FR3076911A1

FR3076911A1 - MICROSCOPE LIGHTING DEVICE FOR MEASURING A FAULT OF FOCUS

Info

Publication number: FR3076911A1
Application number: FR1870037A
Authority: FR
Inventors: Francois Perraut
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2019-07-19

Abstract

Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de mise au point comprenant un système d'illumination d'un objet, un objectif de microscope apte à former une image réelle de l'objet à la surface d'un capteur d'image caractérisé en ce que le système d'illumination est composé de deux sources lumineuses discrètes placées avant l'objet pour que l'objectif forme une première image quand une des sources est allumée et une deuxième image quand l'autre source est allumée, les deux images étant décalées l'une par rapport à l'autre quand la mise au point n'est pas assurée. Une procédure est appliquée pour enregistrer une première image en éclairant l'objet avec la première source et une deuxième image en éclairant l'objet avec la deuxième source. Une procédure de comparaison du décalage des deux images est appliquée dont le résultat fourni une mesure proportionnelle au défaut de mise au point.Device for illuminating an object observed under a microscope for measuring a focusing defect comprising an illumination system of an object, a microscope objective capable of forming a real image of the object on the surface of the object an image sensor characterized in that the illumination system is composed of two discrete light sources placed before the object so that the objective forms a first image when one of the sources is on and a second image when the other source is lit, both images being shifted relative to each other when focus is not assured. A procedure is applied to record a first image by illuminating the object with the first source and a second image by illuminating the object with the second source. A procedure for comparing the offset of the two images is applied, the result of which provides a measurement proportional to the lack of focus.

Description

DISPOSITIF D’ECLAIRAGE DE MICROSCOPE PERMETTANT DE MESURER UN DEFAUT DE MISE AU POINTMICROSCOPE LIGHTING DEVICE FOR MEASURING A FOCUSING DEFECT

BESÇRJPTIQNBESÇRJPTIQN

DOMAINE TECHNIQUETECHNICAL AREA

La présente Invention concerne un dispositif d'éclairage pour un microscope en transmission permettant de mesurer quantitativement un défaut de mise au point. La mesure obtenue à S'aide de ce dispositif est utilisée pour réaliser une mise au point automatique.The present invention relates to a lighting device for a transmission microscope making it possible to quantitatively measure a focusing defect. The measurement obtained using this device is used to achieve automatic focusing.

DESCRIPTION DU PROBLEMEDESCRIPTION OF THE PROBLEM

L’utilisation d'un microscope exige une opération de mise au point pour fournir une image exploitable. La mesure du défaut de focaiisation est donc une étape essentielle à la production d'images de bonne qualité. L'imprécision et la non reproductibilité qui découlent d'une erreur de mise au point affectent les résultats de l'exploitation des images. Les dispositifs existant permettant de mesurer le défaut de mise au point sont complexes, coûteux et imposent des commutations de composants optiques.Using a microscope requires focusing to provide a workable image. Measuring the focusing defect is therefore an essential step in producing good quality images. The imprecision and non-reproducibility which result from a focusing error affect the results of the processing of the images. The existing devices making it possible to measure the focusing defect are complex, costly and require switching of optical components.

DEFINITIONSDEFINITIONS

Observation visuelle directe : l'observation au travers des oculaires du microscope par l'observateur.Direct visual observation: observation through the microscope eyepieces by the observer.

Observation visuelle indirecte : l'observation sur un écran de l'image fournie par une caméra après numérisation de l'image.Indirect visual observation: the observation on a screen of the image provided by a camera after scanning the image.

Focus : synonyme de « mise au point ». « image au focus » : image nette. « Faire le focus » : faire la mise au point.Focus: synonymous with "development". "Focus image": sharp image. "Focus": focus.

Focalisation : action de mise au point, c'est-à-dire de modifier la position relative de l'objet par rapport au microscope afin d'obtenir une image nette.Focus: focusing action, that is to say, changing the relative position of the object relative to the microscope in order to obtain a clear image.

Position de focus: position relative de l'objet par rapport au microscope pour laquelle on obtient une image nette.Focus position: relative position of the object with respect to the microscope for which a clear image is obtained.

ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURESTATE OF THE PRIOR ART

La fourniture d'une image nette par un microscope est indispensable à l'exploitation ultérieure de cette image. La mise au point d'une image avec un microscope s'effectue principalement par le déplacement relatif le long de l’axe optique de l’objet par rapport à l'objectif de microscope, par le déplacement d'un groupe optique intermédiaire ou par le déplacement du capteur d'image. Dans tous les cas, pour effectuer la mise au point de façon automatique, c’est-à-dire sans intervention de l'observateur, il faut disposer d'une mesure du défaut de mise au point et la transmettre à un système de correction.The provision of a clear image by a microscope is essential for the subsequent exploitation of this image. The development of an image with a microscope is mainly carried out by the relative displacement along the optical axis of the object relative to the microscope objective, by the displacement of an intermediate optical group or by moving the image sensor. In all cases, in order to carry out the focusing automatically, that is to say without the intervention of the observer, it is necessary to have a measurement of the defect of focusing and to transmit it to a correction system .

