FR3031678B1 - Utilisation conjointe de asp-8adt et d'un inhibiteur d'autophagie dans le traitement de cancer. - Google Patents

Utilisation conjointe de asp-8adt et d'un inhibiteur d'autophagie dans le traitement de cancer. Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un inhibiteur d'autophagie pour son utilisation dans le traitement de cancer d'un patient traité par ASP-8ADT, une prodrogue d'ASP-8ADT ou un métabolite d'ASP-8ADT, ainsi qu'un produit de combinaison et une composition pharmaceutique comprenant ASP-8ADT, une prodrogue d'ASP-8ADT ou un métabolite d'ASP-8ADT et ledit inhibiteur d'autophagie.

Description

L’invention concerne l’utilisation conjointe d’ASP-8ADT et d’un inhibiteur d’autophagie dans le traitement de cancer. L’apoptose, aussi appelée mort cellulaire programmée, joue un rôle central dans le développement et l’homéostasie des organismes multicellulaires en détruisant les cellules qui ne remplissent plus leurs fonctions physiologiques et deviennent potentiellement dangereuses. L’apoptose s’effectue notamment par le biais de protéases, les caspases, qui déclenchent la mort cellulaire en dégradant des substrats cellulaires du noyau et du cytoplasme. Les caspases sont à l’origine présentes dans les cellules sous formes de précurseurs inactifs (procaspases). Le processus d’activation de ces procaspases, conduisant à la formation des caspases effectrices de l’apoptose, peut être initié par divers types de signaux intra- et extra-cellulaires. Deux voies principales d’activation sont actuellement identifiées : la voie extrinsèque des récepteurs à domaines de mort et la voie intrinsèque, aussi appelée voie mitochondriale.
Cette voie d’activation intrinsèque est basée sur un accroissement soudain de la perméabilité transitoire de la mitochondrie (MPT pour « mitochondrial Permeability Transition ») rendant la membrane mitochondriale interne perméable aux solutés de poids moléculaire supérieur à 1500 Da. Ce phénomène se traduit par une dépolarisation mitochondriale et un gonflement de la mitochondrie (1). Des molécules, comme le cytochrome-c, sont libérées dans le cytosol. Cette libération du cytochrome-c provoque, entre autre, de multiples voies de signalisation, aboutissant à l’activation des caspases effectrices de l’apoptose.
Ces dernières années ont ainsi été développés de nombreux traitements pro-apoptotiques dont l’objectif est de déclencher l’apoptose dans les cellules tumorales, notamment en stimulant la perméabilisation de la membrane mitochondriale (1).
Pour cela, une approche actuellement utilisée est basée sur la dérégulation de l’homéostasie calcique. En effet, il est généralement admis qu’une modification de la signalisation calcique, par exemple une vidange des stocks calciques réticulaires et une entrée soutenue de calcium dans le cytosol par les canaux SOC (pour Store Operated Channel), est un stimulus de la voie d’activation intrinsèque produisant l’apoptose (2-7).
Dans cette optique, la thapsigargine (TG), molécule extraite de la plante Thapsia Garganica L., a longtemps été considérée comme une molécule prometteuse en ce qu’elle inhibe les pompes intracellulaires de type SERCA (sarcoplasmique endoplasmique réticulum Ca2+-ATPase, ou SR Ca2+-ATPase) qui sont exprimées à la membrane du réticulum endoplasmique et qui jouent un rôle central dans la distribution du calcium à l’intérieur du réticulum endoplasmique. Or, comme précédemment mentionné, une exposition prolongée à des niveaux calciques élevés dans le cytosol (ou une déplétion de la réserve calcique du réticulum endoplasmique) provoque l’apoptose.
La thapsigargine, en induisant l’apoptose, représentait donc une voie prometteuse dans le traitement de cancers.
Malheureusement, la thapsigargine cible les pompes SERCA qui sont exprimées de façon ubiquitaire dans l’organisme. Ainsi, la thapsigargine ne possède pas de spécificité cellulaire et ne peut être administrée sans présenter une forte toxicité en détruisant à la fois les cellules tumorales mais également les cellules saines, ce qui constitue un obstacle majeur à son utilisation.
Pour résoudre ce problème, des analogues de la thapsigargine ont été synthétisés, rendant possible la fixation sur ces molécules de groupements comme des peptides ou des anticorps, en particulier des anticorps capables d’interagir spécifiquement avec des antigènes ou des peptides clivables par des enzymes spécifiques. Ces analogues sont utilisables pour la formation de prodrogues.
Une prodrogue est une substance pharmacologique qui est administrée sous une forme inactive mais qui devient active thérapeutiquement dans le corps humain. Pour cela, une approche souvent utilisée consiste à conjuguer la substance pharmacologique à un peptide (ou une protéine) «d’adressage», c'est-à-dire un peptide ciblant spécifiquement les tissus cancéreux. Ainsi, des peptides clivables par des enzymes exprimées dans les tumeurs peuvent être fixés sur ces analogues de la thapsigargine, rendant possible la libération des substances actives.
Un des dérivés de la thapsigargine les plus exploités jusqu’à présent est le ASP-8ADT (encore appelé 12ADT, L12ADT ou 12ADT-ASP), ou 8-O-(12-Aminododécanoyl)-8-O debutanoyl thapsigargine, de formule 1 :
Ce dérivé de la thaspigargine a ainsi été combiné avec des peptides d’adressages clivables par des protéines exprimées spécifiquement dans des tissus cancéreux (3, 4, 8, 10).
Par exemple, parmi les prodrogues d’ASP-8ADT, la prodrogue G-202, ou mipsagargin, est actuellement en phase II d’essais cliniques chez l’homme dans le cancer de la prostate et de Γhépatocarcinome (NCT01056029 et NCT01734681), et du glioblastome. Les essais thérapeutiques ont montré son innocuité (8).
Le composé G-202, dont la structure est représentée à la figure 1 (produit de départ), utilise la spécificité de clivage de la PSMA (Prostat Spécifie Membran Antigen). Cette enzyme protéolytique est une glutamate carboxypeptidase de type II qui clive préférentiellement les peptides poly-y-glutamyl (8).
Puisque la PSMA est surexprimée par rapport aux tissus normaux dans les tissus néovasculaires de nombreuses tumeurs (notamment dans le cas du cancer de la prostate, du cancer hépatocellulaire, du cancer de la vessie, du cancer du rein, du cancer du pancréas, du cancer du foie, du cancer du sein ou du glioblastome) (10), la libération du composé actif ASP-8ADT se fait majoritairement dans les tissus cancéreux, permettant le déclenchement d’une apoptose spécifique dans les cellules tumorales sans affecter les cellules saines. D’autres prodrogues utilisables dans le traitement de cancer peuvent par exemple mettre en œuvre la spécificité de clivage de la PSA (« Prostate Spécifie Antigen ») ou encore hK2 (« Human glandular Kallikrein 2 »).
La PSA est une sérine protéase qui n’est pas active dans le sang mais seulement dans les sites tumoraux et les tissus normaux de la prostate. Cette protéine est codée par le gène humain kallicréine hKLK3.
La protéine hK2 est codée par le gène humain kallicréine hKLK2. Tout comme la PSA, hK2 est presque exclusivement exprimé dans la prostate. Cette protéine est capable de cliver les protéines semenogelin. Dans les tissus normaux de la prostate, les niveaux d’expression de hK2 sont inférieurs à ceux de la PSA. Cependant, hK2 est plus fortement exprimée par les cellules cancéreuses de la prostate que par l’épithélium normal de la prostate.
Il était au départ considéré que les analogues de la thapsigargine comme TASP-8ADT devaient, via l’inhibition des pompes SERCA, provoquer l’activation des mêmes voies de signalisation intracellulaire que la thapsigargine. Par conséquent, les études in vitro des prodrogues de ASP-8ADT, comme par exemple le G-202, se sont principalement limitées à vérifier que la prodrogue inhibait toujours les pompes SERCA, ainsi que l’affinité de liaison (10). Récemment, les inventeurs de la présente invention ont étudié les différents mécanismes d’action des analogues de la thapsigargine (9). Il a été confirmé que le composé ASP-8ADT se lie aux pompes SERCA et inhibe l’activité Ca2+-ATPase avec une affinité proche de la thapsigargine.
