FR3061018A1 - COSMETIC COMPOSITION COMPRISING ALBIZIA JUBIBRISSIN EXTRACT, ROSEMARY EXTRACT AND ROYAL JELLY - Google Patents
COSMETIC COMPOSITION COMPRISING ALBIZIA JUBIBRISSIN EXTRACT, ROSEMARY EXTRACT AND ROYAL JELLY Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention a pour objet une composition cosmétique comprenant un extrait d'Albizia Julibrissin, un extrait de romarin et de la gelée royale d'abeille noire d'Ouessant dans un milieu cosmétiquement acceptable, et son utilisation pour la régénération et/ou la cicatrisation de la peau.The subject of the present invention is a cosmetic composition comprising an Albizia Julibrissin extract, a rosemary extract and Ouessant black bee royal jelly in a cosmetically acceptable medium, and its use for regeneration and / or healing. skin.
Description
Titulaire(s) :Holder (s):
L V M H RECHERCHE.L V M H RESEARCH.
O Demande(s) d’extension :O Extension request (s):
(® Mandataire(s) : REGIMBEAU.(® Agent (s): REGIMBEAU.
® COMPOSITION COSMETIQUE COMPRENANT UN EXTRAIT D'ALBIZIA JUBIBRISSIN, UN EXTRAIT DE ROMARIN ET DE LA GELEE ROYALE.® COSMETIC COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT OF ALBIZIA JUBIBRISSIN, AN EXTRACT OF Rosemary AND ROYAL JELLY.
@) La présente invention a pour objet une composition cosmétique comprenant un extrait d'Albizia Julibrissin, un extrait de romarin et de la gelée royale d'abeille noire d'Ouessant dans un milieu cosmétiquement acceptable, et son utilisation pour la régénération et/ou la cicatrisation de la peau.@) The subject of the present invention is a cosmetic composition comprising an extract of Albizia Julibrissin, an extract of rosemary and royal jelly of Ouessant's black bee in a cosmetically acceptable medium, and its use for regeneration and / or scarring of the skin.
FR 3 061 018 - A1FR 3,061,018 - A1
La présente invention a pour objet une composition cosmétique favorisant la régénération et/ou la cicatrisation de la peau comprenant un extrait d’arbre à soie (Albizia Julibrissin), un extrait de romarin (Rosmarinus officinalis) et de la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant (Apis mellifera mellifera) dans un milieu cosmétiquement acceptable.The subject of the present invention is a cosmetic composition promoting regeneration and / or scarring of the skin comprising an extract of silk tree (Albizia Julibrissin), an extract of rosemary (Rosmarinus officinalis) and royal black bee jelly Ouessant's (Apis mellifera mellifera) in a cosmetically acceptable medium.
La cicatrisation et la régénération tissulaire sont des processus complexes et intimement liés, mettant en jeu de nombreux types cellulaires, impliquant de multiples systèmes de régulation, une communication cellulaire complexe et la sécrétion d’un grand nombre de facteurs de transcription (Martin, 1997).Scarring and tissue regeneration are complex and interrelated processes, involving many cell types, involving multiple regulatory systems, complex cell communication and the secretion of a large number of transcription factors (Martin, 1997) .
Le TGF-béta (TGF-6) est le principal déclencheur et régulateur des trois grandes étapes du processus de cicatrisation que sont l’inflammation, la prolifération cellulaire et le remodelage tissulaire. Par son spectre d’activité et ses actions en amont de ce processus, la voie du TGF-6 est la voie biologique qui permet d’accélérer ou au contraire ralentir les mécanismes de cicatrisation.TGF-beta (TGF-6) is the main trigger and regulator of the three main stages of the healing process: inflammation, cell proliferation and tissue remodeling. By its spectrum of activity and its actions upstream of this process, the TGF-6 pathway is the biological pathway that makes it possible to accelerate or on the contrary slow down the healing mechanisms.
Le TGF-6 agit en se liant à ses récepteurs cellulaires formant un complexe de récepteurs de type I (T6R-I) et de type II (T6R-II) et via l’activation de la voie des smads, conduit ainsi à une régulation positive d’un ensemble de gènes. Ces gènes régulés par TGF-6 sont impliqués dans la synthèse de protéines de la matrice extracellulaire, la prolifération et la motilité cellulaire, la régulation négative de l'expression d’enzymes protéolytiques ou encore la prolifération des fibroblastes dermiques.TGF-6 acts by binding to its cellular receptors forming a type I (T6R-I) and type II (T6R-II) receptor complex and via activation of the smad pathway, thus leads to regulation positive of a set of genes. These genes regulated by TGF-6 are involved in the synthesis of proteins of the extracellular matrix, proliferation and cellular motility, the negative regulation of the expression of proteolytic enzymes or even the proliferation of dermal fibroblasts.
La voie du TGF-6 est altérée par le vieillissement intrinsèque et le photovieiUissement conduisant ainsi à un amincissement cutané et à des retards de cicatrisation tels que ceux observés par exemple chez les personnes âgées. Une autre caractéristique de la peau âgée est la réduction de la synthèse du collagène qui conduit à un amincissement de la peau et à une fragilité accrue. Cependant, une action biologique qui viserait à augmenter la production ou la concentration de TGF-6 pour atténuer les effets du vieillissement serait inefficace puisque c'est une altération des récepteurs au TGF-6 qui est la cause de la perte d'activité du TGF-6 au niveau cellulaire et tissulaire.The TGF-6 pathway is altered by intrinsic aging and photoaging thus leading to skin thinning and delayed healing such as those observed for example in the elderly. Another characteristic of aged skin is the reduction in the synthesis of collagen which leads to thinning of the skin and increased fragility. However, a biological action which aims to increase the production or the concentration of TGF-6 to reduce the effects of aging would be ineffective since it is an alteration of the TGF-6 receptors which is the cause of the loss of activity of TGF. -6 at the cellular and tissue level.
Par ailleurs, TIEG-1 (TGF beta early inducible gene 1) a été identifié en aval de la voie du TGF-6, comme un facteur clef de la régénération osseuse (Subramaniam Ai. et al. Mol. Cell. Biol., 2005, 1191-1199), de la cicatrisation (Taguchi M. et al., J. Musculoskelet. Res., 2008, 11, 63-69) mais aussi de l’organisation moléculaire des fibres de collagène et de la composition de la matrice collagénique (Gumez L. et al., J. Appl. Physiol., 2010, 108, 1706-1710).Furthermore, TIEG-1 (TGF beta early inducible gene 1) has been identified downstream from the TGF-6 pathway, as a key factor in bone regeneration (Subramaniam Ai. Et al. Mol. Cell. Biol., 2005 , 1191-1199), wound healing (Taguchi M. et al., J. Musculoskelet. Res., 2008, 11, 63-69) but also the molecular organization of collagen fibers and the composition of the matrix collagenic (Gumez L. et al., J. Appl. Physiol., 2010, 108, 1706-1710).
Des études récentes rapportées par Subramaniam M. et al. (Biofactors, 2010, 36, 8-18) ont démontré l’implication du gène codant pour TIEG-1 dans la régénération osseuse. En effet, son expression est un élément de la réponse primaire des ostéoblastes (cellules synthétisant la partie non-minérale des os) au TGF-6.Recent studies reported by Subramaniam M. et al. (Biofactors, 2010, 36, 8-18) have demonstrated the involvement of the gene coding for TIEG-1 in bone regeneration. Indeed, its expression is an element of the primary response of osteoblasts (cells synthesizing the non-mineral part of bones) to TGF-6.
L’identification de la protéine TIEG-1, en aval de la voie du TGF-β, représente donc une cible moléculaire d’intérêt pour activer la voie de signalisation du TGF-6, en particulier lorsque les récepteurs au TGF-6 sont altérés.The identification of the TIEG-1 protein, downstream from the TGF-β pathway, therefore represents a molecular target of interest for activating the TGF-6 signaling pathway, in particular when the TGF-6 receptors are altered. .
Dans ce contexte, les inventeurs ont montré de manière surprenante, que l’expression du gène TIEG-1 pouvait être spécifiquement augmentée sous l’effet d’une nouvelle composition comprenant un extrait d’Albizia julibrissin, un extrait de romarin et de la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant (Apis mellifera mellifera). Les inventeurs ont également démontré que cette composition pouvait améliorer la régénération de la peau qui est altérée par les processus intrinsèque ou extrinsèque de vieillissement ou consécutivement à une agression, par exemple une agression physique. On parlera dans ce dernier cas de cicatrisation.In this context, the inventors have shown, surprisingly, that the expression of the TIEG-1 gene can be specifically increased under the effect of a new composition comprising an extract of Albizia julibrissin, an extract of rosemary and jelly Ouessant black bee royal (Apis mellifera mellifera). The inventors have also demonstrated that this composition can improve the regeneration of the skin which is altered by the intrinsic or extrinsic processes of aging or following an attack, for example a physical attack. We will speak in this last case of scarring.