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H existe plusieurs familles de méthodes connues de l'art antérieur pour mesurer ie défaut de mise au point. La plus courante consiste à utiliser une caméra pour enregistrer une ou plusieurs images de l’échantillon observé à une ou plusieurs positions de mise au point. A partir des images obtenues, des paramètres quantitatifs ou des figures de mérite sont extraites et qui fournissent une mesure de la défiscalisation. Le document Lawrence F. et al, Comparison of Autofocus Methads /or Automated Mîcroscopy. Cytometry 12, no. 3 (1991): 195-206, présente une comparaison de méthodes appliquant ce principe. Pour cette famille de méthodes, il est nécessaire d'acquérir plusieurs images en modifiant la position de mise au point ce qui allonge la durée de l’examen. Cet aspect est particulièrement handicapant lorsque la technique d'observation exploite la fluorescence car le niveau de fluorescence décroît après chaque prise d'image en raison du photo-blanchiment des fluorochromes. Par ailleurs, les paramètres quantitatifs extraits de ces images dépendent du type d’échantillon : la méthode n'est pas universelle.There are several families of methods known in the prior art for measuring the focusing defect. The most common is to use a camera to record one or more images of the observed sample at one or more focus positions. From the images obtained, quantitative parameters or figures of merit are extracted and which provide a measure of tax exemption. The document Lawrence F. et al, Comparison of Autofocus Methads / or Automated Mîcroscopy. Cytometry 12, no. 3 (1991): 195-206, presents a comparison of methods applying this principle. For this family of methods, it is necessary to acquire several images by modifying the focus position which lengthens the duration of the examination. This aspect is particularly handicapping when the observation technique exploits fluorescence because the level of fluorescence decreases after each image capture due to the photo-bleaching of fluorochromes. Furthermore, the quantitative parameters extracted from these images depend on the type of sample: the method is not universal.

La deuxième méthode couramment utilisée et décrite dans le document US3721827 consiste à projeter un faisceau de lumière et à analyser la lumière qui se réfléchit sur l’objet par mesure de l'intensité du faisceau réfléchi à l’aide d’un capteur photo-électrique, de son déplacement à l'aide d'un capteur de position, ou de sa structure de phase avec une photodiode à quatre quadrants. Cette méthode n'est pas applicable en transmission et impose d'ajouter plusieurs composants optiques (source de lumière, lame séparatrice, lentilles, supports mécaniques).The second method commonly used and described in document US3721827 consists in projecting a beam of light and in analyzing the light which is reflected on the object by measuring the intensity of the beam reflected using a photoelectric sensor. , its displacement using a position sensor, or its phase structure with a four-quadrant photodiode. This method is not applicable in transmission and requires adding several optical components (light source, separating plate, lenses, mechanical supports).

Une troisième méthode repose sur la projection d'un motif à îa surface de l'échantillon, comme décrit dans le document US4406526. Selon ce document, un motif de ligne est tout d'abord décomposé par un système optique afin d’obtenir la recomposition du motif quand te mise au point est effectuée. Ce dispositif ne fonctionne qu'en réflexion. Il impose une surface d'échantillon assez réfléchissante pour fournir une image en réflexion du motif projeté. De surcroît, cette, méthode impose d'ajuster parfaitement la position de recomposition du motif et la position de mise au point de l'image de l'objet.A third method is based on the projection of a pattern on the surface of the sample, as described in the document US4406526. According to this document, a line pattern is firstly decomposed by an optical system in order to obtain the recomposition of the pattern when the focusing is carried out. This device works only in reflection. It imposes a sufficiently reflective sample surface to provide a reflective image of the projected pattern. In addition, this method requires to perfectly adjust the position of recomposition of the pattern and the focus position of the image of the object.

Une autre méthode de mise au point d'une image pour te microscopie est décrite dans le document Liao et al., Singie-Frame Rapid Autofocusing for Brightfieid and Fluorescence Whoie Siide Imaging.’’, Biomédical Optics Express 7, no. 11 (November 1, 2016): 4763. Dans le dispositif décrit, deux diodes électroluminescentes sont disposées dans la pupille du condenseur d'éclairage du microscope. La position de ces deux diodes électroluminescentes permet, lorsqu'elles sont éclairées, de fournir dans le pian image du microscope, deux images décalées qui se superposent dans ie pian du capteur d'images. L'amplitude du décalage dépend de la valeur de la défiscalisation. La mesure du défocus découle de l'analyse de l'image numérique enregistrée par une caméra. Pour ce dispositif, il est nécessaire de modifier Je condenseur d’édairage pour placer deux diodes électroluminescentes dans ie plan de la pupille d'ouverture du condenseur. De plus, ces deux diodes électroluminescentes obturent partiellement le faisceau d’illumination, créant des phénomènes de diffraction modifiant l'image observée lorsqu’elle est illuminée par te faisceau issu du condenseur. Par ailleurs, comme les diodes électroluminescentes sont placées dans 1e plan de la pupille d'ouverture du condenseur, te dispositif décrit ne permet qu'une seule direction d'illumination dans F espace de Fobjet indépendamment de la distance *i à t'ohjet. La précision de la mesure du défaut de mise au point ne peut être optimale que pourAnother method of developing an image for microscopy is described in the document Liao et al., Singie-Frame Rapid Autofocusing for Brightfieid and Fluorescence Whoie Siide Imaging. ’’, Biomedical Optics Express 7, no. 11 (November 1, 2016): 4763. In the device described, two light-emitting diodes are arranged in the pupil of the lighting condenser of the microscope. The position of these two light-emitting diodes makes it possible, when they are lit, to provide in the yaws image of the microscope, two offset images which are superimposed in the yaws of the image sensor. The magnitude of the offset depends on the value of the tax exemption. The measurement of the defocus results from the analysis of the digital image recorded by a camera. For this device, it is necessary to modify the lighting condenser to place two light-emitting diodes in the plane of the opening pupil of the condenser. In addition, these two light-emitting diodes partially block the illumination beam, creating diffraction phenomena modifying the image observed when it is illuminated by the beam from the condenser. Furthermore, since the light-emitting diodes are placed in the plane of the aperture pupil of the condenser, the device described allows only one direction of illumination in the space of the object regardless of the distance * i to the object. The accuracy of the measurement of the focusing defect can only be optimal for

2/11 quelques grandissements et ne fonctionne bien que pour un intervalle fini de positions de délocalisation. De plus, ce dispositif est inopérant pour des objets présentant une structure de lignes orientées parallèlement à la droite passant par le centre des deux diodes électroluminescentes. Enfin, la méthode exposée dans ce document ne permet pas de connaître le sens à apporter à la correction, suivant que l’objet est au-dessus ou en-dessous S de la position du plan de netteté. Pour contourner ce manque d’information, le microscope doit être défocalisé dans un sens donné pour supprimer l'ambiguïté de position.2/11 some enlargements and works well only for a finite range of offshoring positions. In addition, this device is ineffective for objects having a structure of lines oriented parallel to the straight line passing through the center of the two light-emitting diodes. Finally, the method exposed in this document does not allow to know the direction to bring to the correction, according to whether the object is above or below S of the position of the plane of sharpness. To get around this lack of information, the microscope must be defocused in a given direction to remove ambiguity of position.