Il a également été démontré que le composé ASP-8ADT est capable, comme la thapsigargine mais de manière un peu plus lente, de libérer les stocks calciques réticulaires et d’activer une entrée soutenue de calcium dans le cytosol par les canaux calciques de types SOC (Store Operated Channel) (9).
Cependant, et contre toute attente, les inventeurs ont montré que, contrairement à la thapsigargine, le composé ASP-8ADT induit très peu d’apoptose (9). Il a donc été découvert que, de manière surprenante, la capacité des analogues de la thapsigargine à provoquer la mort des cellules par apoptose est différente de la thapsigargine et ne se résume pas à leur capacité à inhiber les pompes SERCA et à modifier la signalisation calcique.
Cette étude démontre donc clairement l’existence d’un mécanisme de résistance de nature inconnue à ce stade de l’étude, le composé ASP-8ADT induisant très peu d’apoptose par rapport à la thapsigargine (9).
De plus, un essai clinique de phase 1 a montré chez deux patients atteints d’un hépatocarcinome que le G-202, une prodrogue de l’ASP-8ADT, a permis de prolonger la période pendant laquelle la maladie n’a pas progressé. Cependant, le G-202 seul n’a pas permis de guérir ces deux patients (8).
Ainsi, un traitement basé uniquement sur l’administration d’ASP-8ADT risque de ne pas être efficace sur du long terme, l’apoptose induite par ce composé étant moindre et des phénomènes de résistance pouvant se mettre en place.
Il existe donc un besoin de nouveaux traitements pour les patients atteints de cancers, notamment les patients traités via l’utilisation du composé ASP-8ADT.
Or, les inventeurs ont découvert, après de nombreuses recherches, que l’utilisation d’une part d’ASP-8ADT et d’autre part d’un inhibiteur d’autophagie permettait de traiter, de manière synergique et efficace, certaines formes de cancers.
En effet, les inventeurs ont maintenant réussi à mettre en évidence, de manière très surprenante, que le dérivé de la thapsigargine, ASP-8ADT, n’est pas capable d’inhiber l’autophagie, contrairement à la thapsigargine (11). L’autophagie, ou encore macroautophagie, est un processus catabolique lysosomal de recyclage de macromolécules et d'organites cellulaires essentiel à l’homéostasie cellulaire. Elle permet la séquestration d’importantes portions du cytoplasme dans des vésicules à double membrane, les autophagosomes. Ce contenu cytoplasmique est, suite à la fusion des autophagosomes avec des lysosomes, dégradé au sein d’autolysosomes. Certains phénomènes, comme par exemple une carence en nutriments, peuvent stimuler l’autophagie pour permettre le maintien du métabolisme et la survie cellulaire.
Il a ici été découvert que la perte de capacité d’ASP-8ADT à inhiber l’autophagie diminue sa capacité à induire la mort par apoptose des cellules tumorales. H a en effet été démontré dans la présente invention par des tests in vitro que, contrairement aux hypothèses scientifiques largement admises, il ne peut y avoir apoptose en réponse à l’élévation du calcium cytosolique ou à la surcharge des mitochondries en calcium que si l’autophagie est inhibée, ce qui permet alors la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la libération de messagers de morts.
Par ailleurs, l’autophagie est, entre autre, un des mécanismes cellulaires participant à la résistance des cellules tumorales aux chimiothérapies (12).
Un traitement basé sur le composé ASP-8ADT et sur un inhibiteur d’autophagie permet donc à la fois de limiter les phénomènes de résistance qui pouvaient apparaître lors de l’utilisation d’ASP-8ADT seul, mais également de traiter de manière synergique un cancer. En effet, il a été démontré que l’effet anti-cancéreux de la combinaison ASP-8ADT/inhibiteur d’autophagie est significativement supérieur aux effets anti-cancéreux de l’ASP-8ADT et d’un inhibiteur d’autophagie cumulés. L’utilisation d’un inhibiteur d’autophagie augmente considérablement l’efficacité du traitement anti-cancéreux chez un patient traité avec de l’ASP-8ADT. L’invention concerne donc un inhibiteur d’autophagie pour son utilisation dans le traitement de cancer chez un patient traité par ASP-8ADT, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT. ASP-8ADT est le composé de formule 8-0-( 12-Aminododécanoyl)-8-O debutanoyl thapsigargine, dont la structure est représentée à la formule 1 ci-dessus. Ce principe actif cytotoxique est également connu sous le nom 12ADT ou encore L12ADT ou encore 12ADT-Asp (3, 4, 8, 9, 10).
Selon un mode de réalisation particulier, le patient est traité par ASP-8ADT, de formule 8-0-(12-Aminododécanoyl)-8-O debutanoyl thapsigargine. Il a en effet été démontré par les inventeurs qu’un traitement basé sur l’administration de ASP-8ADT et d’un inhibiteur d’autophagie permettait d’obtenir un effet anti-cancéreux particulièrement efficace.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le patient est traité par une prodrogue d’ASP-8ADT. Ce mode de réalisation particulier permet lui aussi l’obtention d’un effet anticancéreux particulièrement efficace étant donné que le principe actif agissant sur les cellules tumorales est ici aussi le principe actif ASP-8ADT.
On entend par «prodrogue» de ASP-8ADT tout composé dont la biotransformation dans l'organisme aboutit audit principe actif ASP-8ADT. Selon un mode de réalisation particulier, le patient est traité par une prodrogue de ASP-8ADT.
Typiquement, une prodrogue de ASP-8ADT est constituée par le principe actif ASP-8ADT conjugué à un peptide «d’adressage», c'est-à-dire un peptide ciblant spécifiquement des tissus cancéreux. Notamment un tel peptide d’adressage peut être un peptide clivable par une protéine exprimée dans des tissus cancéreux. Ce mode de réalisation particulier permet ainsi de cibler spécifiquement lesdits tissus cancéreux, rendant le traitement selon l’invention moins toxique pour le patient traité.
Tout peptide d’adressage connu de l’homme du métier pouvant être conjugué au principe actif ASP-8ADT peut ainsi être utilisé.
De préférence, une prodrogue de ASP-8ADT est constituée par le principe actif ASP-8ADT conjugué à un peptide clivable par la PSMA, la PSA ou hK2.
Selon un mode de réalisation particulier, le peptide clivable par la PSMA, la PSA ou hK2 comprend en outre à l’extrémité N-terminale un groupe permettant de prévenir l’activité endopeptidase capable de dégrader le peptide. Un tel groupe peut être choisi parmi un groupe acétyle, succinyle, benzyloxycarbonyle, morpholinocarbonyle ou glutaryle.
Selon une première alternative, une prodrogue de ASP-8ADT est constituée par le principe actif ASP-8ADT conjugué à un peptide clivable par la PSMA.
La PSMA se réfère à l'antigène membranaire prostatique spécifique (« Prostat Spécifie Membran Antigen ») ainsi qu’à toute enzyme ayant l’activité protéolytique de la PSMA.
Cet enzyme protéolytique est une glutamate carboxypeptidase de type II qui clive préférentiellement les peptides poly-y-glutamyl (8). Lesdites prodrogues peuvent ainsi être activées par l’activité pteroyl poly-y-glutamyl carboxypeptidase (folate hydrolase) de la PSMA.
Tout peptide clivable par la PSMA peut être utilisé. Des peptides clivables par la PSMA sont bien connus de l’homme du métier. On peut par exemple pour cela se référer à la demande US 2012/0093724.
Le peptide clivable par la PSMA peut par exemple être lié directement ou indirectement (c'est-à-dire par un groupe de liaison) à un groupe carboxyle a-amino ou de chaîne latérale d’un peptide, incluant les acides aminés contenant un acide dicarboxylique, par exemple l’acide glutamique, l’acide aspartique, la glutamine ou F asparagine.