En particulier, les inventeurs ont mis en évidence que les trois composés actifs de la composition de l’invention, à savoir l’extrait d’Albizia julibrissin, l’extrait de romarin et la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant permettaient de stimuler l’expression de TIEG-1, et que la combinaison de ces extraits avec de la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant permettait de stimuler l’expression de TIEG-1 de façon plus importante au sein d’une zone cicatricielle par rapport à une zone non-cicatricielle.In particular, the inventors have demonstrated that the three active compounds of the composition of the invention, namely the extract of Albizia julibrissin, the extract of rosemary and the royal jelly of black bee from Ouessant made it possible to stimulate the expression of TIEG-1, and that the combination of these extracts with royal jelly of black bees of Ouessant made it possible to stimulate the expression of TIEG-1 in a more significant way within a scar zone by compared to a non-scarred area.
La présente invention a donc pour objet une composition cosmétique comprenant un extrait d’Albizia julibrissin, un extrait de romarin et de la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant dans un milieu cosmétiquement acceptable.The present invention therefore relates to a cosmetic composition comprising an extract of Albizia julibrissin, an extract of rosemary and royal jelly of Ouessant's black bee in a cosmetically acceptable medium.
Par « cosmétiquement acceptable » on entend que la composition convient à une utilisation topique ou transdermique, en contact avec la peau de mammifère et plus particulièrement la peau humaine.By “cosmetically acceptable” is meant that the composition is suitable for topical or transdermal use, in contact with mammalian skin and more particularly human skin.
Selon un mode de réalisation avantageux, l’extrait d’Albizia julibrissin de la composition cosmétique selon l’invention est un extrait d'écorce d Albizia Julibrissin.According to an advantageous embodiment, the extract of Albizia julibrissin from the cosmetic composition according to the invention is an extract of the bark of Albizia Julibrissin.
Selon un autre mode de réalisation, l’extrait de romarin de la composition cosmétique selon l’invention est un extrait de feuilles de romarin.According to another embodiment, the rosemary extract of the cosmetic composition according to the invention is an extract of rosemary leaves.
La plante ou les parties de la plante sélectionnées peuvent éventuellement être fraîches, séchées et/ou broyées.The selected plant or parts of the plant can optionally be fresh, dried and / or ground.
Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, le matériel végétal se trouve à l’état sec et broyé.According to a preferred implementation of the invention, the plant material is in the dry and ground state.
L’extrait végétal peut être préparé par différents procédés d’extraction connus de l’homme du métier.The plant extract can be prepared by various extraction methods known to a person skilled in the art.
L’extraction est avantageusement réalisée par mise en contact du matériel végétal sélectionné avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires. Selon la présente invention, l’expression « solvant polaire » signifie que le solvant a une valeur d’indice de Polarité qui est égale ou supérieure à une valeur de 4. L’indice de polarité est une grandeur calculée sur la base de grandeurs thermodynamiques (de solubilité et de changement d’état) qui met en évidence le caractère plus ou moins polaire d’une molécule. On se reportera, pour les indices de polarité des solvants, à l'article de Snyder (1974).The extraction is advantageously carried out by bringing the selected plant material into contact with a polar solvent or a mixture of polar solvents. According to the present invention, the expression “polar solvent” means that the solvent has a value of Polarity index which is equal to or greater than a value of 4. The polarity index is a quantity calculated on the basis of thermodynamic quantities (of solubility and change of state) which highlights the more or less polar character of a molecule. Reference is made, for the polarity indices of the solvents, to the article by Snyder (1974).
Le solvant polaire est avantageusement choisi parmi l’eau, les alcools en C1-C4, tel que le méthanol, l’éthanol, les glycols, tels que l’éthylène glycol, le glycérol, le butylèneglycol et leurs mélanges.The polar solvent is advantageously chosen from water, C1-C4 alcohols, such as methanol, ethanol, glycols, such as ethylene glycol, glycerol, butylene glycol and their mixtures.
Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, les extractions sont menées par utilisation d’eau ou d’un mélange hydro glycolique ou avec du méthanol.According to a preferred implementation of the invention, the extractions are carried out by using water or a hydro-glycolic mixture or with methanol.
Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, l’extraction de l’écorce d’Albizia Julibrissin est avantageusement mené dans l’eau ou un alcool, par exemple l’éthanol ou bien encore un mélange hydro-alcoolique, conformément au brevet FR 2980362 SEDERMA, dont le contenu est inclus à la présente demande.According to a preferred implementation of the invention, the extraction of the bark of Albizia Julibrissin is advantageously carried out in water or an alcohol, for example ethanol or even a hydro-alcoholic mixture, in accordance with the patent FR 2980362 SEDERMA, the content of which is included in this request.
Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, l’extraction est menée en utilisant un mélange hydro-alcoolique, en particulier un mélange d’eau et d’éthanol, de préférence un mélange d’eau et d’éthanol, avantageusement dans un rapport 50/50 (v/v).According to a preferred implementation of the invention, the extraction is carried out using a hydro-alcoholic mixture, in particular a mixture of water and ethanol, preferably a mixture of water and ethanol, advantageously in a 50/50 (v / v) ratio.
L’extraction peut aussi comprendre, de façon optionnelle, une étape supplémentaire consistant en un traitement de l’extrait visant à le décolorer partiellement ou complètement, ou à le purifier.The extraction can also optionally include an additional step consisting of a treatment of the extract aimed at partially or completely discolouring it, or at purifying it.
L’extraction peut être complétée par une étape d’élimination partielle ou totale des solvants d’extraction.The extraction can be completed by a stage of partial or total elimination of the extraction solvents.
En cas d’élimination partielle des solvants d’extraction, on concentre généralement l’extrait jusqu’à obtenir un concentré dépourvu de quantités significatives de solvant organique. Dans le cas d’une élimination totale de ces solvants, on obtient un résidu sec.In the event of partial removal of the extraction solvents, the extract is generally concentrated until a concentrate is obtained without significant amounts of organic solvent. In the case of a total elimination of these solvents, a dry residue is obtained.
De façon alternative, le produit de l’étape d’extraction peut être lyophilisé ou atomisé et se présenter sous la forme d’une poudre.Alternatively, the product from the extraction step can be freeze-dried or atomized and be in the form of a powder.
La poudre peut être utilisée en l’état dans une composition, telle qu’une composition cosmétique, selon la présente invention ou être dispersée dans un solvant ou un mélange de solvants.The powder can be used as it is in a composition, such as a cosmetic composition, according to the present invention or can be dispersed in a solvent or a mixture of solvents.
De façon générale, le produit de l’étape d’extraction peut être dissous ou dispersé dans un solvant ou un mélange de solvants, pour être utilisé à titre d’agent actif dans les compositions de l’invention.In general, the product of the extraction step can be dissolved or dispersed in a solvent or a mixture of solvents, to be used as active agent in the compositions of the invention.
Le solvant ou le mélange de solvants dans lequel l’extrait est dissous ou dispersé peut être identique ou différent de celui ayant servi à l’extraction.The solvent or mixture of solvents in which the extract is dissolved or dispersed may be the same or different from that used for the extraction.
L’extrait de l’invention peut également être adsorbé sur un support avantageusement choisi parmi les poudres de nylon, poudres poreuses ou non poreuses et les micas ou toute substance minérale lamellaire.The extract of the invention can also be adsorbed on a support advantageously chosen from nylon powders, porous or non-porous powders and micas or any lamellar mineral substance.
Dans ce cas, l’extrait utilisé est préférentiellement un extrait dans le butylène glycol ou un extrait aqueux.In this case, the extract used is preferably an extract in butylene glycol or an aqueous extract.
La gelée royale est un produit naturel issu de l’apiculture, qui se présente sous la forme d’une pâte. Contrairement à de la gelée royale « classique », ne provenant pas d’abeille noire d’Ouessant, la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant présente l’avantage de stimuler l’expression de TIEG-1, et sa combinaison avec un extrait d'Albizia julibrissin et un extrait de romarin permet de stimuler l’expression de TIEG-1 plus intensément dans la zone cicatricielle, dans un modèle de cicatrisation in vitro par arrachage du tapis cellulaire et recolonisation.Royal jelly is a natural product from beekeeping, which comes in the form of a paste. Unlike “classic” royal jelly, which does not come from Ouessant black bees, Ouessant black bee royal jelly has the advantage of stimulating the expression of TIEG-1, and its combination with a Albizia julibrissin extract and rosemary extract can stimulate the expression of TIEG-1 more intensely in the scar area, in a healing model in vitro by uprooting the cell carpet and recolonization.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition cosmétique selon l’invention comprend :According to a preferred embodiment, the cosmetic composition according to the invention comprises:
l’extrait d'Albizia julibrissin à une concentration comprise entre 0,001% et 5%, préférentiellement 0,01% et 3% et plus préférentiellement encore à 2% en poids de la composition totale;the extract of Albizia julibrissin at a concentration of between 0.001% and 5%, preferably 0.01% and 3% and more preferably still at 2% by weight of the total composition;
l’extrait de romarin à une concentration comprise entre 0,001% et 5%, préférentiellement entre 0,01% et 3 %, et plus préférentiellement encore à 2% en poids de la composition totale ; et la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant à une concentration comprise entre 0,001% et 1% préférentiellement entre 0,005% et 0,5% et plus préférentiellement encore entre 0,5% et 0,2% en poids de la composition totale.rosemary extract at a concentration of between 0.001% and 5%, preferably between 0.01% and 3%, and more preferably still at 2% by weight of the total composition; and Ouessant black bee royal jelly at a concentration of between 0.001% and 1%, preferably between 0.005% and 0.5% and more preferably still between 0.5% and 0.2% by weight of the total composition .