L'invention décrite dans le présent document permet de fournir un moyen de mesurer le défaut de mise au point par dédoublement de l'image de l'objet observé par un microscope. Cette invention permet de connaître 1e sens de la correction de position à effectuer pour obtenir une image nette. Cette invention ne nécessite pas de placer 10 de composant optique entre l'objet et l'image. Quand l'invention est utilisée avec un condenseur d'illumination, la constitution du condenseur d'éclairage n'a pas à être modifiée et la structure du faisceau d'illumination issu du condenseur n'est pas altérée. Dans un mode avantageux, l'invention permet d'avoir une amplitude de mesure étendue qui s'adapte aux différents grandissements possibles avec un microscope. Dans un autre mode avantageux, le procédé décrit est mis en œuvre dans un système d'éclairage complet sans composant optique.The invention described in this document makes it possible to provide a means of measuring the focusing defect by splitting the image of the object observed by a microscope. This invention makes it possible to know the direction of the position correction to be carried out in order to obtain a sharp image. This invention does not require placing an optical component between the object and the image. When the invention is used with an illumination condenser, the constitution of the lighting condenser does not have to be modified and the structure of the illumination beam coming from the condenser is not altered. In an advantageous embodiment, the invention makes it possible to have an extended amplitude of measurement which adapts to the different magnifications possible with a microscope. In another advantageous embodiment, the method described is implemented in a complete lighting system without an optical component.

EXPOSE DE L'tNVENTIONSTATEMENT OF THE INVENTION

Dans différents modes de réalisation, la présente invention concerne également les caractéristiques suivantes qui devront être considérées Isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles :In different embodiments, the present invention also relates to the following characteristics which should be considered in isolation or in all their technically possible combinations:

ie dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point sera constitué de plusieurs 20 sources discrètes disposées selon une structure d’anneau, le dispositif d’éclairage permettant de mesurer ie défaut de mise au point sera constitué de plusieurs sources discrètes disposées selon une structure de plusieurs d’anneaux concentrique, ie dispositif d'éclairage permettant de mesurer te défaut de mise au point sera constitué de plusieurs sources discrètes disposées selon une grille ou une matrice,the lighting device making it possible to measure the focusing defect will consist of several discrete sources arranged in a ring structure, the lighting device making it possible to measure the focusing defect being made up of several discrete sources arranged according to a structure of several concentric rings, the lighting device making it possible to measure the defect of focusing will be made up of several discrete sources arranged according to a grid or a matrix,

- tes sources du dispositif d’éclairage ne sont pas diamétralement opposée par rapport à l'axe optique du microscope, le dispositif d’èdairage permettant de mesurer te défaut de mise au point sera fixé sur te dispositif d'illumination conventionnés du microscope, tes sources discrètes du dispositif d'éclairage seront choisies parmi tes sources discrètes d'une structure 30 de plusieurs sources discrètes, comme par exempte un réseau d'anneaux concentriques de sources, une grille de sources, une matrice de sources.- your sources of the lighting device are not diametrically opposite with respect to the optical axis of the microscope, the lighting device making it possible to measure the focusing defect will be fixed on the conventional illumination device of the microscope, your discrete sources of the lighting device will be chosen from your discrete sources of a structure 30 of several discrete sources, such as for example a network of concentric rings of sources, a grid of sources, a matrix of sources.

L'invention concerne également des procédures numériques d’analyse d’images obtenues avec te dispositif d'éclairage permettant de mesurer te défaut de mise au point.The invention also relates to digital procedures for analyzing images obtained with the lighting device making it possible to measure the focusing defect.

L'invention concerne également un microscope. Selon l’invention, ledit microscope comprend un dispositif 35 d'éclairage permettant de mesurer te défaut de mise au point tel que défini précédemment ainsi que :The invention also relates to a microscope. According to the invention, said microscope comprises a lighting device 35 making it possible to measure the focusing defect as defined above as well as:

3/11 des moyens mécaniques de positionner te dispositif d’éclairage permettant de mesurer te défaut de mise au point dans Ses trois directions de l'espace, d'un moyen électronique de contrôler les sources discrètes du dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point.3/11 mechanical means of positioning the lighting device making it possible to measure the focusing defect in its three directions of space, an electronic means of controlling the discrete sources of the lighting device making it possible to measure the failure to focus.