De manière préférée, un peptide clivable par la PSMA est constitué de la séquence SEQ ID NO : 1, Asp-Glu*Glu*Glu*Glu. Le composé obtenu est ainsi le G-202 ou mipsagargin (cf. figure 1). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le patient est traité par G-202.
Selon une seconde alternative, une prodrogue de ASP-8ADT est constituée par le principe actif ASP-8ADT conjugué à un peptide clivable par la PSA.
La PSA se réfère à l’antigène prostatique spécifique ou «Prostate Spécifie Antigen » ainsi qu’aux enzymes ayant l’activité protéolytique de la PSA.
La PSA est une sérine protéase qui n’est pas active dans le sang mais seulement dans les sites tumoraux et les tissus normaux de la prostate. Cette protéine est codée par le gène humain kallicréine hKLK3.
Tout peptide clivable par la PSA peut être utilisé. Des peptides clivables par la PSA sont bien connus de l’homme du métier. On peut par exemple pour cela se référer à la demande US 2012/0093724.
Selon une troisième alternative, une prodrogue de ASP-8ADT est constituée par le principe actif ASP-8ADT conjugué à un peptide clivable par hK2. « hK2 » se réfère à la kallicréine glandulaire humaine de type 2 ainsi qu’à toute enzyme ayant l’activité protéolytique de hK2.
Tout comme la PSA, le hK2 est presque exclusivement retrouvé dans la prostate. Cette protéine est capable de cliver les protéines semenogelin. Dans les tissus normaux de la prostate, les niveaux d’expression de hK2 sont inférieurs à ceux de la PSA. Cependant, hK2 est plus fortement exprimée par les cellules cancéreuses de la prostate que par l’épithélium normal de la prostate.
Tout peptide clivable par hK2 peut être utilisé. Des peptides clivables par hK2 sont bien connus de l’homme du métier. On peut par exemple pour cela se référer à la demande US 2012/0093724 dont le contenu concernant les peptides clivables par la hK2 est incorporé par référence.
Selon un autre mode de réalisation, le patient est traité par un métabolite d’ASP-8ADT. On entend par « métabolite d’ASP-8ADT » tout produit intermédiaire résultant de la transformation du principe actif ASP-8ADT dans l'organisme lors d'un processus métabolique et présentant toujours l’effet thérapeutique d’ASP-8ADT.
Selon l’invention, on entend par «inhibiteur d’autophagie », tout composé, ou toute combinaison de composés, capable de réduire le niveau d’autophagie se produisant dans une cellule en sa présence par rapport au niveau d’autophagie se produisant dans une cellule en son absence.
Typiquement, un inhibiteur d’autophagie est apte à inhiber une ou plusieurs phases de l’autophagie, à savoir l’induction de l’autophagie, la formation des autophagosomes, la séquestration du matériel cellulaire dans des autophagosomes, la fusion des autophagosomes avec des lysosomes et/ou la dégradation du matériel cellulaire. Il a ainsi été démontré qu’un cancer peut être traité de manière synergique selon l’invention quel que soit l’inhibiteur d’autophagie utilisé, notamment que ce soit un inhibiteur de phase(s) précoce(s) de l’autophagie (par exemple, mais de manière non limitative, avec un siRNA de ATG5 ou un inhibiteur de Rab7) ou un inhibiteur de phase(s) plus tardive(s) de l’autophagie (par exemple, mais de manière non limitative, la chloroquine).
De tels inhibiteurs d’autophagie sont bien connus de l’homme du métier (cf. par exemple WO 2012088254 Al). L’inhibiteur d’autophagie peut par exemple être un ARN interfèrent (siRNA pour « Small inhibitory RNA”) ou tout autre composé inhibant l’expression ou la fonction de LAMP2 ou LAMP1 (protéines de la membrane lysosomale), de Beclinl, ou d’un gène d’autophagie, par exemple Atgl, Atg4, Atg8, Atg5, Atg7 or Atgl2, de préférence Atg5.
Un inhibiteur d’autophagie peut également être choisi parmi un inhibiteur des Phosphatidylinositol 3-kinases de type III (PI-3K), comme la 3-Méthyladenine (3-MA), la wortmannine et le LY294002, un inhibiteur de p38 MAPKinase comme SB203580, un agent lysosomotropique comme la chloroquine, l’hydroxychloroquine, la chlorimipramine, la suramine, du chlorure d’ammonium (agent lysosomotropique), cAMP ou du méthylamine, un inhibiteur d’ATPase, un inhibiteur de proton-ATPase vacuolaire comme de la Bafilomycin Al (qui inhibe la maturation des vacuoles autophagiques en inhibant la fusion entre les autophagosomes et les lysosomes), un agent agissant sur le système circulatoire, comme de l’Amioradone ou du Perhexilene, un agent cytotoxique comme du Vinblastine et la vincristine, des agents contrôlant le métabolisme lipidique, un antibiotique comme de la monensine, une hormone comme du Glucagon ou de l’Estradiol, un inhibiteur de protéase, un inhibiteur de protéase lysosomale comme un inhibiteur de cathepsine, un inhibiteur d’une ou plusieurs GTPase Rab intervenant notamment dans la formation et/ou maturation d’autophagosome, par exemple Rabl, Rab5, Rab7, Rab81, Rab8B, Rab9A, Rabll, Rab23, Rab24, Rab25, Rab32, Rab33B, de préférence Rab7 (13) (par exemple une molécule inhibitrice comme utilisée dans les exemples ci-après), la spautin-1 (inhibiteur de la Beclinl), le SP600125( inhibiteur de JNK), TAzithromycin (antibiotique Macrolide), le compound C ou dosomorphin (AMPkinase inhibiteur), le cycloheximide (inhibiteur de la synthèse protéique), le DBeQ (p97 inhibiteur), la metformin (AMPK inhibiteur), la Nutlin-3 (p53 inhibiteur), du Paclitaxel (inhibiteur de la dépolymérisation des microtubules), le PD98059 (MEK/ERK inhibiteur), le U0126 (MEK inhibiteur).
De préférence, l’inhibiteur d’autophagie selon l’invention est choisi parmi la chloroquine, la wortmannine, un inhibiteur de Rab7, le salubrinal, un ARN interfèrent de Beclinl ou un ARN interfèrent de Atg5.
Comme exposé plus haut, les inhibiteurs d’autophagie permettent d’augmenter considérablement l’efficacité du traitement anti-cancéreux chez un patient traité par ASP-8ADT, une prodrogue ou un métabolite de celui-ci.
Au sens, de l’invention, on entend par « traiter » ou « traitement » tout traitement capable, par exemple, de supprimer un cancer ou des métastases, réduire le risque de récidive, ralentir le développement d’un cancer ou des métastases, et/ou traiter les symptômes de la maladie.
Les cancers visés par la présente invention sont ceux sur lesquels ASP-8ADT exerce un effet anti-cancéreux. De manière générale, tous les cancers sont concernés par la présente invention, les mécanismes cellulaires identifiés (i.e. l’apoptose calcium-dépendante provoquée par augmentation de la concentration en calcium cytosolique, surcharge calcique mitochondriale induisant une dépolarisation de la membrane etc.) étant impliqués dans toutes formes de cancers (8). Ainsi, il a été démontré par les inventeurs que la combinaison entre ASP-8ADT et un inhibiteur d’autophagie permettait d’augmenter considérablement l’effet anti-cancéreux induit par ASP-8ADT seul.
Par exemple, il est connu qu’ASP-8ADT exerce un effet anti-cancéreux dans le cancer de la prostate, le glioblastome, le cancer du foie. D’une manière avantageuse, un cancer selon l’invention est choisi parmi le cancer de la prostate, le cancer hépatocellulaire, le cancer de la vessie, le cancer du rein, le cancer du pancréas, le cancer du foie, le cancer du sein ou le glioblastome. De préférence, un cancer selon l’invention est choisi parmi le cancer de la prostate, le cancer du pancréas, le cancer du foie, le cancer du sein ou le glioblastome. De préférence encore, un cancer selon l’invention est choisi parmi le cancer de la prostate, le cancer du sein et le cancer du pancréas. De préférence encore, un cancer selon l’invention est le cancer de la prostate.