Selon un autre objet de la présente invention, la composition cosmétique selon l’invention est plus particulièrement destinée à la régénération et/ou cicatrisation de la peau.According to another object of the present invention, the cosmetic composition according to the invention is more particularly intended for the regeneration and / or healing of the skin.
La composition de l’invention est en particulier destinée à des peaux présentant des signes de vieillissement chronologique ou de photovieillissement.The composition of the invention is in particular intended for skin exhibiting signs of chronological aging or photoaging.
En effet, le vieillissement intrinsèque ou extrinsèque de la peau provoque un ralentissement du renouvellement cellulaire et une dégradation de la matrice extracellulaire de façon plus importante que sa néo-synthèse, ce qui indique une perte de l’homéostasie cutanée. Ceci se traduit notamment par un amincissement de la peau, un relâchement de la peau, ainsi que l’apparition de rides et ridules.In fact, intrinsic or extrinsic aging of the skin causes a slowing down of cell renewal and a degradation of the extracellular matrix to a greater extent than its neosynthesis, which indicates a loss of cutaneous homeostasis. This results in particular in thinning of the skin, sagging of the skin, as well as the appearance of fine lines and wrinkles.
Selon un mode de réalisation préférée, la composition de l’invention est destinée à une application topique.According to a preferred embodiment, the composition of the invention is intended for topical application.
La composition cosmétique selon l’invention comprend, outre les principes actifs que sont l’extrait d’Albizia julibrissin, l’extrait de romarin et la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant, un ou plusieurs excipients cosmétiques acceptable parmi ceux connus de l’homme du métier en vue d’obtenir une composition pour l’application topique sous forme de lait, de crème, de pommade, d’émulsion eau-dans huile ou huile dans eau, de baume, de gel, de lotion, de sérum, de spray, préférentiellement de crème ou de sérum.The cosmetic composition according to the invention comprises, in addition to the active principles that are the extract of Albizia julibrissin, the extract of rosemary and the royal jelly of Ouessant's black bee, one or more cosmetic excipients acceptable among those known from a person skilled in the art with a view to obtaining a composition for topical application in the form of milk, cream, ointment, water-in oil or oil in water emulsion, balm, gel, lotion, serum, spray, preferably cream or serum.
Selon la nature de la composition, on sélectionnera un ou plusieurs excipients cosmétiquement acceptables parmi des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des conservateurs, des colorants, des nacres, des pigments et leurs mélanges.Depending on the nature of the composition, one or more cosmetically acceptable excipients will be selected from polymers, surfactants, rheology agents, perfumes, electrolytes, pH adjusters, antioxidants, preservatives, dyes. , nacres, pigments and their mixtures.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition cosmétique selon la présente invention peut comprendre en outre au moins un agent cosmétiquement actif bien connu de l’homme du métier choisis parmi des agents pour retarder ou ralentir l’apparition de signes du vieillissement cutané intrinsèque ou extrinsèque ; des agents ayant une activité dépigmentante ou une activité éclaircissante de la peau; des agents ayant une activité amincissante ; des agents ayant une activité hydratante ; des agents ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; des agents stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; des agents ayant une activité sébo-régulatrice pour le soin des peaux grasses ; des agents destinés à nettoyer ou purifier la peau ; des agents ayant une activité anti-radicalaire.In a particular embodiment, the cosmetic composition according to the present invention can also comprise at least one cosmetically active agent well known to those skilled in the art chosen from agents for delaying or slowing the appearance of signs of intrinsic skin aging or extrinsic; agents having depigmenting or lightening activity on the skin; agents having slimming activity; agents with hydrating activity; agents having a calming, soothing or relaxing activity; agents stimulating the microcirculation of the skin to improve the radiance of the complexion, in particular of the face; agents having a seboregulatory activity for the care of oily skin; agents for cleaning or purifying the skin; agents having anti-radical activity.
La composition cosmétique de l’invention peut ainsi comprendre une ou plusieurs autres substances pouvant être avantageusement choisies parmi :The cosmetic composition of the invention can thus comprise one or more other substances which can advantageously be chosen from:
- des molécules favorisant le renouvellement cellulaire telles que, le rétinol et/ou ses esters; des alpha ou beta hydroxy acides tels que les acides de fruits, notamment l’acide malique, l’acide glycolique ou l’acide citrique, l’acide salicylique ou ses esters, l’acide gentisique ou ses esters, en particulier le gentisate de tocopherol ;- molecules promoting cell renewal such as retinol and / or its esters; alpha or beta hydroxy acids such as fruit acids, in particular malic acid, glycolic acid or citric acid, salicylic acid or its esters, gentisic acid or its esters, in particular gentisate of tocopherol;
- des molécules ou extraits stimulant la fermeté de la peau telles que des peptides stimulateurs de la synthèse de collagène, en particulier le collagène de type I, II, IV ou VII, un extrait de Centella asiatica, l’acide madécassique, l’acide asiatique, le madécassoside, un extraits d’avoine, un extrait de Berthollétia exscelsa, un hydrolysat de protéines ou des peptides de soja, un extrait de Potentilla erecta, un extrait de Siegesbeckia orientalis, des ginsenosides ou notoginsenosides, un extrait de graines de Vigna aconitifolia ;- molecules or extracts stimulating the firmness of the skin such as peptides that stimulate collagen synthesis, in particular collagen type I, II, IV or VII, an extract of Centella asiatica, madecassic acid, acid Asian, madecassoside, an oat extract, an extract of Berthollétia exscelsa, a protein hydrolyzate or soy peptides, an extract of Potentilla erecta, an extract of Siegesbeckia orientalis, ginsenosides or notoginsenosides, an extract of Vigna seeds aconitifolia;
- des molécules ou extraits favorisant la synthèse d’acide hyaluronique ou de glycosaminoglycanes au niveau épidermique et dermique, tels qu’un extrait d’essence vitale de Mamaku, un extrait de feuilles de Cyathea medullaris, un extrait d’Eriobotrya japonica ou des fragments d’acide hyaluronique de bas et moyens poids moléculaires ou bien encore un extrait d’Adenum obesum ;- molecules or extracts promoting the synthesis of hyaluronic acid or glycosaminoglycans at the epidermal and dermal level, such as an extract of vital essence from Mamaku, an extract of leaves of Cyathea medullaris, an extract of Eriobotrya japonica or fragments low and medium molecular weight hyaluronic acid or even an extract of Adenum obesum;
- des molécules ou extraits régulant la différentiation de l’épiderme tels que l’ecdystérone, la turkestérone, des dérivés de calcium, des précurseurs de vitamine D ;- molecules or extracts regulating the differentiation of the epidermis such as ecdysterone, turkesterone, calcium derivatives, vitamin D precursors;
- l’adénosine, la carnitine ou ses dérivés en particulier l’acetylcarnitine, le retinol ou un de ces esters cosmétiquement acceptable, en particulier le propionate ou le retinyl palmitate;- adenosine, carnitine or its derivatives in particular acetylcarnitine, retinol or one of these cosmetically acceptable esters, in particular propionate or retinyl palmitate;
- des inhibiteurs de métalloprotéinases (MMP), en particulier des inhibiteurs des MMP 1, 2, 9 tel qu’un extrait de Ruscus asculeatus, des peptides de soja ou des flavonoïdes ou des extraits végétaux en contenants ;- metalloproteinase (MMP) inhibitors, in particular MMP inhibitors 1, 2, 9 such as an extract of Ruscus asculeatus, soy peptides or flavonoids or plant extracts in containers;
- des inhibiteurs d’élastase tels que des extraits végétaux d’Aspergillus fumigatus, de Momordica charantia, de Cucurbita maxima ;- elastase inhibitors such as plant extracts of Aspergillus fumigatus, Momordica charantia, Cucurbita maxima;
- un peptide analogue de l’élastine, avantageusement estérifié, tel que celui formé par la séquence palmitoyl-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly commercialisé sous la dénomination commerciale BIOPEPTIDE EL par la société SEDERMA ;- a peptide analogous to elastin, advantageously esterified, such as that formed by the palmitoyl-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly sequence marketed under the trade name BIOPEPTIDE EL by the company SEDERMA;
- des substances capables de stimuler la synthèse de dermatopontine, telles qu’un extrait d’ambre ;- substances capable of stimulating the synthesis of dermatopontin, such as an amber extract;
- des molécules ou extraits de plantes astringents resserrant les pores tels qu’un extrait d’Hamamélis ; le gluconate de zinc,- molecules or extracts of astringent plants tightening pores such as an extract of witch hazel; zinc gluconate,
- des filtres protégeant des radiations UVA et UVB, tels que la benzophenone 4-butyl méthoxydibenzoylméthane, l’éthylhexyl méthoxycinnamate, l’octocrylène, l’éthylhexyl salicylate, l’acide sulfonique phenylbenzymidazole, l’homosalate, seuls ou en association avec des oxydes de titane ;- filters protecting against UVA and UVB radiation, such as benzophenone 4-butyl methoxydibenzoylmethane, ethylhexyl methoxycinnamate, octocrylene, ethylhexyl salicylate, sulfonic acid phenylbenzymidazole, homosalate, alone or in combination with oxides titanium;
- des molécules ou extraits végétaux agissant sur la pigmentation telles que l’acide kojique, les extraits de racine de réglisse ou de mûrier, l’arbutine, le pantothenosulfonate de calcium, la boldine, la diacetylboldine, la vitamine C ou un de ses dérivés, tels que les glycosides, des extraits de lys en particulier de bulbe.- plant molecules or extracts acting on pigmentation such as kojic acid, liquorice or mulberry root extracts, arbutin, calcium pantothenosulfonate, boldine, diacetylboldine, vitamin C or one of its derivatives , such as glycosides, extracts of lily in particular of bulb.