Dans différents modes de réalisations possibles, l’invention sera décrite plus en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels :In different possible embodiments, the invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings in which:

la figure 1 représente schématiquement le principe du dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, la figure 2A représente te dispositif d'éclairement dans un premier mode de réalisation de la présente invention, les figures 2B et 2C représentent deux configurations particulières de l'invention dans te premier mode de réalisation, la figure 3A représente te dispositif d'éclairement dans un deuxième mode de réalisation de la présente invention, les figures 3B et 3C représentent deux configurations particulières de l'invention dans le deuxième mode de réalisation, la figure 4A représente te dispositif d'éclairement dans un troisième mode de réalisation de la présente invention, la figure 4B représente une configuration particulière de l’invention dans le troisième mode de réalisation, la figure SA représente une procédure de mesure d'un défeut de mise au point avec te dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, la figure 5B représente schématiquement un résultat obtenue lors d'un étape de la procédure de mesure d'un défaut de mise au point avec te dispositif d'éclairage permettant de mesurer te défaut de mise au point, ia figure 6A représente deux images expérimentales enregistrées avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer te défaut de mise au point, te figure 6B représente un résultat expérimental de mesures de plusieurs défauts de mise au point avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point dans un premier mode de réalisation, te figure 6C représente une table de mesures quantitatives du défaut de mise au point obtenues avec te dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, te figure 7 représente un résultat expérimental de mesures de plusieurs défauts de mise au point avec te dispositif d’éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point dans un deuxième mode de réalisation.FIG. 1 diagrammatically represents the principle of the lighting device making it possible to measure the focusing defect, FIG. 2A represents the lighting device in a first embodiment of the present invention, FIGS. 2B and 2C represent two configurations particulars of the invention in the first embodiment, FIG. 3A represents the lighting device in a second embodiment of the present invention, FIGS. 3B and 3C represent two particular configurations of the invention in the second embodiment embodiment, FIG. 4A represents the lighting device in a third embodiment of the present invention, FIG. 4B represents a particular configuration of the invention in the third embodiment, FIG. SA represents a procedure for measuring a focusing defect with the lighting device making it possible to measure the defect of FIG. 5B schematically represents a result obtained during a step of the procedure for measuring a focusing defect with the lighting device making it possible to measure the focusing defect, FIG. 6A represents two experimental images recorded with the lighting device making it possible to measure the focusing failure, FIG. 6B represents an experimental result of measurements of several focusing defects with the lighting device making it possible to measure the focusing failure point in a first embodiment, FIG. 6C represents a table of quantitative measurements of the focusing defect obtained with the lighting device making it possible to measure the focusing defect, FIG. 7 represents an experimental result of measurements of several focusing defects with the lighting device making it possible to measure the focusing defect in a second mode of r embodiment.

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La figure 1 donne une description de l'invention. Un objet 100 est placé sur un support transparent 101 comme par exemple une lame de microscope. Un objectif de microscope 102 transporte l'image de l'objet jusqu'au plan d'un capteur d’image 104. Selon le type d'objectif de microscope utilisé, un groupe optique additionnel 103 peut être intercalé entre l'objectif de microscope et le capteur d’image. Deux sources de lumière 105i et 105z sont 5 placées sous l’objet sur un support 106. Ces sources peuvent être choisies parmi les diodes électroluminescentes, les sources à filament de petites tailles, les diodes électroluminescentes organiques, les diodes lasers, les diodes lasers à cavité verticale. L'axe 110 correspond à l'axe optique du microscope.Figure 1 gives a description of the invention. An object 100 is placed on a transparent support 101 such as for example a microscope slide. A microscope objective 102 transports the image of the object to the plane of an image sensor 104. Depending on the type of microscope objective used, an additional optical group 103 can be interposed between the microscope objective and the image sensor. Two light sources 105i and 105z are placed under the object on a support 106. These sources can be chosen from light-emitting diodes, small filament sources, organic light-emitting diodes, laser diodes, laser diodes with vertical cavity. The axis 110 corresponds to the optical axis of the microscope.

Dans un premier mode d'utilisation de l'invention, l'objet 100 étant en place, la mesure du défaut de mise au point est réalisée en plusieurs étapes représentées à la Fig. SA. Une première étape 201 consiste à allumer une 10 des sources de lumière 105i ou 105i pour éclairer l'objet, par exemple avec la source 105i. Une deuxième étapeIn a first mode of use of the invention, the object 100 being in place, the measurement of the focusing defect is carried out in several steps shown in FIG. HER. A first step 201 consists in switching on one of the light sources 105i or 105i to illuminate the object, for example with the source 105i. A second step

202 consiste à enregistrer une première image h. Une troisième étape 203 consiste à éteindre la source allumée à l'étape 201. Une quatrième étape 204 consiste à allumer la seconde source de lumière, par exemple Sa source 1052 si la première source de lumière allumée était 1051. Une cinquième étape 205 consiste à enregistrer une deuxième image h.202 consists in recording a first image h. A third step 203 consists in switching off the source lit at step 201. A fourth step 204 consists in turning on the second light source, for example Its source 1052 if the first light source turned on was 1051. A fifth step 205 consists in record a second image h.

La mesure du défaut de mise au point est calculée en combinant numériquement les images h et h. Par exempte, on peut réaliser une étape 206 consistant à calculer l'inter-corrélation des images li et h enregistrées aux étapes 202 et 205 : le résultat de i’inter-corrélation est une matrice à deux dimensions 211. Une étape 207 est ensuite réalisée, consistant à calculer ie vecteur CM. Le point C du vecteur CM est le centre 213 de la matrice 211 et le point M du vecteur CM correspond à la position du maximum 212 de l'inter corrélation 211. La norme du vecteurThe focus defect measurement is calculated by digitally combining the h and h images. For example, one can carry out a step 206 consisting in calculating the inter-correlation of the images li and h recorded in steps 202 and 205: the result of the inter-correlation is a two-dimensional matrix 211. A step 207 is then performed, consisting in calculating the vector CM. The point C of the vector CM is the center 213 of the matrix 211 and the point M of the vector CM corresponds to the position of the maximum 212 of the inter-correlation 211. The norm of the vector

