 lots, ont été menés afin de caractériser les lysats plaquettaires irradiés aux différentes doses (figure 12).
Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) ont été ensemencées en plaques de 6 puits (triplicats pour chaque condition) à 2 500 cellules/cm2.
Tous les lysats plaquettaires ont été utilisés à 8% dans un milieu alphaMEM. L'expérience a été effectuée deux fois.
La figure 12 montre que les deux expériences génèrent le même profil de prolifération des CSMs au contact du lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC.
D'une part, on peut noter que les contrôles de lysat plaquettaire non irradié sont bien similaires. De plus, on observe un plateau de 0 J/cm2 à 1,2 J/cm2 où la prolifération des CSMs ne semble pas être impactée. Entre 1,2 J/cm2 et 1,6 J/cm2 la prolifération des CSMs commence à diminuer visiblement.
Exemple 2 : Production industrielle de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC
2.1 Préparation du lysat plaquettaire
Plusieurs lots de lysat plaquettaire (LP) ont été produits comme décrit dans l’exemple 1.1 ci-dessus, à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma et 70% d’une solution additive.
2.2 Irradiation par rayonnement UVC
Le mélange de lysats plaquettaires est filtré au travers un filtre de porosité 0,45 pm avant d’être irradié par rayonnement UVC.
Le mélange de lysats plaquettaires filtré est transféré, par volume de 500 ml, dans des poches d’irradiation. L’air et toutes les bulles sont éliminés des poches d’irradiation.
Les poches d’irradiation sont ensuite irradiées à l’aide d’un appareil d’illumination aux UVC (Macotronic UV, Maco Pharma), à une dose de 1 J/cm2. Les poches d’irradiation sont agitées à une vitesse de 110 trs/min.
Après irradiation par rayonnement UVC, les contenus des poches d’irradiation sont re-mélangés dans une poche de transfert et le mélange de lysats plaquettaires irradié par rayonnement UVC est filtré au travers un filtre stérilisant de porosité 0,2 pm pour former un lot de lysat plaquettaire irradié aux UVC (LP-UVC).
2.3 Dosage des cytokines
Dans des échantillons de LP et LP-UVC on dose, à l’aide de kits Elisa commerciaux, la quantité de bFGF (ref.SFB50/ lot P116487), PDGF-AB (ref.SHDOOC/ lot P122623), PDGF-BB (ref.SBBOO/ lot P116857) et TGF-bêta1 (ref.SBIOOB/ lot P119433).
Sur la figure 13, La concentration en bFGF est impactée par l’irradiation par rayonnement UVC. En effet, on observe une perte moyenne de 23% de la concentration en bFGF aprèsirradiation aux UVC.
Sur la figure 14, la concentration en PDGF-AB est légèrement impactée par l’irradiation par rayonnement UVC. On observe une perte de 6% de la concentration en PDGF-AB causée par l’effet de l’irradiation aux UVC.
Sur la figure 15, la concentration en PDGF-BB est fortement impactée par l’irradiation par rayonnement UVC En effet, on observe une perte moyenne de 24% de la concentration en PDGF-BB après irradiation aux UVC.
Sur la figure 16, la concentration en TGF-bêta1 est impactée par l’irradiation par rayonnement UVC. En effet, on observe une perte moyenne de 35% de la concentration en TGF-bêta1 causée par l’irradiation par rayonnement UVC.
D’après ces résultats, seule la concentration en PDGF-AB est faiblement impactée par l’irradiation par rayonnement UVC (6% de perte), en revanche les concentrations en bFGF et TGF-bêta1 diminuent d’environ 30%, et la concentration en PDGF-BB diminue d’environ 20% après traitement aux UVC pour la dose étudiée.
2.4 Dosage des protéines
Le dosage de protéines est réalisé grâce à un kit BCA (UP40840/Q05KL03).
Aucun effet notable de l’irradiation par rayonnement UVC n’est observé sur la concentration en protéines (Figure 17).
2.5. Dosages biochimiques et facteurs de coagulation
Les analyses biochimiques ont été réalisées sur les 12 éléments suivants :
| Dosages biochimiques |
| Protéines totales |
| Albumine sérique |
| Calcium |
| Sodium |
| Fibrinogène |
| D-dimères |
| Mycoplasmes |
| Vitamine B12 |
| Vitamine D |
| Chlore |
| Fer |
| Cholestérol |
Parmi les 12 éléments dosés, seule la vitamine B12 est impactée par l’irradiation par rayonnement UVC. En effet, on observe une perte moyenne de 18,5% de la concentration en vitamine B12 causée par l’irradiation par rayonnement UVC (figure 18).
La concentration en facteurs de coagulation (Facteurs II, VII, IX, X, XI) et en antithrombine III, protéine impliquée dans la coagulation, est impactée par l’irradiation par rayonnement UVC. On observe toutefois que l’antithrombine III n’est que faiblement impactée par l’irradiation par rayonnement UVC (perte moyenne de 5% par rapport au lysat plaquettaire non irradié) en comparaison des autres facteurs de coagulation (Tableau 6 ci-dessous).
Tableau 6 : Pourcentages de différence en concentration de protéines par rapport au LP de départ
| Protéines | LP-UVC |
| Facteur II (Fil) | -24,6% |
| Facteur VII (FVII) | -10,6% |
| Facteur IX (FIX) | -52,4% |
| Facteur (FX) | -40,3% |
| Facteur XI (FXI) | -66,7% |
| antithrombine III (ATIII) | -6,1% |
2.6. Test de gélification
Le test a été réalisé à différentes concentrations de lysat plaquettaire dans le milieu de base alphaMEM sans héparine: 2,5%, 5%, 8%, 10%, 15%, et 20%.