- des molécules ou extraits antiradicalaires ou anti-inflammatoires tels qu’un extrait d’Artemisia capillaris, un extrait de Sanguisorba officinalis, le resvératrol et ses dérivés, le cucurma, la cucurmine ou la tetrahydrocucurmine, des polyphénols extraits de pépins de raisin, de la vitamine E et ses dérivés, en particulier ses dérivés phosphate, l’ergothionéine ou ses dérivés, l’idébenone,- anti-free radical or anti-inflammatory molecules or extracts such as an extract of Artemisia capillaris, an extract of Sanguisorba officinalis, resveratrol and its derivatives, cucurma, cucurmine or tetrahydrocucurmine, polyphenols extracted from grape seeds, vitamin E and its derivatives, in particular its phosphate derivatives, ergothionein or its derivatives, idebenone,
- un extrait d’orchidée telle qu’une orchidée appartenant au genre Brassocattleya, par exemple un extrait de l’orchidée Brassocattleya marcella, ou au genre Vanda, par exemple un extrait d’une orchidée parmi Vanda coerulea, Vanda teres ou encore Vanda denisoniana ;an orchid extract such as an orchid belonging to the genus Brassocattleya, for example an extract of the orchid Brassocattleya marcella, or to the genus Vanda, for example an extract of an orchid from Vanda coerulea, Vanda teres or even Vanda denisoniana ;
- des agents hydratants comme le glycérol, la triméthylglycine ou des polyols naturels, des céramides naturels ou de synthèse, des eaux de sources ou minérales.- hydrating agents such as glycerol, trimethylglycine or natural polyols, natural or synthetic ceramides, spring or mineral waters.
Avantageusement, la composition selon l’invention peut comprendre en outre un miel ou un extrait de miel. Le miel étant préférentiellement un miel unifloral ou polyfloral.Advantageously, the composition according to the invention may also comprise a honey or a honey extract. The honey is preferably a unifloral or polyfloral honey.
De préférence, le miel utilisé dans la composition selon l’invention est peut être un miel de trèfle (Trifolium repens), un miel de thym (Thymus vulgaris), un miel de Manuka (Leptospernum scoparium), un miel d’Ouessant, un miel d’euphorbe (Euphorbia echinus) ou un miel de CorsePreferably, the honey used in the composition according to the invention may be clover honey (Trifolium repens), thyme honey (Thymus vulgaris), Manuka honey (Leptospernum scoparium), Ouessant honey, spurge honey (Euphorbia echinus) or Corsican honey
Sous quelle que forme que ce soit, la composition cosmétique de l’invention est appliquée sur une partie de la peau du corps, en particulier le visage, le cou, le décolleté et/ou les mains.In any form whatsoever, the cosmetic composition of the invention is applied to a part of the skin of the body, in particular the face, the neck, the décolleté and / or the hands.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de traitement cosmétique pour stimuler la régénération et/ou la cicatrisation de la peau, caractérisé en ce qu’on applique sur la peau une quantité suffisante d’une composition cosmétique comprenant au moins un extrait d’Albizia julibrissin, un extrait de romarin et de la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant, à titre d'agent cosmétiquement actif.According to another aspect, the present invention relates to a cosmetic treatment method for stimulating the regeneration and / or scarring of the skin, characterized in that a sufficient amount of a cosmetic composition comprising at least one extract is applied to the skin Albizia julibrissin, an extract of rosemary and Ouessant black bee royal jelly, as a cosmetically active agent.
Les figures et exemples ci-après sont donnés à titre illustratif et ne sont pas limitatifs.The figures and examples below are given by way of illustration and are not limiting.
FIGURESFIGURES
Figure 1 : Effet des extraits de Romarin (ROMext) et d’Albizia Julibrissin (ALBZ) sur le niveau de l’ARNm de TIEG-1 dans les Kératinocytes Humains Normaux (KHN).Figure 1: Effect of extracts of Rosemary (ROMext) and Albizia Julibrissin (ALBZ) on the level of TIEG-1 mRNA in Normal Human Keratinocytes (KHN).
Figure 2 : Etude de l’expression de la protéine TIEG-1 par Western Blot sur les fibroblastes humains normaux (FHN). A. Recomposition des images des membranes après révélation par chimiluminescence, C1 : ROMext + ALBZ (1ppm/30ppm), C2 : ROMext + ALBZ (0,5ppm/30ppm), C3 : ROMext + ALBZ (1ppm/50ppm) et C4 : ROMext + ALBZ (2ppm/30ppm) ; B. Analyse des ratios d’expression TIEG-1/Actine sur FHN après 6h de traitement.Figure 2: Study of the expression of the TIEG-1 protein by Western Blot on normal human fibroblasts (FHN). A. Recomposition of the images of the membranes after revelation by chemiluminescence, C1: ROMext + ALBZ (1ppm / 30ppm), C2: ROMext + ALBZ (0.5ppm / 30ppm), C3: ROMext + ALBZ (1ppm / 50ppm) and C4: ROMext + ALBZ (2ppm / 30ppm); B. Analysis of TIEG-1 / Actin expression ratios on FHN after 6 hours of treatment.
Figure 3 : Expression protéique de TIEG-1 dans un modèle de cicatrisation in vitro dans des FHN.Figure 3: Protein expression of TIEG-1 in an in vitro healing model in FHN.
Zone A. Schéma des zones d’intérêts où signal immunofluorescent est quantifié dans un modèle de cicatrisation. Zone A : éloignée de la zone blessée ; zone B : zone mixte comprenant la zone limitrophe de la blessure et une zone témoin sur le tapis cellulaire ; zone C : zone de blessure correspondant à la zone raclée par une pointe de cône ; B. Suivi de l’expression protéique de TIEG-1 dans les fibroblastes 48h après blessure.Zone A. Diagram of the zones of interest where the immunofluorescent signal is quantified in a healing model. Zone A: far from the injured zone; zone B: mixed zone comprising the zone bordering the wound and a control zone on the cell mat; zone C: zone of wound corresponding to the zone scraped by a point of cone; B. Monitoring of the protein expression of TIEG-1 in fibroblasts 48 hours after injury.
Figure 4 : Effet des extraits de Romarin (ROMext), d’Albizia Julibrissin (Prodizia®) et de gelée royale d’abeille noire d’Ouessant (gelée royale AN) sur le niveau protéique de TIEG-1 dans des FHN en culture au niveau de zones blessée (ou zone cicatricielle) et non-blessé.Figure 4: Effect of Rosemary (ROMext), Albizia Julibrissin (Prodizia®) and Ouessant black bee royal jelly (AN royal jelly) extracts on the protein level of TIEG-1 in FHN in culture in level of injured (or scar) and non-injured areas.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemple 1 : Etude de l’association de l’extrait de romarin et de l’extrait d’Albizia Julibrissin sur les Kératinocytes Humains Normaux par q-PCR.Example 1 Study of the Association of Rosemary Extract with Albizia Julibrissin Extract on Normal Human Keratinocytes by q-PCR.