20. CM (repère 210) est proportionnelle à la mesure du défaut de mise au point et sa direction donne le sens de la correction. Par exemple, si Xm et Ym sont tes coordonnées du maximum 212 de l'inter-corrélation et Xc et Yc les coordonnées du centre de la matrice 211, la norme du vecteur CM 210 est calculée selon la relation suivante :20. CM (item 210) is proportional to the measurement of the focusing defect and its direction gives the direction of the correction. For example, if Xm and Ym are your coordinates of the maximum 212 of the inter-correlation and Xc and Yc the coordinates of the center of the matrix 211, the norm of the vector CM 210 is calculated according to the following relation:

[ Equation 1 ][Equation 1]

Le sens de correction est donné par la comparaison de Xm à Xc, ou de Ym à Yc. Si Xm est supérieur à Xc, on corrigera 25 dans un sens donné à définir par une étape d'étalonnage et si Xm est inférieur à Xc, on corrigera dans 1e sens inverse, il est important de noter que la connaissance du sens de correction est obtenue grâce à l'enregistrement distinct des Images h et h dans un ordre déterminé.The direction of correction is given by the comparison of Xm to Xc, or of Ym to Yc. If Xm is greater than Xc, we will correct 25 in a given direction to be defined by a calibration step and if Xm is less than Xc, we will correct in the opposite direction, it is important to note that knowledge of the direction of correction is obtained by separate recording of Images h and h in a specified order.

La distance 210 est transmise à un dispositif de correction de te position, par exemple un contrôleur d'actionneur comme un moteur tournant, un dispositif de déplacement piézo-électrique, une lentille à focale variable.The distance 210 is transmitted to a position correction device, for example an actuator controller such as a rotating motor, a piezoelectric displacement device, a lens with variable focal length.

La succession des étapes 201 à 207 est désignée par le repère 200.The succession of steps 201 to 207 is designated by the reference 200.

Préalablement à l'utilisation de ce premier mode pour fournir une consigne de déplacement à un contrôleur de déplacement, une procédure d'étalonnage est réalisée. Par exempte, on peut procéder en appliquant la procédure 200 à une première position axiale de l’objet et enregistrer une première distance 210 notée 210i.Before using this first mode to provide a movement instruction to a movement controller, a calibration procedure is carried out. For example, we can proceed by applying the procedure 200 to a first axial position of the object and record a first distance 210 denoted 210i.

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L'objet est ensuite déplacé selon l'axe optique d'une quantité Δζ connue, par exemple en se repérant aux graduations de la molette de mise au point ou en déplaçant un moteur de commande de mise au point d’une consigne connue relative à Δζ. L’unité de Δζ pourra être indifféremment exprimée en mètre, en graduation, en pas moteur, en pas codeur. On applique ensuite la procédure 200 à cette, nouvelle position axiale et on enregistre S une deuxième distance 210 notée 2102. La correspondance entre la distance 210 et le déplacement physique 22 à effectuer pour obtenir une image nette est exprimée par la relation suivante :The object is then moved along the optical axis by a known quantity Δζ, for example by referring to the graduations on the focusing wheel or by moving a focusing control motor with a known setpoint relating to Δζ. The unit of Δζ can be expressed in meters, in graduation, in motor step, in encoder step. The procedure 200 is then applied to this new axial position and a second distance 210 denoted S 210 is recorded S. The correspondence between the distance 210 and the physical displacement 22 to be carried out in order to obtain a sharp image is expressed by the following relation:

Z_C = 210xZ _C = 210x

ΔζΔζ

21O₂~21oZ [ Equation 2 ]21O ₂ ~ 21oZ [Equation 2]

Une autre façon de réaliser l'étalonnage du dispositif de correction revient à enregistrer plusieurs coules (Δζ ;Another way of calibrating the correction device is to record several flows (Δζ;

201) et à calculer le coefficient directeur de la droite de régression linéaire entre les valeurs de Δζ et tes valeurs 10 de 210.201) and to calculate the directing coefficient of the linear regression line between the values of Δζ and the values 10 of 210.

Dans un deuxième mode d’utilisation, les deux sources 105i et WSz sont choisies pour qu'elles émettent chacune des rayonnements optiques de longueur d’onde différente. De façon avantageuse, les rayonnements des deux sources sont émis dans des intervalles spectraux distincts. Le choix des intervalles spectraux est fait selon le type de capteur d’image utilisé. Par exemple, pour un détecteur d'image couleur à matrice de Bayer, on choisira 15 préférentiellement une source émettant une couleur rouge et une source émettant une couleur bleue, comme des diodes électroluminescentes. La procédure 200 est alors modifiée : tes étapes 201 à 205 sont remplacées par une première étape d'allumage simultané des deux sources et d'une deuxième étape d'enregistrement de l’image de l'objet par le microscope à l'aide d'une caméra couleur. Une troisième étape consiste à décomposer l'image couleur en trois images monochromatiques correspondant chacune aux composantes rouge, verte et 20 bleue. Si la source 105i émet un rayonnement rouge et la source lOSz émet un rayonnement bleu, on associe, par exemple, la composante rouge à l'image 11 et la composante bleue à l’image 12 et on applique les étapes 206 à 208. L'avantage de ce deuxième mode d'utilisation est de réduire 1e temps nécessaire à la procédure de mesure de la distance de mise au point en réduisant te nombre d'enregistrement d'images. La connaissance du sens de correction est obtenue grâce à l'association déterminée des images h et h aux composantes rouge et bleue.In a second mode of use, the two sources 105i and WSz are chosen so that they each emit optical radiation of different wavelength. Advantageously, the radiation from the two sources is emitted in separate spectral intervals. The choice of spectral intervals is made according to the type of image sensor used. For example, for a Bayer matrix color image detector, a source emitting a red color and a source emitting a blue color are preferentially chosen, such as light-emitting diodes. The procedure 200 is then modified: your steps 201 to 205 are replaced by a first step of simultaneous ignition of the two sources and of a second step of recording the image of the object by the microscope using 'a color camera. A third step consists in decomposing the color image into three monochromatic images each corresponding to the red, green and blue components. If the source 105i emits red radiation and the source lOSz emits blue radiation, for example, the red component is associated with image 11 and the blue component with image 12 and steps 206 to 208 are applied. L The advantage of this second mode of use is to reduce the time required for the procedure for measuring the focusing distance by reducing the number of image recordings. Knowledge of the direction of correction is obtained thanks to the determined association of the images h and h with the red and blue components.