Tableau 7 :
| % LP | 2,5 % | 5% | 8% | 10% | 15% | 20% |
| LP | - | + | ++ | +++ | +++ | +++ |
| LP-UVC | - | - | - | + | +++ | +++ |
- : pas de gélification + : effet gélifié mais quasi liquide ++ : gélifié à 50% +++ : gélifié à 100%
Pour le lysat plaquettaire non irradié (LP), à faible pourcentage de lysat plaquettaire (2,5%), il n’y a pas d’effet gélifié. Les résultats montrent que plus le pourcentage de lysat plaquettaire présent dans le milieu de base augmente, plus la gélification du milieu de base est importante.
A 5% de LP, le milieu de base a déjà un effet gélifié, et à 8% de lysat plaquettaire, le milieu de base est gélifié jusqu’à 50%.
Le milieu de base contenant du LP-UVC ne commence à gélifier qu’à des concentrations de LP-UVC de 10%.
En conclusion, on note que la seule irradiation par rayonnement UVC dégrade le pouvoir de coagulation du LP.
2.7. Tests de prolifération
Les cellules utilisées sont des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines primaires dérivées de moelle osseuse provenant de deux donneurs différents (MO65 et MO68). L’expérience a été réalisée en aveugle par deux expérimentatrices.
Le premier jour, on ensemence des plaques 6 puits à 2500 cellules/cm2 en triplicata. Les CSMh sont à P3.
Le milieu de base utilisé est le milieu alphaMEM et les échantillons de lysat plaquettaire à 8% sont ceux du tableau 7.
On change le milieu tous les 3 jours. Après 7 jours de culture cellulaire, les cellules sont comptées au ViCell.
On n’observe qu’un faible impact de l’irradiation par rayonnement UVC sur l’efficacité du lysat plaquettaire : perte de 8% de la prolifération cellulaire causée par les UVC (Figure 19).
Claims (15)
1. Procédé de préparation d’un lysat plaquettaire irradié comprenant les étapes suivantes :
- la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d’obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d’une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d’autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation,
- l’irradiation dudit lysat plaquettaire de départ, par un rayonnement UVC de longueur d’onde comprise entre 200 et 280 nm afin d’obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, ladite irradiation étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d’au moins 20% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’irradiation par rayonnement UVC est agencée pour réduire d’au moins 20% la concentration de chacun des facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI dans le lysat plaquettaire de départ.
3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le lysat plaquettaire de départ comprend au moins les facteurs de croissance endogènes TGF-bêta1, EGF, PDGF-AB, IGF-1, VEGF et bFGF, et en ce que l’irradiation par rayonnement UVC est agencée pour conserver au moins 80% de la concentration de l’un des facteurs de croissance incluant IGF-1, PDGF-AB, EGF et VEGF, et notamment au moins 80% de la concentration de chacun des facteurs de croissance incluant IGF-1, PDGF-AB, EGF et VEGF, du lysat plaquettaire de départ.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’irradiation par rayonnement UVC est réalisée à une dose comprise entre 0,01 à 2 J/cm2, particulièrement entre 0,5 J/cm2 et 1,5 J/cm2, et plus particulièrement à 1 J/cm2.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le lysat plaquettaire de départ est irradié par rayonnement UVC à l’état liquide.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l’irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration dudit lysat plaquettaire de départ au travers d'un filtre de porosité 0,65 pm ou moins, particulièrement 0,45 pm ou moins.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend, postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration stérilisante dudit lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC au travers d'un filtre de porosité 0,45 pm ou moins, particulièrement 0,22 pm ou moins.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu’il comprend en outre, postérieurement à l’irradiation par rayonnement UVC, une étape d'irradiation du lysat plaquettaire par un rayonnement ionisant ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 100 nm, particulièrement inférieure à 10 nm, et notamment par un rayonnement gamma ayant une longueur d’onde inférieure ou égale à 10 pm.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu’il comprend, préalablement à l’étape d’irradiation par rayonnement ionisant, une étape de congélation dudit lysat plaquettaire afin d’irradier par rayonnement ionisant le lysat plaquettaire à l’état congelé.
10. Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que l’irradiation par rayonnement ionisant est réalisée à une dose absorbée comprise dans la plage allant de 20 kGy à 75kGy, notamment de 35 kGy à 55 kGy.
11. Lysat plaquettaire irradié obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une concentration en protéines totales comprise entre 18 et 80 mg/ml, une concentration en fibrinogène inférieure à 0,4 mg/ml, et une concentration en facteur de croissance endogène TGF-bêta1 inférieure à 70 000 pg/ml.
12. Lysat plaquettaire irradié selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il comprend une concentration en facteur de croissance bFGF endogène inférieure à 140 pg/ml, une concentration en facteur de croissance endogène EGF inférieure à 2 800 pg/ml, et une concentration en facteur de croissance endogène PDGF-BB inférieure à 12 000 pg/ml.
13. Lysat plaquettaire irradié selon l’une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce qu’il comprend une concentration en vitamine B12 comprise entre 120 et 140 pg/ml.
14. Procédé pour la culture de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses, comprenant la mise en contact desdites cellules avec une composition nutritive comprenant un milieu de base et un lysat plaquettaire irradié selon l'une quelconque des revendications 11 à 13.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la composition nutritive est sous forme liquide et exempte d'anticoagulant.
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