Le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’extrait de Romarin (ROMext), riche en acide ursolique, et l’extrait d’Albizia Julibrissin (ALBZ) sur l’ARNm de TIEG-1 par qRT-PCR.The aim of this study is to evaluate the effect of Rosemary extract (ROMext), rich in ursolic acid, and Albizia Julibrissin extract (ALBZ) on TIEG-1 mRNA by qRT-PCR .
1.1. Matériels 8t Méthodes1.1. Materials 8t Methods
Tableau 1 : Récapitulatifs des informations sur les extraits testésTable 1: Summary of information on the extracts tested
Afin d’observer un effet sur notre cible TIEG-1, le contrôle Τΰβ1 (Sigma) a été testé sur chaque essai à la concentration de 10ng/mL.In order to observe an effect on our TIEG-1 target, the Τΰβ1 (Sigma) control was tested on each test at a concentration of 10ng / mL.
L’extrait d’Albizia Julibrissin (ALBZ) correspond à un extrait sans conservateur de l’actif commercialisé par la société SEDERMA sous le nom de Prodizia® : 0,001% (10ppm) d’ALBZ = 0,08% de Prodizia®.The Albizia Julibrissin extract (ALBZ) corresponds to a preservative-free extract of the active ingredient marketed by SEDERMA under the name Prodizia®: 0.001% (10 ppm) of ALBZ = 0.08% of Prodizia®.
L’extrait de feuilles de romarin (ROMext) correspond à un extrait commercialisé par la société SEDERMA titré en acide ursolique : 0.05% de Rosemary extract URSO (ROMext) contient à 0.75 ppm d’acide ursolique.Rosemary leaf extract (ROMext) corresponds to an extract marketed by the company SEDERMA titrated in ursolic acid: 0.05% of Rosemary extract URSO (ROMext) contains 0.75 ppm of ursolic acid.
1.2. Traitements des Kératinocytes Humains Normaux (KHN)1.2. Treatments for Normal Human Keratinocytes (KHN)
Les KHN sont ensemencés dans le milieu de culture approprié sans antibiotique, milieu sans sérum pour kératinocyte (kératinocyte serum-free medium, KSFM) avec complément (Extrait Pituitaire et EGF) de 0,100 à 0,125 x106 cellules/puits, en plaque 12 puits.The KHNs are seeded in the appropriate culture medium without antibiotic, medium without serum for keratinocyte (keratinocyte serum-free medium, KSFM) with complement (Pituitary Extract and EGF) from 0.100 to 0.125 x 10 6 cells / well, in 12-well plate.
Les cellules sont ensuite traitées avec les différents extraits préparés extemporanément dans du milieu de culture approprié, KSFM sans complément sans antibiotique afin d’en extraire les ARN totaux.The cells are then treated with the various extracts prepared extemporaneously in appropriate culture medium, KSFM without supplement without antibiotic in order to extract the total RNA therefrom.
1.3. RT-PCR quantitative en temps réel1.3. Real-time quantitative RT-PCR
a. Obtention des ARN totaux à l’aide du pipeteur EpMotion (Eppendorf)at. Obtaining total RNA using the EpMotion pipettor (Eppendorf)
Le milieu de culture des cellules est éliminé, et 250 pL de tampon de lyse RLT (fourni dans le kit Nucleospin 96 RNA, (Macherey-Nagel) sont ajoutés. Les cellules sont raclées à l’aide d’un « Cell Scraper » puis le lysat cellulaire récupéré est dans un puit de 1,2 mL (fourni dans le kit Nucleospin 96 RNA). On extrait les ARN totaux selon un protocole que connaît l’Homme du Métier. Les solutions d’ARN totaux obtenues sont dosées à l’aide du BioAnalyser 2100 (Agilent Technologies). La technique nécessite une micro-plaque de 12 puits (RNA 6000 NanoChips) et un kit de réactifs (RNA 6000 Nano Reagents), spécifiques du dosage des ARN totaux eucaryotes.The cell culture medium is eliminated, and 250 μL of RLT lysis buffer (supplied in the Nucleospin 96 RNA kit, (Macherey-Nagel) are added. The cells are scraped using a “Cell Scraper” then the cell lysate recovered is in a 1.2 ml well (supplied in the Nucleospin 96 RNA kit). The total RNAs are extracted according to a protocol known to those skilled in the art. The total RNA solutions obtained are assayed at 1 using BioAnalyser 2100 (Agilent Technologies) The technique requires a 12-well micro-plate (RNA 6000 NanoChips) and a reagent kit (RNA 6000 Nano Reagents), specific for the assay of total eukaryotic RNA.
Les ARNt sont considérés comme qualitatifs selon 2 informations apportées par le BioAnalyser 2100 : le RIN (« RNA Integrity Number ») doit être supérieur à 7 pour valider l’intégrité des ARNt (non dégradés) et le Ratio 28S/18S doit être compris entre 1,8 et 2,2 pour ne pas avoir de contaminants comme les protéines.TRNAs are considered to be qualitative according to 2 information provided by the BioAnalyser 2100: the RIN ("RNA Integrity Number") must be greater than 7 to validate the integrity of tRNAs (not degraded) and the 28S / 18S Ratio must be between 1.8 and 2.2 to avoid contaminants like proteins.
b. Synthèse des ADN complémentairesb. Synthesis of complementary DNAs
Le kit de transcription inverse (RT) utilisé est le « High Capacity Reverse Transcription Kit » (Life Technologies-Applied). Il a été utilisé selon le protocole proposé par le fournisseur. On dilue 500 ng d’ARN totaux dans de l’eau pour un volume final de 25 pL. Ils sont ensuite incubés pendant 10 minutes à 25°C puis 2 heures à 37°C en présence de 25 pL de mélange réactionnel de « High Capacity Reverse Transcription Kit 2X » préalablement préparé comme indiqué ci-dessous.The reverse transcription kit (RT) used is the “High Capacity Reverse Transcription Kit” (Life Technologies-Applied). It was used according to the protocol proposed by the supplier. 500 ng of total RNA are diluted in water to a final volume of 25 pL. They are then incubated for 10 minutes at 25 ° C and then 2 hours at 37 ° C in the presence of 25 μL of reaction mixture of "High Capacity Reverse Transcription Kit 2X" previously prepared as indicated below.
Tableau 2 : Préparation du mélange réactionnel « High Capacity ReverseTable 2: Preparation of the “High Capacity Reverse” reaction mixture
c. RT-PCR quantitative en temps réelvs. Real-time quantitative RT-PCR
L’effet des différents traitements est évalué par PCR quantitative en temps réel avec le bloc de 96 puits adapté à l’appareil 7900HT et les réactifs de chez LifeThe effect of the various treatments is evaluated by quantitative PCR in real time with the block of 96 wells adapted to the 7900HT device and reagents from Life.
Technologies-Applied.Technologies-Applied.
Les amorces « TaqMan gene expression assay 20X » utilisées sont :The “TaqMan gene expression assay 20X” primers used are:
- La bêta-2-microglobuline (62M) comme gène de ménage- Beta-2-microglobulin (62M) as a household gene
- Gène cible TIEG-1- TIEG-1 target gene
Tableau 3 : Préparation du mélange réactionnel pour 1 réactionTable 3: Preparation of the reaction mixture for 1 reaction
On place les 15 pL du mélange ans les puits d’une plaque 96 puits spécialement conçue pour l’appareil 7900HT, on ajoute 5 pL d’eau (pour le blanc) ou 5 pL de dilutions successives d’ADNc (pour la gamme) ou 5 pL d’échantillons dans les puits correspondants.The 15 μL of the mixture is placed in the wells of a 96-well plate specially designed for the 7900HT apparatus, 5 μL of water (for the blank) or 5 μL of successive dilutions of cDNA (for the range) are added. or 5 µL of samples in the corresponding wells.
La PCR quantitative en temps réel peut être exploitée si l’efficacité des amorces est comprise entre 90% et 110%.Quantitative real-time PCR can be used if the effectiveness of the primers is between 90% and 110%.
Dans la méthode de qPCR, la quantification est effectuée en utilisant la méthode comparative de ACt : la quantification relative (RQ). Cette méthode détermine le Ct (Cycle threshold) de chaque gène.. Ce Ct est normalisé par rapport au Ct d’un gène de ménage (dans notre étude Beta-2-microglobuline) qui est étudié en parallèle sur la carte.In the qPCR method, quantification is carried out using the comparative method of ACt: relative quantification (RQ). This method determines the Ct (Cycle threshold) of each gene. This Ct is normalized compared to the Ct of a household gene (in our Beta-2-microglobulin study) which is studied in parallel on the map.
1.4. Résultats1.4. Results
Les résultats (figure 1) sont présentés en moyenne sur n=3 avec les écart-types. Le test t de Student a été utilisé pour comparer l’effet entre les cellules traitées et contrôles (non traités ou excipient).The results (Figure 1) are presented on average over n = 3 with the standard deviations. Student's t test was used to compare the effect between treated and control cells (untreated or excipient).