Un premier mode de réalisation possible selon les deux modes d'utilisation est décrit par la Fig. 2. Dans ce premier mode de réalisation, le support 106 comportant les sources 105i et 105?. est conçu pour se placer sur un diamètre externe du support 107 de l'optique du condenseur du microscope. La Fig. 2A représente une vue de côté avec te support 106 en coupe. La Rg. 2B représente la vue de dessus. Dans ce premier mode de réalisation, le condenseur du microscope n’est pas modifié et te faisceau d'éclairement de l'objet sortant du condenseur 30 n'est pas altéré par la présence des sources 105i et 105?. Ce premier mode de réalisation permet de régler la précision de la mesure de défocalisation en modifiant la position du condenseur 1e long de l'axe optique.A first possible embodiment according to the two modes of use is described in FIG. 2. In this first embodiment, the support 106 comprising the sources 105i and 105 ?. is designed to be placed on an external diameter of the support 107 of the optics of the condenser of the microscope. Fig. 2A shows a side view with the support 106 in section. The Rg. 2B shows the top view. In this first embodiment, the condenser of the microscope is not modified and the illumination beam of the object leaving the condenser 30 is not altered by the presence of the sources 105i and 105 ?. This first embodiment makes it possible to adjust the precision of the defocusing measurement by modifying the position of the condenser 1e along the optical axis.

Dans un premier mode avantageux selon ce premier mode de réalisation, les deux sources de lumière 105i et lOS?. sont disposées sur le support 106 de telle sorte que tes axes passant par te centre du condenseur et le centre de chaque source font un angle A comme représenté en Fig. 28. Ce mode avantageux permet d'obtenir un 3c de? l’image pour toutes Ses orientations des structures de l’objet, Dans un deuxième modeIn a first advantageous embodiment according to this first embodiment, the two light sources 105i and lOS ?. are arranged on the support 106 so that your axes passing through the center of the condenser and the center of each source form an angle A as shown in FIG. 28. This advantageous mode makes it possible to obtain a 3c of? the image for all Its orientations of the structures of the object, In a second mode

6/11 avantageux séton ce premier mode de réalisation, on place plusieurs sources sur le support 106 comme représenté en Fig. 2.C. Ce mode permet de choisir la direction de dédoublement de l’image en sélectionnant le couple de sources allumées.6/11 advantageous in this first embodiment, several sources are placed on the support 106 as shown in FIG. 2.C. This mode allows you to choose the image splitting direction by selecting the pair of lit sources.

Dans un deuxième mode de réalisation selon les deux modes d'utilisation, le support 106 se fixe en lieu et place S du condenseur. Ce mode de réalisation peut être choisi quand aucun condenseur n'est utilisé, par exemple, quand une observation en épi-illumination est utilisée, comme i'épi-fiuorescence. Dans la Fig. 3, on a représenté un support 106 muni, par exemple, d'une queue d’aronde mâle pouvant se fixer sur la queue d’aronde femelle, non représentée, présente sur les microscopes. La Fig. 3A représente une vue de côté avec le support 106 qui supporte les sources 105i et 105î et la queue d'aronde male 108. La Fig. 3B représente la vue de dessus. Ce mode 10 de réalisation permet d'ajuster la précision de la mesure du défaut de mise au point en modifiant la distance entre les sources 105 et l'objet 100.In a second embodiment according to the two modes of use, the support 106 is fixed in place of the condenser S. This embodiment can be chosen when no condenser is used, for example, when an observation in epi-illumination is used, such as epi-fluorescence. In Fig. 3, there is shown a support 106 provided, for example, with a male dovetail which can be fixed on the female dovetail, not shown, present on the microscopes. Fig. 3A shows a side view with the support 106 which supports the sources 105i and 105î and the male dovetail 108. FIG. 3B shows the top view. This embodiment makes it possible to adjust the precision of the measurement of the focusing defect by modifying the distance between the sources 105 and the object 100.

Dans un premier mode avantageux selon ce deuxième mode de réalisation, les deux sources de lumière 105i et 1052 sont disposées sur le support 106 de telle sorte que les axes passant par te centre du condenseur et le centre de chaque source font un angle A différent de 180 comme représenté en Fig. 3B. Ce mode avantageux permet 15 d'obtenir un dédoublement de l'image pour toutes les orientations des structures de l'objet. Dans un deuxième mode avantageux selon ce deuxième mode de réalisation, on place plusieurs sources sur le support 106 comme représenté en Fig. 3C. Ce mode permet de choisir la direction de dédoublement de l’image en sélectionnant le couple de sources allumées.In a first advantageous embodiment according to this second embodiment, the two light sources 105i and 1052 are arranged on the support 106 so that the axes passing through the center of the condenser and the center of each source make an angle A different from 180 as shown in FIG. 3B. This advantageous mode makes it possible to obtain a splitting of the image for all the orientations of the structures of the object. In a second advantageous embodiment according to this second embodiment, several sources are placed on the support 106 as shown in FIG. 3C. This mode allows you to choose the image splitting direction by selecting the pair of lit sources.