Selon un mode de réalisation particulier dans lequel ASP-8ADT est une prodrogue d’ASP-8ADT, les cancers visés par la présente invention sont notamment ceux dans lesquels est exprimée la protéine clivant le peptide d’adressage utilisé. La détection des cancers visés par la présente invention peut se faire selon des techniques connues de l’homme du métier. Typiquement, les techniques d’immunohistochimie, de spectrométrie de masse, de qPCR/PCR, de tissus microarray peuvent être utilisées. On peut se référer pour cela à la publication Denmeade et al (10).
Ainsi, lorsqu’est utilisé un peptide clivable par la PSMA, les cancers visés par la présente invention sont notamment ceux dans lesquels est exprimée la PSMA. D’une manière avantageuse, un cancer exprimant la PSMA est choisi parmi le cancer de la prostate, le cancer hépatocellulaire, le cancer de la vessie, le cancer du rein, le cancer du pancréas, le cancer du foie, le cancer du sein ou le glioblastome.
Lorsqu’est utilisé un peptide clivable par la PSA, les cancers visés par la présente invention sont notamment ceux dans lesquels est exprimée la PSA. De manière avantageuse, un cancer exprimant la PSA est le cancer de la prostate.
Lorsqu’est utilisé un peptide clivable par hK2, les cancers visés par la présente invention sont notamment ceux dans lesquels est exprimée hK2. De manière avantageuse, un cancer exprimant la PSA est le cancer de la prostate.
Le terme « patient » est entendu comme un animal à sang chaud affecté, ou amené à être affecté, par un cancer visé par la présente invention, tel que précédemment défini. De préférence, un patient selon l’invention est un mammifère, par exemple un humain, un rongeur, un félin, un canidé ou un primate. De préférence encore, un patient selon l’invention est un humain.
Un objet de l’invention concerne également une méthode de traitement d’un cancer chez un patient traité par ASP-8ADT, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT, comprenant une étape d’administration audit patient d’une quantité thérapeutiquement active d’un inhibiteur d’autophagie tel que précédemment décrit.
Les composés selon l’invention peuvent être administrés sous forme de composition pharmaceutique, comme définie ci-après.
On entend par « quantité thérapeutiquement active » une quantité de composé suffisante pour traiter un cancer selon l’invention, ayant un rapport bénéfice/risque acceptable pour un traitement médicamenteux. La quantité de composés/compositions selon la présente invention ainsi que la fréquence d'administration pourront être déterminées par des études cliniques, par le médecin ou par le pharmacien. La quantité "thérapeutiquement active" spécifique à chacun des patients pourra dépendre d'un certain nombre de facteurs comme la nature et la sévérité du cancer à traiter, le composé/composition utilisé(e), l'âge, le poids, l'état de santé général, le sexe et le régime du patient, le mode d'administration, la durée du traitement (en monodose ou en plusieurs doses), les médicaments utilisés en combinaison et d'autres facteurs bien connus des spécialistes médicaux.
Typiquement, ASP-8ADT, la prodrogue ou le métabolite de celui-ci tels que définis ci-dessus, et l’inhibiteur d’autophagie selon l’invention peuvent être administrés de manière simultanée ou séquentielle.
De manière avantageuse, ASP-8ADT, la prodrogue ou le métabolite de celui-ci tels que définis ci-dessus, et l’inhibiteur d’autophagie selon l’invention peuvent être combinés dans une composition pharmaceutique ou peuvent être séparés, par exemple sous forme de produit de combinaison (kit).
Un objet de l’invention se rapporte ainsi à une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur d’autophagie tel que précédemment décrit, un composé choisi parmi PASP-8ADT, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprend un inhibiteur d’autophagie tel que précédemment décrit, ASP-8ADT et au moins un support pharmaceutiquement acceptable.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprend un inhibiteur d’autophagie tel que précédemment décrit, une prodrogue d’ASP-8ADT et au moins un support pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, une prodrogue d’ASP-8ADT est le G-202.
Un mode de réalisation particulier se rapporte à une telle composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement de cancer selon l’invention.
Dans la composition pharmaceutique selon l’invention, ASP-8ADT, la prodrogue ou le métabolite de celui-ci tels que définis ci-dessus, et l’inhibiteur d’autophagie, en quantités thérapeutiquement actives, sont combinés avec un ou plusieurs supports pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, afin de former des compositions thérapeutiques.
On entend par « pharmaceutique » ou « pharmaceutiquement acceptable » toute entité moléculaire et composition qui ne produisent pas de réaction allergique, négative ou toute autre réaction désirée lors de l’administration à un patient. Un support ou excipient pharmaceutiquement acceptable se réfère ainsi à un solide, semi-solide, diluant, matériel encapsulant, ou autre quelconque formulation non toxique. Par exemple, des solutions salines tamponnées au phosphate et stériles sont pharmaceutiquement acceptables. Les supports pharmaceutiquement acceptables peuvent habituellement comprendre un ou plusieurs composés, par exemple choisis parmi des excipients, conservateurs, solubilisants, agents tampon, albumine etc. Des excipients connus sont par exemple de l’amidon, gélatine, acide stéarique, stéarate de calcium ou de magnésium etc.
La forme de la composition pharmaceutique, le mode d'administration, le dosage et la posologie peuvent dépendre, entre autres, du cancer à traiter, de ses symptômes, de sa sévérité, de l'âge, du poids et/ou du sexe du patient.
De façon non limitative, la composition pharmaceutique selon l'invention peut être formulée de façon à pouvoir être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intratumorale, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, les inhibiteurs selon l’invention pouvant être administrés, de manière individuelle ou en combinaison, sous forme unitaire d'administration.
Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques (« patch »), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire, intratumorale ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres.
Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes habituelles des domaines considérés.
Un autre objet de l’invention se rapporte à un produit de combinaison comprenant : un inhibiteur d’autophagie, tel que précédemment décrit, et de PASP-8ADT, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT.
Selon un mode de réalisation particulier, le produit de combinaison comprend un inhibiteur d’autophagie tel que précédemment décrit et ASP-8ADT.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le produit de combinaison comprend un inhibiteur d’autophagie tel que précédemment décrit et une prodrogue d’ASP-8ADT. Par exemple, une prodrogue d’ASP-8ADT est le G-202.
Un tel produit de combinaison ou kit permet l’administration d’ASP-8ADT, d’une prodrogue d’ASP-8ADT ou d’un métabolite d’ASP-8ADT, et d’un inhibiteur d’autophagie conformes à l’invention de manière simultanée, i.e. au même moment, ou séparée dans le temps, i.e. séquentielle.
De manière avantageuse, ASP-8ADT, la prodrogue ou le métabolite de celui-ci et l’inhibiteur d’autophagie selon l’invention peuvent être utilisés en combinaison avec d’autres thérapies connues contre le cancer comme par exemple, la chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie ou des combinaisons de celles-ci. De manière particulièrement avantageuse, ASP-8ADT, la prodrogue ou le métabolite de celui-ci et l’inhibiteur d’autophagie selon l’invention sont utilisés en combinaison avec un autre agent chimiothérapeutique.
Il a en effet été mis en évidence par les inventeurs que Putilisation d’ASP-8ADT, d’une prodrogue d’ASP-8ADT ou d’un métabolite d’ASP-8ADT, et d’un inhibiteur d’autophagie selon l’invention permet de traiter un cancer de manière synergique, mais également de potentialiser significativement, et ce, toujours de manière synergique, les traitements chimiothérapeutiques utilisés actuellement contre différents cancers.
Les agents chimiothérapeutiques sont généralement classés dans les catégories suivantes: agents alkylants, comme par exemple le cisplatine qui se fixe sélectivement sur les bases puriques de l'ADN (A ou G) et induit une variation de la conformation locale du double brin dADN. Cette déformation inhibe la réplication et la transcription de l'ADN en ARN, et induit par ce biais la mort cellulaire.