Les résultats de la figure 1 représentés par une étoile sont considérés comme significatifs pour p<0,05.The results in Figure 1 represented by a star are considered significant for p <0.05.
Le TGFpi favorise significativement l’expression du gène TIEG-1 dans les KHN.TGFpi significantly promotes the expression of the TIEG-1 gene in KHNs.
Le traitement par chacun des actifs testés séparément ne stimule pas l’expression deTreatment with each of the active ingredients tested separately does not stimulate the expression of
TIEG-1. Par contre l’association des 2 (ROMext + ALBZ) favorise une augmentation significative à 2h de 72% et à 6h de 25% (Figure 1).TIEG-1. On the other hand, the combination of the 2 (ROMext + ALBZ) promotes a significant increase at 2 hours by 72% and at 6 hours by 25% (Figure 1).
L’association des extraits de romarin et d’Albizia julibrissin présente une synergie d’activité si on la compare aux résultats obtenus pour chacun des actifs testés séparément.The combination of rosemary and Albizia julibrissin extracts presents a synergistic activity when compared to the results obtained for each of the active ingredients tested separately.
Ce résultat inattendu permet d’envisager l’utilisation de la combinaison précitée dans des compositions de soin cosmétique de la peau pour limiter l’apparition des signes de vieillissement cutané intrinsèque ou extrinsèque.This unexpected result makes it possible to envisage the use of the above combination in cosmetic skin care compositions to limit the appearance of signs of intrinsic or extrinsic skin aging.
L’association de l’extrait de Romarin (ROMext) enrichi en USRO et de l’extrait d’écorce d’Albizia julibrissin augmente significativement l’expression de TIEG-1 de 72% à 2h et de 25% à 6h pour les KHN.The association of Rosemary extract (ROMext) enriched in USRO and Albizia julibrissin bark extract significantly increases the expression of TIEG-1 by 72% at 2 h and by 25% at 6 h for KHN .
Exemple 2 : Etude de l’expression de la protéine TIEG-1 par Western Blot sur les Fibroblastes Humains (FHN)Example 2 Study of the Expression of the TIEG-1 Protein by Western Blot on Human Fibroblasts (FHN)
Le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’association d’un extrait de Romarin riche en acide Usolique (URSO) et l’extrait d’Albizia Julibrissin sur l’expression de la protéine de TIEG-1 par Western Blot.The aim of this study is to assess the effect of the association of a Rosemary extract rich in Usolic acid (URSO) and the extract of Albizia Julibrissin on the expression of the TIEG-1 protein by Western Blot.
2.1. Matériels et Méthodes2.1. Materials and methods
Voir exemple 1, point 1.1.See example 1, point 1.1.
2.2. Traitements des FHN2.2. HLF treatments
Les FHN sont ensemencés dans le milieu de culture approprié sans antibiotique, DMEM 1g/L de glucose avec 10% SVF (sérum de veau fœtal) à une densité d’ensemencement de 0,200x106 cellules/puits, en plaque 6 puits.The FHN are seeded in the appropriate culture medium without antibiotic, DMEM 1 g / L of glucose with 10% FCS (fetal calf serum) at a seeding density of 0.200 × 10 6 cells / well, in a 6-well plate.
Les cellules sont ensuite traitées avec les extraits préparés extemporanément dans du milieu de culture approprié sans antibiotique et sans SVF afin d’en extraire les protéines.The cells are then treated with the extracts prepared extemporaneously in appropriate culture medium without antibiotic and without SVF in order to extract the proteins.
2.3. Préparation des Réactifs et échantillons2.3. Preparation of Reagents and samples
Les anticorps utilisés sont répertoriés dans le tableau 4 ci-dessous.The antibodies used are listed in Table 4 below.
Tableau 4 : récapitulatif des anticorps et protéines recombinantes utilisésTable 4: summary of the recombinant antibodies and proteins used
2.4. Préparation des extraits protéiques et dépôt sur gel2.4. Preparation of protein extracts and deposition on gel
L’extraction des protéines totales se fait directement dans le tampon de dépôt qui est adapté au nombre de cellules obtenues. Pour ce faire, les cellules sont trypsinées et collectées en tube 15 mL pour être comptées via le compteur « Vi-Cell Coulter » pour en déterminer le nombre total. Les cellules sont ensuite culotées à 1 million après lavage au PBS dans des microtubes pour être lyser avec le tampon de dépôt (Tableau ) (1 OOpL de tampon pour 1 million de cellules).The extraction of total proteins is done directly in the deposition buffer which is adapted to the number of cells obtained. To do this, the cells are trypsinized and collected in a 15 ml tube to be counted via the “Vi-Cell Coulter” counter to determine the total number. The cells are then pelleted to 1 million after washing with PBS in microtubes to be lysed with the deposition buffer (Table) (1 OOpL of buffer for 1 million cells).
Tableau 5 : Tampon de lyse-LDS à 1XTable 5: LDS-1X lysis buffer
Avant le dépôt, les échantillons sont chauffés à 95 °C pendant 5 min afin de les dénaturer. On dépose 10pL de chaque lysat dans les gels SDS-PAGE pour correspondre à 100 000 cellules/piste (Tableau 6).Before deposition, the samples are heated at 95 ° C for 5 min in order to denature them. 10 μL of each lysate is deposited in the SDS-PAGE gels to correspond to 100,000 cells / lane (Table 6).
Un marqueur est déposé en parallèle des échantillons, le « Précision Plus Proteinm WesternC™ » (Bio-Rad) qui peut être visualisé en visible, fluorescence et chimiluminescence.A marker is deposited in parallel with the samples, the "Precision Plus Protein m WesternC ™" (Bio-Rad) which can be viewed in visible, fluorescence and chemiluminescence.
2.5. Western Blot2.5. Western blot
L’électrophorèse est réalisée à l’aide de la cuve « Criterion™ Cell» de Bio-Rad qui permet de migrer 2 midi-gels précoulés. Le tampon de migration utilisé est le tampon MES (Bio-Rad). La migration se fait à 200V constant pendant 35 minutes pour les mini gels et 45 minutes pour les midi-gels. Aussitôt, les gels peuvent être démoulés pour réaliser le transfert en cuve.The electrophoresis is carried out using the Bio-Rad "Criterion ™ Cell" tank which allows to migrate 2 pre-molded midi-gels. The migration buffer used is the MES buffer (Bio-Rad). The migration is done at 200V constant for 35 minutes for mini gels and 45 minutes for midi-gels. Immediately, the gels can be removed from the mold for transfer to the tank.
Le transfert permet d’imprimer les protéines contenues dans le gel sur une membrane de nitrocellulose de 0,2μΜ (Bio-Rad). Le système utilisé pour ce transfert est le « Criteriorf - Blotter » de Bio-Rad pouvant accueillir 2 midi-gels ou 4 mini gels. Le tampon de transfert utilisé est le tampon Tris/Glycine (Bio-Rad) contenant 20% de méthanol.The transfer allows the proteins contained in the gel to be printed on a 0.2μΜ nitrocellulose membrane (Bio-Rad). The system used for this transfer is the "Criteriorf - Blotter" from Bio-Rad which can accommodate 2 midi-gels or 4 mini gels. The transfer buffer used is the Tris / Glycine buffer (Bio-Rad) containing 20% methanol.
Les membranes sont placées dans une solution de saturation, « Blotti n% Grade Blocker » à 5% (Bio-Rad) pendant 1h sous agitation à température ambiante. Puis, les membranes sont incubées toutes la nuit à +4°C sous agitation dans la solution d’anticorps primaire préparée dans la solution de saturation.The membranes are placed in a saturation solution, “Blotti n% Grade Blocker” at 5% (Bio-Rad) for 1 hour with stirring at room temperature. The membranes are then incubated overnight at + 4 ° C with shaking in the primary antibody solution prepared in the saturation solution.
Le lendemain après plusieurs lavages au TBS-T (« Tris Buffer Saline » (Sigma) contenant 0,1% de Tween20 (Bio-Rad ; 161-0781)), les membranes sont incubées dans l’anticorps secondaire couplé à une enzyme HRP (HorseRadish Peroxydase) pendant 1h sous agitation à température ambiante.The following day after several washes with TBS-T (“Tris Buffer Saline” (Sigma) containing 0.1% Tween20 (Bio-Rad; 161-0781)), the membranes are incubated in the secondary antibody coupled to an enzyme HRP (HorseRadish Peroxidase) for 1 hour with stirring at room temperature.
Après les lavages dans le TBS-T, les membranes sont mises en contact avec la solution de révélation contenue dans le kit « Super Signal Pico » (Pierce Thermo Scientific). L’HRP des anticorps secondaires catalyse l’oxydation du luminol contenu dans la solution de révélation en lumière. Cette émission de lumière est visualisée par la caméra CCD MyECL Imager (Thermo).After washing in TBS-T, the membranes are brought into contact with the developer solution contained in the “Super Signal Pico” kit (Pierce Thermo Scientific). The secondary antibody HRP catalyzes the oxidation of the luminol contained in the light revealing solution. This light emission is viewed by the MyECL Imager CCD camera (Thermo).