Dans un troisième mode de réalisation selon les deux modes d’utilisation représenté en Fig. 4, on dispose sur le 20 support 106 plusieurs sources selon plusieurs anneaux concentriques. En Fig. 4A, on a représenté trois anneauxIn a third embodiment according to the two modes of use shown in FIG. 4, several sources are arranged on the support 106 according to several concentric rings. In Fig. 4A, three rings are shown

108i, IO82 et IO83 sur lesquels on dispose six sources, 105i et 105s sur l'anneau 1081,105s et 105« sur l'anneau108i, IO82 and IO83 on which there are six sources, 105i and 105s on the ring 1081,105s and 105 "on the ring

IO82 et 105s et 105s sur l'anneau 108s. Pour dédoubler l’image, on choisira d'allumer tes sources par paire, par exemple 105j et IOSî, 105s et 105« ou 105s et 105s. On pourra aussi associer tes sources de toutes tes manières possibles, par exempte 105i et 105«, 105i et 105s. Le choix de la paire de sources aîiumées permet de régler Sa 25 précision de mesure du défaut de mise au point en modifiant l’amplitude du dédoublement : pour une même défocalisation, l'amplitude est plus grande pour les sources placées te plus loin du centre des anneaux. L'avantage de cette configuration est qu’elle permet d’augmenter le domaine de mise au point : pour une forte défocalisation, on allume tes sources de l'anneau ayant te plus petit diamètre. Pour une faible défiscalisation, on allume tes sources de l’anneau ayant le plus grand diamètre. La précision de îa mesure du défaut de mise au 30 point peut être ajustée en modifiant la distance à l’objet 100 du support 106. Dans un premier mode avantageux selon ce troisième mode de réalisation, tes sources de lumière 105 sont disposées sur te support 106 de telle sorte que tes axes passant par te centre du condenseur et le centre de chaque source font un angle A, comme représenté en Fig. 4A. Ce mode avantageux permet d'obtenir un dédoublement de l’image pour toutes tes orientations des structures de l’objet. Dans un deuxième mode avantageux selon le troisième mode de 35 réalisation, on place plusieurs sources sur chaque anneau du support 106 comme représenté en Fig. 48. Ce mode permet de choisir ta direction de dédoublement de l'image en sélectionnant le couple de sources allumées. Une source 111 peut être ajoutée au centre de la structure. Ce mode de réalisation constitue un dispositif completIO82 and 105s and 105s on the 108s ring. To split the image, we will choose to switch on your sources in pairs, for example 105j and IOSî, 105s and 105 "or 105s and 105s. We can also associate your sources in all your possible ways, for example 105i and 105 ", 105i and 105s. The choice of the pair of senior sources makes it possible to adjust its precision of measurement of the defect of focusing by modifying the amplitude of the splitting: for the same defocusing, the amplitude is greater for the sources placed farther from the center. rings. The advantage of this configuration is that it allows you to increase the focusing range: for strong defocusing, you turn on your sources of the ring with the smallest diameter. For a low tax exemption, we turn on your sources of the ring with the largest diameter. The precision of the measurement of the focusing defect can be adjusted by modifying the distance to the object 100 from the support 106. In a first advantageous mode according to this third embodiment, your light sources 105 are arranged on the support 106 so that your axes passing through the center of the condenser and the center of each source form an angle A, as shown in FIG. 4A. This advantageous mode makes it possible to obtain a duplication of the image for all your orientations of the structures of the object. In a second advantageous embodiment according to the third embodiment, several sources are placed on each ring of the support 106 as shown in FIG. 48. This mode allows you to choose your image splitting direction by selecting the pair of lit sources. A source 111 can be added to the center of the structure. This embodiment constitutes a complete device

7/11 d’illumination qui se substitue au condenseur d'illumination. Les sources 105 peuvent être réparties de manière circulaire comme représenté en Fig. 4B ou en matrice rectangulaire.7/11 illumination which replaces the illumination condenser. The sources 105 can be distributed in a circular manner as shown in FIG. 4B or in rectangular matrix.

RESULTATS EXPERIMENTAUX OBTENUS AVEC LT NVENTTONEXPERIMENTAL RESULTS OBTAINED WITH LT NVENTTON

Des résultats expérimentaux sont présentés. Une première expérience est réalisée selon le troisième mode de réaîisation avec une structure de sources comme représentée en Fig. 4B. Un réticule micrométrique est l'objet 100. Les deux sources 105i et 1052 sont des diodes électroluminescentes vertes placées de façon asymétriques par rapport à l’axe optique 110.105i est placée à 1 cm de l'axe optique et lOSz à 2 cm. Les axes parallèles au plan objet passant par le centre des sources et l'axe optique font entre eux un angle de 116”. L'image 104 de l’objet formée par le microscope est enregistrée avec une caméra couleur avec un grandissement de 10 fois. La Fig. 6A représente une première image 301 enregistrée avec la source 105i seule allumée et une deuxième imageExperimental results are presented. A first experiment is carried out according to the third mode of realization with a structure of sources as represented in FIG. 4B. A micrometric reticle is the object 100. The two sources 105i and 1052 are green light-emitting diodes placed asymmetrically with respect to the optical axis 110.105i is placed 1 cm from the optical axis and lOSz at 2 cm. The axes parallel to the object plane passing through the center of the sources and the optical axis make an angle of 116 ”between them. The image 104 of the object formed by the microscope is recorded with a color camera with a magnification of 10 times. Fig. 6A represents a first image 301 recorded with the source 105i only lit and a second image

302 enregistrée avec la source 105s seule allumée. Le décalage de l'image 302 par rapport à l'image 301 est nettement visible.302 recorded with source 105s only on. The shift of image 302 from image 301 is clearly visible.