Antimétabolites, comme le fluorouracile (5-FU) qui bloque l'activité de la thimidylate synthase. antibiotiques antitumoraux comme la bléomycine, la daunorubicine, la doxorubicine, agents tubulo-affines, comme par exemple le docétaxel, commercialisé sous le nom de Taxotère® en France ou le cabazitaxel commercialisé sous le nom de Jevtana®. inhibiteurs de la topoisomérase, comme par exemple l’étoposide commercialisé notamment sous le nom VEPESIDE® (France) ou encore ETOPOSIDE DAKOTA PHARM, (France). le PEITC (Phenéthyl isothiocyanate), qui est un composé naturel provenant de certains végétaux comme les crucifères ayant une activité anti-tumorale (14,15).
Les inventeurs ont mis en évidence que Putilisation de la combinaison selon l’invention, i.e. ASP-8ADT, une prodrogue ou un métabolite d’ASP-8ADT et un inhibiteur d’autophagie, permet d’augmenter considérablement et de manière synergique l’effet anti-cancéreux d’un traitement chimiothérapeutique, et ce quel que soit l’agent chimiothérapeutique utilisé. Ceci est particulièrement avantageux et permet d’améliorer efficacement l’effet anti-cancéreux d’un agent chimiothérapeutique utilisé pour le traitement d’un cancer, quel que soit son mécanisme d’action.
Un objet de l’invention se rapporte ainsi à un inhibiteur d’autophagie pour son utilisation dans le traitement de cancer d’un patient traité par ASP-8ADT, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT caractérisé en ce que le patient est en outre traité par un autre agent chimiothérapeutique, de préférence choisi parmi un agent alkylant, un antimétabolite, un antibiotique cytotoxique, un agent tubulo-affine, un antimétabolite et/ou un inhibiteur de la topoisomérase. De préférence encore, ledit agent chimiothérapeutique est choisi parmi un agent alkylant, un agent tubulo-affine et/ou un inhibiteur de la topoisomérase. De préférence encore, ledit agent chimiothérapeutique est choisi parmi le cisplatine, le docétaxel, le cabazitaxel, le Phenéthyl isothiocyanate (PEITC), le fluorouracile (5-FU) et/ou l’étoposide. De préférence encore, ledit agent chimiothérapeutique est choisi parmi le cisplatine, le docétaxel, le Phenéthyl isothiocyanate (PEITC), le fluorouracile (5-FU) et/ou l’étoposide.
FIGURES
Figure 1 : Structures de G-202 et d’ASP-8ADT, obtenu après clivage de G-202 par PSMA.
Figure 2 : Expression protéique dans la lignée cellulaire LNCaP, déterminée par Western-Blot, des acteurs moléculaires impliqués dans l’apoptose (PARP et PARP c (PARP clivé)) et l’autophagie (LC3 I et II, P62) en fonction des traitements avec des inhibiteurs de SERCA (ASP-8ADT, 1 μΜ et TG, 1 pM) seuls ou combinés avec un inhibiteur de l’autophagie (inhibiteur de Rab7 100 nM ou Chloroquine 25 pM). Les cellules contrôles reçoivent uniquement le solvant (DMSO lpL/lOmL) et non les molécules actives.
Figure 3 : Evaluation des effets du composé ASP-8ADT comparé à la thapsigargine sur le calcium cytosolique, le calcium mitochondrial ainsi que la dépolarisation de la membrane mitochondriale. (Test de Student, p<0,05 : *, N.S : différence non significative). Les cellules contrôles correspondent aux cellules non traitées. (A) Concentration en calcium cytosolique évaluée par imagerie calcique après 18h de traitement avec de la Thapsigargine (lpM, 18h) ou avec le composé ASP-8ADT (lpM, 18h) (B) Evaluation des stocks calciques mitochondriaux après 18h de traitement avec de la Thapsigargine (lpM, 18h) ou avec le composé ASP-8ADT (lpM, 18h). (C) Evaluation du potentiel de la membrane mitochondriale par utilisation d’une sonde DIOC6 et analyse par cytométrie en flux après 18h de traitement avec de la Thapsigargine (lpM, 18h) ou avec le composé ASP-8ADT (lpM, 18h) seul ou combiné avec un inhibiteur d’autophagie (inhibiteur de Rab7).
Figure 4 : Quantification de l’apoptose induite par la TG et ASP-8ADT (1 pM, 48h) combiné(e) avec des inhibiteurs de l’autophagie et révélée par coloration au Hoescht, sur des cellules LNCaP contrôles et traitées. (Test de Student, p<0,05 : *) (A) Avec comme inhibiteurs de l’autophagie : Wortmannine (WT) 40pM, Chloroquine (CQ) 25pM ou inhibiteur de Rab7 (O.lpM). (B) Avec comme inhibiteur de l’autophagie un ARN interfèrent de Atg5. (C) Avec comme inhibiteur de l’autophagie : le salubrinal (Slb) 25pM, 48h. (D) Avec comme inhibiteur de l’autophagie un ARN interfèrent de Beclinl.
Figure 5 : Quantification de l’apoptose induite par un agent chimiothérapeutique (cisplatin 4μΜ, etoposide 50μΜ, docetaxel lOnM, Phenethyl isothiocyanate (PEITC) 2μΜ (A) ou le fluorouracile (5-FU) 15μΜ (B)) éventuellement combiné à ASP-8ADT (1 μΜ) et/ou un inhibiteur de l’autophagie (inhibiteur de Rab7, lOOnM) (Test de Student, p<0,05 : *).
Figure 6 : Evolution de la taille relative des tumeurs selon les traitements : ASP-8ADT (ΙμΜ) seul ou en combinaison avec un inhibiteur de l’autophagie (Chloroquine CQ, 25μΜ) (Test de Student, p<0,05 : *).
Figure 7 : Expression protéique, déterminée par Western-Blot, des acteurs moléculaires impliqués dans l’apoptose (PARP et PARP c) obtenus après traitement ASP-8ADT seul ou combiné à la chloroquine (CQ), ou après traitement au docetaxel seul ou combiné à ASP-8ADT et à la chloroquine (CQ). Les échantillons protéiques selon les traitements proviennent de tumeurs sous-cutanées (xénogreffes réalisées chez des souris nude) après sacrifice des animaux.
Figure 8 : Evolution de la taille relative des tumeurs selon les traitements : Docetaxel (5mg/kg) seul ou en combinaison avec ASP-8ADT et un inhibiteur d’autophagie (Chloroquine (CQ)) (Test de Student, p<0,05 : *).
Figure 9 : Histogramme représentant la taille relative des tumeurs selon les traitements : ASP-8ADT et inhibiteur d’autophagie (Chloroquine CQ), et ASP-8ADT, inhibiteur d’autophagie (Chloroquine CQ) et Docetaxel (Test de Student, p<0,05 : *).
Figure 10 : Evaluation du potentiel apoptotique des combinaisons ASP-8ADT/inhibiteurs d’autophagie et chimiothérapies sur des lignées agressives de cancer du sein et du pancréas. (A) Détection de l’apoptose dans les cellules de cancers pancréatiques (MiaPanc) après traitement chimio-thérapeutique (Etoposide 20μΜ, Cisplatine 2μΜ) seul ou combiné avec la chloroquine et ASP-8ADT pendant 48h. Le taux d’apoptose est déterminé par comptage cellulaire après un marquage au Hoeschst (Test de Student, p<0,05 : *). (B) Détection de l’apoptose dans les cellules MCF-7 de cancer du sein après traitement chimio-thérapeutique (Etoposide 20μΜ, Docetaxel 5nM) seul ou combiné avec ASP-8ADT ou avec chloroquine + ASP-8ADT pendant 48h. Le taux d’apoptose est déterminé par comptage cellulaire après un marquage au Hoeschst (Test de Student, p<0,05 : *).
EXEMPLES
Pour les essais ci-après, un test de Student a été utilisé pour la comparaison statistique des différences. Les différences ont été considérées comme significatives avec p<0,05 : * (écart-type de la moyenne, n=3). EXEMPLE 1 - ASP-8ADT n’est pas capable de bloquer le flux autophagique comme le fait la thapsigargine, ce qui impacte sa capacité à induire de l’apoptose L’expression protéique des acteurs moléculaires impliqués dans l’apoptose (PARP) et l’autophagie (LC3, P62) a été déterminée par Western-Blot en fonction des traitements avec des inhibiteurs de pompes SERCA seuls ou combinés avec des inhibiteurs de l’autophagie.