Les images obtenues sont analysées par un logiciel adapté permettant de mesurer l’intensité des bandes pour déterminer le ratio d’expression par rapport à une protéine de référence, l’actine.The images obtained are analyzed by suitable software allowing the intensity of the bands to be measured to determine the expression ratio compared to a reference protein, actin.
2.6 Résultats2.6 Results
Différents ratio des extraits de romarin et d’Albizia julibrissin ont été testés en cinétique (Tableau 7):Different ratios of rosemary and Albizia julibrissin extracts have been tested in kinetics (Table 7):
Tableau 7 : Les combinaisons d’extraits de romarin et d’Albizia julibrissin utilisésTable 7: The combinations of rosemary and Albizia julibrissin extracts used
Les résultats (Figure 2) sont présentés en moyenne sur n=3 avec les écart-types. Le test t de Student a été utilisé pour comparer l’effet entre les cellules traitées et non traitées.The results (Figure 2) are presented on average over n = 3 with the standard deviations. Student's t test was used to compare the effect between treated and untreated cells.
Les résultats avec un astérisque sont considérés comme significatifs pour p<0,05.Results with an asterisk are considered significant for p <0.05.
Pour les associations testées, des augmentations significatives de la cible sont observées à 6h. L’effet semble plus important lorsque la proportion en ALBZ est plus forte que ROMext.For the associations tested, significant increases in the target are observed at 6 a.m. The effect seems greater when the proportion of ALBZ is higher than ROMext.
2.7. Conclusion2.7. Conclusion
Sur les FHN, une augmentation significative de l’expression protéique de TIEG-1 est observée avec les associations testées des extraits de romain et Albizia julibrissin.On the FHN, a significant increase in the protein expression of TIEG-1 is observed with the combinations tested extracts of roman and Albizia julibrissin.
L’effet est plus important lorsque la proportion en extrait d’Albizia Julibrissin est plus forte que l’extrait de Romarin (Figure 2).The effect is greater when the proportion of extract of Albizia Julibrissin is higher than the extract of Rosemary (Figure 2).
Exemple 3. Expression de TIEG-1 dans un modèle de cicatrisation in vitro.Example 3. Expression of TIEG-1 in an in vitro healing model.
Il est possible d’obtenir par culture cellulaire, une surface couverte uniformément de cellules. Ce tapis peut être blessé en effectuant une déchirure par utilisation de la pointe d’un cône qui va racler le tapis cellulaire.It is possible to obtain, by cell culture, a surface uniformly covered with cells. This carpet can be injured by making a tear by using the tip of a cone which will scrape the cellular carpet.
Sur ce modèle, on distingue 3 zones différentes : la zone de blessure correspondant à la zone raclée par la pointe de cône (zone C), une zone mixte c’est-à-dire la zone comprenant la zone limitrophe de la blessure (zone B) et une zone témoin sur le tapis cellulaire, éloignée de la zone blessée (Zone A) (Figure 3, A). L’expression de TIEG-1 a été révélée par immuno-marquage et quantifiée par analyse d’image dans les fibroblastes présents dans ces trois zones quand le processus de cicatrisation est amorcé.On this model, there are 3 different zones: the wound zone corresponding to the zone scraped by the tip of the cone (zone C), a mixed zone, that is to say the zone comprising the zone bordering on the wound (zone B) and a control zone on the cell mat, distant from the injured zone (Zone A) (Figure 3, A). The expression of TIEG-1 was revealed by immunostaining and quantified by image analysis in the fibroblasts present in these three areas when the healing process is initiated.
Cette étude démontre que TIEG-1 est surexprimé significativement dans la zone de blessure C de 47% par rapport à la zone mixte B et de 53% par rapport à la zone témoin A (Figure 3, B).This study demonstrates that TIEG-1 is significantly overexpressed in injury zone C by 47% compared to mixed zone B and 53% compared to control zone A (Figure 3, B).
Ceci indique que TIEG-1 est un acteur majeur du mécanisme de la mobilité cellulaire notamment fibroblastique, mécanisme majeur du processus de cicatrisation.This indicates that TIEG-1 is a major player in the mechanism of cellular mobility, notably fibroblastic, a major mechanism in the healing process.
Exemple 4. Etude de l’expression protéique de TIEG 1 dans des FHN en culture soumis à un test de cicatrisation sous l’effet de l’association d’un extrait d’écorce d’Albizia julibrissin, d’un extrait de feuilles de romarin et Prodizia® et de gelée royale d’abeille noire d’OuessantEXAMPLE 4 Study of the Protein Expression of TIEG 1 in FHNs in Culture Subject to a Healing Test Under the Effect of the Association of an Albizia julibrissin Bark Extract, an Extract of Leaves of rosemary and Prodizia® and royal jelly of black bees from Ouessant
L’expression de TIEG 1 a été évaluée sous l’effet d’un traitement par la combinaison d’un extrait d’écorce d’Albizia julibrissin (Prodizia®), d’un extrait de feuilles de romarin et de gelée royale d’abeille noire d’Ouessant dans un test de cicatrisation sur des FHN en culture.The expression of TIEG 1 was evaluated under the effect of a treatment by the combination of an extract of the bark of Albizia julibrissin (Prodizia®), an extract of rosemary leaves and royal jelly of Ouessant black bee in a wound healing test on cultured FHN.
4.1. Traitement des cellules4.1. Cell processing
Des Fibroblastes Humains Normaux (FHN) sont ensemencés à raison de 80 000 cellules par boite de pétri 35 ibidi traité dans du milieu DMEM faible en glucose implémenté de 10% de SVF et d’un mélange d’antibiotiques (Pénicilline/Streptomycine) et maintenues en culture pendant 48 heures, puis le milieu est changé et remplacé par du milieu dépiété en SVF.Normal Human Fibroblasts (FHN) are seeded at the rate of 80,000 cells per 35 ibidi petri dish treated in low glucose DMEM medium implemented with 10% FCS and a mixture of antibiotics (Penicillin / Streptomycin) and maintained in culture for 48 hours, then the medium is changed and replaced with medium which has been screened in SVF.
Après 24 heures de culture sans SVF, les FHN sont traités par la combinaison des trois ingrédients actifs préparés extemporanément (tableau 8).After 24 hours of culture without SVF, the FHN are treated by the combination of the three active ingredients prepared extemporaneously (Table 8).
Tableau 4 : Récapitulatif des ingrédients testésTable 4: Summary of the ingredients tested
Après 15 heures de traitement, une blessure sur le tapis de FHN de chaque boîte de Pétri est réalisée à l’aide d’un cône, en forme de croix.After 15 hours of treatment, a wound on the FHN mat of each Petri dish is made using a cone, in the shape of a cross.
24h après la blessure, le milieu de culture est éliminé et l’immunomarquage de TIEG-1 est réalisé.24 hours after the injury, the culture medium is removed and the TIEG-1 immunostaining is performed.
Les cellules sont fixées à la formaline puis perméabilisées au triton (0,1%) pendant 10 minutes. Elles sont ensuite saturées avec du PBS/BSA 1% (« Phosphate Buffer Salin », « Bovin Sérum Albumin ») pendant 30 minutes. L’anticorps primaire (anti-KLF10 de lapin; Abcam) est dilué au 1/200eme dans du tampon PBS-BSA 1% et incubé sur les cellules à température ambiante pendant 1 heure. Après rinçage par du PBS, l’anticorps secondaire (« Alexa Fluor® 568 Goat Anti-Rabbit IgG » ) est dilué au 1/200eme dans du tampon PBS-BSA 1% et déposé à température ambiante pendant 1 heure à l’obscurité. Un marquage des noyaux au DAPI (dilué au 1/100eme) ainsi que des filaments d’actine à la phalloïdine 488 (diluée au 1/200eme) est réalisé en parallèle de l’incubation de l’anticorps secondaire.The cells are fixed with formalin and then permeabilized with triton (0.1%) for 10 minutes. They are then saturated with 1% PBS / BSA ("Phosphate Buffer Saline", "Bovine Serum Albumin") for 30 minutes. The primary antibody (rabbit anti-KLF10; Abcam) is diluted 1/200 th in 1% PBS-BSA buffer and incubated on the cells at room temperature for 1 hour. After rinsing with PBS, the secondary antibody (“Alexa Fluor® 568 Goat Anti-Rabbit IgG”) is diluted 1/200 th in 1% PBS-BSA buffer and deposited at room temperature for 1 hour in the dark . Labeling of the nuclei with DAPI (diluted 1/100 th ) and actin filaments with phalloidin 488 (diluted 1/200 th ) is carried out in parallel with the incubation of the secondary antibody.