La Fig. 6B représente dans un graphique à deux dimensions Ses positions du maximum d'înter-corrélation 212 pour plusieurs défocus 303 à 310 calculé en appliquant la procédure 200. Chaque position est marquée par une croix. De 303 à 309, i’objet est déplacé de 125 pm après chaque enregistrement d'image. De 309 à 310, l'objet est déplacé de 25 pm. La position de mise au point est repérée par le cercle plein 311. A partir des valeurs expérimentales, une droite de régression linéaire est calculée et représentée par te repère 312. Les points expérimentaux sont bien alignés sur cette droite. L'écart moyen entre les points 303 à 309 est de 16.28 pixels. L'écart entre ies points 309 et 310 est de 32.55 pixels ce qui correspond au double de la valeur précédente. En appliquant la relation établie précédemment, on converti, pour ies points 303 à 310, les distances 210 en écart à la position de mise au point comme illustré dans la Fig. 6C : la colonne de gauche reprend les repères des pointsFig. 6B represents in a two-dimensional graph Its positions of the maximum inter-correlation 212 for several defocuses 303 to 310 calculated by applying the procedure 200. Each position is marked by a cross. From 303 to 309, the object is moved 125 pm after each image recording. From 309 to 310, the object is moved 25 pm. The focus position is identified by the solid circle 311. From the experimental values, a linear regression line is calculated and represented by the reference 312. The experimental points are well aligned on this line. The average difference between the points 303 to 309 is 16.28 pixels. The difference between the points 309 and 310 is 32.55 pixels, which corresponds to twice the previous value. By applying the relation established previously, the distances 210 are converted, for points 303 to 310, into deviation from the focus position as illustrated in FIG. 6C: the left column shows the marks of the points

303 à 310 et la colonne de droite donne l’écart à la position de mise au point exprimée en micromètre.303 to 310 and the right column gives the deviation from the focus position expressed in micrometers.

Une deuxième expérience est réalisée en utilisant le deuxième mode d'utilisation. La source 105i est une diode électroluminescente rouge et la source 1052 est une diode électroluminescente bleue. Les deux sources sont allumées en même temps et une image est enregistrée avec une caméra couleur pour plusieurs positions de l'objet. La procédure de traitement de cette image selon le deuxième mode d'utilisation est appliquée. Une courbe simiiaire à celle de la Fig.A second experiment is carried out using the second mode of use. Source 105i is a red light emitting diode and source 1052 is a blue light emitting diode. Both sources are turned on at the same time and an image is recorded with a color camera for several positions of the object. The procedure for processing this image according to the second mode of use is applied. A curve similar to that of FIG.

6B est obtenue et illustrée en Fig7. L'exploitation des données est effectuée de façon identique à celle de l'exemple précédent.6B is obtained and illustrated in Fig7. Data processing is carried out in the same way as in the previous example.

Claims

gÊVÆWÇAUQSS

1. Device for lighting an object observed under a microscope for measuring a focusing defect which comprises a system for illuminating an object (100) placed on a support (101), a microscope objective (102 ) capable of forming an image of the object on the surface of an image sensor 104 characterized in that:

the illumination system is composed of two discrete light sources (105i and 105a) placed before the object in such a way that the objective forms a first image 301 when one of the sources is switched on and a second image 302 when the other source is on, the two images being offset from each other when the focus is not ensured, a procedure is applied to record a first image 301 by lighting the object with the first source and a second image 302 by lighting the object with the second source, a procedure for comparing the offset of the two images is applied, the result of which provides a measure proportional to the focusing defect.

2. Device for lighting an object observed under a microscope for measuring a focusing defect according to claim 1, characterized in that your light sources are chosen from light-emitting diodes, organic light-emitting diodes, laser diodes, vertical cavity laser diodes.

3. Lighting device according to claim 1 characterized in that:

The two light sources are not placed symmetrically with respect to the optical beam (110), the angle A between the axes parallel to the object plane passing through the center of the sources and the optical axis is different from 180 °.

4. Device for lighting an object observed under a microscope for measuring a focusing defect according to claim 1 characterized in that the two sources are chosen from a plurality of sources.

5. Device for lighting an object observed under a microscope for measuring a focusing defect according to claim 1, characterized in that:

the procedure for comparing the two images integrates an inter-correlation operation between the two images, from the inter-correlation matrix, a vector CM is calculated, with C the center of the inter-correlation matrix and M te point corresponding to the maximum value in the inter-correlation matrix. The norm of the vector CM is proportional to the measurement of the defect of focusing and its direction gives the direction of the correction.

6. Device for illuminating an object observed under a microscope for measuring a focusing defect which comprises a system for illuminating an object (10G) placed on a support (101), a microscope objective (102 ) capable of forming a real image of the object on the surface of an image sensor 104 capable of recording color images characterized in that:

9/11 te illumination system is composed of two discrete light sources (105i and 10.¾) each emitting optical radiation of different wavelength, your two sources are placed before the object so that the objective forms a first image 301 at the first wavelength and a second image 302 at the second wavelength, the two images being offset from one another when the focus is not ensured, a procedure is applied comprising a first step of recording the two images by lighting the object simultaneously with the first source and with the second source, a second step of separating the color frames to obtain two images each corresponding to the image of the object by the first source and that of the object by the second source and a procedure for comparing the offset of the two images, the result of which provides a measure proportional to the d out of focus.

7. Device for lighting an object observed under a microscope for measuring a focusing defect according to claim S, characterized in that the light sources are chosen from light-emitting diodes, organic light-emitting diodes, laser diodes, iasers diodes with vertical cavity.

8. Device for lighting an object observed under a microscope for measuring a focusing defect according to claim 6 characterized in that your two sources are chosen from a plurality of sources.

9. Device for lighting an object observed under a microscope for measuring a focusing defect according to claim 6, characterized in that:

the procedure for comparing the two images integrates an inter-correlation operation between the two images, from its inter-correlation matrix, a vector CM is calculated, with C te center of the inter-correlation matrix and M the point corresponding to the maximum value in the inter-correlation matrix. The norm of the vector CM is proportional to the measurement of the focusing defect and its direction gives you the sense of the correction.