Au cours de la formation des autophagosomes, il y a conversion de LC3I en LC3II par un mécanisme de lipidation. LC3 II est un marqueur de la formation des autophagosomes, et P62 est un marqueur du flux autophagique.
Matériels et méthodes
Western Blot
Les échantillons protéiques obtenus après extraction protéique de cellules (lignées cancéreuses prostatiques (LNCaP)) (50 pg) traités avec des inhibiteurs de SERCA (ASP-8ADT, 1 μΜ ou TG, 1 pM) seuls ou combinés avec des inhibiteurs de l’autophagie (inhibiteur de Rab7 100 nM (PubChem CID 1067700 ou 2-(benzoylcarbamothioylamino)-5,5-dimethyl-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyran-3-carboxylic acid), Chloroquine 25 pM) ont été soumis à un SDS-PAGE et transférés sur des membranes de nitrocellulose par « semi-dry Western Blotting » (Bio-Rad Laboratories). La membrane a été bloquée dans du tampon TNT (Tris-HCl, pH 7.5, 140 mM NaCl, et 0.05% Tween 20) contenant 5% de lait pendant 45 min à température ambiante. Les membranes sont ensuite incubées doucement toute la nuit à 4°C avec des anticorps primaires spécifiques (un anticorps de lapin polyclonal anti PARP (Cell Signaling, 1/1000), un anticorps de proc anti P62 (PROGEN, 1/1000) et un anticorps de lapin polyclonal antiLC3 (SIGMA, 1/1000)). Après 5 min de lavage dans du tampon TNT, les membranes ont été transférées avec un anticorps secondaire anti-IgG de lapin lié à la peroxydase de raifort (Chemicon, 1/50000), ou un anticorps secondaire de souris lié à la peroxydase de raifort (Chemicon, 1/10000) pendant lh à température ambiante. Après 15 min de lavage dans du tampon TNT, la membrane a été traitée pour la détection par chimioluminescence en utilisant le substrat chimioluminescent Supersignal Ouest Dura (Pierce) selon les instructions du fabricant. Les empreintes ont été ensuite exposées à un film X-Omat ARs (Eastman Kodak Company, Rochester, NY).
Les expressions protéiques ont été évaluées à plusieurs durées de traitement : 24h, 48h et/ou 72h. Résultats
Comme visible à la figure 2, le composé ASP-8ADT n’est pas capable de bloquer le processus d’autophagie contrairement à la thapsigargine. En effet, il n’y a pas d’accumulation de P62 comme observé avec la thapsigargine, ni de formation de LC3II. Ces analyses ont ainsi révélé l’incapacité de ASP-8ADT à bloquer l’autophagie. Dans ces mêmes conditions, la thapsigargine induit de l’apoptose caspase dépendante révélée par le clivage de PARP (PARP c). Ce clivage se fait via la caspase 8. Ce clivage n’est pas observé avec le composé ASP-8ADT seul, mais apparaît en combinaison avec de la chloroquine et l’inhibiteur de Rab7, suggérant un lien entre l’inhibition de l’autophagie et l’induction de l’apoptose. EXEMPLE 2 - Une augmentation de la concentration en calcium cytosolique et une surcharge calcique mitochondriale ne sont pas suffisantes pour induire la dépolarisation mitochondriale. L’apoptose calcium-dépendante est l’aboutissement d’une série d’évènements établis et connus notamment une augmentation de la concentration en calcium cytosolique, une surcharge mitochondriale entraînant une dépolarisation de la membrane mitochondriale (associées à la sortie de messagers de morts de la mitochondrie). (2, 16-19)
Afin d’expliquer la différence de mode d’action entre la thapsigargine et un de ses analogues, ASP-8ADT, leurs effets respectifs sur le calcium cytosolique, le calcium mitochondrial ainsi que la dépolarisation de la membrane mitochondriale ont été évalués.
Matériels et méthodes
Imagerie calcique
Les cellules LNCaP ont été mises en cultures sur des lamelles de verre au moins 3 jours avant les expériences et chargées avec du fura-2 AM (5 μΜ fura-2 AM), et ensuite rincées 3 fois avec une solution sans fura-2 AM. Pour les mesures, les cellules sont excitées alternativement à 340 et 380 nm. La fluorescence émise est filtrée à 510 nm, capturée et analysée grâce à un système d’imagerie calcique dédié. La concentration en Ca2+ cytosolique a été calculée à partir du ratio de la fluorescence émise, excitée par une lumière à 340 et 380 nm en utilisant l’équation de Grynkiewicz.
Les cellules ont été traitées avec la thapsigargine (ΙμΜ, 18h) ou avec ASP-8ADT (ΙμΜ, 18h). La vidange des mitochondries est induite en utilisant du FCCP (5μΜ) qui va découpler la chaîne oxydative mitochondriale et induire une vidange calcique de la mitochondrie. La sonde Fura-2 AM a ensuite permis d’évaluer la variation de calcium qui en résulte dans le cytosol, ainsi équivalente au Ca2+ mitochondrial.
Evaluation du potentiel mitochondrial : DIOC6 &amp; cytométrie en flux
Après un traitement avec la thapsigargine (ΙμΜ, 18h) ou avec ASP-8ADT (ΙμΜ, 18h), seul ou combiné avec un inhibiteur d’autophagie (inhibiteur de la GTPase Rab7 (PubChem CID 1067700 ou 2-(benzoylcarbamothioylamino)-5,5-dimethyl-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyran-3-carboxylic acid)), les cellules sont rincées au PBS et incubées avec du DIOC6 (30nM, 30min, 37°C). Le DIOC6 permet de discriminer les cellules selon l’état de leur potentiel de membrane. Les cellules sont ensuite analysées par cytométrie en flux grâce à un cytomètre Cyan LX9 (Beckman Coulter, France) et les données ont été analysées grâce au logiciel multicycle software (phoenix Flow Systems, San Diego, USA). Résultats
Contrairement aux hypothèses actuelles, l’élévation du calcium cytosolique ainsi que la surcharge des mitochondries en calcium ne sont pas des signaux calciques suffisants pour induire l’apoptose des cellules puisque la thapsigargine et le composé ASP-8ADT ont les mêmes actions sur les signaux calciques. En effet, ASP-8ADT échoue à induire l’apoptose bien qu’il soit capable comme la thapsigargine d’augmenter à la fois la concentration cytosolique et mitochondriale de calcium (Figure 3 A, B). La capacité de la thapsigargine à induire l’apoptose n’est donc pas seulement liée à sa capacité à augmenter le niveau de calcium dans le cytoplasme et les mitochondries.
Durant le processus d’apoptose, la mitochondrie va libérer des agents pro-apoptotiques afin d’induire la phase effectrice de l’apoptose. Durant cette étape la mitochondrie perd son potentiel membranaire. Il est donc possible de déterminer si la cellule est entrée dans le processus de mort cellulaire en évaluant le potentiel membranaire de ses mitochondries.
Comme visible à la figure 3C, la thapsigargine seule est apte à altérer significativement le potentiel de la membrane mitochondriale provoquant l’apoptose en augmentant considérablement le nombre de cellules dont les mitochondries ont perdu leur potentiel membranaire.
Au contraire, ASP-8ADT seul n’est pas capable d’altérer le potentiel de la membrane mitochondriale provoquant l’apoptose. La combinaison d’ASP-8ADT et d’un inhibiteur de Rab7 permet, comme la thapsigargine, d’augmenter significativement le nombre de cellules dont les mitochondries ont perdu leur potentiel membranaire.
De manière très surprenante, et comme visible à la figure 3C, il a ici été démontré qu’il ne peut y avoir apoptose que si l’autophagie est inhibée (ici par un inhibiteur de la GTPase Rab7) ce qui permet alors la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la libération de messagers de morts.