Après rinçage au PBS, quelques gouttes de milieu de montage aqueux sont ajoutées. Les boites sont enfin stockées à 4°C en attente d’acquisition d’image au microscope à fluorescence.After rinsing with PBS, a few drops of aqueous mounting medium are added. The boxes are finally stored at 4 ° C while awaiting image acquisition under a fluorescence microscope.
4.2. Acquisition et analyse d’images4.2. Image acquisition and analysis
Les images sont réalisées avec un microscope confocal Leica SP5 II à l’objectif à air x20 à la résolution 1024 x 1024 pixels. Trois images sont faites en zone non blessée et trois images ou plus en zone blessée, avec les mêmes paramètres d’acquisition. Les images sont faites après excitation des fluorochromes par un laser spécifique : 1. laser à Argon (488 nm), 2. diode laser (405 nm) et 3. laser hélium-néon » (633 nm).The images are taken with a Leica SP5 II confocal microscope with the x20 air objective at a resolution of 1024 x 1024 pixels. Three images are taken in the non-injured area and three or more images in the injured area, with the same acquisition parameters. The images are taken after excitation of the fluorochromes by a specific laser: 1. Argon laser (488 nm), 2. laser diode (405 nm) and 3. helium-neon laser ”(633 nm).
Après acquisition, les images sont analysées une par une grâce au logiciel Leica QWin, afin d’en obtenir une description quantitative.After acquisition, the images are analyzed one by one using Leica QWin software, in order to obtain a quantitative description.
Un programme d’analyse d’image permet une détection spécifique des noyaux et du marquage TIEG-1. La détection du marquage de TIEG-1 est réalisée dans le compartiment cytoplasmique et dans le noyau des cellules. Pour chaque condition, la quantification de TIEG-1 est mesurée dans la zone cicatricielle et dans la zone non blessée. Les valeurs de cette quantification sont systématiquement pondérées par le nombre de noyaux ou la surface cellulaire.An image analysis program allows specific detection of nuclei and TIEG-1 labeling. The detection of the labeling of TIEG-1 is carried out in the cytoplasmic compartment and in the nucleus of the cells. For each condition, the quantification of TIEG-1 is measured in the scar area and in the uninjured area. The values of this quantification are systematically weighted by the number of nuclei or the cell surface.
4.3. Résultats4.3. Results
L’expression de TIEG-1 a été analysée dans le compartiment nucléaire pour chaque condition de traitement et dans les deux zones à comparer : la zone de blessure, dite zone cicatricielle et la zone non blessée (Figure 4). Les résultats sont regroupés dans le tableau 9 ci-dessous :The expression of TIEG-1 was analyzed in the nuclear compartment for each treatment condition and in the two areas to be compared: the injury area, called the scar area and the uninjured area (Figure 4). The results are collated in Table 9 below:
Tableau 9 : Expression TIEG-1 pour différentes conditions de traitement dans la zone de blessure et la zone non-blesséeTable 9: TIEG-1 expression for different treatment conditions in the injury zone and the non-injured zone
L’étude de l’expression de TIEG-1 dans le compartiment nucléaire montre que la combinaison d’extraits et de gelée royale d’abeille noire d’Ouessant (gelée royale AN) selon l’invention induit une augmentation significative de l’expression nucléaire de TIEG-1 par rapport au témoin non traité de +581% dans la zone non blessée et de +624% dans la zone cicatricielle (Figure 4).The study of the expression of TIEG-1 in the nuclear compartment shows that the combination of extracts and royal jelly of Ouessant black bee (AN royal jelly) according to the invention induces a significant increase in expression of TIEG-1 compared to the untreated control of + 581% in the uninjured area and + 624% in the scar area (Figure 4).
Par ailleurs, on note que le traitement par Albizia julibrissin, le romarin et la gelée royale d’abeille noire d’Ouessant augmente de 23% l’expression protéique de TIEG-1 dans le compartiment nucléaire des cellules de la zone cicatricielle par rapport à l’expression de TIEG-1 après traitement des cellules de la zone non blessée contre 16% pour le témoin non traité.In addition, it is noted that the treatment with Albizia julibrissin, rosemary and royal jelly of black bees of Ouessant increases by 23% the protein expression of TIEG-1 in the nuclear compartment of the cells of the scar zone compared to the expression of TIEG-1 after treatment of the cells of the uninjured area against 16% for the untreated control.
La combinaison de ces trois extraits présente un intérêt tout particulier pour une utilisation dans une composition cosmétique de soin destinée à contrer l’apparition de signes du vieillissement intrinsèque ou extrinsèque.The combination of these three extracts is of particular interest for use in a cosmetic care composition intended to counter the appearance of signs of intrinsic or extrinsic aging.
Exemple 5 : Crème riche comprenant la combinaison d’ingrédients actifs selon l’inventionExample 5: Rich Cream Comprising the Combination of Active Ingredients According to the Invention
Une crème fortement nourrissante et hydratante (riche) est préparée sous la forme d’une émulsion huile-dans-eau.A highly nourishing and hydrating (rich) cream is prepared in the form of an oil-in-water emulsion.
La formule de cette crème est indiquée ci-dessous, et les pourcentages sont indiqués en poids de l’ingrédient par rapport à la composition finale :The formula of this cream is indicated below, and the percentages are indicated by weight of the ingredient relative to the final composition:
- Solution d’extrait de feuilles de romarin (Rosemarinus officinalis)2,0- Rosemary (Rosemarinus officinalis) leaf extract solution 2.0
- Solution d’extrait d’écorce d’arbre à soie (Albizia julibrissin)2,0- Silk tree bark extract solution (Albizia julibrissin) 2.0
- Gelée royale d’abeille noire d’Ouessant0,1- Ouessant black bee royal jelly 0.1
- Glycérine7,5- Glycerin7.5
- Acrylates/C10-30 alkyl acrylate crosspolymer0,3- Acrylates / C10-30 alkyl acrylate crosspolymer0,3
- Gomme xanthane0,2- Xanthan gum0.2
- cetyl alcool/glyceryl stearate/PEG-75/ceteth/steareth-25,3- cetyl alcohol / glyceryl stearate / PEG-75 / ceteth / steareth-25,3
- C10-C18 triglycérides5,0- C10-C18 triglycerides5,0
- Coco-glycerides hydrogénés2,5- Hydrogenated coco-glycerides 2.5
- Alcool cétylique1,0- Cetyl alcohol 1.0
- Polyisobutène hydrogéné8,2- Hydrogenated polyisobutene 8.2
- Acide citrique<0,1- Citric acid <0.1
- Citrate trisodique0,14- Trisodium citrate 0.14
- Tocopheryl acetate0,2- Tocopheryl acetate0,2
- Adjuvants (parfums, agent neutralisant, conservateurs)Qs- Adjuvants (perfumes, neutralizing agent, preservatives) Qs
- Eau purifiée Qsp 100%- Purified water Qsp 100%
L’extrait d’écorce d’Albizia julibrissin est sous la forme d’une solution dudit extrait (45% en poids sec d’extrait) dans le glycérol, commercialisée sous la dénomination commerciale Prodizia® par la société SEDERMA. L’extrait de romarin est un extrait méthanolique de feuilles de romarin. Cet extrait est séché pour être mis en solution à 2% en poids sec dans un mélange butyleneglycol/glycérol, titré à 1500ppm en acide ursolique.Albizia julibrissin bark extract is in the form of a solution of said extract (45% by dry weight of extract) in glycerol, marketed under the trade name Prodizia® by the company SEDERMA. Rosemary extract is a methanolic extract of rosemary leaves. This extract is dried to be dissolved in 2% by dry weight in a butylene glycol / glycerol mixture, titrated at 1500 ppm in ursolic acid.
La phase grasse est préparée à chaud. Une fois homogène, elle est dispersée dans la phase aqueuse contenant la combinaison des ingrédients actifs selon l’invention.The fatty phase is prepared hot. Once homogeneous, it is dispersed in the aqueous phase containing the combination of the active ingredients according to the invention.
Exemple 6 : Sérum comprenant la combinaison d’ingrédients actifs selon l’inventionExample 6 Serum comprising the combination of active ingredients according to the invention
La formule du sérum est indiquée ci-dessous et les pourcentages sont indiqués en poids de l’ingrédient par rapport à la composition finale :The serum formula is indicated below and the percentages are indicated by weight of the ingredient relative to the final composition:
Les extraits de romarin et d’Albizia julibrissin sont identiques à l’exemple 5.The extracts of rosemary and Albizia julibrissin are identical to Example 5.
Le sérum est appliqué sur le visage, en particulier sur les zones présentant des signes de vieillissement.The serum is applied to the face, especially on areas showing signs of aging.
Outre sa texture agréable à l’application, il présente une efficacité anti-âge remarquable, notamment pour ralentir l’évolution des signes de vieillissement intrinsèque ou extrinsèque.In addition to its texture that is pleasant to apply, it has remarkable anti-aging efficacy, in particular for slowing down the development of signs of intrinsic or extrinsic aging.
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