La combinaison d’un inhibiteur d’autophagie au composé ASP-8ADT est donc indispensable dans le processus d’apoptose calcium-dépendant. EXEMPLE 3 - L’inhibition de l’autophagie restaure le potentiel apoptotique du composé ASP-8ADT dans des cellules LNCaP. L’apoptose induite par le composé ASP-8ADT ou par la thapsigargine associé(e) à des inhibiteurs de l’autophagie dans les cellules de cancer de la prostate LNCaP a été déterminée après coloration au Hoeschst.
Matériels et méthodes
Technique d’évaluation de l’apoptose
Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits (BD Lalcon) avec du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de vœu fœtal et 5mM de glutamine. Après 24h, les cellules ont été traitées avec de la thapsigargine ou ASP-8ADT (ΙμΜ, 48h), éventuellement combiné(e) avec un inhibiteur de l’autophagie (Wortmannine 40μΜ, Chloroquine 25μΜ, siARN ATG5 lOOnM (siARN ID sl8160 et siARN ID sl8158 de chez Life technologies), salubrinal 25μΜ, siARN BECN1 100 nM (Beclin 1) (séquence SEQ ID NO: 2, 5'-3' AAGAUUGAAGACACAGGAGGC) (21) ou une petite molécule inhibitrice de Rab7 (PubChem CID 1067700 ou 2-(benzoylcarbamothioylamino)-5,5-dimethyl-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyran-3-carboxylic acid) O.lpM). Les cellules du surnageant ont été collectées avec les cellules adhérentes de la lame par traitement avec de la trypsine (0.05%), et centrifugées et resuspendues dans du PBS. A partir de cette suspension, les fractions sont déposées sur des lamelles avec une centrifugeuse de type cytospin. Pour l’analyse morphologique, les cellules ont été fixées avec du méthanol glacé pendant 10 min et lavées 2 fois avec du PBS. Les cellules ont ensuite été colorées avec du Hoechst 33258 (lmg/ml dans PBS, 10 min) à température ambiante et montées dans du glycergel (DAKO). La morphologie nucléaire a été observée sur un microscope à fluorescence Olympus BH-2 (405-435nm). Le pourcentage de cellules apoptotiques a été déterminé par comptage d’au moins 500 cellules dans des champs aléatoires, 3 fois pour chaque condition.
Pour évaluer l’apoptose précoce les cellules ont été marquées avec de l’Annexin V-FITC puis analysées par cytométrie en flux selon le protocole du fabricant (Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit by Life Technologies). Brièvement, après 15 -24h de traitement, les cellules sont collectées et lavées 2 fois dans tampon PBS froid. Le surnageant a été éliminé et les cellules resuspendues dans un tampon de liaison à l’Annexine IX pour atteindre une densité cellulaire de lxlO6 cellules/mL. Pour chaque 100 pL de suspension cellulaire, 5 pL d’Annexin V Alexa Fluor 488 et 1 pL d’iodure de propidium (100 pg/mL) ont été ajoutés. Après 15 min d’incubation à température ambiante, 400 pL de tampon de liaison à l’Annexine IX ont été ajoutés. Les échantillons ont ensuite été mixés doucement et gardés dans la glace. Les cellules marquées à l’Annexine V ont été analysées par l’émission de fluorescence mesurée par cytométrie de flux. Résultats
Comme visible à la figure 4A, l’inhibition de l’autophagie par un inhibiteur spécifique (comme la chloroquine, Wortmannine ou inhibiteur de Rab7 (PubChem CID 1067700 ou 2-(benzoylcarbamothioylamino)-5,5-dimethyl-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyran-3-carboxylic acid)) augmente significativement la capacité du composé ASP-8ADT à induire l’apoptose. Ces résultats indiquent une action synergique entre le composé ASP-8ADT et l’inhibition de l’autophagie dans le traitement de cancer via l’induction d’une apoptose importante.
Au contraire, un inhibiteur d’autophagie combiné à la thapsigargine ne produit aucun effet supplémentaire significatif sur l’apoptose.
Les mêmes résultats sont obtenus avec un ARN interfèrent inhibant Atg5, qui est impliqué dans la formation des autophagosomes, comme visible à la figure 4B.
Les mêmes résultats sont obtenus avec un ARN interfèrent inhibant la Beclinl qui est impliquée dans l’initiation de la formation des autophagosomes, comme visible à la figure 4D.
Au contraire, l’ARN interfèrent inhibant Atg5 combiné à la thapsigargine ne produit aucun effet supplémentaire significatif sur l’apoptose.
Comme visible à la figure 4C, rutilisation du salubrinal (Slb) qui permet d’inhiber l’autophagie (20) augmente significativement la capacité du composé ASP-8ADT à induire l’apoptose.
Ces résultats indiquent une action synergique entre le composé ASP-8ADT et l’inhibition de l’autophagie dans le traitement de cancer via l’induction d’une apoptose importante. EXEMPLE 4 - Le composé ASP-8ADT associé à des inhibiteurs de l’autophagie est capable d’augmenter l’efficacité de traitements chimio-thérapeutiques
Matériels et méthodes
Techniques d’évaluation de l’apoptose
La technique mise en place pour évaluer l’apoptose sur des cellules de cancer de la prostate LNCaP est identique à celle mise en œuvre pour l’exemple 3 (agent chimiothérapeutique (cisplatin 4μΜ, etoposide 50μΜ, docetaxel lOnM, 5-FU 15μΜ ou Phenethyl isothiocyanate (PEITC) 2μΜ) éventuellement combiné à ASP-8ADT (1 μΜ) et/ou un inhibiteur de l’autophagie (inhibiteur de Rab7 (PubChem CID 1067700 ou 2-(benzoylcarbamothioylamino)-5,5-dimethyl-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyran-3-carboxylic acid), lOOnM)). Résultats
Comme visible à la figure 5, l’utilisation combinée du composé ASP-8ADT/inhibiteur de l’autophagie (inhibiteur de Rab7) potentialise significativement et de manière synergique l’efficacité de molécules chimiothérapeutiques tel que le cisplatin, l’étoposide, le docetaxel (taxotère®), le 5-FU ou le PEITC dans des lignées cellulaires prostatiques. EXEMPLE 5 - ASP-8ADT en combinaison avec un inhibiteur de l’autophagie augmente in vivo de manière significative et synergique l’apoptose ainsi que l’efficacité antitumorale du Docetaxel.
Matériels et méthodes Détermination du volume tumoral
Pour les études in vivo, des xénogreffes sous cutanées de cellules cancéreuses agressives (PC- 3) ont été réalisées chez des souris mâle swiss nude non consanguines âgées de 6 semaines (Laboratoire Charles River, France). Sur chaque flanc, 2 millions de cellules PC-3 sont injectées. Avant injection, les cellules sont rincées dans du PBS stérile et mélangé avec du BD-Matrigel® (volume finale 50/50). Une fois les tumeurs formées (3 semaines), elles sont mesurées grâce à un pied à coulisse et le volume final est déterminé grâce à la formule suivante ((longueur x largeur2)/2). Afin d’appliquer la règle des 3R, pour chaque expériences, le nombre d’individu a été soigneusement calculé : 5 individus par condition a ainsi été choisi. L’animal est sacrifié à la fin de son traitement ou quand le poids tumoral atteint 10% du poids de l’animal. Après sacrifice, les tumeurs sont pesées et divisées afin d’être analysées selon différentes techniques. Une partie de la tumeur (coupe transversal afin d’avoir le milieu et les extrémités de la tumeur) sera directement mise dans du formol (4%, 24h), elle sera ensuite déshydratée afin d’être inclus en bloc de paraffine et permettre des analyse imuno-histochimiques. Le reste de la tumeur sera divisé en 2 afin de réaliser des études par western blot (protéique) et RT-PCR ou Q-PRC (ARNm), et conservé dans de l’azote liquide.
Mode opératoire d’administration des traitements selon l’invention
Des expériences sur des xénogreffes de tumeurs chez des souris mâles swiss nude ont été réalisées. Ces expérimentations ont consisté en des injections intra-tumorale sur la base d’une injection tous les trois jours du composé ASP-8ADT (50 pL/PBS à 2 μΜ) seul ou en association avec le Docetaxel (5 mg/kg). La chloroquine (CQ) a été administrée par gavage également tous les trois jours (50 pL à 10 mM).
Marquage Tunel (Terminal deoxynucléotidyl transferase dUTP Nick End Labelling) des coupes de tumeurs
Les tissus ayant été fixés dans le formaldéhyde 4% ont été inclus en paraffine après avoir été déshydratés selon le protocole suivant : lh éthanol 30%, lh éthanol 70%, U journée éthanol 95%, 1 nuit éthanol absolu, puis 2h éthanol absolu et pour finir butanol sur la nuit. En utilisant un microtome des coupes de 6pm sont réalisées et déposées sur lame de verre. Ces lames seront déparaffinées et démasquées selon la procédure suivante : 3 bains de solvant (Claral) de 10min, bains d’éthanol décroissants de 5 min : éthanol 100%, 95%, 70% et 30%. Les coupes sont alors réhydratées dans du PBS pendant 30min à 4°C. La dernière étape est celle du démasquage qui a pour but de rompre les liaisons moléculaires créées par le fixateur et qui altèrent la configuration spatiale des épitopes et leur accessibilité aux anticorps. Pour cela on utilise un démasquage thermique grâce à 5 séries de chauffage au four à micro-onde (4x 4min et 1x5min). Après avoir refroidies à l’air libre pendant 30 min, les lames sont rincées dans du PBS. Les lames ont ensuite été marquées en utilisant le kit in situ cell death selon les instructions du fournisseur (Roche 1684817).
Pour la révélation des lames par révélation enzymatique, du DAB (3.3 Diaminobenzidine 4HC1, Sigma) dilué dans du PBS avec 30% d’eau oxygénée est utilisé jusqu’à la visualisation d’un signal (entre 5 et 30 min). Pour stopper la réaction, la lame est rincée avec du PBS. Les lames sont montées en Eukkit (Dominique Dustcher) puis observées grâce à un microscope à lumière transmise (Leica DMIRE 2).
Western Blot
La technique mise en place pour l’analyse par Western Blot des tumeurs obtenues après traitement au ASP-8ADT seul ou combiné à un inhibiteur d’autophagie (chloroquine), ou après traitement au docetaxel seul ou combiné à ASP-8ADT et à un inhibiteur d’autophagie (chloroquine), est identique à celle mise en œuvre pour l’exemple 1. Résultats L’effet in vivo de la combinaison du composé ASP-8ADT et d’un inhibiteur d’autophagie (chloroquine) sur les cellules tumorales a tout d’abord été évalué.
Comme visible à la figure 6, un traitement basé sur la combinaison entre ASP-8ADT et un inhibiteur d’autophagie (chloroquine) permet une diminution significativement plus importante de la taille des tumeurs qu’un traitement basé sur ASP-8ADT seul. L’analyse de coupes de tumeurs par marquage Tunel met en évidence que l’association du stress calcique réticulaire par ASP-8ADT et de l’inhibition de l’autophagie par Putilisation de chloroquine induit l’apoptose de manière significativement plus importante que par un traitement ASP-8ADT seul (résultats non illustrés). L’analyse par Western Blot des tumeurs confirme l’induction d’une apoptose caspase dépendante révélée par le clivage de PARP lorsque ASP-8ADT est combiné avec de la chloroquine, comme visible à la figure 7. L’effet in vivo de la combinaison du composé ASP-8ADT et d’un inhibiteur d’autophagie (chloroquine) sur des cellules tumorales traitées par un traitement chimiothérapeutique (docetaxel) a ensuite été évalué.
Comme visible à la figure 8, un traitement basé sur une chimiothérapie (Docetaxel) associée à la combinaison entre ASP-8ADT et un inhibiteur d’autophagie (chloroquine) permet une diminution significativement plus importante de la taille des tumeurs qu’un traitement chimiothérapeutique (Docetaxel) seul. L’analyse de coupes de tumeurs par marquage Tunel met en évidence que l’association du stress calcique réticulaire par ASP-8ADT et de l’inhibition de l’autophagie par chloroquine, en plus d’un traitement chimiothérapeutique (Docetaxel), induit l’apoptose de manière significativement plus importante que lors d’un traitement chimiothérapeutique (Docetaxel) seul (résultats non illustrés). L’analyse par Western Blot des tumeurs confirme l’induction d’une apoptose caspase dépendante par le clivage de PARP lorsqu’un traitement chimiothérapeutique est combiné avec ASP-8ADT et de la chloroquine, comme visible à la figure 7.
Enfin, il a été mis en évidence qu’un traitement basé sur une chimiothérapie (Docetaxel) et sur la combinaison entre ASP-8ADT et un inhibiteur d’autophagie (chloroquine) permet une diminution significativement plus importante de la taille des tumeurs qu’un traitement basé sur la combinaison entre ASP-8ADT et un inhibiteur d’autophagie (chloroquine) (cf. figure 9). EXEMPLE 6 - La combinaison ASP-8ADT/inhibiteur d’autophagie augmente également l’efficacité de traitements chimiothérapeutiques dans des modèles de cancers agressifs du sein et du pancréas.
Matériels et méthodes
Techniques d’évaluation de l’apoptose
La technique mise en place pour évaluer l’apoptose sur des cellules cancéreuses pancréatiques (MiaPanc) ou du sein (MCF-7) est identique à celle mise en œuvre pour l’exemple 2 (agent chimiothérapeutique (cisplatin 2μΜ, etoposide 20μΜ ou docetaxel 5nM) seul ou combiné à ASP-8ADT (ΙμΜ, 48h) et à un inhibiteur de l’autophagie (chloroquine, 25μΜ, 48h). Résultats
Comme visible à la figure 10 A, l’utilisation combinée du composé ASP-8ADT/inhibiteur de l’autophagie (chloroquine, 25μΜ 48h) potentialise significativement l’efficacité de molécules chimiothérapeutiques tel que le cisplatin ou l’étoposide dans la lignée cancéreuse du sein MCF7.
Comme visible à la figure 10 B, l’utilisation du composé ASP-8ADT seule ou en combinaison avec un inhibiteur de l’autophagie (chloroquine, 25μΜ 48h) potentialise significativement l’efficacité de molécules chimiothérapeutiques tel que l’étoposide ou le docetaxel dans la lignée cancéreuse du pancréas MiaPanc.
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Claims (9)

  1. REVENDICATIONS
    1. Inhibiteur d’autophagie choisi entre la chloroquine, la wortmannine, un inhibiteur de Rab7, le salubrinal, un ARN interfèrent de Beclinl ou un ARN interfèrent de Atg5 pour son utilisation dans le traitement de cancer chez un patient traité par ASP-8ADT, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT.
  2. 2. Inhibiteur d’autophagie pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le patient est traité par ASP-8ADT,
  3. 3. Inhibiteur d’autophagie pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le patient est traité par une prodrogue d’ASP-8ADT.
  4. 4. Inhibiteur d’autophagie pour son utilisation selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que le patient est traité par G-202.
  5. 5. Inhibiteur d’autophagie pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit cancer est choisi parmi le cancer de la prostate, le cancer hépatocellulaire, le cancer de la vessie, le cancer du rein, le cancer du pancréas, le cancer du foie, le cancer du sein ou le glioblastome
  6. 6. Inhibiteur d’autophagie pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit cancer est le cancer de la prostate.
  7. 7. Inhibiteur d’autophagie pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le patient est en outre traité par un autre agent chimiothérapeutique, de préférence choisi parmi un agent alkylant, un antimétabolîte, un antibiotique cytotoxique, un agent îubulo-affîne et/ou un inhibiteur de la topoisomérase,
  8. 8. Composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur d’autophagie, un composé choisi parmi ΓΑ5Ρ-8ΑΒΤ, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable.
  9. 9. Produit de combinaison comprenant : - un inhibiteur d’autophagie, et - du ASP-8ADT, une prodrogue d’ASP-8ADT ou un métabolite d’ASP-8ADT.
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